Nghiên Cứu Sự Biến Đổi Di Truyền Các Gen PB2, PB1 Và PA Của Virus Cúm A/H5N1 Tại Việt Nam

Nghiên cứu sự biến đổi di truyền các gen pb2, pb1 và pa polymerase của virus cúm AH5N1 tại Việt Nam, cung cấp thông tin quan trọng cho y tế công cộng.

• Tác giả: Nguyễn Mạnh Kiên
• Người hướng dẫn: PGS. Đặng Thị Ngọc Dung
• Trường học: Trường Đại Học Y Hà Nội
• Chuyên ngành: Hóa Sinh Y Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Sự Biến Đổi Di Truyền Virus Cúm A/H5N1 Tại Việt Nam
• Loại tài liệu: Luận Án Tiến Sĩ Y Học
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Biến Đổi Di Truyền Virus Cúm A H5N1 Tại Việt Nam

Virus cúm A/H5N1 đã gây ra nhiều đại dịch nghiêm trọng tại Việt Nam. Nghiên cứu về sự biến đổi di truyền của virus này là rất cần thiết để hiểu rõ hơn về cơ chế lây truyền và độc lực của nó. Các gen PB2, PB1 và PA polymerase đóng vai trò quan trọng trong khả năng thích nghi và lây truyền của virus. Việc phân tích các biến đổi di truyền này sẽ giúp phát triển các biện pháp phòng ngừa hiệu quả hơn.

1.1. Đặc Điểm Sinh Học Của Virus Cúm A H5N1

Virus cúm A/H5N1 thuộc họ Orthomyxoviridae, có khả năng lây nhiễm cao và gây ra tỷ lệ tử vong lớn ở người. Đặc điểm cấu trúc của virus này bao gồm 8 phân đoạn RNA, trong đó các gen PB2, PB1 và PA là những yếu tố quyết định khả năng lây truyền và độc lực của virus.

1.2. Tình Hình Dịch Bệnh Cúm A H5N1 Tại Việt Nam

Từ năm 2003, Việt Nam đã ghi nhận nhiều đợt bùng phát dịch cúm A/H5N1. Tỷ lệ tử vong do virus này lên tới 60%, khiến Việt Nam trở thành một trong những quốc gia có tỷ lệ nhiễm cao nhất thế giới. Việc giám sát và nghiên cứu virus là rất quan trọng để ngăn chặn sự lây lan.

II. Vấn Đề Biến Đổi Di Truyền Của Virus Cúm A H5N1

Sự biến đổi di truyền của virus cúm A/H5N1 là một thách thức lớn trong việc kiểm soát dịch bệnh. Các gen PB2, PB1 và PA có khả năng đột biến cao, dẫn đến sự hình thành các chủng virus mới. Điều này không chỉ ảnh hưởng đến khả năng lây truyền mà còn làm giảm hiệu quả của các loại vaccine hiện có.

2.1. Thách Thức Trong Việc Kiểm Soát Dịch Bệnh

Sự biến đổi nhanh chóng của virus cúm A/H5N1 gây khó khăn trong việc phát triển vaccine và các biện pháp điều trị. Các chủng virus mới có thể kháng lại các loại thuốc hiện có, làm tăng nguy cơ bùng phát dịch bệnh.

2.2. Tác Động Của Virus Đến Sức Khỏe Cộng Đồng

Virus cúm A/H5N1 không chỉ ảnh hưởng đến sức khỏe của người nhiễm mà còn gây ra lo ngại lớn cho cộng đồng. Tình trạng lây lan của virus có thể dẫn đến các cuộc khủng hoảng y tế công cộng, đòi hỏi sự chú ý và hành động kịp thời từ các cơ quan chức năng.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Biến Đổi Di Truyền Virus Cúm A H5N1

Nghiên cứu sự biến đổi di truyền của virus cúm A/H5N1 được thực hiện thông qua các phương pháp sinh học phân tử hiện đại. Các kỹ thuật như RT-PCR, giải trình tự DNA và phân tích phả hệ gen là những công cụ quan trọng trong việc xác định các biến đổi di truyền của virus.

3.1. Kỹ Thuật RT PCR Trong Nghiên Cứu Virus

RT-PCR là một phương pháp hiệu quả để phát hiện và định lượng RNA của virus cúm A/H5N1. Kỹ thuật này cho phép xác định nhanh chóng sự hiện diện của virus trong mẫu bệnh phẩm, từ đó hỗ trợ trong việc giám sát dịch bệnh.

3.2. Phân Tích Phả Hệ Gen Của Virus

Phân tích phả hệ gen giúp xác định nguồn gốc và sự phát triển của các chủng virus cúm A/H5N1. Việc so sánh trình tự gen giữa các chủng virus khác nhau sẽ cung cấp thông tin quý giá về sự biến đổi di truyền của virus.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Biến Đổi Di Truyền Virus Cúm A H5N1

Kết quả nghiên cứu cho thấy sự biến đổi di truyền của các gen PB2, PB1 và PA có ảnh hưởng lớn đến khả năng lây truyền và độc lực của virus cúm A/H5N1. Các chủng virus mới được phát hiện có sự khác biệt rõ rệt về cấu trúc gen so với các chủng trước đó, điều này cho thấy sự thích nghi của virus với môi trường.

4.1. So Sánh Thành Phần Nucleotide Của Các Gen

Kết quả so sánh cho thấy sự khác biệt về nucleotide giữa các chủng virus cúm A/H5N1. Những thay đổi này có thể ảnh hưởng đến khả năng lây truyền và độc lực của virus, làm tăng nguy cơ bùng phát dịch bệnh.

4.2. Đánh Giá Tác Động Của Các Gen Đến Độc Lực

Nghiên cứu cho thấy các gen PB2, PB1 và PA có vai trò quan trọng trong việc xác định độc lực của virus. Sự biến đổi trong các gen này có thể dẫn đến sự gia tăng độc lực, làm cho virus trở nên nguy hiểm hơn đối với sức khỏe con người.

V. Kết Luận Về Nghiên Cứu Virus Cúm A H5N1 Tại Việt Nam

Nghiên cứu sự biến đổi di truyền của virus cúm A/H5N1 tại Việt Nam là rất cần thiết để hiểu rõ hơn về cơ chế lây truyền và độc lực của virus. Các kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp cơ sở khoa học cho việc phát triển vaccine và các biện pháp phòng ngừa hiệu quả hơn trong tương lai.

5.1. Tương Lai Của Nghiên Cứu Virus Cúm A H5N1

Nghiên cứu tiếp tục về virus cúm A/H5N1 sẽ giúp phát hiện sớm các biến đổi di truyền mới, từ đó có thể đưa ra các biện pháp phòng ngừa kịp thời. Sự hợp tác giữa các nhà khoa học và cơ quan y tế là rất quan trọng trong việc kiểm soát dịch bệnh.

5.2. Đề Xuất Các Giải Pháp Phòng Ngừa Hiệu Quả

Cần phát triển các vaccine tái tổ hợp và các biện pháp điều trị mới để đối phó với virus cúm A/H5N1. Việc nâng cao nhận thức cộng đồng về phòng ngừa dịch bệnh cũng là một yếu tố quan trọng trong việc kiểm soát sự lây lan của virus.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ thuộc họ Orthomyxoviridae, gồm nhiều phân type (subtype) lƣu hành ở chim hoang dã, có khả năng biến đổi xâm nhiễm, lây truyền sang ngƣời và nhiều loài động vật, nguyên nhân gây ra các đại dịch cúm A ở ngƣời trong lịch sử. Hệ gen củ (RNA) sợi đơn âm, gồm 8 phân đoạn RNA riêng biệt là PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M và NS, lần lƣợt mã hóa tổng hợp 12 protein tƣơng ứng đƣợc biết cho đến nay, đó là PB2, PB1, PB1-N40, PB1-F2, PA, HA, NP, NA, M1, M2, NS1 và NS2. Các protein trên tham gia cấu tạo hạt virus và đảm bảo các chức năng xâm nhiễm, độc lực và thích nghi lây truyền gây bệnh của virus ở các loài vật chủ. Đặc biệt, phức hợp enzym polymerase của virus cúm A không có cơ chế “đọc-sửa” bản sao trong quá trình sao chép, tổng hợp các phân đoạn RNA hệ gen của hạt virus mới.

Đặc tính cấu trúc hệ gen và enzym polymerase giúp virus cúm A có khả năng đột biến cao, hình thành chủng virus mới thay đổi độc lực hoặc chuyển nhiễm, thích nghi lây truyền sang nhiề và ngƣời trong quá trình lƣu hành tự nhiên. Trong đó, các gen PB2, PB1 và PA mã hóa tổng hợp 3 protein PB2, PB1 và PA polymerase, là các đơn vị cấu tạo phức hợp enzym polymerase, có vai trò quyết định khả năng thích nghi nhân lên và lây truyền của virus ở cơ thể các loài vật chủ. Ngoài ra, gen PB1 còn chứa 2 khung đọc mở gen PB1-F2 và PB1-N40 mã hóa tổng hợp các protein tƣơng ứng, tham gia biểu hiện độc lực của virus cúm A ở cơ thể bị nhiễm. Từ năm 2003 đến nay, virus cúm A/H5N1 thể độc lực cao nguyên nhân gây ra dịch cúm gia cầm và gây bệnh có tỉ lệ tử vong cao ở ngƣời (khoảng 60%), lan truyền rộng rãi tới hơn 60 quốc gia trên thế giới.

Trong đó, Việt Nam là quốc gia có dịch cúm gia cầm A/H5N1 bùng phát vào năm 2003 và liên tục tái bùng phát nhiều đợt dịch ở gia cầm hàng năm tại các địa phƣơng, với hơn 62 ngƣời tử vong trong tổng số hơn 124 ngƣời đƣợc xác định nhiễm loại virus này. Các trƣờng hợp ngƣời nhiễm và tử vong bởi virus cúm A/H5N1, đƣợc xác định là do virus xâm nhiễm trực tiếp sang ngƣời thông qua tiếp xúc với gia cầm bệnh, chất thải ô nhiễm hoặc do sử dụng các sản phẩm chứa virus từ gia cầm bệnh. Việt Nam cùng với Indonesia và Hy Lạp, là các quốc gia có tỉ lệ ngƣời nhiễm và tử vong do virus cúm A/H5N1 cao nhất 2 trên thế giới, đƣợc xác định là vùng dịch tễ trọng điểm cần quan tâm giám sát, ngăn chặn, khống chế sự lây truyền của virus ở gia cầm và từ gia cầm sang ngƣời. Các chủng virus cúm A/H5N1 clade 1, 2 và 7 với sự hình thành nhiều nhánh clade thuộc 3 genotye Z, V và G, là các nhóm virus lƣu hành phổ biến gây dịch cúm A/H5N1 ở chim hoang dã, gia cầm và xâm nhiễm gây bệnh với tỉ lệ tử vong cao ở ngƣời, tại Việt Nam và nhiều quốc gia trên thế giới từ năm 2003 đến nay.

Gần đây, nhóm virus clade 1.1 và đặc biệt là nhóm virus clade 2.1 hình thành từ năm 2009, có sự thay đổi lớn về kháng nguyên H5, có độc lực cao ở gia cầm và ngƣời nhiễm so với các nhóm virus lƣu hành trƣớc đó, làm cho vấn đề phòng chống dịch cho gia cầm và ngăn ngừa virus xâm nhiễm ở ngƣời trở nên phức tạp hơn. Sự biến đổi của các gen PB2, PB1 và PA là cơ sở giúp virus thích nghi nhân lên trong tế bào cảm thụ, yếu tố chìa khóa quyết định quá trình lây truyền dễ dàng giữa ngƣời với ngƣời và gia tăng độc lực của virus ở cơ thể ngƣời, một trong các vấn đề đƣợc quan tâm nghiên cứu giám sát ở virus cúm A/H5N1 gây bệnh dịch ở gia cầm và ngƣời hiện nay. Bên cạnh đó, dữ liệu di truyền của các gen PB2, PB1 và PA cùng với các gen trong hệ gen virus cúm A/H5N1 đƣơng nhiễm, là cơ sở khoa học cho phép dự báo sớm diễn biến dịch tễ học virus ở mức độ phân tử, nghiên cứu phát triển vaccine tái tổ hợp và sử dụng vaccine phòng chống bệnh cúm A/H5N1 cho ngƣời và gia cầm trong tƣơng lai. Xuất phát từ cơ sở lí luận và thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu sự biến đổi di truyền các gen PB2, PB1 và PA polymerase của virus cúm A/H5N1 đƣơng nhiễm tại Việt Nam”.

Nhằm các mục tiêu: 1- Giải trình tự, so sánh biến đổi đặc tính di truyền, tƣơng đồng về nucleotide và amino acid các gen PB2, PB1, PA, của một số biến chủng virus cúm A/H5N1 đƣơng nhiễm tại Việt Nam từ năm 2007 – 2011 với các chủng A/H5N1 trên thế giới. 2- Tìm hiểu nguồn gốc phả hệ các gen nói trên của các biến chủng virus cúm A/H5N1 trong nghiên cứu với các chủng virus A/H5N1 của Việt Nam và thế giới. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VIRUS CÚM A Virus cúm A (influenza A virus) là nhóm virus thuộc họ Orthomyxoviridae, bộ Mononegavirales, còn gọi là virus cúm chim (avian influenza virus, AIV) hay virus cúm gia cầm. Vị trí phân loại của virus cúm A trong hệ thống phân loại cơ sở (Basic Taxonomy) là: Viruses; ssRNA negative-stranded viruses; Orthomyxoviridae; Influenzavirus A [1], [2], [3].

Nhóm virus cúm A gồm nhiều phân type (subtype), biểu hiện đặc tính kháng nguyên của hai protein là hemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA) gắn trên bề mặt vỏ capsid hạt virus, cho đáp ứng kháng thể khác nhau của cơ thể nhiễm với mỗi kháng nguyên này giữa các phân type virus. Cho đến nay, đã phát hiện có 16 phân type HA (kí hiệu từ H1 đến H16) và 9 phân type NA (từ N1 đến N9) của virus cúm A lƣu hành ở chim hoang dã. Sự tổ hợp của các phân type HA và NA, có thể dẫn đến sự hình thành hơn 144 phân type virus cúm A khác nhau lƣu hành trong tự nhiên. Trong đó, 3 phân type virus cúm A/H1N1, A/H2N2 và A/H3N2, đã có sự biến đổi hình thành các chủng virus thích nghi lây truyền dễ dàng trong quần thể gây ra các đại dịch cúm A ở ngƣời trong lịch sử [1], [2], [3], [4], [5], [6].

Đặc trƣng virus cúm A là kí sinh nội bào bắt buộc, cấu tạo hạt virus đơn giản với hệ gen là phân tử RNA sợi đơn âm, gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt có khả năng tự nhân lên trong nhân của tế bào nhiễm. Bên cạnh đó, phức hợp enzym polymerase của virus cúm A thuộc nhóm enzym RNA phụ thuộc RNA type II, không có cơ chế đọc-sửa bản sao, tạo nên khả năng đột biến cao trong hệ gen, qua quá trình lây truyền và lƣu hành gây bệnh của virus ở các loài vật chủ [1], [2], [6]. Cấu tạo chung của virus cúm A Virus cúm A tồn tại ở dạng các hạt virus (virion) hình cầu hoặc hình khối đa diện đôi khi có dạng hình sợi, đƣờng kính 80 – 120 nano mét (nm), khối lƣợng phân tử khoảng 250 triệu dalton (Da). Hạt virus cúm A có cấu tạo đơn giản, bao gồm vỏ ngoài (envelope), capsid và lõi là vật chất di truyền (hệ gen) của virus [1], [7].

+ Vỏ capsid có chức năng bảo vệ vật chất di truyền của virus cúm A, gồm hàng trăm đơn vị cấu trúc gọi là capsomer. 4 + Lớp vỏ ngoài (envelope) có bản chất là lipoprotein có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm, mặt ngoài gắn các protein bề mặt đặc hiệu của virus và mặt trong đƣợc lót bởi một lớp màng đệm là protein M1. - Các protein bề mặt của virus cúm A có bản chất là glycoprotein gồm HA, NA và M2, đƣợc gắn nhƣ những gai mấu nhô ra mặt ngoài vỏ capsid của hạt virus. Có khoảng 500 gai mấu phân bố trên mặt ngoài vỏ capsid của một hạt virus, mỗi gai mấu dài khoảng 10 – 14 nm và có đƣờng kính khoảng 4 – 6 nm.

Tỉ lệ phân bố khoảng 4 – 5 phân tử protein HA trên 1 cụm protein NA (Hình 1. Mô hình và ảnh chụp các tiểu phần virus cúm A (xem [8]) Ghi chú: (A): Mô hình cấu tạo virus cúm A; (B): Các hạt virus cúm A chụp dƣới kính hiển vi điện tử 4. - Hai protein HA và NA gắn trên bề mặt vỏ capsid, có vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm, giải phóng hạt virus cúm A mới ở tế bào cảm thụ và là hai kháng nguyên chủ yếu cho đáp ứng miễn dịch của cơ thể vật chủ chống lại virus, cơ sở sản xuất vaccine phòng và chống dịch cúm A hiện nay [1], [2], [3]. - Hệ gen củ m A là ribonucleic acid sợi đơn âm (negative-single stranded RNA, viết tắt là (-)ssRNA) còn gọi là sợi đơn đối mã, nằm bên trong vỏ capsid của hạt virus [1], [2], [7].

Đặc điểm cấu tạo hệ gen của virus cúm A Virus cúm A có cấu trúc hệ gen gồm 8 phân đoạn RNA có khả năng tự sao chép độc lập, giúp cho virus dễ dàng nhân lên và tổng hợp các thành phần của hạt virus mới ở tế bào cảm thụ trong cơ thể vật chủ [1], [2], [9]. - Các phân đoạn RNA trong hệ gen của virus cúm A tồn tại ở dạng cấu trúc RNP (ribonucleoprotein) có tổng độ dài từ 10.000 base pair (bp), chứa 5 khoảng 13.500 bp thông tin di truyền tùy theo chủng virus. Hai đầu 5’- và 3’- của mỗi phân đoạn RNA có chứa các trình tự không mã hóa (untranslation region), gồm 12 – 15 nucleotide 5’-AGUAGAACAAGG và 3’-UCG(U/C)UUUCGUCC, có tính bảo tồn cao giữa các phân type virus cúm A. Mô hình cấu trúc hệ gen virus cúm A (xem [8]) Ghi chú: (A): Sơ đồ các phân đoạn PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M và NS trong hệ gen của virus cúm A.

(B): Mô hình cấu trúc một phân đoạn RNP của virus cúm A. - Mỗi phân đoạn RNA sợi đơn âm trong hệ gen của virus cúm A đƣợc bao bọc bởi các phân tử nucleoprotein (NP) tạo thành phân đoạn RNP tƣơng ứng, có cấu trúc xoắn đối xứng (α helix) dài 50 – 100 nm, đƣờng kính 9 – 10 nm. Các phân tử NP liên kết với nhau qua cầu nối peptide và tạo thành vòm (loop) ở giới hạn cuối mỗi phân đoạn RNP, đầu tận cùng 3’- và 5’- gắn với phức hợp enzym polymerase, gồm 3 protein dƣới đơn vị PB2, PB1 và PA polymerase, tạo thành một phức hệ tự sao chép độc lập trong quá trình nhân lên của virus ở tế bào nhiễm (Hình 1.