Tổng quan luận án

Ung thư phổi là bệnh lý ác tính phát sinh từ biểu mô niêm mạc phế quản, tiểu phế quản, phế nang hoặc các tuyến phế quản, trong đó trên 95% trường hợp có nguồn gốc từ biểu mô phế quản. Về phân loại mô bệnh học lâm sàng, ung thư phổi được chia thành hai nhóm chính: ung thư phổi tế bào nhỏ (chiếm khoảng 13%) và ung thư phổi không tế bào nhỏ (chiếm khoảng 84%). Bệnh thường diễn tiến âm thầm ở giai đoạn sớm và phần lớn bệnh nhân chỉ được phát hiện khi khối u đã tiến triển đến giai đoạn muộn, dẫn đến hiệu quả điều trị hóa trị thông thường bị hạn chế và tiên lượng sống sau 5 năm thấp. Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) trong bản cập nhật phân loại khối u phổi năm 2021 đã nhấn mạnh tầm quan trọng của việc kết hợp các dấu ấn sinh học phân tử và di truyền học nhằm hướng tới mục tiêu điều trị cá thể hóa.

Khoảng trống nghiên cứu được chỉ ra là các biến đổi trên hệ gen ty thể (DNA ty thể - mtDNA) bao gồm biến đổi số bản sao, mất đoạn lớn và đột biến điểm có liên quan mật thiết đến quá trình sinh ung thư, nhưng các công bố quốc tế hiện nay vẫn chưa đạt được sự đồng thuận nhất quán và có sự khác biệt rõ rệt giữa các quần thể người. Bên cạnh đó, exosome (các túi ngoại bào kích thước nano tiết ra từ tế bào ung thư mang theo protein và acid nucleic vào máu tuần hoàn) là đối tượng tiềm năng cho kỹ thuật sinh thiết lỏng, tuy nhiên các nghiên cứu về hệ protein và mtDNA trong exosome huyết tương ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ tại Việt Nam còn rất hạn chế.

Luận án tiến sĩ sinh học chuyên ngành Nhân chủng học (mã số: 9420101.02) của nghiên cứu sinh Lê Lan Phương, thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS. Trịnh Hồng Thái và PGS. Lê Trung Thọ tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội (năm 2024), xác định hai mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

  1. Xác định được biến đổi của một số gen ty thể trong mô phổi, máu và exosome huyết tương của bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ và mối liên quan giữa các biến đổi này với bệnh ung thư phổi không tế bào nhỏ.
  2. Đánh giá được thành phần của hệ protein exosome huyết tương của bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ người Việt Nam.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài được xác định cụ thể như sau:

Nhóm mẫu Loại bệnh phẩm Số lượng mẫu Tiêu chuẩn lựa chọn Nguồn thu thập
Bệnh nhân UTPKTBN Mô phổi tươi (mô u và mô lân cận u cách mép u $\ge$ 5 cm) 60 cặp mẫu Xác nhận bằng chẩn đoán bệnh học (ung thư biểu mô vảy, ung thư biểu mô tuyến, ung thư tế bào lớn nguyên phát) Bệnh viện Phổi Trung ương (6/2018 - 6/2020)
Bệnh nhân UTPKTBN Máu toàn phần và huyết tương 57 mẫu Thu thập trước điều trị hoặc trong quá trình phẫu thuật của bệnh nhân UTPKTBN Bệnh viện Phổi Trung ương (6/2018 - 6/2020)
Đối chứng bệnh lý Mô phổi cắt bỏ không do ung thư 51 mẫu Bệnh nhân mắc bệnh phổi không ung thư (xơ hóa phổi, phổi biệt lập, thùy phổi mất chức năng) Bệnh viện Phổi Trung ương (6/2018 - 6/2020)
Đối chứng khỏe mạnh Máu toàn phần và huyết tương 31 mẫu Người khỏe mạnh bình thường Trung tâm xét nghiệm - Bệnh viện Đa khoa Xanh Pôn

Nghiên cứu áp dụng tiêu chuẩn loại trừ nghiêm ngặt đối với các trường hợp ung thư di căn từ cơ quan khác đến phổi. Toàn bộ các thực nghiệm chuyên sâu được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Sinh học người và Phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, cùng sự phối hợp thiết bị từ Viện Khoa học Vật liệu và Công ty BCE Việt Nam.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã hệ thống hóa các tài liệu khoa học trong nước và quốc tế liên quan đến bệnh lý ung thư phổi, đặc điểm biến đổi hệ gen ty thể và sinh học exosome:

  • Dịch tễ học và chẩn đoán ung thư phổi: Số liệu từ Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC, 2020) và Hiệp hội Ung thư Hoa Kỳ (2022) cho thấy ung thư phổi là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu do ung thư trên phạm vi toàn cầu, với khoảng 80-90% trường hợp liên quan đến khói thuốc lá. Tại Việt Nam, tỷ lệ mắc chuẩn hóa theo tuổi giai đoạn 2013-2017 tại Hà Nội và TP. Hồ Chí Minh là 32,03/100.000 dân ở nam và 10,48/100.000 dân ở nữ; tỷ lệ sống sót sau 5 năm ở bệnh nhân ung thư phổi tế bào nhỏ chỉ đạt khoảng 6% và ung thư phổi không tế bào nhỏ đạt khoảng 18%.
  • Nghiên cứu biến đổi DNA ty thể trên thế giới:
    • Lee và Wei tổng kết biến đổi mất đoạn 4977 bp ($\Delta$mtDNA4977) xảy ra giữa hai đoạn lặp trực tiếp 13 nucleotide (vị trí 8470-8482 và 13447-13459) làm mất 5 gen tRNA và 7 gen cấu trúc chuỗi hô hấp tế bào. Dai và cộng sự (2006) phát hiện $\Delta$mtDNA4977 hiện diện ở 20/37 mẫu mô u phổi, 22/37 mẫu lân cận u và 6/20 mẫu mô phổi bình thường.
    • Về số bản sao mtDNA, Bonner và cộng sự (2009) ghi nhận số bản sao mtDNA trong tế bào đờm > 157 bản sao làm tăng nguy cơ ung thư phổi với OR = 1,8 (KTC 95%: 1,0 - 3,2). Ngược lại, Wang và Dai (2011) nhận thấy số bản sao mtDNA ở mô u thấp hơn mô lân cận u ($P < 0,001$). Phân tích tổng hợp của Kim và cộng sự (2014) chỉ ra sự thay đổi số bản sao mtDNA khác biệt tùy theo chủng tộc và mức độ hút thuốc.
    • Về đa hình và đột biến điểm, Xu và cộng sự (2013) nghiên cứu trên 128 bệnh nhân Trung Quốc chỉ ra bệnh nhân mang biến thể 10398G và số bản sao mtDNA cao có thời gian sống thêm dài hơn nhóm mang alen 10398A và số bản sao thấp ($P = 0,053$). Qi và cộng sự (2016) trên 129 bệnh nhân xác định tỷ lệ dị tế bào chất của biến thể 10398G dao động từ 0,31% đến 97,04%. Choi và cộng sự (2011) ghi nhận tần số biến đổi soma tại vị trí 8701 và 10398 đạt 10,5/bp và xảy ra đồng thời ở 86% trường hợp ung thư phổi. Wang và cộng sự (2015) phân tích 250 bệnh nhân UTPKTBN Hàn Quốc chỉ ra haplogroup D/D4 và M/N có liên quan đến khả năng sống sót và là điểm nóng biến đổi soma.
  • Nghiên cứu mtDNA ở bệnh phổi không ung thư: Ballinger và cộng sự (1996) xác định mức độ mất đoạn mtDNA ở người hút thuốc cao gấp 7 lần người không hút thuốc. Zheng và cộng sự (2012) chỉ ra haplogroup A và M7 tăng nguy cơ mắc bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính (COPD), trong khi haplogroup F, D, M9 làm giảm nguy cơ; mất đoạn 822 bp tăng ở nhóm nam giới hút thuốc mắc COPD. Kiriev và cộng sự (2017) ghi nhận mức độ mất đoạn 4977 bp trong tế bào đờm tương quan thuận với mức độ stress oxy hóa nội bào ($R = 0,80, P < 0,0001$).
  • Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam: Nhóm tác giả Trần Huy Thịnh và cộng sự (2015, 2016, 2017) đã công bố các đa hình gen nhân liên quan đến ung thư phổi như CYP1A1 (T6235C, A4889G), CYP2D6 (G4268C), TP53 (Arg72Pro) và MDM2 (T309G). Về hệ gen ty thể, Phạm Thị Bích và cộng sự (2011) phát hiện mất đoạn 4977 bp, 5093 bp, 5167 bp ở ung thư đại trực tràng; Lưu Huyền Trang và cộng sự phát hiện mất đoạn 4977 bp (tỷ lệ 89,42%) cùng 6 dạng mất đoạn mới ở ung thư vú; Nguyễn Thị Tú Linh và cộng sự khảo sát biến đổi A10398G trên gen ND3 ở ung thư vú. Đối với ung thư phổi, trước luận án này chỉ có công bố sơ bộ trên 13 mẫu máu phát hiện biến đổi điểm vùng HVI (16189T>C, 16519T>C) nhưng chưa khảo sát hệ thống mức độ mất đoạn lớn và số bản sao.
  • Nghiên cứu về protein exosome: Guescini và cộng sự (2009, 2010), Phinney và cộng sự (2016), Sansone và cộng sự (2017) đã chứng minh exosome chứa mtDNA và protein tham gia truyền tín hiệu giữa các tế bào. Li và cộng sự (2011) xác định LRG1 trong exosome nước tiểu bệnh nhân UTPKTBN; Huang và cộng sự (2013) ghi nhận 80% mẫu UTPKTBN dương tính với EGFR trên bề mặt exosome; Sandfeld-Paulsen và cộng sự (2016) trên 431 bệnh nhân UTPKTBN nhận thấy NY-ESO-1 liên quan đến giảm tỷ lệ sống sót (HR = 1,78); Vykoukal và cộng sự (2017) xác định panel 4 protein exosome (SRGN, TPM3, THBS1, HUWE1) phân biệt ung thư biểu mô tuyến với diện tích dưới đường cong ROC đạt 0,90; Niu và cộng sự (2019) xác định kết hợp AHSG, ECM1 và CEA cho giá trị AUC đạt 0,938.

Khoảng trống nghiên cứu luận án lựa chọn giải quyết là xây dựng dữ liệu toàn diện về các dạng mất đoạn lớn, mức độ mất đoạn, số bản sao mtDNA và biến đổi A10398G trên đồng thời 3 loại mẫu (mô phổi, máu ngoại vi và exosome huyết tương), đồng thời định danh thành phần hệ protein exosome huyết tương ở bệnh nhân UTPKTBN người Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên cơ sở lý thuyết về sinh học phân tử ty thể và cấu trúc exosome:

  • Hệ gen ty thể người: Phân tử DNA dạng vòng, chuỗi kép gồm 16.569 cặp base (bp), mã hóa cho 37 gen (2 rRNA, 22 tRNA và 13 polypeptide cấu thành phức hệ chuỗi truyền điện tử OXPHOS). mtDNA không có vỏ bọc histone, không chứa intron và có cơ chế sửa chữa hạn chế nên tần số tích lũy đột biến cao hơn DNA nhân từ 10 đến 100 lần. Hiện tượng dị tế bào chất (heteroplasmy) là trạng thái cùng tồn tại giữa phân tử mtDNA đột biến và kiểu dại trong một tế bào.
  • Sinh học exosome: Là các bóng màng ngoại bào kích thước nano (30-150 nm), hình thành từ con đường nội thể (tạo túi nội khoang ILV trong thể đa túi MVB trước khi dung hợp màng tế bào giải phóng ra khoang ngoại bào). Exosome chứa vật chất di truyền (nDNA, mtDNA, mRNA, miRNA) và protein đặc trưng màng (CD63, CD81, Alix, Tsg101), đóng vai trò chất mang trong vi môi trường khối u.

Phương pháp nghiên cứu được thiết kế theo mô hình mô tả cắt ngang và phân tích bệnh - chứng với các quy trình kỹ thuật cụ thể:

Kỹ thuật thực nghiệm Hóa chất / Sinh phẩm chính Thiết bị phân tích chính Mục đích thực hiện
Tách chiết DNA tổng số G-Spin™ Total DNA Extraction Kit, QIAamp DNA mini kit Máy ly tâm lạnh 5714R, Tủ an toàn sinh học cấp II Tách chiết DNA từ mô phổi, máu toàn phần và exosome huyết tương
Đo quang phổ & Tinh sạch MEGAquick-spin™ Plus Kit Máy đo quang phổ NanoDrop 2000c Kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ DNA tách chiết
Long-range PCR & PCR thường LongAmp Hot Start Taq 2X Master Mix, i-Star Taq™ DNA Polymerase, 13 cặp mồi mtDNA Máy luân nhiệt GeneAmp PCR system 9700 Nhân bản toàn bộ hệ gen ty thể và phát hiện các dạng mất đoạn lớn
Điện di gel agarose Agarose Invitrogen, chất nhuộm Runsafe Nguồn PowerPac™ HC, Bể điện di Mini-Sub Cell GT, Máy chụp ảnh gel Chemidoc Kiểm tra kích thước và độ đặc hiệu sản phẩm PCR
Phân tích PCR-RFLP Enzyme cắt giới hạn FastDigest HpyF3I (DdeI) Bể ủ nhiệt ED5, Gel agarose 2,5% Nhận diện biến đổi điểm A10398G trên gen ND3 của mtDNA
Định lượng qPCR SensiFAST™ SYBR® Lo-ROX Kit, mồi ND1, ND4, HBB Hệ thống Realtime PCR 7500 Fast Đo mức độ mất đoạn mtDNA và định lượng số bản sao tương đối mtDNA
Phân tách & Đặc trưng exosome Gel Sepharose CL-4B, Kháng thể kháng CD63, CD81, Kit Amersham™ ECL Advance™ Hệ sắc ký lọc gel, Kính hiển vi điện tử quét Nova NanoSEM, Máy Zetasizer Nano ZS, Hệ Western Blot Turbo Trans Blot Tách exosome từ huyết tương, chụp cấu trúc hạt, đo phân bố kích thước DLS, kiểm tra chỉ thị màng
Proteomics khối phổ Enzyme Trypsin Promega Hệ thống sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS/MS) Định danh thành phần và mức độ biểu hiện hệ protein exosome
Tin sinh học & Thống kê Phần mềm FunRich, công cụ BLAST, phần mềm thống kê y sinh Máy vi tính Phân nhóm chức năng protein, dựng mạng tương tác protein - protein, tính đường cong ROC (AUC)

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tổng quan tài liệu

Chương 1 tổng hợp có hệ thống cơ sở lý luận và các bằng chứng thực nghiệm về:

  • Đặc điểm dịch tễ học ung thư phổi toàn cầu và tại Việt Nam; hệ thống phân loại mô bệnh học theo 6 lần sửa đổi của WHO (1967, 1981, 1999, 2004, 2014, 2021); hệ thống phân loại giai đoạn bệnh TNM phiên bản 8 (2017) của AJCC/UICC; phân loại phân tử dựa trên các đường truyền tín hiệu sinh ung (EGFR, Kras, EML4-ALK, c-MET, PI3K/AKT, ROS1).
  • Các phương pháp chẩn đoán lâm sàng và cận lâm sàng hiện hành: chẩn đoán hình ảnh (X-quang, CT Scanner), nội soi phế quản ống mềm (phát minh bởi Shigeto Ikeda năm 1968), hóa mô miễn dịch (TTF-1, Napsin A, CK7, P40, P63, CK5/6) và xét nghiệm đột biến gen.
  • Bệnh lý phổi không ung thư gồm 3 nhóm: bệnh phổi tắc nghẽn (COPD, hen, giãn phế quản), bệnh phổi hạn chế (bụi phổi, xơ phổi) và nhiễm trùng phổi (lao, viêm phổi).
  • Cấu trúc hệ gen ty thể người (giải mã bởi Anderson, 1981), đặc điểm mã di truyền ty thể (UGA mã hóa Tryptophan, AUA mã hóa Methionine, AGA/AGG là mã kết thúc), cơ chế tổn thương do stress oxy hóa (ROS), hiện tượng dị tế bào chất và vai trò của mtDNA trong quá trình chết theo chương trình (apoptosis).
  • Tổng quan tình hình nghiên cứu biến đổi mtDNA trên thế giới và tại Việt Nam ở bệnh nhân ung thư phổi và bệnh phổi không ung thư.
  • Cơ chế sinh học của exosome, quá trình đóng gói acid nucleic và protein vào exosome; tổng quan các nghiên cứu quốc tế về DNA và protein exosome huyết tương ứng dụng trong sinh thiết lỏng.

Chương 2. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 trình bày chi tiết về:

  • Tiêu chuẩn lựa chọn và thu thập 60 cặp mẫu mô u/mô lân cận u và 57 mẫu máu bệnh nhân UTPKTBN tại Bệnh viện Phổi Trung ương; 51 mẫu mô bệnh phổi không ung thư và 31 mẫu máu người khỏe mạnh tại Bệnh viện Xanh Pôn.
  • Quy trình đạo đức nghiên cứu y sinh học: thu thập phiếu đồng thuận tham gia nghiên cứu của bệnh nhân, bảo mật dữ liệu cá nhân, phê duyệt đề tài nghiên cứu cấp Đại học Quốc gia Hà Nội (mã số QG.03).
  • Danh mục 19 nhóm hóa chất, sinh phẩm phân tích và 16 hệ thống máy móc, thiết bị chuẩn.
  • Chi tiết các quy trình thực nghiệm phân tử:
    • Tách chiết DNA tổng số và đo quang phổ NanoDrop 2000c.
    • Xác định mất đoạn lớn trên mtDNA bằng kỹ thuật Long-range PCR và các cặp mồi chuyên biệt (ND3, mtDNA, 4977-1, 4977-2).
    • Xác định đa hình A10398G trên gen ND3 bằng kỹ thuật PCR-RFLP sử dụng enzyme cắt giới hạn DdeI (FastDigest HpyF3I).
    • Định lượng số bản sao tương đối và mức độ mất đoạn mtDNA bằng Real-time PCR (qPCR) với các cặp mồi đặc hiệu gen ND1, ND4 và gen nhân HBB.
    • Quy trình phân tách exosome huyết tương bằng cột sắc ký lọc gel Sepharose CL-4B tự thiết kế; đánh giá kích thước hạt nano bằng phương pháp tán xạ ánh sáng động (DLS) trên máy Zetasizer Nano ZS; kiểm tra hình thái hạt bằng kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường Nova NanoSEM; xác nhận sự hiện diện của chỉ thị bề mặt CD63 và CD81 bằng kỹ thuật Western blot.
    • Phân tích thành phần hệ protein exosome bằng khối phổ LC-MS/MS sau khi thủy phân bằng Trypsin; phân tích tin sinh học phân nhóm chức năng và mạng lưới tương tác protein - protein bằng phần mềm FunRich.
    • Phương pháp xử lý số liệu thống kê y sinh, khoảng tứ phân vị (IQR), khoảng tin cậy 95% (KTC 95%) và phân tích đường cong ROC (AUC).

Chương 3. Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm và thảo luận học thuật:

  • Đặc điểm đối tượng nghiên cứu: Thống kê phân bố về độ tuổi, giới tính, tiền sử hút thuốc lá, sử dụng rượu bia, loại mô bệnh học (ung thư biểu mô tuyến, vảy, tế bào lớn) và phân loại giai đoạn bệnh theo hệ thống TNM.
  • Kết quả xác định biến đổi gen ty thể:
    • Tách chiết thành công DNA tổng số từ mô phổi, máu và exosome đạt nồng độ và độ tinh sạch phục vụ phản ứng khuếch đại.
    • Xác định sự có mặt của mtDNA trong exosome huyết tương bằng 13 cặp mồi PCR đặc hiệu bao phủ toàn bộ hệ gen ty thể.
    • Kỹ thuật PCR và giải trình tự trực tiếp đã xác định tỷ lệ và các dạng mất đoạn lớn trên mtDNA ở các nhóm mẫu mô u, mô lân cận u và mô phổi không ung thư; ghi nhận các dạng mất đoạn lớn mới chưa từng được công bố trước đây trên hệ gen ty thể người.
    • Phân tích PCR-RFLP xác định tỷ lệ phân bố biến thể A10398G trên gen ND3 ở các nhóm mẫu và đánh giá mối liên quan giữa biến đổi này với các đặc điểm bệnh học của bệnh nhân UTPKTBN.
    • Định lượng qPCR xác định mức độ mất đoạn lớn và số bản sao tương đối mtDNA trong mô phổi, máu và exosome huyết tương; phân tích mối tương quan giữa mức độ mất đoạn và số bản sao mtDNA với các giai đoạn tiến triển của bệnh.
    • Xây dựng mô hình đường cong ROC xác định ngưỡng biểu hiện lâm sàng của mức độ mất đoạn mtDNA trong máu nhằm dự báo nguy cơ mắc UTPKTBN.
  • Kết quả phân tích hệ protein exosome huyết tương:
    • Phân tách thành công exosome từ huyết tương qua sắc ký lọc gel Sepharose CL-4B; ảnh chụp SEM cho thấy hạt có cấu trúc hình cầu đặc trưng dạng túi; phân tích DLS ghi nhận kích thước hạt nằm trong dải kích thước nano của exosome; Western blot xác nhận dương tính rõ nét với hai chỉ thị màng CD63 và CD81.
    • Phân tích proteomics khối phổ LC-MS/MS định danh được danh sách các protein trong exosome huyết tương ở nhóm UTPKTBN và đối chứng khỏe mạnh; lọc ra danh sách 34 protein có mức độ biểu hiện tăng ở mẫu UTPKTBN so với đối chứng, và danh sách 28 protein chỉ xuất hiện ở mẫu UTPKTBN đồng thời biểu hiện tăng ở các giai đoạn ung thư tiến triển.
    • Phân tích mạng lưới tương tác protein - protein (FunRich) xác định các cụm protein liên quan đến con đường xâm lấn, tăng sinh và di căn; chỉ ra các protein tiềm năng gồm EEF1A1, KPNB1, SRC và ACTC1 có vai trò chỉ thị sinh học đánh giá tiến triển bệnh.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt lý luận và khoa học

  • Luận án là công trình nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam cung cấp bộ dữ liệu có hệ thống về các dạng mất đoạn lớn, tỷ lệ mất đoạn, mức độ mất đoạn lớn, sự thay đổi số bản sao mtDNA và các biến đổi gen ty thể (bao gồm đa hình A10398G) trên cả 3 loại bệnh phẩm: mô phổi (mô u và mô lân cận u), máu toàn phần và exosome huyết tương của bệnh nhân UTPKTBN người Việt Nam.
  • Phát hiện các dạng mất đoạn lớn mới trên hệ gen ty thể ở mô phổi của bệnh nhân UTPKTBN và bệnh nhân mắc bệnh phổi không ung thư chưa từng được công bố trong các cơ sở dữ liệu quốc tế.
  • Là công trình đầu tiên tại Việt Nam phân lập, tinh sạch và giải mã thành công hệ protein exosome huyết tương ở bệnh nhân UTPKTBN; xác định được danh sách 34 protein biểu hiện tăng ở bệnh nhân UTPKTBN và 28 protein đặc trưng chỉ xuất hiện ở giai đoạn tiến triển của ung thư phổi.

Đóng góp mới về mặt thực tiễn và ứng dụng

  • Xây dựng thành công mô hình dự báo nguy cơ mắc UTPKTBN dựa trên phân tích đường cong ROC của mức độ mất đoạn lớn mtDNA trong mẫu máu ngoại vi, mở ra cơ sở khoa học cho việc phát triển các xét nghiệm sàng lọc nguy cơ không xâm lấn.
  • Xác định được các protein tiềm năng trong exosome huyết tương (EEF1A1, KPNB1, SRC, ACTC1) có khả năng phát triển thành các chỉ thị sinh học phân tử hỗ trợ đánh giá mức độ tiến triển và tiên lượng cho bệnh nhân UTPKTBN.
  • Cung cấp dẫn liệu thực nghiệm hỗ trợ phát triển các phương pháp chẩn đoán sinh thiết lỏng từ máu ngoại vi, giảm thiểu nhu cầu can thiệp sinh thiết mô xâm lấn đối với bệnh nhân ung thư phổi giai đoạn muộn.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế của nghiên cứu: Cỡ mẫu nghiên cứu được thu thập theo phương pháp chọn mẫu thuận tiện tại một trung tâm y tế chuyên khoa (Bệnh viện Phổi Trung ương) với 60 cặp mẫu mô và 57 mẫu máu bệnh nhân UTPKTBN, 51 mẫu mô bệnh phổi không ung thư và 31 mẫu máu đối chứng khỏe mạnh; các phân tích chức năng của các protein exosome mới phát hiện chủ yếu dựa trên các thuật toán tin sinh học và mô hình mạng tương tác protein mà chưa tiến hành can thiệp biến đổi gen chức năng in vitro hoặc in vivo.
  • Hướng nghiên cứu tiếp theo: Mở rộng quy mô mẫu nghiên cứu đa trung tâm trên các vùng địa lý khác nhau của Việt Nam; tiến hành các nghiên cứu chức năng chuyên sâu để kiểm chứng vai trò sinh học phân tử của các protein chỉ thị (EEF1A1, KPNB1, SRC, ACTC1) trong sự xâm lấn và kháng thuốc của tế bào ung thư phổi; xây dựng quy trình xét nghiệm sinh thiết lỏng hoàn chỉnh kết hợp chỉ thị mtDNA và protein exosome phục vụ thử nghiệm lâm sàng.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên khảo có giá trị cao cho các đối tượng học thuật và ứng dụng chuyên ngành:

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên thuộc các chuyên ngành Sinh học người, Nhân chủng học, Di truyền học, Sinh học phân tử, Hóa sinh học và Công nghệ sinh học y dược.
  • Giảng viên và nhà nghiên cứu tại các trường đại học, viện nghiên cứu chuyên ngành khoa học sự sống và y sinh học: có thể tham khảo trực tiếp quy trình kỹ thuật tách chiết exosome bằng sắc ký lọc gel Sepharose CL-4B tự thiết kế, phương pháp Long-range PCR phát hiện mất đoạn lớn mtDNA, quy trình qPCR định lượng số bản sao mtDNA bằng mồi ND1, ND4, HBB, và phương pháp phân tích tin sinh học FunRich.
  • Bác sĩ chuyên khoa ung bướu, bác sĩ giải phẫu bệnh và kỹ thuật viên xét nghiệm: tham khảo các dẫn liệu biến đổi phân tử và tiềm năng ứng dụng của exosome trong phát triển các xét nghiệm sinh thiết lỏng phục vụ chẩn đoán, phân loại giai đoạn và theo dõi tiên lượng điều trị bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ.

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án đã khảo sát biến đổi DNA ty thể và hệ protein exosome trên những loại bệnh phẩm cụ thể nào?

Nghiên cứu được thực hiện đồng thời trên 3 loại bệnh phẩm: mẫu mô phổi tươi (gồm 60 cặp mô u và mô lân cận u cách mép u ít nhất 5 cm không chứa tế bào ung thư), mẫu máu toàn phần/huyết tương (57 mẫu bệnh nhân UTPKTBN) và các hạt exosome nano được phân tách trực tiếp từ mẫu huyết tương của bệnh nhân, cùng các nhóm mẫu mô và máu đối chứng tương ứng.

2. Kỹ thuật nào được sử dụng để nhận diện biến đổi điểm A10398G trên gen ND3 của hệ gen ty thể?

Luận án sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphism). Sản phẩm khuếch đại gen ND3 được xử lý cắt giới hạn bằng enzyme FastDigest HpyF3I (DdeI) và phân tích kích thước đoạn cắt qua điện di trên gel agarose nồng độ 2,5% để xác định sự có mặt của alen kiểu dại (10398A) hoặc alen biến thể (10398G).

3. Những protein exosome huyết tương nào được xác định có tiềm năng làm chỉ thị sinh học đánh giá tiến triển UTPKTBN?

Thông qua phân tích khối phổ LC-MS/MS và phần mềm tin sinh học FunRich, luận án đã xác định được 4 protein tiềm năng trong exosome huyết tương gồm: EEF1A1 (Eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1), KPNB1 (Karyopherin subunit beta 1), SRC (Proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src) và ACTC1 (Actin alpha cardiac muscle 1).

4. Quy trình kiểm định độ tinh sạch và đặc trưng cấu trúc của exosome huyết tương được thực hiện bằng các phương pháp nào?

Exosome sau khi phân tách qua cột sắc ký lọc gel Sepharose CL-4B được kiểm định bằng 3 kỹ thuật bổ trợ: (1) Đo phân bố kích thước hạt nano bằng phương pháp tán xạ ánh sáng động (DLS) trên máy Zetasizer Nano ZS; (2) Chụp ảnh hình thái cấu trúc hạt nano dạng túi màng bằng kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường Nova NanoSEM; (3) Phân tích thẩm tách miễn dịch Western blot xác nhận sự có mặt của hai chỉ thị màng bề mặt đặc trưng là CD63 và CD81.

5. Mô hình đường cong ROC trong luận án được xây dựng nhằm giải quyết mục tiêu gì?

Mô hình đường cong ROC (Receiver Operating Characteristic) được xây dựng nhằm đánh giá giá trị chẩn đoán và xác định ngưỡng biểu hiện lâm sàng của mức độ mất đoạn lớn mtDNA trong máu ngoại vi, phục vụ mục tiêu dự báo nguy cơ mắc bệnh ung thư phổi không tế bào nhỏ ở người Việt Nam bằng phương pháp sinh thiết lỏng không xâm lấn.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của Lê Lan Phương đã giải quyết một cách có hệ thống các mục tiêu nghiên cứu về biến đổi hệ gen ty thể và hệ protein exosome huyết tương ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ người Việt Nam. Bằng việc kết hợp các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại từ Long-range PCR, PCR-RFLP, qPCR đến sắc ký lọc gel tách exosome và khối phổ LC-MS/MS, công trình đã cung cấp bộ dữ liệu thực nghiệm toàn diện về các dạng mất đoạn mới trên mtDNA, mức độ mất đoạn, số bản sao mtDNA và định danh các protein exosome chỉ thị (EEF1A1, KPNB1, SRC, ACTC1). Các kết quả này tạo lập cơ sở khoa học quan trọng cho việc phát triển các xét nghiệm sinh thiết lỏng hỗ trợ đánh giá nguy cơ, chẩn đoán giai đoạn và tiên lượng bệnh lý ung thư phổi không tế bào nhỏ trong thực tiễn y học.