Nghiên cứu thiết kế vector baculovirus mang gen HA của virus cúm A/H5N1

Nghiên cứu thiết kế vector baculovirus mang gen HA của virus cúm A H5N1 nhằm phát triển vaccine thế hệ mới bằng công nghệ virus like particle.

• Tác giả: Đào Thị Như Hoa
• Người hướng dẫn: TS. Đỗ Ngọc Quyền
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu thiết kế vector baculovirus mang gen HA của virus cúm A/H5N1
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2012
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về virus cúm
• 1.2. Đặc điểm hình thái, cấu trúc của virus cúm
• 1.3. Đặc điểm các phân đoạn gen của virus
• 1.4. Các kháng nguyên quan trọng của virus cúm
• 1.5. Tình hình dịch bệnh H5N1
• 1.6. Vaccine phòng chống cúm
• 1.6.1. Đại cương về vaccine
• 1.6.2. Vaccine truyền thống
• 1.6.3. Vaccine thế hệ mới
• 1.6.3.1. Hạt giả virus - VLPs
• 1.6.3.2. Phương pháp tạo VLPs
• 1.6.3.3. Các hệ thống biểu hiện tạo VLPs
• 1.6.3.4. Cơ chế tạo đáp ứng miễn dịch của VLPs
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Vector tách dòng
• 2.3. Vector biểu hiện trong tế bào côn trùng
• 2.4. Hóa chất và sinh phẩm
• 2.5. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5.1. Tách chiết RNA tổng số
• 2.5.2. Kiểm tra RNA bằng quang phổ kế
• 2.5.3. Thiết kế hộp gen HA của virus cúm A/H5N1
• 2.5.4. Thiết kế các vector trung gian baculovirus mang hộp gen HA
• 2.5.5. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E
• 2.5.6. Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn E
• 2.5.7. Kiểm tra DNA plasmid bằng enzym giới hạn
• 2.5.8. Thu đoạn DNA từ gel agarose
• 2.5.9. Chọn lọc các dòng plasmid pBluBac4.5/V5-His-TOPO mang hộp gen HA
• 2.5.10. Chuẩn bị tế bào Sf9 cho quá trình đồng chuyển nạp
• 2.5.11. Tách chiết DNA tổng số từ baculovirus tái tổ hợp
• 2.5.12. Kiểm tra sự có mặt gen HA trong tế bào côn trùng Sf9 bằng PCR
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Thiết kế DNA bộ khung của baculovirus tái tổ hợp mang hộp gen HA
• 3.2. Thiết kế hộp gen HA
• 3.3. Tách dòng hộp gen HA vào vector PCR 2
• 3.4. Thiết kế vector trung gian baculovirus mang hộp gen HA
• 3.5. Nuôi cấy và bảo quản tế bào côn trùng Spodoptera frugiperda (Sf9)
• 3.6. Đồng chuyển nạp tạo baculovirus tái tổ hợp mang hộp gen H5
• 3.7. Kiểm tra sự có mặt của gen HA trong virus tái tổ hợp bằng phương pháp PCR
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Virus Cúm A H5N1 và Gen HA Nghiên cứu mới

Virus cúm A/H5N1 là một mối đe dọa lớn đối với sức khỏe cộng đồng toàn cầu. Theo WHO, từ 2003-2012, có 610 ca mắc và 360 ca tử vong do cúm gia cầm. Điều nguy hiểm là virus này liên tục biến đổi, làm tăng khả năng lây nhiễm và độc lực. Phương pháp hiệu quả nhất để phòng chống là tiêm vaccine. Các vaccine cúm A/H5N1 hiện tại sản xuất trên trứng gà có phôi, có nhiều hạn chế như thời gian sản xuất lâu, hiệu suất thấp, chi phí cao. Công nghệ virus-like particles (VLPs) là một hướng nghiên cứu mới đầy triển vọng. Vaccine VLPs cúm gia cầm tạo đáp ứng miễn dịch mạnh hơn và kéo dài hơn so với vaccine truyền thống. Việt Nam là một trong hai quốc gia chịu tổn thất lớn nhất do cúm gia cầm, nhu cầu vaccine là rất lớn và cấp thiết. Nghiên cứu này tập trung vào thiết kế vector baculovirus mang gen HA của virus cúm A/H5N1 để phát triển vaccine thế hệ mới bằng công nghệ VLP.

1.1. Đặc điểm hình thái và cấu trúc của virus cúm

Bệnh cúm là bệnh của loài chim và động vật có vú do virus RNA thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra. Virus cúm A có cấu tạo hình cầu hoặc hình khối đa diện, đường kính 80 - 120 nm. Hệ gen virus cúm A là RNA sợi đơn âm (-) ssRNA, gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt, mã hóa cho 11 protein khác nhau. Bao bọc hạt virus là một lớp vỏ lipid kép có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm. Bề mặt ngoài của vỏ được bao phủ bởi các glycoprotein phân bố dày đặc. Virus cúm có hai loại protein kháng nguyên quan trọng là haemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA). Theo [4, 6], các nhóm virus khác nhau bởi kháng nguyên bề mặt capsid, ở virus cúm A và B là Hem agglutinin, ở virus cúm c là Hemagglutinin Esterase Fusion, và ở Thogotovirus là Glycoprotein.

1.2. Vai trò của gen HA trong quá trình lây nhiễm virus

Gen HA mã hóa protein HA, kháng nguyên bề mặt chủ yếu của virus cúm. HA đóng vai trò gắn virus vào thụ thể tế bào vật chủ, hòa tan màng tế bào, giải phóng RNA hệ gen để thực hiện quá trình nhân lên trong tế bào cảm nhiễm. Có tới 400 phân tử HA trên bề mặt capsid của virus. Mỗi phân tử có dạng hình trụ, dài khoảng 130 A°, cấu tạo gồm ba đom phân. Tiểu phần HA2 có dạng sợi, đóng vai trò gắn kháng nguyên vào màng virus. Phần đầu tự do hình chỏm cầu được tạo bởi tiểu đơn vị H A I. Tiểu phần này có chứa những thụ thể đặc hiệu, đóng vai trò gắn virus vào màng tế bào chủ trong quá trình xâm nhiễm.

II. Thách Thức Sản Xuất Vaccine Cúm A H5N1 Truyền Thống

Các vaccine cúm A/H5N1 truyền thống sản xuất trên trứng gà có phôi gặp nhiều hạn chế. Thời gian sản xuất kéo dài, hiệu suất thấp, và chi phí cao là những vấn đề lớn. Đặc biệt, trong trường hợp đại dịch xảy ra, phương pháp này không thể đáp ứng đủ nhu cầu. Ngoài ra, sự biến đổi liên tục của virus cúm đòi hỏi phải cập nhật vaccine thường xuyên. Các chủng virus mới có thể kháng lại vaccine hiện tại, làm giảm hiệu quả phòng ngừa. Do đó, cần có những phương pháp sản xuất vaccine nhanh chóng, hiệu quả và linh hoạt hơn. Công nghệ vector baculovirus và VLPs hứa hẹn giải quyết những thách thức này, cung cấp một giải pháp thay thế tiềm năng cho vaccine truyền thống.

2.1. Hạn chế của vaccine cúm sản xuất trên trứng gà

Vaccine cúm sản xuất trên trứng gà có phôi đòi hỏi thời gian sản xuất lâu, thường mất vài tháng để sản xuất một lô vaccine. Hiệu suất sản xuất cũng thấp, không đáp ứng đủ nhu cầu trong trường hợp đại dịch. Chi phí sản xuất cao do quy trình phức tạp và yêu cầu kỹ thuật cao. Ngoài ra, virus cúm có thể biến đổi trong quá trình nhân lên trong trứng gà, làm giảm hiệu quả của vaccine. Theo Đào Thị Như Hoa, việc sản xuất vaccine cúm A/H5N1 truyền thống gặp nhiều khó khăn trong việc đáp ứng nhu cầu thực tế.

2.2. Sự biến đổi của virus cúm và ảnh hưởng đến vaccine

Virus cúm liên tục biến đổi do đột biến và tái tổ hợp gen. Sự biến đổi này có thể làm thay đổi kháng nguyên bề mặt của virus, khiến vaccine hiện tại không còn hiệu quả. Các chủng virus mới có thể kháng lại kháng thể tạo ra bởi vaccine, làm giảm khả năng bảo vệ. Do đó, cần phải cập nhật vaccine thường xuyên để đối phó với sự biến đổi của virus. Việc thiết kế vaccine phải linh hoạt để có thể nhanh chóng thích ứng với các chủng virus mới xuất hiện.

III. Thiết Kế Vector Baculovirus Mang Gen HA Phương Pháp Mới

Nghiên cứu này tập trung vào thiết kế vector baculovirus mang gen HA của virus cúm A/H5N1. Vector baculovirus là một hệ thống biểu hiện gen hiệu quả trong tế bào côn trùng. Hệ thống này cho phép sản xuất protein HA với số lượng lớn và chất lượng cao. Gen HA được chèn vào vector baculovirus và biểu hiện trong tế bào côn trùng. Protein HA được tạo ra sẽ tự lắp ráp thành VLPs, có cấu trúc tương tự virus cúm nhưng không có khả năng gây bệnh. VLPs này có thể được sử dụng làm vaccine để kích thích hệ miễn dịch tạo ra kháng thể chống lại virus cúm A/H5N1.

3.1. Ưu điểm của hệ thống biểu hiện baculovirus

Hệ thống biểu hiện baculovirus có nhiều ưu điểm so với các hệ thống biểu hiện khác. Baculovirus có khả năng biểu hiện protein với số lượng lớn, giúp tăng hiệu suất sản xuất protein HA. Hệ thống này cũng dễ dàng sử dụng và có thể biểu hiện protein phức tạp với cấu trúc chính xác. Ngoài ra, baculovirus an toàn và không gây bệnh cho người, làm cho nó trở thành một lựa chọn lý tưởng cho sản xuất vaccine.

3.2. Quy trình thiết kế vector baculovirus mang gen HA

Quy trình thiết kế vector baculovirus mang gen HA bao gồm các bước sau: (1) Tổng hợp gen HA từ virus cúm A/H5N1. (2) Chèn gen HA vào vector baculovirus. (3) Biến nạp vector baculovirus vào tế bào côn trùng. (4) Thu hoạch baculovirus tái tổ hợp. (5) Kiểm tra sự biểu hiện của protein HA trong tế bào côn trùng. (6) Tinh sạch protein HA và VLPs.

3.3. Biểu hiện gen HA và tạo VLPs trong tế bào côn trùng

Sau khi vector baculovirus mang gen HA được biến nạp vào tế bào côn trùng, gen HA sẽ được biểu hiện và protein HA sẽ được tạo ra. Protein HA sẽ tự lắp ráp thành VLPs trong tế bào côn trùng. VLPs này có cấu trúc tương tự virus cúm nhưng không có khả năng gây bệnh. VLPs có thể được thu hoạch và tinh sạch để sử dụng làm vaccine.

IV. Ứng Dụng VLPs trong Phát Triển Vaccine Cúm A H5N1 Thế Hệ Mới

Công nghệ VLPs là một hướng đi đầy hứa hẹn trong phát triển vaccine cúm A/H5N1 thế hệ mới. VLPs có khả năng kích thích hệ miễn dịch tạo ra đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ và kéo dài hơn so với vaccine truyền thống. VLPs cũng an toàn hơn vaccine sống giảm độc lực, vì chúng không có khả năng gây bệnh. Vaccine VLPs có thể được sản xuất nhanh chóng và linh hoạt, đáp ứng nhu cầu trong trường hợp đại dịch. Các nghiên cứu cho thấy vaccine VLPs cúm gia cầm tạo đáp ứng miễn dịch phòng vệ mạnh hơn, kéo dài hơn so với vaccine cùng loại sản xuất bằng công nghệ truyền thống.

4.1. Cơ chế tạo đáp ứng miễn dịch của VLPs

VLPs kích thích hệ miễn dịch bằng cách trình diện kháng nguyên HA cho các tế bào miễn dịch. VLPs được nhận diện bởi các tế bào đuôi gai và tế bào B, kích hoạt các tế bào này sản xuất kháng thể và tế bào T. Kháng thể sẽ trung hòa virus cúm, ngăn chặn sự xâm nhập và lây nhiễm. Tế bào T sẽ tiêu diệt các tế bào bị nhiễm virus cúm. Đáp ứng miễn dịch tạo ra bởi VLPs mạnh mẽ và kéo dài hơn so với vaccine truyền thống.

4.2. So sánh hiệu quả của vaccine VLPs và vaccine truyền thống

Vaccine VLPs có nhiều ưu điểm so với vaccine truyền thống. Vaccine VLPs tạo đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ và kéo dài hơn. Vaccine VLPs an toàn hơn vaccine sống giảm độc lực. Vaccine VLPs có thể được sản xuất nhanh chóng và linh hoạt. Các nghiên cứu cho thấy vaccine VLPs cúm gia cầm tạo đáp ứng miễn dịch phòng vệ mạnh hơn, kéo dài hơn so với vaccine cùng loại sản xuất bằng công nghệ truyền thống.

V. Kết Quả Nghiên Cứu và Thảo Luận về Thiết Kế Vector

Nghiên cứu đã thành công trong việc thiết kế vector baculovirus mang gen HA của virus cúm A/H5N1. Vector này có thể được sử dụng để sản xuất protein HA và VLPs trong tế bào côn trùng. Kết quả PCR cho thấy sự có mặt của gen HA trong virus tái tổ hợp. Các nghiên cứu tiếp theo sẽ tập trung vào việc tối ưu hóa quá trình biểu hiện protein HA và sản xuất VLPs với hiệu suất cao. VLPs này sẽ được sử dụng để thử nghiệm vaccine trên động vật và đánh giá khả năng bảo vệ chống lại virus cúm A/H5N1.

5.1. Thiết kế DNA bộ khung của baculovirus tái tổ hợp

Việc thiết kế DNA bộ khung của baculovirus tái tổ hợp mang gen HA là một bước quan trọng trong nghiên cứu. Bộ khung này phải đảm bảo sự biểu hiện hiệu quả của gen HA và sự ổn định của vector. Các yếu tố như promoter, terminator và trình tự tín hiệu phải được lựa chọn cẩn thận để tối ưu hóa quá trình biểu hiện gen.

5.2. Kiểm tra sự có mặt của gen HA trong virus tái tổ hợp

Việc kiểm tra sự có mặt của gen HA trong virus tái tổ hợp là cần thiết để đảm bảo rằng gen HA đã được chèn thành công vào vector baculovirus. Phương pháp PCR được sử dụng để khuếch đại gen HA từ virus tái tổ hợp. Kết quả PCR dương tính cho thấy sự có mặt của gen HA trong virus tái tổ hợp.

VI. Triển Vọng và Hướng Nghiên Cứu Vaccine Cúm A H5N1 Tương Lai

Nghiên cứu này mở ra triển vọng mới trong phát triển vaccine cúm A/H5N1 thế hệ mới. Công nghệ vector baculovirus và VLPs có tiềm năng thay thế vaccine truyền thống, cung cấp một giải pháp hiệu quả và an toàn hơn. Các nghiên cứu trong tương lai sẽ tập trung vào việc cải thiện hiệu quả của vaccine VLPs, phát triển vaccine đa giá có khả năng bảo vệ chống lại nhiều chủng virus cúm khác nhau. Ngoài ra, cần có những nghiên cứu về cơ chế đáp ứng miễn dịch của VLPs để tối ưu hóa thiết kế vaccine.

6.1. Phát triển vaccine đa giá chống lại nhiều chủng virus

Phát triển vaccine đa giá có khả năng bảo vệ chống lại nhiều chủng virus cúm khác nhau là một mục tiêu quan trọng trong nghiên cứu vaccine. Vaccine đa giá có thể giảm thiểu nhu cầu cập nhật vaccine thường xuyên và cung cấp sự bảo vệ rộng rãi hơn. Công nghệ VLPs có thể được sử dụng để sản xuất vaccine đa giá bằng cách kết hợp nhiều kháng nguyên HA từ các chủng virus khác nhau.

6.2. Nghiên cứu cơ chế đáp ứng miễn dịch của VLPs

Nghiên cứu cơ chế đáp ứng miễn dịch của VLPs là cần thiết để tối ưu hóa thiết kế vaccine. Hiểu rõ cách VLPs kích thích hệ miễn dịch sẽ giúp chúng ta thiết kế vaccine hiệu quả hơn. Các nghiên cứu có thể tập trung vào việc xác định các yếu tố ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch của VLPs, chẳng hạn như kích thước, cấu trúc và liều lượng VLPs.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Cúm gia cầm, đặc biệt là chủng virus cúm A/H5N1, đã và đang là mối đe dọa nghiêm trọng đối với sức khỏe cộng đồng toàn cầu. Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), từ năm 2003 đến 2012, đã ghi nhận khoảng 610 ca mắc cúm gia cầm với hơn 360 trường hợp tử vong, tỷ lệ tử vong lên đến hơn 60% trong số các ca nhiễm người. Virus cúm gia cầm có khả năng biến đổi liên tục, làm tăng nguy cơ lây nhiễm sang người và tăng độc lực, gây ra các đợt dịch bệnh nghiêm trọng. Việt Nam là một trong hai quốc gia chịu tổn thất nặng nề nhất do cúm gia cầm, với hàng trăm triệu gia súc, gia cầm bị chết hoặc tiêu hủy, gây thiệt hại lớn về kinh tế và ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng.

Mục tiêu nghiên cứu của luận văn là thiết kế vector baculovirus mang gen HA của virus cúm A/H5N1 nhằm phục vụ cho việc phát triển vaccine thế hệ mới sử dụng công nghệ Virus-Like Particles (VLPs). Nghiên cứu được thực hiện tại phòng Vi sinh vật học Phân tử, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, trong bối cảnh nhu cầu vaccine phòng cúm gia cầm tại Việt Nam là rất cấp thiết. Việc phát triển vaccine VLPs hứa hẹn khắc phục các hạn chế của vaccine truyền thống như thời gian sản xuất lâu, hiệu suất thấp và chi phí cao, đồng thời tạo ra đáp ứng miễn dịch mạnh và kéo dài hơn.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình nghiên cứu về virus cúm, đặc biệt là cấu trúc và chức năng của gen HA (hemagglutinin) – kháng nguyên bề mặt quan trọng của virus cúm A/H5N1. HA đóng vai trò thiết yếu trong quá trình xâm nhiễm tế bào vật chủ và là mục tiêu chính của vaccine. Ngoài ra, nghiên cứu ứng dụng công nghệ tái tổ hợp gen và hệ thống biểu hiện baculovirus trong tế bào côn trùng Sf9 để tạo ra các hạt giả virus (VLPs) mang gen HA, tận dụng ưu điểm của hệ thống baculovirus như khả năng sửa chữa sau dịch mã và gấp nếp protein chính xác.

Các khái niệm chính bao gồm:

• Virus-Like Particles (VLPs): Các hạt giả virus cấu tạo từ protein virus nhưng không chứa vật liệu di truyền, không có khả năng lây nhiễm, nhưng có tính sinh miễn dịch cao.
• Vector baculovirus: Vector trung gian sử dụng virus baculovirus để biểu hiện protein tái tổ hợp trong tế bào côn trùng.
• Gen HA: Gen mã hóa protein hemagglutinin, kháng nguyên bề mặt quan trọng của virus cúm A/H5N1.
• Phương pháp tái tổ hợp gen: Kỹ thuật chèn gen HA vào vector baculovirus để biểu hiện protein trong tế bào Sf9.
• Phương pháp PCR: Kỹ thuật khuếch đại gen để kiểm tra sự có mặt của gen HA trong các mẫu DNA.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu chính là chủng virus cúm A/H5N1 (A/chicken/hatay/2004) được bảo quản tại phòng Vi sinh vật phân tử. Nghiên cứu sử dụng vector pCR2.1 để tách dòng gen HA trong vi khuẩn E.coli chủng DH5α, sau đó chuyển gen HA vào vector trung gian baculovirus pBluBac4.5/V5-His-TOPO để biểu hiện trong tế bào côn trùng Sf9.

Phương pháp phân tích bao gồm:

• Tách chiết RNA virus bằng dung dịch Trizol, kiểm tra nồng độ RNA bằng quang phổ kế.
• Tổng hợp cDNA từ RNA bằng bộ kit Superscript™.
• Khuếch đại gen HA bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu.
• Tách dòng gen HA vào vector pCR2.1, kiểm tra bằng enzym giới hạn và đọc trình tự DNA.
• Chuyển gen HA vào vector baculovirus trung gian pBluBac4.5/V5-His-TOPO, kiểm tra tái tổ hợp bằng enzym giới hạn và PCR.
• Nuôi cấy tế bào côn trùng Sf9, chuẩn bị tế bào cho quá trình đồng chuyển nạp.
• Đồng chuyển nạp DNA baculovirus và vector mang gen HA vào tế bào Sf9 để tạo baculovirus tái tổ hợp.
• Kiểm tra sự có mặt của gen HA trong baculovirus tái tổ hợp bằng PCR.
• Thời gian nghiên cứu kéo dài trong nhiều tháng, đảm bảo các bước kỹ thuật được thực hiện chính xác và lặp lại để xác nhận kết quả.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Thiết kế và tách dòng gen HA thành công: Gen HA của virus cúm A/H5N1 được khuếch đại đặc hiệu với kích thước khoảng 1664 bp, tương đương với dự kiến. Vector pCR2.1 mang gen HA được xác nhận bằng enzym giới hạn và đọc trình tự DNA, đảm bảo trình tự không bị biến đổi.

2. Tạo vector baculovirus trung gian mang gen HA: Gen HA được chuyển thành công vào vector pBluBac4.5/V5-His-TOPO, kích thước plasmid tái tổ hợp khoảng 6600 bp (5000 bp vector + 1600 bp gen HA). Kiểm tra bằng enzym giới hạn và PCR cho thấy sự tái tổ hợp chính xác.

3. Nuôi cấy và bảo quản tế bào Sf9: Tế bào Sf9 sau khi bảo quản trong nitơ lỏng vẫn sinh trưởng tốt, mật độ tế bào đạt 80-90% sau 3 ngày nuôi cấy ở 28°C, đảm bảo điều kiện cho quá trình đồng chuyển nạp.

4. Đồng chuyển nạp tạo baculovirus tái tổ hợp: Sau 72 giờ đồng chuyển nạp, tế bào Sf9 xuất hiện các hiệu ứng gây bệnh tế bào (CPE) với tỷ lệ 60-70%, chứng tỏ virus tái tổ hợp đã được tạo ra. PCR kiểm tra DNA baculovirus tái tổ hợp xác nhận sự có mặt của gen HA với kích thước sản phẩm khoảng 1,6 kb.

Thảo luận kết quả

Việc thiết kế thành công vector baculovirus mang gen HA là bước then chốt để phát triển vaccine VLPs thế hệ mới. Kết quả PCR và enzym giới hạn cho thấy gen HA được giữ nguyên vẹn và biểu hiện đúng trong hệ thống tế bào côn trùng Sf9. Tế bào Sf9 được nuôi cấy và bảo quản hiệu quả, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình đồng chuyển nạp và tạo baculovirus tái tổ hợp.

So sánh với các nghiên cứu trước đây, việc sử dụng hệ thống baculovirus/tế bào côn trùng cho phép biểu hiện protein HA với cấu trúc gần giống tự nhiên, hỗ trợ quá trình lắp ráp VLPs có tính sinh miễn dịch cao. Kết quả này phù hợp với các báo cáo về ưu điểm của công nghệ VLPs trong việc tạo vaccine an toàn, hiệu quả và có khả năng đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ hơn vaccine truyền thống.

Dữ liệu có thể được trình bày qua các biểu đồ điện di gel agarose thể hiện kích thước DNA, hình ảnh kính hiển vi tế bào Sf9 trước và sau đồng chuyển nạp, cũng như biểu đồ thể hiện tỷ lệ tế bào bị ảnh hưởng (CPE) sau 72 giờ.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Tiếp tục nghiên cứu tạo chủng baculovirus sản xuất VLPs: Tập trung vào việc biểu hiện và tinh sạch các hạt giả virus mang protein HA để phát triển vaccine thế hệ mới, nhằm nâng cao hiệu quả miễn dịch và giảm thiểu tác dụng phụ.

2. Tối ưu hóa quy trình nuôi cấy tế bào Sf9: Đảm bảo điều kiện nuôi cấy ổn định, tăng mật độ tế bào và hiệu suất đồng chuyển nạp để nâng cao năng suất sản xuất baculovirus tái tổ hợp trong vòng 6-12 tháng.

3. Phát triển quy trình tinh sạch VLPs: Áp dụng các kỹ thuật ly tâm siêu tốc gradient và sắc ký phân tách kích thước để tách biệt VLPs khỏi baculovirus, đảm bảo độ tinh khiết và an toàn cho vaccine.

4. Thử nghiệm đánh giá đáp ứng miễn dịch: Tiến hành các thử nghiệm in vitro và in vivo để đánh giá khả năng kích thích miễn dịch của VLPs, so sánh với vaccine truyền thống trong vòng 12-18 tháng, phối hợp với các viện nghiên cứu và cơ sở sản xuất vaccine.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành vi sinh vật học, công nghệ sinh học: Nghiên cứu về kỹ thuật tái tổ hợp gen, biểu hiện protein và phát triển vaccine thế hệ mới.

2. Các công ty dược phẩm và sản xuất vaccine: Áp dụng công nghệ baculovirus và VLPs để phát triển vaccine cúm gia cầm và các loại vaccine tái tổ hợp khác.

3. Cơ quan quản lý y tế và thú y: Tham khảo để xây dựng chính sách phòng chống dịch cúm gia cầm, đánh giá hiệu quả và an toàn của các loại vaccine mới.

4. Bộ phận kiểm nghiệm và kiểm soát chất lượng vaccine: Sử dụng các phương pháp phân tích gen, PCR và kỹ thuật nuôi cấy tế bào để kiểm tra chất lượng vaccine tái tổ hợp.

Câu hỏi thường gặp

1. VLPs là gì và tại sao lại được sử dụng trong vaccine thế hệ mới?
   VLPs là các hạt giả virus cấu tạo từ protein virus nhưng không chứa vật liệu di truyền, do đó không gây lây nhiễm. Chúng có cấu trúc tương tự virus tự nhiên, kích thích hệ miễn dịch mạnh mẽ và an toàn hơn vaccine truyền thống.

2. Tại sao chọn hệ thống baculovirus và tế bào Sf9 để biểu hiện gen HA?
   Hệ thống này cho phép biểu hiện protein với cấu trúc và gấp nếp chính xác, có khả năng sửa chữa sau dịch mã, đồng thời dễ dàng mở rộng quy mô sản xuất với chi phí hợp lý.

3. Làm thế nào để kiểm tra sự có mặt của gen HA trong baculovirus tái tổ hợp?
   Sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen HA, sau đó kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di gel agarose để xác định kích thước đoạn gen đúng với dự kiến.

4. Ưu điểm của vaccine VLPs so với vaccine truyền thống là gì?
   Vaccine VLPs tạo đáp ứng miễn dịch mạnh và kéo dài hơn, an toàn do không chứa vật liệu di truyền, không có nguy cơ tái tổ hợp virus, đồng thời có thể sản xuất nhanh và hiệu quả hơn.

5. Quy trình đồng chuyển nạp baculovirus tái tổ hợp được thực hiện như thế nào?
   DNA vector mang gen HA và DNA baculovirus được trộn với chất chuyển nạp, sau đó đồng chuyển vào tế bào Sf9. Trong tế bào, xảy ra tái tổ hợp tạo baculovirus mang gen HA, biểu hiện protein và tạo VLPs.

Kết luận

• Đã thiết kế thành công vector baculovirus mang gen HA của virus cúm A/H5N1 với đầy đủ các thành phần cần thiết cho biểu hiện trong tế bào côn trùng Sf9.
• Đã nhân dòng và bảo quản hiệu quả tế bào Sf9, đảm bảo điều kiện cho quá trình đồng chuyển nạp và tạo baculovirus tái tổ hợp.
• Đã tạo được baculovirus tái tổ hợp mang gen HA, được xác nhận bằng PCR và enzym giới hạn.
• Nghiên cứu mở ra hướng phát triển vaccine thế hệ mới sử dụng công nghệ VLPs, hứa hẹn nâng cao hiệu quả phòng chống cúm gia cầm.
• Đề xuất tiếp tục nghiên cứu tinh sạch VLPs và đánh giá đáp ứng miễn dịch để hoàn thiện quy trình sản xuất vaccine trong các giai đoạn tiếp theo.

Hành động tiếp theo là triển khai các bước nghiên cứu sâu hơn về biểu hiện protein HA, tinh sạch VLPs và thử nghiệm đánh giá hiệu quả vaccine nhằm đáp ứng nhu cầu cấp thiết phòng chống dịch cúm gia cầm tại Việt Nam và trên thế giới.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về virus cúm 1. Đặc điểm hình thái, cấu trúc của virus cúm Bệnh cúm là bệnh của loài chim và động vật có vú do virus dạng RNA thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra. Họ Orthomyxoviridae đã được phát hiện, bao gồm 4 nhóm virus: nhóm virus cúm A, cúm B, cúm c và nhóm Thogotovirus.

Các nhóm virus khác nhau bởi kháng nguyên bề mặt capsid, ở virus cúm A và B là Hem agglutinin, ở virus cúm c là Hemagglutinin Esterase Fusion, và ở Thogotovirus là G lycoprotein [4, 6]. Virus cúm A có cấu tạo hình cầu hoặc hình khối đa diện, đôi khi cũng có dạng hình sợi, đường kính 80 - 120 nm, khối lượng phân tử khoảng 250 triệu Da (Hình 1. Kết quả phân tích thành phần hóa học cho thấy một hạt virus có chứa khoảng 0,8-1,1% RNA; 70-75% protein; 20-24% lipid và 5-8% carbonhydrate[23]. Hệ gen virus cúm A là RNA sợi đon âm (-) ssRNA, bao gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt, mã hóa cho 11 protein khác nhau của virus gồm: HA, NA, M (M I và M2), NP, NS (NS1 và NS2), PA, PB1, PB1 - F2 và PB2[6].

Mỗi phân đoạn RNA của virus cúm A có cấu trúc bậc 2, xoắn a đổi xứng, dài 50-100 nm, đường kính 9-10 nm, được bao bọc bởi nucleoprotein có bản chất là lipoprotein, tạo thành cấu trúc ribonucleoprotein (RNP) (Hình 1. Mỗi RNP kết hợp với 3 protein enzym polym erase chịu trách nhiệm trong quá trình phiên mã và sao chép RNA của virus. Các phân đoạn của hệ gen virus cúm A nối với nhau bàng các cầu nổi peptide tạo dạng vòm tại giới hạn cuối của mỗi phân đoạn và tạo thành một sợi RNA duy nhất có tổng độ dài từ lOkb - 15 kb (tuỳ theo từng chủng virus cúm A), chứa khoảng 13,5 kb thông tin di truyền và có cấu trúc xoắn a bên trong vỏ virus[6]. Bao bọc hạt virus là một lớp vỏ lipid kép có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm được gắn protein m àng của virus, đóng vai trò bảo vệ vật chất di truyền RNA của virus.

Bề mặt ngoài của vỏ được bao phủ bởi các glycoprotein phân bố dày đặc. Mỗi glycoprotein có kích thước dài khoảng 10-14 nm, đường kính 4-6 nm. Virus 3 z Luận văn thạc s ĩ sinh học Đào Thị N hư Hoa cúm có hai loại protein kháng nguyên đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus là haemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA). Các phân tử HA và NA phân bố không đồng đều (cứ 4-5 phân tử HA thì có 1 phân tử NA).

Ngoài ra trên bề mặt vỏ còn có protein M2 nằm xuyên qua màng lipit kép và hoạt động như kênh vận chuyển ion. Xen giữa hạt virus và vỏ là lớp protein nền M l (matrix) [6], Influenza virus RNP (■) sense ssRNA 3 polymerase subunits NP H ình 1.1: Virus cúm r A /H IN I chụp băng kính __ hiên vi> (A) và hình ảnh mô phỏng câu trúc ribonucleoprotein (B) (nguôn internet). Đặc điểm các phân đoạn gen của virus Virus cúm cỏ hệ gen là RNA sợi đơn âm gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt m ang tên từ 1-8 theo thứ tự giảm dần của kích thước phân tử, mã hóa tổng hợp cho 11 protein (Hình 1. Trong hệ gen các phân đoạn 1; 2; 3; 5; 7; 8 có độ dài tương đối ổn định và có tính bảo thủ cao.

Hai phân đoạn 4 và 6 mã hóa cho các protein bề mặt của virus (HA và NA) có độ dài không ổn định và đặc trưng theo từng chủng virus [1,6]. > Phân đoạn 1 có kích thước 2431 bp, m ã hóa tổng hợp protein enzym PB2. Enzym này có khối lượng phân tử khoảng 84 kDa, là tiểu đom vị thành phần trong phức hợp enzym polym erase chịu trách nhiệm khởi đầu phiên mã RNA của virus. Tính thích nghi nhiệt độ cơ thể loài vật chủ có liên quan đến vị trí amino axít 627 ở protein PB2.

4 z Luận văn thạc s ĩ sinh học Đào Thị N hư Hoa P B 1. PA ha NP X NA 3 M1 I M2 I NS2 41 NS1 Hình 1.2: Mô hình cấu trúc virus cúm A /H 5N 1. > Phân đoạn 2 có kích thước 2431 bp, mã hóa tổng hợp enzym P B 1. P B 1 có khối lượng phân tử khoảng 87 kDa, là tiểu đon vị xúc tác của phức hợp enzym polym erase chịu trách nhiệm gắn mũ RNA trong quá trình tổng hợp RNA virus.

Gần đây, các nhà khoa học đã phát hiện thêm một protein P B 1 - F2 được m ã hóa bởi m ột khung đọc mở khác của phân đoạn 2. > Phân đoạn 3 có kích thước 2233 bp, mã hóa tổng hợp protein enzym PA. PA có khối lượng phân tử khoảng 83 kDa, là một tiểu đơn vị của enzym polym erase chịu trách nhiệm kéo dài sự phiên mã RNA trong quá trình tổng hợp RNA của virus. Phân đoạn gen này có tính bảo tồn cao.

> Phân đoạn 4 chịu trách nhiệm m ã hóa tổng hợp protein HA - kháng nguyên bề m ặt virus cúm. Phân đoạn này gồm hai tiểu phần là HA I và HA2 có độ dài thay đổi tuỳ theo từng chủng virus cúm A, ở A/H1N1 là 1778 bp. Protein HA có khối lượng phân tử khoảng 63 kDa, đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus và có khả năng gây ngưng kết hồng cầu. Vùng nổi giữa HA I và HA2 là m ột số am ino axít mang tính kiềm được mã hóa bởi một chuỗi oligonucleotide.

Vùng này chứa vị trí nhận biết và cắt đặc hiệu của một số enzym protease của vật chủ và là vùng quyết định độc lực của virus. > Phân đoạn 5 có kích thước khoảng 1556 bp, mã hóa tổng hợp nucleoprotein (NP). Protein NP là thành phần của phức hệ phiên mã chịu trách nhiệm vận chuyển 5 z Luận > văn thạc • s ĩ sinh học • Đào Thị N hư Hoa RNA giữa nhân và bào tương tế bào chủ, có khối lượng phân tử khoảng 56 kDa, tồn tại trong các hạt virus ở dạng kết hợp với mỗi phân đoạn RNA trong hệ gen virus tạo cấu trúc nucleocapsid đổi xứng xoắn bền vững. > Phân đoạn 6 mã hóa tổng hợp protein NA - kháng nguyên bề mặt capsid của virus.

Chiều dài phân đoạn gen này thay đổi theo từng chủng virus cúm A (ở cúm A/H6N2 là 1413 bp, ở cúm A/H5N1 thay đổi khoảng từ 1350 - 1410 bp). Cùng với kháng nguyên HA, NA đóng vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy sự lây nhiễm của virus trong tế bào vật chủ, giúp quá trình nhân lên của virus diễn ra nhanh hơn và giải phóng hạt virus ra khỏi tế bào bị nhiễm. > Phân đoạn 7 có kích thước khoảng 1027 bp, mã hóa cho protein M của virus gồm hai tiểu phần là M I và M2 được dịch m ã từ những khung đọc mở khác nhau của cùng m ột phân đoạn RNA. Protein M I là protein nền, thành phần chính của virus có chức năng bao bọc RNA tạo nên phức hợp RNP và tham gia vào quá trình nảy chồi của virus.

Protein M2 là chuỗi polypeptide có khối lượng phân tử là 11 kDa. Đây là protein xuyên màng cần thiết cho quá trình lây nhiễm của virus và chịu trách nhiệm cởi áo virus trong quá trình xâm nhiễm trên vật chủ. > Phân đoạn 8 mã hóa tổng hợp protein không cấu trúc. Phân đoạn này có độ dài ổn định nhất trong hệ gen của virus cúm A, kích thước khoảng 890 bp, mã hóa tổng hợp hai protein NS1 và NS2 có vai trò bảo vệ hệ gen của virus.

Protein NS1 có khối lượng phân tử khoảng 27 kDa, chịu trách nhiệm vận chuyển RNA thông tin của virus từ nhân ra bào tương tế bào nhiễm và tác động lên các RNA vận chuyển cũng như các quá trình cắt và dịch mã của tể bào chủ, ức chế sự cắt dán tiền RNA thông tin. Ngoài ra, NS1 có thể ức chế đáp ứng interferon trong các tế bào nhiễm virus, làm cho sự sinh sản virus không bị cản trở. NS2 là protein được dịch mã từ hai đoạn gen, khối lượng phân tử khoảng 14 kDa, đóng vai trò vận chuyển các RNP của virus ra khỏi nhân tế bào nhiễm để lắp ráp với capsid tạo nên hạt virus mới. Các kháng nguyên quan trọng của virus cúm 1.

Hem agglutinin (HA) HA là kháng nguyên bề mặt chủ yếu của virus cúm và là đích để kháng thể 6 z Luận văn thạc s ĩ sinh học Đào Thị Như Hoa trung hòa. Nó đóng vai trò gắn virus vào thụ thể tế bào vật chủ, hòa tan màng tế bào, giải phóng RNA hệ gen để thực hiện quá trình nhân lên trong tế bào cảm nhiễm. Có tới 400 phân tử HA trên bề mặt capsid của virus. Mỗi phân tử có dạng hình trụ, dài khoảng 130 A°, cấu tạo gồm ba đom phân.

Mỗi đơn phân được tạo thành dưới hai đơn vị H A I và HA2 liên kết với nhau bởi các cầu nối disulfide. Tiểu phần HA2 có dạng sợi, đóng vai trò gắn kháng nguyên vào màng virus. Phần đầu tự do hình chỏm cầu được tạo bởi tiểu đơn vị H A I. Tiểu phần này có chứa những thụ thể đặc hiệu, đóng vai trò gắn virus vào màng tế bào chủ trong quá trình xâm nhiễm.

Đoạn polypeptide liên kết giữa hai tiểu phần H A I và HA2 là trình tự nhận biết của một số protease trong tế bào vật chủ. Đổi với chủng virus thể độc lực cao (Highly Pathogenic Avian Influenza, HP AI), vị trí liên kết hai tiểu phần HA thường là một chuỗi amino acid kiềm, dễ dàng bị cắt bởi các protease thông thường có mặt trong nhiều loại mô tế bào và các cơ quan khác nhau trong cơ thể (Hình 1. Do đó, virus có thể nhân lên trong toàn bộ cơ thể, gây nguy hiểm tới tính mạng vật chủ [3,4].3: Mô hình cấu trúc phân tử HA Các nhà khoa học đã phát hiện 17 loại HA gây bệnh ở gia cầm và vật nuôi, nhưng chỉ có 3 loại là có khả năng gây bệnh ở người (H l, H2 và H3). Sự phù hợp cấu hình không gian giữa thụ thể chứa axít sialic của tế bào đích với vị trí gắn thụ thể này trên phân tử HA của virus cúm quyết định sự xâm nhiễm dễ dàng của virus đối với các loài vật chủ khác nhau.

Ở hầu hết các loại virus cúm lưu hành trong tự 7 z Luận văn thạc •________ s ĩ sinh học •__________ » Đào Thị N hu Hoa nhiên, vị trí amino axít 226 và 228 của tiểu phần HAI quyết định khả năng liên kết của protein HA với thụ thể đặc hiệu trên màng tế bào chủ.