Nghiên Cứu Sự Biến Đổi Di Truyền Các Gen PB2, PB1 Và PA Của Virus Cúm A/H5N1 Tại Việt Nam

Nghiên cứu sự biến đổi di truyền các gen pb2, pb1 và pa polymerase của virus cúm AH5N1 tại Việt Nam, cung cấp thông tin quan trọng cho y tế công cộng.

• Tác giả: Nguyễn Mạnh Kiên
• Người hướng dẫn: PGS. Đặng Thị Ngọc Dung
• Trường học: Trường Đại Học Y Hà Nội
• Chuyên ngành: Hóa Sinh Y Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Sự Biến Đổi Di Truyền Virus Cúm A/H5N1 Tại Việt Nam
• Loại tài liệu: Luận Án Tiến Sĩ Y Học
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• Trang phụ bìa
• Lời cảm ơn
• Lời cam đoan
• Danh mục chữ viết tắt trong luận án
• Danh mục các bảng
• Danh mục các hình và sơ đồ
• ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1. Chương 1: ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VIRUS CÚM A
• 1.1. Cấu tạo chung của virus cúm A
• 1.2. Đặc điểm cấu tạo hệ gen của virus cúm A
• 1.3. Cấu tạo và chức năng của các phân đoạn RNA hệ gen virus cúm A
• 1.4. Đặc điểm cấu tạo và chức năng của các gen PB2, PB1 và PA
• 1.5. Phức hợp enzym polymerase của virus cúm A
• 1.6. Đặc tính biến đổi di truyền các gen và hệ gen virus cúm A
• 1.7. ĐẠI DỊCH CÚM A VÀ ĐẶC ĐIỂM BIẾN ĐỔI CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA CỦA VIRUS CÚM A GÂY ĐẠI DỊCH CÚM Ở NGƯỜI
• 1.7.1. Các đại dịch cúm A ở người trong lịch sử
• 1.7.2. Đặc điểm biến đổi các gen PB2, PB1 và PA của virus cúm A gây đại dịch cúm ở người
• 1.8. ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ VÀ SINH HỌC VIRUS CÚM A/H5N1
• 1.8.1. Đặc điểm dịch tễ virus cúm A/H5N1
• 1.8.2. Đặc điểm sinh học của virus cúm A/H5N1
• 1.9. NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI CÁC GEN PB2, PB1, PA LIÊN QUAN ĐỘC LỰC VÀ LÂY TRUYỀN Ở NGƯỜI CỦA VIRUS CÚM A/H5N1
• 1.9.1. Trên thế giới
• 1.9.2. Tại Việt Nam
• 2. Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
• 2.1.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
• 2.1.2. Dụng cụ, trang thiết bị
• 2.1.3. Các bộ kit sinh học phân tử sử dụng trong nghiên cứu
• 2.1.4. Môi trường sử dụng trong dòng hóa
• 2.1.5. Các hóa chất sử dụng trong điện di trên gel agarose
• 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.2.1. Kỹ thuật tách chiết ribonucleic acid tổng số
• 2.2.2. Thiết kế các trình tự mồi nucleotide sử dụng trong nghiên cứu
• 2.2.3. Kỹ thuật RT-PCR
• 2.2.4. Tinh sạch DNA sản phẩm PCR
• 2.2.5. Kỹ thuật điện di nucleic acid trên gel agarose
• 2.2.6. Kỹ thuật dòng hóa DNA
• 2.2.7. Giải trình tự DNA
• 2.2.8. Xử lí, kiểm chứng, thu nhận trình tự nucleotide và amino acid của các gen nghiên cứu
• 2.3. VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU
• 3. Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. KẾT QUẢ THU NHẬN VÀ GIẢI TRÌNH TỰ CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU
• 3.1.1. Kết quả tách chiết RNA tổng số và chuyển đổi cDNA hệ gen virus
• 3.1.2. Kết quả PCR thu nhận và dòng hóa DNA các gen PB2, PB1 và PA
• 3.1.3. Kết quả giải trình tự DNA các gen PB2, PB1 và PA
• 3.2. KẾT QUẢ SO SÁNH THÀNH PHẦN NUCLEOTIDE VÀ AMINO ACID CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU VỚI CÁC CHỦNG THẾ GIỚI
• 3.2.1. Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB2
• 3.2.1.1. Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB2
• 3.2.1.2. Kết quả so sánh tỉ lệ tương đồng về nucleotide và amino acid gen PB2
• 3.2.2. Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB1
• 3.2.2.1. Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB1
• 3.2.2.2. Kết quả so sánh tỉ lệ tương đồng về nucleotide và amino acid gen PB1
• 3.2.2.3. Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB1-F2
• 3.2.2.4. Kết quả xác định trình tự khung đọc mở gen PB1-N40
• 3.2.3. Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PA
• 3.2.3.1. Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PA
• 3.2.3.2. Kết quả so sánh tỉ lệ tương đồng về nucleotide và amino acid gen PA
• 3.3. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH PHẢ HỆ NGUỒN GỐC CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU
• 3.3.1. Kết quả phân tích xác định phả hệ nguồn gốc gen PB2
• 3.3.2. Kết quả phân tích xác định phả hệ nguồn gốc gen PB1
• 3.3.3. Kết quả phân tích xác định phả hệ nguồn gốc gen PA
• 4. Chương 4: VỀ KẾT QUẢ THU NHẬN CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU
• 4.1. Về kết quả thu nhận các gen PB2, PB1 và PA
• 4.2. Về qui trình nghiên cứu thu nhận các gen PB2, PB1 và PA
• 4.3. VỀ KẾT QUẢ SO SÁNH THÀNH PHẦN NUCLEOTIDE VÀ AMINO ACID CÁC GEN PB2, PB1, PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU VỚI CÁC CHỦNG CỦA THẾ GIỚI
• 4.3.1. Về biến đổi thành phần nucleotide và amino acid gen PB2
• 4.3.2. Về biến đổi thành phần nucleotide và amino acid gen PB1
• 4.3.2.1. Về kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB1
• 4.3.2.2. Về biến đổi thành phần nucleotide và amino acid gen PB1-F2
• 4.3.2.3. Về kết quả xác định trình tự khung đọc mở gen PB1-N40
• 4.3.3. Về biến đổi thành phần nucleotide và amino acid gen PA
• 4.4. VỀ KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH PHẢ HỆ NGUỒN GỐC CÁC GEN PB2, PB1, CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU VỚI CÁC CHỦNG CỦA THẾ GIỚI
• 4.4.1. Về kết quả xác định phả hệ nguồn gốc gen PB2
• 4.4.2. Về kết quả xác định phả hệ nguồn gốc gen PB1
• 4.4.3. Về kết quả xác định phả hệ nguồn gốc gen PA
• 4.5. PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI PHỨC HỢP ENZYM POLYMERASE, TỔ HỢP CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU VỚI CÁC CHỦNG CỦA THẾ GIỚI
• 4.5.1. Về đặc điểm biến đổi phức hợp enzym polymerase liên quan bệnh học và dịch tễ học lây truyền sang người của virus cúm A/H5N1
• 4.5.2. Về nguồn gốc tổ hợp các gen PB2, PB1 và PA polymerase
• KẾT LUẬN
• KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Biến Đổi Di Truyền Virus Cúm A H5N1 Tại Việt Nam

Virus cúm A/H5N1 đã gây ra nhiều đại dịch nghiêm trọng tại Việt Nam. Nghiên cứu về sự biến đổi di truyền của virus này là rất cần thiết để hiểu rõ hơn về cơ chế lây truyền và độc lực của nó. Các gen PB2, PB1 và PA polymerase đóng vai trò quan trọng trong khả năng thích nghi và lây truyền của virus. Việc phân tích các biến đổi di truyền này sẽ giúp phát triển các biện pháp phòng ngừa hiệu quả hơn.

1.1. Đặc Điểm Sinh Học Của Virus Cúm A H5N1

Virus cúm A/H5N1 thuộc họ Orthomyxoviridae, có khả năng lây nhiễm cao và gây ra tỷ lệ tử vong lớn ở người. Đặc điểm cấu trúc của virus này bao gồm 8 phân đoạn RNA, trong đó các gen PB2, PB1 và PA là những yếu tố quyết định khả năng lây truyền và độc lực của virus.

1.2. Tình Hình Dịch Bệnh Cúm A H5N1 Tại Việt Nam

Từ năm 2003, Việt Nam đã ghi nhận nhiều đợt bùng phát dịch cúm A/H5N1. Tỷ lệ tử vong do virus này lên tới 60%, khiến Việt Nam trở thành một trong những quốc gia có tỷ lệ nhiễm cao nhất thế giới. Việc giám sát và nghiên cứu virus là rất quan trọng để ngăn chặn sự lây lan.

II. Vấn Đề Biến Đổi Di Truyền Của Virus Cúm A H5N1

Sự biến đổi di truyền của virus cúm A/H5N1 là một thách thức lớn trong việc kiểm soát dịch bệnh. Các gen PB2, PB1 và PA có khả năng đột biến cao, dẫn đến sự hình thành các chủng virus mới. Điều này không chỉ ảnh hưởng đến khả năng lây truyền mà còn làm giảm hiệu quả của các loại vaccine hiện có.

2.1. Thách Thức Trong Việc Kiểm Soát Dịch Bệnh

Sự biến đổi nhanh chóng của virus cúm A/H5N1 gây khó khăn trong việc phát triển vaccine và các biện pháp điều trị. Các chủng virus mới có thể kháng lại các loại thuốc hiện có, làm tăng nguy cơ bùng phát dịch bệnh.

2.2. Tác Động Của Virus Đến Sức Khỏe Cộng Đồng

Virus cúm A/H5N1 không chỉ ảnh hưởng đến sức khỏe của người nhiễm mà còn gây ra lo ngại lớn cho cộng đồng. Tình trạng lây lan của virus có thể dẫn đến các cuộc khủng hoảng y tế công cộng, đòi hỏi sự chú ý và hành động kịp thời từ các cơ quan chức năng.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Biến Đổi Di Truyền Virus Cúm A H5N1

Nghiên cứu sự biến đổi di truyền của virus cúm A/H5N1 được thực hiện thông qua các phương pháp sinh học phân tử hiện đại. Các kỹ thuật như RT-PCR, giải trình tự DNA và phân tích phả hệ gen là những công cụ quan trọng trong việc xác định các biến đổi di truyền của virus.

3.1. Kỹ Thuật RT PCR Trong Nghiên Cứu Virus

RT-PCR là một phương pháp hiệu quả để phát hiện và định lượng RNA của virus cúm A/H5N1. Kỹ thuật này cho phép xác định nhanh chóng sự hiện diện của virus trong mẫu bệnh phẩm, từ đó hỗ trợ trong việc giám sát dịch bệnh.

3.2. Phân Tích Phả Hệ Gen Của Virus

Phân tích phả hệ gen giúp xác định nguồn gốc và sự phát triển của các chủng virus cúm A/H5N1. Việc so sánh trình tự gen giữa các chủng virus khác nhau sẽ cung cấp thông tin quý giá về sự biến đổi di truyền của virus.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Biến Đổi Di Truyền Virus Cúm A H5N1

Kết quả nghiên cứu cho thấy sự biến đổi di truyền của các gen PB2, PB1 và PA có ảnh hưởng lớn đến khả năng lây truyền và độc lực của virus cúm A/H5N1. Các chủng virus mới được phát hiện có sự khác biệt rõ rệt về cấu trúc gen so với các chủng trước đó, điều này cho thấy sự thích nghi của virus với môi trường.

4.1. So Sánh Thành Phần Nucleotide Của Các Gen

Kết quả so sánh cho thấy sự khác biệt về nucleotide giữa các chủng virus cúm A/H5N1. Những thay đổi này có thể ảnh hưởng đến khả năng lây truyền và độc lực của virus, làm tăng nguy cơ bùng phát dịch bệnh.

4.2. Đánh Giá Tác Động Của Các Gen Đến Độc Lực

Nghiên cứu cho thấy các gen PB2, PB1 và PA có vai trò quan trọng trong việc xác định độc lực của virus. Sự biến đổi trong các gen này có thể dẫn đến sự gia tăng độc lực, làm cho virus trở nên nguy hiểm hơn đối với sức khỏe con người.

V. Kết Luận Về Nghiên Cứu Virus Cúm A H5N1 Tại Việt Nam

Nghiên cứu sự biến đổi di truyền của virus cúm A/H5N1 tại Việt Nam là rất cần thiết để hiểu rõ hơn về cơ chế lây truyền và độc lực của virus. Các kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp cơ sở khoa học cho việc phát triển vaccine và các biện pháp phòng ngừa hiệu quả hơn trong tương lai.

5.1. Tương Lai Của Nghiên Cứu Virus Cúm A H5N1

Nghiên cứu tiếp tục về virus cúm A/H5N1 sẽ giúp phát hiện sớm các biến đổi di truyền mới, từ đó có thể đưa ra các biện pháp phòng ngừa kịp thời. Sự hợp tác giữa các nhà khoa học và cơ quan y tế là rất quan trọng trong việc kiểm soát dịch bệnh.

5.2. Đề Xuất Các Giải Pháp Phòng Ngừa Hiệu Quả

Cần phát triển các vaccine tái tổ hợp và các biện pháp điều trị mới để đối phó với virus cúm A/H5N1. Việc nâng cao nhận thức cộng đồng về phòng ngừa dịch bệnh cũng là một yếu tố quan trọng trong việc kiểm soát sự lây lan của virus.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Virus cúm A/H5N1 phân lập từ các vụ dịch bùng phát tại châu Á từ năm 2003 đến nay là tác nhân gây bệnh truyền nhiễm nguy hiểm hàng đầu ở gia cầm và có khả năng vượt rào cản loài để xâm nhiễm sang người với tỷ lệ tử vong đặc biệt cao (xấp xỉ 60%). Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), từ năm 2003 đến tháng 4 năm 2013, toàn cầu ghi nhận 623 ca nhiễm H5N1 trên người với 372 trường hợp tử vong tại 15 quốc gia. Việt Nam nằm trong nhóm ba quốc gia có số ca mắc và tử vong cao nhất thế giới (124 ca mắc, 62 ca tử vong tính đến tháng 4 năm 2013) và được định vị là "trung tâm dịch tễ biến đổi của cúm A/H5N1 cần quan tâm giám sát".

Khoảng trống nghiên cứu (research gap) lớn trong dịch tễ học phân tử lúc bấy giờ là phần lớn các công trình tập trung chủ yếu vào hai phân đoạn gen mã hóa kháng nguyên bề mặt Hemagglutinin (HA) và Neuraminidase (NA), trong khi ba phân đoạn gen nội vi cốt lõi mã hóa phức hợp polymerase gồm PB2 (Polymerase Basic 2), PB1 (Polymerase Basic 1) và PA (Polymerase Acidic) – những yếu tố quyết định tốc độ sao chép, hoạt tính enzyme không có cơ chế sửa sai (proof-reading), tính thích ứng nhiệt độ và độc lực vượt rào cản loài – chưa được phân tích toàn diện, có hệ thống ở cấp độ toàn bộ khung đọc mở (Open Reading Frame - ORF) trên các biến chủng lưu hành đương nhiễm tại Việt Nam giai đoạn 2007–2011.

Luận án tiến sĩ y học của nghiên cứu sinh Nguyễn Mạnh Kiên (chuyên ngành Hóa sinh Y học, mã số 62 72 01 12, thực hiện tại Trường Đại học Y Hà Nội dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Đặng Thị Ngọc Dung và PGS.TS. Lê Thanh Hòa) đã giải quyết trọn vẹn khoảng trống này thông qua hai câu hỏi nghiên cứu trọng tâm:

1. Đặc điểm cấu trúc di truyền, tỷ lệ tương đồng nucleotide/amino acid và các đột biến điểm đặc hiệu trên toàn bộ trình tự ba gen PB2, PB1, PA của các biến chủng cúm A/H5N1 phân lập tại Việt Nam giai đoạn 2007–2011 biến đổi như thế nào so với các chủng chuẩn quốc tế?
2. Mối quan hệ phả hệ nguồn gốc tiến hóa và cấu trúc tổ hợp kiểu gen (genotype) của phức hợp polymerase ở các biến chủng này phản ánh bức tranh dịch tễ học phân tử tái tổ hợp tại thực địa ra sao?

Hai giả thuyết nghiên cứu được xác lập: (H1) Các biến chủng H5N1 đương nhiễm tại Việt Nam giai đoạn 2007–2011 mang các biến đổi nucleotide và amino acid đặc trưng trong phức hợp polymerase phản ánh tính ổn định thích nghi trên gia cầm nhưng đã xuất hiện các dấu hiệu đột biến thích ứng trên động vật có vú; (H2) Nguồn gốc phả hệ của PB2, PB1 và PA phản ánh các sự kiện tái tổ hợp nội vùng phức tạp, tạo nên sự phân nhánh kiểu gen đa dạng (Genotype Z, V, G) tương ứng với các phân nhóm kháng nguyên Clade 1.1, Clade 2.3.4 và Clade 2.3.2.1.

Khung lý thuyết của nghiên cứu tích hợp: Lý thuyết tiến hóa phân tử và đồng hồ phân tử (Molecular Clock Theory - Kimura, 1968), Thuyết tái tổ hợp phân đoạn bộ gen Orthomyxoviridae (Genomic Reassortment Paradigm - Webster et al., 1992) và Mô hình tương tác phức hợp phiên mã - sao chép RNP (Ribonucleoprotein Complex Transcription-Replication Model - Taubenberger et al., 2005). Đối tượng nghiên cứu trực tiếp gồm 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 đại diện phân lập từ gia cầm mắc bệnh tại 4 tỉnh (Quảng Trị, Tiền Giang, Đồng Tháp, Nghệ An) thuộc 3 clade H5 chủ đạo (Clade 1.1, Clade 2.3.4, Clade 2.3.2.1), kết hợp bộ dữ liệu đối sánh quốc tế gồm 50 chủng tham chiếu đại diện cho 10 clade và 12 kiểu gen tái tổ hợp toàn cầu.

Literature Review và Positioning

Nghiên cứu về cơ chế thích nghi vật chủ và độc lực của virus cúm A khởi sắc từ công trình giải mã bộ gen chủng đại dịch H1N1/1918 của Taubenberger và cộng sự (2005). Các tác giả đã chứng minh phức hợp polymerase đóng vai trò sống còn trong việc cho phép virus cúm gia cầm nhân lên hiệu quả trong tế bào đường hô hấp người, xác định 10 vị trí amino acid đặc thù phân biệt virus người và gia cầm: 5 vị trí trên PB2 (A199S, L475M, D567N, E627K, K702R), 1 vị trí trên PB1 (N/S/T375S) và 4 vị trí trên PA (D55N, V100A, E382D, T552S).

Tranh luận học thuật quốc tế tập trung vào cơ chế thích nghi nhiệt độ và thụ thể nhân tế bào:

• Luồng quan điểm thứ nhất (Subbarao et al., 1993; Massin et al., 2001; Hatta et al., 2001) nhấn mạnh đột biến acid glutamic chuyển thành lysine tại vị trí 627 (E627K) trên protein PB2 là "công tắc phân tử" đơn lẻ quyết định khả năng nhân lên của virus ở nhiệt độ đường hô hấp trên của động vật có vú (33°C–35°C) so với đường tiêu hóa gia cầm (41°C). Đột biến này giúp PB2 tương tác tối ưu với thụ thể Importin-α của tế bào người (Gabriel et al., 2008).
• Luồng quan điểm thứ hai (Gabriel et al., 2005; Bussey et al., 2010; Mehle & Doudna, 2009) chỉ ra rằng sự thích nghi không chỉ phụ thuộc duy nhất vào E627K mà còn được bù trừ hoặc khuếch đại bởi các đột biến thay thế như D701N (tương tác Importin-α1/α7), T271A, E158G trên PB2 hoặc T552S trên PA. Điển hình là chủng đại dịch A/H1N1/2009 lưu hành trên người vẫn bảo tồn E627 nhưng bù đắp bằng đột biến T271A và SR polymorphism tại vùng 590/591 (Bussey et al., 2010).

Đối với protein phụ trợ PB1-F2 (mã hóa từ khung đọc mở lồng trong gen PB1), Chen et al. (2001) và Zamarin et al. (2006) phát hiện chức năng gây chết tế bào theo chương trình (apoptosis) thông qua cơ chế phá hủy điện thế màng ty thể. Conenello et al. (2007) xác lập đột biến N66S trên PB1-F2 là chỉ dấu độc lực cực cao ở chủng đại dịch 1918 và chủng H5N1 Hồng Kông 1997. Ngược lại, Wise et al. (2009, 2011) công bố sự tồn tại của polypeptide sORF2 và protein PB1-N40 (khuyết 39 amino acid đầu N-tận) có vai trò điều hòa đối kháng trong chu kỳ nhân lên của virus, mở ra một phân lớp chức năng chưa từng được khảo sát trên các chủng H5N1 tự nhiên.

Tại thực địa Đông Nam Á và quốc tế, các công trình tại Trung Quốc (Guan et al., 2004; Chen et al., 2006; Li et al., 2010) và Indonesia (Smith et al., 2006) đã phân loại 12 kiểu gen tái tổ hợp (A–Z) và ghi nhận sự trỗi dậy của Genotype Z và V. Tại Việt Nam, nghiên cứu của Nguyễn Thị Bích Nga và Lê Thanh Hòa (2012), Wan et al. (2008), Nguyen et al. (2005) đã ghi nhận sự thay thế kế tiếp giữa các clade kháng nguyên H5 (Clade 1 giai đoạn 2003–2005 chuyển sang Clade 2.3.4 giai đoạn 2007–2008 và Clade 2.3.2.1/Clade 1.1 giai đoạn 2009–2011).

Luận án này định vị tại điểm giao thoa giữa hóa sinh cấu trúc và dịch tễ học phân tử: lần đầu tiên cung cấp dữ liệu chuỗi nucleotide và amino acid hoàn chỉnh cho cả ba gen polymerase của 6 chủng H5N1 đại diện cho các làn sóng dịch 2007–2011 tại Việt Nam, đặt trong tương quan phân tích cấu trúc không gian 3D của phức hợp enzyme và phân tích phả hệ đa tầng với các chủng đại diện từ Trung Quốc (A/Goose/Guangdong/1/1996, A/bar-headed goose/Qinghai/3/2005, A/Hubei/1/2010), Campuchia (A/Cambodia/U0417030/2010), Thái Lan và Indonesia.

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Nghiên cứu đóng góp mở rộng Thuyết tiến hóa thích ứng của virus cúm A (Taubenberger et al., 2005; Webster et al., 1992) qua các phát hiện cụ thể:

1. Làm sáng tỏ tính bảo tồn chức năng và rào cản loài của bộ máy sao chép: Xác nhận ở cấp độ phân tử rằng các biến chủng H5N1 đương nhiễm tại Việt Nam (thuộc Clade 1.1, 2.3.4 và 2.3.2.1) vẫn duy trì kiểu hình "thích nghi tối ưu trên gia cầm" với sự bảo tồn nghiêm ngặt của E627 và D701 trên PB2, T552 trên PA. Điều này lý giải tại sao virus H5N1 tại Việt Nam chưa hình thành khả năng lây truyền trực tiếp và bền vững từ người sang người, mặc dù tỷ lệ tử vong khi xâm nhiễm ngẫu nhiên là rất cao.
2. Bổ sung dữ liệu cấu trúc cho mô hình tương tác PB1-F2 / PB1-N40 (Wise et al., 2009): Chứng minh rằng hầu hết các chủng phân lập đều duy trì khung đọc mở PB1-F2 nguyên vẹn dài 90 amino acid mang serine tại vị trí 66 (S66), đồng thời bảo tồn nguyên vẹn điểm khởi đầu dịch mã AUG5 của PB1-N40, củng cố lý thuyết về cơ chế điều biến độc lực và ức chế đáp ứng miễn dịch tự nhiên thông qua con đường apoptotic ty thể.

+-------------------------------------------------------------------------+
|                  KHUNG PHÂN TÍCH TỔNG HỢP HỆ GEN POLYMERASE             |
+-------------------------------------------------------------------------+
|  [Đầu vào: Mẫu bệnh phẩm gia cầm 2007-2011 (Nghệ An, Đ.Tháp, T.Giang, Q.Trị)]  |
|           [Tách chiết RNA -> RT-PCR (Mồi 468F + Cặp mồi đặc hiệu)]      |
|      [Tách dòng plasmid pCR2.1 -> Giải trình tự Sanger ABI 3100 Avant]   |
|       [Phân tích Phả hệ & Phân định Kiểu gen Tái tổ hợp (MEGA / 56 chủng)] |
|  [Đánh giá Độc lực, Rào cản Loài & Xu hướng Dịch tễ học Phân tử tại VN] |
+-------------------------------------------------------------------------+

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của luận án kết hợp ba trục lý thuyết sinh học phân tử:

• Trục 1: Tương tác dị lập thể nội phức hợp (Intra-complex Allosteric Interactions) giữa 3 tiểu phần enzyme: miền đầu C-tận của PB2 liên kết với đầu N-tận của PB1; miền đầu N-tận của PB1 (chứa motif xoắn α gồm 12 amino acid đầu tiên) gắn kết chặt chẽ với miền C-tận của PA (các amino acid K328, K539, R566, K574).
• Trục 2: Đa dạng hóa phiên mã từ một phân đoạn đơn (Gen-in-a-gene transcription strategy): phân tích đồng thời 3 protein từ phân đoạn 2 (PB1, PB1-F2, PB1-N40) dưới sự kiểm soát của 5 codon khởi đầu (AUG1 đến AUG5).
• Trục 3: Động lực học phôi thai phả hệ (Phylogenetic Dynamics): đánh giá sự tương thích giữa cây tiến hóa từng gen polymerase đơn lẻ với cây tiến hóa HA/NA để xác định chính xác các genotype tái tổ hợp tự nhiên.

Điều kiện biên (boundary conditions): Nghiên cứu áp dụng trên các chủng virus cúm A thể độc lực cao (HPAI) phân lập trên thủy cầm và gia cầm cạn tại Việt Nam, tập trung vào cấu trúc enzyme polymerase trong mối liên hệ với các mẫu lâm sàng trên người và chim hoang dã giai đoạn 1996–2012.

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu theo triết học thực chứng (positivism), sử dụng phương pháp luận sinh học phân tử thực nghiệm và tin sinh học đối sánh chuẩn mực. Thiết kế đa tầng tích hợp từ thu thập bệnh phẩm lâm sàng, sinh học thực nghiệm (ướt - wet lab) đến phân tích dữ liệu phân tử máy tính (khô - dry lab).

Mẫu nghiên cứu gồm 6 chủng virus cúm A/H5N1 sống phân lập từ dịch bài tiết niêm mạc mũi - họng - khí phế quản của gia cầm chết bệnh tại 4 địa phương trọng điểm dịch tễ của Việt Nam:

1. DkQT801-2011: A/Duck/VietNam/QT801/2011(H5N1) – Vịt, Quảng Trị, 2011 (Clade 2.3.2.1)
2. DkQT802-2011: A/Duck/VietNam/QT802/2011(H5N1) – Vịt, Quảng Trị, 2011 (Clade 2.3.2.1)
3. DkTG926-2009: A/Duck/VietNam/TG926/2009(H5N1) – Vịt, Tiền Giang, 2009 (Clade 1.1)
4. CkDT382-2008: A/Chicken/VietNam/DT382/2008(H5N1) – Gà, Đồng Tháp, 2008 (Clade 1.1)
5. DkNA72-2007: A/Duck/VietNam/NA72/2007(H5N1) – Vịt, Nghệ An, 2007 (Clade 2.3.4)
6. DkNA114-2007: A/Duck/VietNam/NA114/2007(H5N1) – Vịt, Nghệ An, 2007 (Clade 2.3.4)

Bộ mẫu đối sánh gồm 19 chủng H5N1 quốc tế và Việt Nam đại diện cho các clade 1, 1.1, 2.1, 2.3 và 31 chủng bổ sung đại diện cho 5 genotype (GD, Z+, Z, V, G), nâng tổng số chủng phân tích phả hệ lên 56 chủng.

Quy trình nghiên cứu rigorous

Quy trình thực nghiệm được chuẩn hóa nghiêm ngặt qua các bước:

1. Tách chiết RNA tổng số: Sử dụng bộ sinh phẩm QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN Inc., USA) trên mẫu dịch bài tiết đường hô hấp gia cầm theo hướng dẫn nhà sản xuất, bảo quản tại -80°C.
2. Tổng hợp cDNA hệ gen: Sử dụng Maxima Universal First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, USA). Để khắc phục tính biến dị cao ở các đầu mút phân đoạn, tác giả thiết kế mồi chuyên biệt 468F (5'-AGCAAAAGCAGG-3') dài 12 nucleotide dựa trên trình tự bảo tồn 12–15 nucleotide ở đầu 3' và 5' của các phân đoạn gen polymerase, phối hợp cùng mồi Random Hexamer (5'-NpNpNpNpNpN-3') để tối đa hóa hiệu suất chuyển đổi toàn bộ 8 phân đoạn RNA sợi đơn âm (-)ssRNA thành cDNA sợi đôi.
3. Khuếch đại PCR đặc hiệu: Thiết kế các cặp mồi xuôi/ngược đặc hiệu thu nhận toàn bộ chiều dài gen:
   • Gen PB2 (~2,3 kb): Cặp mồi KPB2F (5'-AGCRAAAGCAGGTCAATTATATTCA-3') và KPB2R (5'-AGTAGAAACAAGGTCGTTTTTAAACTA-3').
   • Gen PB1 (~2,3 kb): Cặp mồi KPB1F (5'-GCRAAAGCAGGCAAACCATTTGAATG-3') và KPB1R (5'-AGTAGAAACAAGGCATTTTTTCATGAA-3').
   • Gen PA (~2,2 kb): Cặp mồi KPAF (5'-AGCRAAGCAGGTACTGATYCGAAATG-3') và KPAR (5'-AGTAGAAACAAGGTACTTTTTTGGACA-3').
   • Kiểm tra định danh H5 bằng cặp mồi H5F1 (5'-ACATACTGGAAAGGACACACAACG-3') và H5R1 (5'-GGCATACTAGAGTTTATCGCCC-3') cho sản phẩm ~1.0 kb.
4. Tách dòng phân tử (Cloning): Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng AccuPrep Gel Purification Kit (Bioneer, Hàn Quốc), ghép nối vào vector plasmid pCR2.1 bằng TA Cloning Kit (Invitrogen, Nhật Bản), biến nạp vào tế bào khả biến E. coli, chọn lọc khuẩn lạc trắng/xanh trên môi trường thạch LB chứa Kanamycin (50 µg/ml) và X-gal (40 µl nồng độ 20 mg/ml). Thể truyền tái tổ hợp được tách chiết bằng AccuPrep Plasmid Mini Extraction Kit (Bioneer) và kiểm tra kích thước đoạn chèn bằng enzyme cắt giới hạn EcoRI.
5. Giải trình tự Sanger: Sử dụng bộ hóa chất BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit trên máy giải trình tự mao quản tự động ABI 3100 Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA). Sử dụng mồi phổ thông M13F, M13R cùng hệ thống mồi nội bộ bổ sung (PB2FS, PB1FS, PB1F3, PB1R3, PAFF) để đọc chồng lấp (overlapping) 100% hai chiều các đoạn gen dài trên 2,2 kb.

Data và phân tích

Xử lý và phân tích dữ liệu chuỗi nucleotide và amino acid suy diễn:

• Ghép nối, kiểm tra tính toàn vẹn của khung đọc mở bằng phần mềm BioEdit v7.0 và GeneDoc v2.7.
• Căn chỉnh đa chuỗi (Multiple sequence alignment) bằng thuật toán ClustalW.
• Phân tích tương đồng tỷ lệ nucleotide và amino acid giữa 25 chủng (6 chủng nghiên cứu và 19 chủng đối chiếu).
• Xây dựng cây phả hệ nguồn gốc tiến hóa cho từng gen PB2, PB1, PA trên tập dữ liệu 56 chủng bằng phần mềm MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) sử dụng phương pháp Neighbor-Joining (NJ) kết hợp mô hình khoảng cách Kimura 2-parameter, kiểm định độ tin cậy nhánh bằng phân tích Bootstrap với 1.000 lần lặp lại.

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

1. Xác định chính xác độ dài và cấu trúc khung đọc mở hoàn chỉnh của phức hợp polymerase trên 6 biến chủng H5N1:

   • Phân đoạn gen PB2 có độ dài 2.341 bp, khung đọc mở 2.280 bp mã hóa protein PB2 gồm 759 amino acid.
   • Phân đoạn gen PB1 có độ dài 2.341 bp, khung đọc mở 2.274 bp mã hóa protein PB1 gồm 757 amino acid; đồng thời chứa khung đọc lồng PB1-F2 dài 273 bp (từ nucleotide 95 đến 367) mã hóa 90 amino acid và khung đọc mở PB1-N40 dài 2.151 bp (từ nucleotide 121 đến 2.274) mã hóa 717 amino acid.
   • Phân đoạn gen PA có độ dài 2.233 bp, khung đọc mở 2.151 bp mã hóa protein PA gồm 716 amino acid.

2. Tỷ lệ tương đồng phân tử cao nhưng có sự phân hóa theo clade dịch tễ:

   • Gen PB2 đạt độ tương đồng 96,2%–99,9% về nucleotide và 98,4%–100% về amino acid giữa 6 chủng nghiên cứu với các chủng tham chiếu.
   • Gen PB1 đạt độ tương đồng 95,7%–99,8% về nucleotide và 98,8%–99,9% về amino acid.
   • Gen PA đạt độ tương đồng 95,4%–99,7% về nucleotide và 97,9%–99,9% về amino acid.
   • Hai chủng Clade 2.3.2.1 phân lập năm 2011 (DkQT801-2011, DkQT802-2011) có sự sai khác nucleotide rõ rệt so với các chủng Clade 1.1 (CkDT382-2008, DkTG926-2009) và Clade 2.3.4 (DkNA72-2007, DkNA114-2007).

3. Bảo tồn các vị trí amino acid chỉ thị thích nghi gia cầm và độc lực cao:

   • Toàn bộ 6 biến chủng nghiên cứu đều bảo tồn acid glutamic tại vị trí 627 (E627) và acid aspartic tại vị trí 701 (D701) trên protein PB2. Không ghi nhận đột biến E627K hoặc D701N (vốn là dấu hiệu thích nghi trên người) trên các mẫu gia cầm này, chứng minh virus đang lưu hành ổn định trong quần thể chim/gia cầm.
   • Trên protein PB1-F2: Cả 6 chủng đều bảo tồn serine tại vị trí 66 (S66) – một đột biến độc lực cao đã được xác định trước đó, đồng thời giữ nguyên dạng chuỗi đầy đủ 90 amino acid mà không bị đột biến vô nghĩa (nonsense mutation) tạo bộ ba kết thúc sớm (như thường gặp ở các chủng cúm mùa người chỉ có 11 hoặc 57 amino acid).
   • Trên protein PA: Bảo tồn hoàn toàn threonine tại vị trí 552 (T552) đặc trưng cho virus cúm gia cầm và các gốc amino acid cấu trúc trung tâm liên kết PB1 (K328, K539, R566, K574).

4. Phát hiện các biến đổi amino acid phân nhóm đặc thù:

   • Ghi nhận các đột biến điểm dẫn đến thay đổi amino acid mới trên các chủng Clade 2.3.2.1 tại Quảng Trị (2011) so với các chủng Clade 1 phân lập giai đoạn 2003–2005, phản ánh áp lực chọn lọc phân tử và sự trôi dạt kháng nguyên/di truyền (genetic drift) liên tục của virus tại miền Trung Việt Nam.

5. Tái lập bản đồ phả hệ và kiểu gen tái tổ hợp (Genotype):

   • Phân tích phả hệ 56 chủng chỉ ra: Các chủng Clade 1.1 (CkDT382-2008, DkTG926-2009) có 3 gen PB2, PB1, PA thuộc kiểu gen tái tổ hợp Genotype Z.
   • Các chủng Clade 2.3.4 (DkNA72-2007, DkNA114-2007) có 3 gen polymerase thuộc kiểu gen Genotype V (nguồn gốc từ các chủng miền Nam Trung Quốc như A/Fujian/1/2005).
   • Các chủng Clade 2.3.2.1 (DkQT801-2011, DkQT802-2011) hình thành một nhánh phả hệ mới biệt lập, bắt nguồn từ dòng virus di cư Thanh Hải (Qinghai-like lineage) và virus Hubei/2010, đại diện cho làn sóng tái tổ hợp mới xâm nhập vào Việt Nam qua đường chim di cư và vận chuyển gia cầm xuyên biên giới.

Implications đa chiều

• Ý nghĩa lý thuyết: Củng cố mô hình tiến hóa theo dòng (lineage-specific evolution) của virus cúm A; chứng minh rằng bộ ba gen polymerase tiến hóa đồng bộ với phân đoạn kháng nguyên bề mặt HA/NA trong từng đợt dịch, nhưng có khả năng tái tổ hợp độc lập giữa các genotype Z, V và các biến chủng mới xâm nhập.
• Ý nghĩa phương pháp học: Chuẩn hóa thành công quy trình RT-PCR hai bước khuếch đại trọn vẹn các gen polymerase kích thước lớn (>2,3 kb) trực tiếp từ bệnh phẩm lâm sàng bằng hệ thống mồi đặc hiệu 468F, KPB2, KPB1, KPA, cho phép ứng dụng rộng rãi trong giám sát sinh học phân tử thường quy.
• Ý nghĩa thực tiễn & chính sách y tế: Cảnh báo cơ quan thú y và y tế dự phòng rằng mặc dù virus H5N1 giai đoạn 2007–2011 vẫn mang các chỉ dấu thích nghi gia cầm (E627), sự xuất hiện liên tục của các clade mới (như 2.3.2.1) mang độc lực cao trên gia cầm và khả năng tương thích phức hợp enzyme mở ra nguy cơ thường trực xuất hiện đột biến thích ứng trên người (như từng ghi nhận E627K ở các ca tử vong tại Việt Nam 2003–2005 và 2007–2008). Do đó, cần thay đổi chiến lược vaccine phòng bệnh cho đàn gia cầm tương thích với Clade 2.3.2.1 và tăng cường giám sát giải trình tự định kỳ các gen polymerase.

Limitations và Future Research

1. Giới hạn cỡ mẫu đại diện trực tiếp: Nghiên cứu thực hiện giải trình tự chuyên sâu trên 6 biến chủng H5N1 đại diện cho các năm 2007, 2008, 2009 và 2011. Mặc dù được mở rộng đối sánh với 50 chủng ngân hàng gen, một cỡ mẫu giải trình tự trực tiếp lớn hơn trên nhiều địa bàn sinh thái (vùng núi phía Bắc, Tây Nguyên, Đồng bằng sông Hồng) sẽ mang lại độ phân giải không gian cao hơn.
2. Giới hạn đánh giá chức năng in vitro và in vivo: Do hạn chế điều kiện phòng an toàn sinh học cấp 3 (BSL-3) tại thời điểm thực hiện, luận án tập trung vào phân tích hóa sinh phân tử và cấu trúc di truyền, chưa tiến hành tái tạo virus bằng di truyền ngược (reverse genetics) để đo lường định lượng hoạt tính polymerase (minigenome assay) hoặc thử nghiệm độc lực trực tiếp trên động vật thí nghiệm (chuột, chồn ferrets).
3. Hướng nghiên cứu tương lai:
   • Khảo sát chức năng sinh học của protein PB1-N40 trên các dòng tế bào động vật có vú nhằm làm rõ cơ chế điều hòa sao chép của virus H5N1.
   • Thiết lập hệ thống giám sát phân tử thời gian thực (real-time NGS) theo dõi đồng thời các đột biến E627K, D701N, N66S và T552S trên các ổ dịch gia cầm giáp biên giới.
   • Nghiên cứu cấu trúc tinh thể học phức hợp trimer PB2-PB1-PA của các biến chủng Clade 2.3.2.1 để phục vụ thiết kế thuốc kháng virus nhắm trúng đích vị trí gắn mũ (cap-binding domain) và vị trí endonuclease.

Tác động và ảnh hưởng

• Tác động học thuật: Luận án cung cấp bộ dữ liệu chuỗi chuẩn độ dài đầy đủ của 3 gen PB2, PB1, PA cho Ngân hàng Gen quốc tế (GenBank), phục vụ cộng đồng nghiên cứu cúm toàn cầu trong việc phân tích mô hình tiến hóa của HPAI A/H5N1 tại Đông Nam Á.
• Chuyển giao ngành Thú y & Y tế dự phòng: Cung cấp bằng chứng khoa học phục vụ Cục Thú y (Bộ Nông nghiệp & PTNT) và Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương (Bộ Y tế) trong việc đánh giá hiệu lực của các chủng vaccine cúm gia cầm đang lưu hành, đề xuất cập nhật chủng giống vaccine phù hợp với Clade 2.3.2.1.
• Tác động xã hội & Quốc tế: Nằm trong khuôn khổ Nghị định thư hợp tác nghiên cứu Việt Nam - Thái Lan ("Nghiên cứu virus cúm A/H5N1 ở Việt Nam và Thái Lan: Dịch tễ phân tử, chẩn đoán và vắc-xin phòng chống"), luận án củng cố mạng lưới giám sát dịch bệnh truyền nhiễm xuyên biên giới tại tiểu vùng sông Mê Kông.

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh & Nhà khoa học trẻ: Tiếp cận quy trình kỹ thuật chuẩn về thiết kế mồi, RT-PCR phân đoạn lớn, tách dòng pCR2.1 và giải trình tự gen virus RNA kích thước lớn không có cơ chế sửa sai.
• Các nhà vi sinh học & Dịch tễ học phân tử: Sử dụng dữ liệu chuỗi và phân tích phả hệ của luận án làm hệ quy chiếu (baseline data) để đối chiếu với các biến chủng cúm mới nổi sau này (như H5N6, H5N8, H7N9).
• Đơn vị R&D Vaccine & Sinh phẩm chẩn đoán: Khai thác thông tin vùng bảo tồn và đột biến của phức hợp polymerase để phát triển các kit Real-time RT-PCR phát hiện nhanh các marker kháng thuốc hoặc marker tăng độc lực trên người.
• Cơ quan hoạch định chính sách phòng chống dịch bệnh: Có cơ sở dữ liệu xác thực để ban hành các quy định về an toàn sinh học chăn nuôi gia cầm và kịch bản ứng phó khẩn cấp khi xuất hiện biến chủng vượt rào cản loài.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của nghiên cứu là gì và đã mở rộng lý thuyết nào? Nghiên cứu đã mở rộng Thuyết thích nghi rào cản loài của phức hợp Polymerase virus cúm A (Subbarao et al., 1993; Taubenberger et al., 2005) bằng cách chứng minh rằng trên các biến chủng H5N1 đương nhiễm tại Việt Nam (2007–2011), sự biến đổi kháng nguyên bề mặt từ Clade 1 sang Clade 2.3.4 và Clade 2.3.2.1 đi kèm với sự tái tổ hợp các phân đoạn polymerase (Genotype Z sang Genotype V và dòng Qinghai-like) nhưng vẫn duy trì tính bảo tồn tuyệt đối của các amino acid đặc trưng gia cầm (E627, D701 trên PB2 và T552 trên PA). Điều này xác lập luận điểm: tính đa dạng kháng nguyên và độc lực trên gia cầm gia tăng không đồng nghĩa với việc virus đã hoàn tất thích ứng lây truyền trên người, mà rào cản sao chép ở mức độ polymerase vẫn là chốt chặn phân tử quan trọng nhất.

2. Đổi mới phương pháp luận của luận án so với các công trình trước đây thể hiện ở điểm nào? So với các nghiên cứu trước đây tại Việt Nam thường chỉ khuếch đại từng đoạn ngắn (partial sequencing) của gen HA/NA hoặc các vùng cục bộ mang tính chẩn đoán (Wan et al., 2008; Nguyen et al., 2005), luận án đã: (1) Phát triển chiến lược mồi kép 468F kết hợp Random Hexamer cho phép phiên mã ngược toàn vẹn toàn bộ 8 phân đoạn (-)ssRNA; (2) Thiết kế các cặp mồi chuyên biệt khuếch đại thành công 100% chiều dài các gen kích thước lớn (~2,3 kb) trong một phản ứng đơn lẻ; (3) Tách dòng vào vector pCR2.1 và giải trình tự 2 chiều phủ kín khung đọc mở, loại bỏ hoàn toàn hiện tượng sai số do đọc cụt hoặc lỗi polymerase của enzyme in vitro.

3. Phát hiện bất ngờ nhất từ dữ liệu thực nghiệm là gì? Phát hiện bất ngờ nhất là mặc dù hai chủng virus Clade 2.3.2.1 phân lập tại Quảng Trị năm 2011 (DkQT801-2011 và DkQT802-2011) gây chết hàng loạt ở thủy cầm với bệnh cảnh độc lực cực cao, phức hợp polymerase của chúng lại có nguồn gốc tiến hóa gắn liền với nhánh virus hoang dã vùng hồ Thanh Hải (Qinghai) và chủng xâm nhiễm người A/Hubei/1/2010 tại Trung Quốc, nhưng vẫn duy trì hoàn toàn amino acid S66 trên khung đọc mở PB1-F2 dài 90 aa và bảo tồn E627 trên PB2. Điều này chứng minh nguồn gen polymerase của virus độc lực cao xâm nhập vào Việt Nam theo con đường chim hoang dã di cư kết hợp tái tổ hợp tại chỗ, tạo nên các tổ hợp gen nguy hiểm tiềm tàng.

4. Luận án có cung cấp quy trình tái lập (replication protocol) chi tiết không? Có. Luận án cung cấp chi tiết toàn bộ điều kiện luân nhiệt, thành phần hóa chất, nồng độ đệm, chu trình PCR, trình tự chính xác của 17 đoạn mồi chuyên biệt (Bảng 2.4 trong tài liệu gốc), quy trình cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng EcoRI và quy trình giải trình tự BigDye Terminator v3.1 trên hệ thống ABI 3100 Avant. Bất kỳ phòng thí nghiệm sinh học phân tử đạt chuẩn an toàn sinh học nào cũng có thể tái lập chính xác quy trình nhân dòng và phân tích này.

5. Chương trình nghiên cứu 10 năm tiếp theo được định hình như thế nào từ kết quả luận án? Từ nền tảng của luận án, chương trình nghiên cứu 10 năm tiếp theo tập trung vào: (1) Mở rộng giải trình tự toàn bộ hệ gen (Whole Genome Sequencing - WGS) trên công nghệ Next-Generation Sequencing (NGS) cho tất cả các ổ dịch H5N1, H5N6, H5N8 tái bùng phát; (2) Đánh giá tác động phối hợp của các đột biến kép (như E627K kết hợp Q591K hoặc D701N) trên mô hình di truyền ngược; (3) Phát triển thuốc kháng virus thế hệ mới ức chế tiểu phần endonuclease của PA dựa trên dữ liệu cấu trúc các chủng lưu hành tại Việt Nam.

Kết luận

1. Đã phân lập, khuếch đại và giải trình tự thành công toàn bộ khung đọc mở hoàn chỉnh của 3 gen PB2 (2.341 bp / 759 aa), PB1 (2.341 bp / 757 aa; bao gồm PB1-F2 90 aa và PB1-N40 717 aa) và PA (2.233 bp / 716 aa) từ 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 đại diện cho các làn sóng dịch 2007–2011 tại Việt Nam.
2. Dữ liệu phân tích tỷ lệ tương đồng khẳng định tính thống nhất cao về nucleotide (95,4%–99,9%) và amino acid (97,9%–100%) giữa các chủng nghiên cứu với các chủng H5N1 quốc tế, đồng thời chỉ ra sự phân nhánh phân tử rõ rệt tương ứng giữa các Clade 1.1, Clade 2.3.4 và Clade 2.3.2.1.
3. Xác nhận sự bảo tồn nghiêm ngặt của các amino acid chỉ thị thích nghi gia cầm gồm E627, D701 trên protein PB2 và T552 trên protein PA, giải thích cơ sở phân tử của việc virus H5N1 tại Việt Nam giai đoạn này chưa thích nghi để lây truyền từ người sang người.
4. Phát hiện sự bảo tồn của chỉ dấu độc lực cao S66 trên protein PB1-F2 nguyên vẹn (90 amino acid) ở tất cả các biến chủng nghiên cứu, lý giải nguyên nhân duy trì độc lực nghiêm trọng trên gia cầm mắc bệnh.
5. Chứng minh sự tồn tại của 3 kiểu gen tái tổ hợp polymerase chính tại Việt Nam: Genotype Z (Clade 1.1 tại miền Nam), Genotype V (Clade 2.3.4 tại miền Bắc/Trung) và dòng tái tổ hợp mới Qinghai/Hubei-like (Clade 2.3.2.1 tại miền Trung năm 2011).
6. Công trình mở ra hướng nghiên cứu sâu về tương tác protein - protein trong phức hợp polymerase virus cúm gia cầm và cung cấp cơ sở dữ liệu dịch tễ học phân tử vững chắc cho chiến lược kiểm soát, dự báo đại dịch cúm tại Việt Nam và khu vực Đông Nam Á.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ thuộc họ Orthomyxoviridae, gồm nhiều phân type (subtype) lƣu hành ở chim hoang dã, có khả năng biến đổi xâm nhiễm, lây truyền sang ngƣời và nhiều loài động vật, nguyên nhân gây ra các đại dịch cúm A ở ngƣời trong lịch sử. Hệ gen củ (RNA) sợi đơn âm, gồm 8 phân đoạn RNA riêng biệt là PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M và NS, lần lƣợt mã hóa tổng hợp 12 protein tƣơng ứng đƣợc biết cho đến nay, đó là PB2, PB1, PB1-N40, PB1-F2, PA, HA, NP, NA, M1, M2, NS1 và NS2. Các protein trên tham gia cấu tạo hạt virus và đảm bảo các chức năng xâm nhiễm, độc lực và thích nghi lây truyền gây bệnh của virus ở các loài vật chủ. Đặc biệt, phức hợp enzym polymerase của virus cúm A không có cơ chế “đọc-sửa” bản sao trong quá trình sao chép, tổng hợp các phân đoạn RNA hệ gen của hạt virus mới.

Đặc tính cấu trúc hệ gen và enzym polymerase giúp virus cúm A có khả năng đột biến cao, hình thành chủng virus mới thay đổi độc lực hoặc chuyển nhiễm, thích nghi lây truyền sang nhiề và ngƣời trong quá trình lƣu hành tự nhiên. Trong đó, các gen PB2, PB1 và PA mã hóa tổng hợp 3 protein PB2, PB1 và PA polymerase, là các đơn vị cấu tạo phức hợp enzym polymerase, có vai trò quyết định khả năng thích nghi nhân lên và lây truyền của virus ở cơ thể các loài vật chủ. Ngoài ra, gen PB1 còn chứa 2 khung đọc mở gen PB1-F2 và PB1-N40 mã hóa tổng hợp các protein tƣơng ứng, tham gia biểu hiện độc lực của virus cúm A ở cơ thể bị nhiễm. Từ năm 2003 đến nay, virus cúm A/H5N1 thể độc lực cao nguyên nhân gây ra dịch cúm gia cầm và gây bệnh có tỉ lệ tử vong cao ở ngƣời (khoảng 60%), lan truyền rộng rãi tới hơn 60 quốc gia trên thế giới.

Trong đó, Việt Nam là quốc gia có dịch cúm gia cầm A/H5N1 bùng phát vào năm 2003 và liên tục tái bùng phát nhiều đợt dịch ở gia cầm hàng năm tại các địa phƣơng, với hơn 62 ngƣời tử vong trong tổng số hơn 124 ngƣời đƣợc xác định nhiễm loại virus này. Các trƣờng hợp ngƣời nhiễm và tử vong bởi virus cúm A/H5N1, đƣợc xác định là do virus xâm nhiễm trực tiếp sang ngƣời thông qua tiếp xúc với gia cầm bệnh, chất thải ô nhiễm hoặc do sử dụng các sản phẩm chứa virus từ gia cầm bệnh. Việt Nam cùng với Indonesia và Hy Lạp, là các quốc gia có tỉ lệ ngƣời nhiễm và tử vong do virus cúm A/H5N1 cao nhất 2 trên thế giới, đƣợc xác định là vùng dịch tễ trọng điểm cần quan tâm giám sát, ngăn chặn, khống chế sự lây truyền của virus ở gia cầm và từ gia cầm sang ngƣời. Các chủng virus cúm A/H5N1 clade 1, 2 và 7 với sự hình thành nhiều nhánh clade thuộc 3 genotye Z, V và G, là các nhóm virus lƣu hành phổ biến gây dịch cúm A/H5N1 ở chim hoang dã, gia cầm và xâm nhiễm gây bệnh với tỉ lệ tử vong cao ở ngƣời, tại Việt Nam và nhiều quốc gia trên thế giới từ năm 2003 đến nay.

Gần đây, nhóm virus clade 1.1 và đặc biệt là nhóm virus clade 2.1 hình thành từ năm 2009, có sự thay đổi lớn về kháng nguyên H5, có độc lực cao ở gia cầm và ngƣời nhiễm so với các nhóm virus lƣu hành trƣớc đó, làm cho vấn đề phòng chống dịch cho gia cầm và ngăn ngừa virus xâm nhiễm ở ngƣời trở nên phức tạp hơn. Sự biến đổi của các gen PB2, PB1 và PA là cơ sở giúp virus thích nghi nhân lên trong tế bào cảm thụ, yếu tố chìa khóa quyết định quá trình lây truyền dễ dàng giữa ngƣời với ngƣời và gia tăng độc lực của virus ở cơ thể ngƣời, một trong các vấn đề đƣợc quan tâm nghiên cứu giám sát ở virus cúm A/H5N1 gây bệnh dịch ở gia cầm và ngƣời hiện nay. Bên cạnh đó, dữ liệu di truyền của các gen PB2, PB1 và PA cùng với các gen trong hệ gen virus cúm A/H5N1 đƣơng nhiễm, là cơ sở khoa học cho phép dự báo sớm diễn biến dịch tễ học virus ở mức độ phân tử, nghiên cứu phát triển vaccine tái tổ hợp và sử dụng vaccine phòng chống bệnh cúm A/H5N1 cho ngƣời và gia cầm trong tƣơng lai. Xuất phát từ cơ sở lí luận và thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu sự biến đổi di truyền các gen PB2, PB1 và PA polymerase của virus cúm A/H5N1 đƣơng nhiễm tại Việt Nam”.

Nhằm các mục tiêu: 1- Giải trình tự, so sánh biến đổi đặc tính di truyền, tƣơng đồng về nucleotide và amino acid các gen PB2, PB1, PA, của một số biến chủng virus cúm A/H5N1 đƣơng nhiễm tại Việt Nam từ năm 2007 – 2011 với các chủng A/H5N1 trên thế giới. 2- Tìm hiểu nguồn gốc phả hệ các gen nói trên của các biến chủng virus cúm A/H5N1 trong nghiên cứu với các chủng virus A/H5N1 của Việt Nam và thế giới. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VIRUS CÚM A Virus cúm A (influenza A virus) là nhóm virus thuộc họ Orthomyxoviridae, bộ Mononegavirales, còn gọi là virus cúm chim (avian influenza virus, AIV) hay virus cúm gia cầm. Vị trí phân loại của virus cúm A trong hệ thống phân loại cơ sở (Basic Taxonomy) là: Viruses; ssRNA negative-stranded viruses; Orthomyxoviridae; Influenzavirus A [1], [2], [3].

Nhóm virus cúm A gồm nhiều phân type (subtype), biểu hiện đặc tính kháng nguyên của hai protein là hemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA) gắn trên bề mặt vỏ capsid hạt virus, cho đáp ứng kháng thể khác nhau của cơ thể nhiễm với mỗi kháng nguyên này giữa các phân type virus. Cho đến nay, đã phát hiện có 16 phân type HA (kí hiệu từ H1 đến H16) và 9 phân type NA (từ N1 đến N9) của virus cúm A lƣu hành ở chim hoang dã. Sự tổ hợp của các phân type HA và NA, có thể dẫn đến sự hình thành hơn 144 phân type virus cúm A khác nhau lƣu hành trong tự nhiên. Trong đó, 3 phân type virus cúm A/H1N1, A/H2N2 và A/H3N2, đã có sự biến đổi hình thành các chủng virus thích nghi lây truyền dễ dàng trong quần thể gây ra các đại dịch cúm A ở ngƣời trong lịch sử [1], [2], [3], [4], [5], [6].

Đặc trƣng virus cúm A là kí sinh nội bào bắt buộc, cấu tạo hạt virus đơn giản với hệ gen là phân tử RNA sợi đơn âm, gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt có khả năng tự nhân lên trong nhân của tế bào nhiễm. Bên cạnh đó, phức hợp enzym polymerase của virus cúm A thuộc nhóm enzym RNA phụ thuộc RNA type II, không có cơ chế đọc-sửa bản sao, tạo nên khả năng đột biến cao trong hệ gen, qua quá trình lây truyền và lƣu hành gây bệnh của virus ở các loài vật chủ [1], [2], [6]. Cấu tạo chung của virus cúm A Virus cúm A tồn tại ở dạng các hạt virus (virion) hình cầu hoặc hình khối đa diện đôi khi có dạng hình sợi, đƣờng kính 80 – 120 nano mét (nm), khối lƣợng phân tử khoảng 250 triệu dalton (Da). Hạt virus cúm A có cấu tạo đơn giản, bao gồm vỏ ngoài (envelope), capsid và lõi là vật chất di truyền (hệ gen) của virus [1], [7].

+ Vỏ capsid có chức năng bảo vệ vật chất di truyền của virus cúm A, gồm hàng trăm đơn vị cấu trúc gọi là capsomer. 4 + Lớp vỏ ngoài (envelope) có bản chất là lipoprotein có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm, mặt ngoài gắn các protein bề mặt đặc hiệu của virus và mặt trong đƣợc lót bởi một lớp màng đệm là protein M1. - Các protein bề mặt của virus cúm A có bản chất là glycoprotein gồm HA, NA và M2, đƣợc gắn nhƣ những gai mấu nhô ra mặt ngoài vỏ capsid của hạt virus. Có khoảng 500 gai mấu phân bố trên mặt ngoài vỏ capsid của một hạt virus, mỗi gai mấu dài khoảng 10 – 14 nm và có đƣờng kính khoảng 4 – 6 nm.

Tỉ lệ phân bố khoảng 4 – 5 phân tử protein HA trên 1 cụm protein NA (Hình 1. Mô hình và ảnh chụp các tiểu phần virus cúm A (xem [8]) Ghi chú: (A): Mô hình cấu tạo virus cúm A; (B): Các hạt virus cúm A chụp dƣới kính hiển vi điện tử 4. - Hai protein HA và NA gắn trên bề mặt vỏ capsid, có vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm, giải phóng hạt virus cúm A mới ở tế bào cảm thụ và là hai kháng nguyên chủ yếu cho đáp ứng miễn dịch của cơ thể vật chủ chống lại virus, cơ sở sản xuất vaccine phòng và chống dịch cúm A hiện nay [1], [2], [3]. - Hệ gen củ m A là ribonucleic acid sợi đơn âm (negative-single stranded RNA, viết tắt là (-)ssRNA) còn gọi là sợi đơn đối mã, nằm bên trong vỏ capsid của hạt virus [1], [2], [7].

Đặc điểm cấu tạo hệ gen của virus cúm A Virus cúm A có cấu trúc hệ gen gồm 8 phân đoạn RNA có khả năng tự sao chép độc lập, giúp cho virus dễ dàng nhân lên và tổng hợp các thành phần của hạt virus mới ở tế bào cảm thụ trong cơ thể vật chủ [1], [2], [9]. - Các phân đoạn RNA trong hệ gen của virus cúm A tồn tại ở dạng cấu trúc RNP (ribonucleoprotein) có tổng độ dài từ 10.000 base pair (bp), chứa 5 khoảng 13.500 bp thông tin di truyền tùy theo chủng virus. Hai đầu 5’- và 3’- của mỗi phân đoạn RNA có chứa các trình tự không mã hóa (untranslation region), gồm 12 – 15 nucleotide 5’-AGUAGAACAAGG và 3’-UCG(U/C)UUUCGUCC, có tính bảo tồn cao giữa các phân type virus cúm A. Mô hình cấu trúc hệ gen virus cúm A (xem [8]) Ghi chú: (A): Sơ đồ các phân đoạn PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M và NS trong hệ gen của virus cúm A.

(B): Mô hình cấu trúc một phân đoạn RNP của virus cúm A. - Mỗi phân đoạn RNA sợi đơn âm trong hệ gen của virus cúm A đƣợc bao bọc bởi các phân tử nucleoprotein (NP) tạo thành phân đoạn RNP tƣơng ứng, có cấu trúc xoắn đối xứng (α helix) dài 50 – 100 nm, đƣờng kính 9 – 10 nm. Các phân tử NP liên kết với nhau qua cầu nối peptide và tạo thành vòm (loop) ở giới hạn cuối mỗi phân đoạn RNP, đầu tận cùng 3’- và 5’- gắn với phức hợp enzym polymerase, gồm 3 protein dƣới đơn vị PB2, PB1 và PA polymerase, tạo thành một phức hệ tự sao chép độc lập trong quá trình nhân lên của virus ở tế bào nhiễm (Hình 1.