Luận văn thạc sĩ vnua nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của bệnh tiêu chảy thành dịch ped trên lợn landrace và áp dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch trong chẩn đoán bệnh

Luận văn thạc sĩ kỹ thuật nghiên cứu vnua nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của bệnh tiêu chảy thành dịch ped trên lợn landrace và áp, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân,

• Tác giả: Nguyễn Thị Yến
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Thị Lan
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Thú y
• Đề tài: Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của bệnh tiêu chảy thành dịch (PED) trên lợn Landrace và áp dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch trong chẩn đoán bệnh
• Loại tài liệu: Luận văn
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. MỞ ĐẦU
• 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
• 1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI
• 1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
• 1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI
• 1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
• 1.5.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH PED TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC
• 2.1.1. Tình hình nghiên cứu bệnh PED trong nước
• 2.1.2. Tình hình nghiên cứu bệnh PED ngoài nước
• 3. SƠ LƯỢC VỀ HÓA MÔ MIỄN DỊCH
• 3.1. LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN
• 3.2. KHÁNG NGUYÊN (ANTIGEN)
• 3.3. KHÁNG THỂ (ANTIBODY)
• 3.4. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHÁNG THỂ
• 3.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP NHUỘM
• 4. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 4.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
• 4.2. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
• 4.3. ĐỐI TƯỢNG/VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
• 4.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
• 4.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 4.5.1. PHƯƠNG PHÁP THEO DÕI TRIỆU CHỨNG LÂM SÀNG
• 4.5.2. PHƯƠNG PHÁP RT-PCR
• 4.5.3. PHƯƠNG PHÁP MỔ KHÁM, QUAN SÁT BỆNH TÍCH ĐẠI THỂ
• 4.5.4. PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN VI THỂ VÀ QUAN SÁT BỆNH TÍCH TRÊN TIÊU BẢN
• 4.5.5. PHƯƠNG PHÁP NHUỘM HÓA MÔ MIỄN DỊCH
• 4.5.6. PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY TẾ BÀO
• 4.5.7. PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VIRUS
• 4.6. XỬ LÝ SỐ LIỆU
• 5. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 5.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA LỢN LANDRACE MẮC PED
• 5.1.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CÁC TRIỆU CHỨNG LÂM SÀNG CHỦ YẾU CỦA LỢN LANDRACE MẮC PED
• 5.1.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ ĐẠI THỂ CỦA LỢN LANDRACE MẮC PED
• 5.1.3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ VI THỂ CỦA LỢN LANDRACE MẮC PED
• 5.1.4. KẾT QUẢ NHUỘM HÓA MÔ MIỄN DỊCH
• 5.1.5. SO SÁNH KẾT QUẢ NHUỘM HÓA MÔ MIỄN DỊCH VỚI CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN KHÁC
• 5.2. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về bệnh tiêu chảy thành dịch PED trên lợn Landrace

Bệnh tiêu chảy thành dịch (PED) là một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất đối với đàn lợn, đặc biệt là lợn con. Bệnh do virus PEDV gây ra, thuộc nhóm Coronavirus, có thể dẫn đến tỷ lệ tử vong cao, đặc biệt ở lợn con dưới 2 tháng tuổi. Bệnh xuất hiện lần đầu tiên ở Châu Âu vào những năm 1970 và đã lan rộng ra nhiều quốc gia, trong đó có Việt Nam. Nghiên cứu này tập trung vào đặc điểm bệnh lý của PED trên giống lợn Landrace, một giống lợn phổ biến tại Việt Nam.

1.1. Đặc điểm virus gây bệnh PED trên lợn

Virus PEDV có cấu trúc gen phức tạp và có khả năng biến đổi cao. Nghiên cứu cho thấy virus này có thể tồn tại trong môi trường và lây lan nhanh chóng giữa các đàn lợn. Đặc biệt, virus có thể gây ra các triệu chứng lâm sàng nghiêm trọng như tiêu chảy, nôn mửa và mất nước.

1.2. Tình hình dịch bệnh PED tại Việt Nam

Tại Việt Nam, bệnh PED đã được phát hiện từ năm 2008 và gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi. Các nghiên cứu gần đây cho thấy virus PEDV có sự khác biệt về gen so với các chủng virus ở các nước khác, điều này làm cho việc chẩn đoán và điều trị trở nên khó khăn hơn.

II. Vấn đề và thách thức trong chẩn đoán bệnh PED

Chẩn đoán bệnh PED gặp nhiều khó khăn do các triệu chứng lâm sàng tương tự với nhiều bệnh khác. Việc phân biệt PED với các bệnh khác như viêm dạ dày ruột truyền nhiễm (TGE) là rất cần thiết để có biện pháp điều trị kịp thời. Hơn nữa, sự xuất hiện của các bệnh ghép cũng làm phức tạp thêm tình hình chẩn đoán.

2.1. Các triệu chứng lâm sàng của bệnh PED

Lợn mắc PED thường có triệu chứng như sốt, ủ rũ, tiêu chảy nặng, và mất nước. Những triệu chứng này có thể gây nhầm lẫn với các bệnh khác, do đó cần có các phương pháp chẩn đoán chính xác.

2.2. Khó khăn trong việc phân biệt bệnh

Sự tương đồng về triệu chứng giữa PED và các bệnh khác như TGEV khiến cho việc chẩn đoán trở nên khó khăn. Việc áp dụng các phương pháp chẩn đoán hiện đại như RT-PCR và hóa mô miễn dịch là cần thiết để xác định chính xác nguyên nhân gây bệnh.

III. Phương pháp nghiên cứu bệnh tiêu chảy thành dịch PED

Nghiên cứu này áp dụng nhiều phương pháp khác nhau để xác định đặc điểm bệnh lý của PED trên lợn Landrace. Các phương pháp bao gồm khám lâm sàng, mổ khám, và nhuộm hóa mô miễn dịch. Mỗi phương pháp đều có những ưu điểm riêng, giúp cung cấp thông tin chi tiết về tình trạng bệnh lý.

3.1. Phương pháp khám lâm sàng

Khám lâm sàng giúp xác định các triệu chứng biểu hiện trên lợn mắc PED. Các triệu chứng như sốt, tiêu chảy, và tình trạng sức khỏe tổng quát của lợn được ghi nhận để phục vụ cho việc phân tích.

3.2. Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch

Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch cho phép xác định sự hiện diện của virus PED trong các mô của lợn. Kỹ thuật này giúp phát hiện virus một cách chính xác và nhanh chóng, từ đó hỗ trợ cho việc chẩn đoán.

IV. Kết quả nghiên cứu đặc điểm bệnh lý của lợn Landrace mắc PED

Kết quả nghiên cứu cho thấy lợn Landrace mắc PED có nhiều triệu chứng lâm sàng và bệnh tích điển hình. Các triệu chứng này bao gồm sốt, tiêu chảy, và các bệnh tích ở ruột, dạ dày, và các cơ quan khác. Những phát hiện này cung cấp thông tin quan trọng cho việc chẩn đoán và điều trị bệnh.

4.1. Triệu chứng lâm sàng chủ yếu

Các triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn mắc PED bao gồm sốt cao, tiêu chảy nặng, và tình trạng ủ rũ. Những triệu chứng này thường xuất hiện đột ngột và có thể dẫn đến tử vong nếu không được điều trị kịp thời.

4.2. Bệnh tích đại thể và vi thể

Bệnh tích đại thể ở lợn mắc PED thường thấy ở ruột non, với tình trạng căng phồng và xuất huyết. Bệnh tích vi thể cho thấy sự tổn thương tế bào biểu mô và thâm nhiễm tế bào viêm, điều này cho thấy mức độ nghiêm trọng của bệnh.

V. Ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu trong chẩn đoán bệnh PED

Nghiên cứu này không chỉ cung cấp thông tin về đặc điểm bệnh lý của PED mà còn mở ra hướng đi mới trong việc áp dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch trong chẩn đoán. Việc áp dụng các phương pháp chẩn đoán hiện đại sẽ giúp nâng cao hiệu quả trong việc phát hiện và điều trị bệnh.

5.1. Tính ứng dụng của hóa mô miễn dịch

Kỹ thuật hóa mô miễn dịch có thể được áp dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm thú y để chẩn đoán bệnh PED. Phương pháp này giúp xác định chính xác sự hiện diện của virus trong các mô, từ đó hỗ trợ cho việc điều trị.

5.2. Lợi ích cho ngành chăn nuôi

Việc chẩn đoán nhanh và chính xác bệnh PED sẽ giúp giảm thiểu thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi. Các biện pháp phòng ngừa và điều trị kịp thời sẽ giúp bảo vệ sức khỏe đàn lợn và nâng cao hiệu quả sản xuất.

VI. Kết luận và triển vọng nghiên cứu trong tương lai

Nghiên cứu về bệnh tiêu chảy thành dịch PED trên lợn Landrace đã chỉ ra nhiều đặc điểm bệnh lý quan trọng. Kết quả nghiên cứu không chỉ có giá trị trong việc chẩn đoán mà còn mở ra hướng đi mới cho các nghiên cứu tiếp theo về bệnh này. Việc áp dụng các phương pháp chẩn đoán hiện đại sẽ giúp nâng cao hiệu quả trong việc kiểm soát dịch bệnh.

6.1. Tóm tắt kết quả nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng virus PEDV có sự phân bố rộng rãi trong các mô của lợn mắc bệnh. Các triệu chứng lâm sàng và bệnh tích được ghi nhận sẽ là cơ sở cho việc chẩn đoán và điều trị.

6.2. Hướng nghiên cứu trong tương lai

Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về virus PEDV và các biện pháp phòng ngừa hiệu quả. Việc phát triển vaccine và các phương pháp điều trị mới sẽ là mục tiêu quan trọng trong tương lai để kiểm soát dịch bệnh này.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Dịch tiêu chảy thành dịch ở lợn (Porcine Epidemic Diarrhea - PED) là một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm hàng đầu trong ngành chăn nuôi, với tỷ lệ chết ở lợn con từ 0 đến 5 ngày tuổi có thể lên đến 100%. Kể từ khi được phát hiện lần đầu tại Việt Nam vào năm 2008, virus PED (PEDV) đã nhanh chóng lây lan ra nhiều vùng chăn nuôi trọng điểm, gây thiệt hại kinh tế ước tính hàng trăm tỷ đồng mỗi năm. Vấn đề cốt lõi hiện nay là triệu chứng lâm sàng của PED rất dễ nhầm lẫn với các bệnh tiêu chảy do virus khác như TGE hay Rotavirus, trong khi các cơ sở thú y địa phương còn thiếu công cụ chẩn đoán nhanh và chính xác ở mức độ mô bệnh học.

Đề tài tập trung nghiên cứu trên giống lợn Landrace nhằm xác định rõ nét các triệu chứng lâm sàng, biến đổi bệnh lý đại thể và vi thể, đồng thời chuẩn hóa kỹ thuật hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry - IHC) phục vụ chẩn đoán đặc hiệu. Nghiên cứu được triển khai từ tháng 9/2016 đến tháng 5/2017 tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học thú y và Bộ môn Bệnh lý thú y thuộc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, thu thập 64 ca bệnh nghi nhiễm tại 4 tỉnh phía Bắc gồm Hải Dương, Hưng Yên, Thái Bình và Bắc Ninh.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của công trình thể hiện ở việc nâng tỷ lệ xác định mầm bệnh thông qua việc định vị chính xác vị trí cư trú của kháng nguyên PEDV trong tế bào biểu mô ruột non. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở dữ liệu quan trọng giúp các phòng xét nghiệm đạt độ chính xác chẩn đoán trên 90%, đồng thời tối ưu hóa việc chọn lọc mẫu bệnh phẩm phục vụ phân lập virus và nghiên cứu sản xuất vắc-xin phòng bệnh.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng lý thuyết bệnh truyền nhiễm thú y và cơ chế sinh bệnh học của giống Coronavirus thuộc họ Coronaviridae. Virus PED là virus có vỏ bọc với bộ gen ARN sợi đơn dương kích thước khoảng 28 kb, mã hóa cho 4 protein cấu trúc chính gồm Spike (S, trọng lượng phân tử 180-200 kDa), Membrane (M, 27-32 kDa), Nucleocapsid (N, 57-58 kDa) và Envelope (E, 7 kDa). Trong đó, protein S đóng vai trò gắn kết đặc hiệu với thụ thể màng tế bào vật chủ, là mục tiêu sinh kháng thể trung hòa và phát hiện phân tử.

Cơ sở thứ hai là nguyên lý miễn dịch học huỳnh quang và liên kết kháng nguyên - kháng thể đặc hiệu trong kỹ thuật Hóa mô miễn dịch (IHC). Phương pháp sử dụng kháng thể sơ cấp đơn dòng liên kết với kháng nguyên PEDV trên lát cắt mô, tiếp nối bởi kháng thể thứ cấp gắn enzyme peroxidase và chất hiện màu 3,3'-Diaminobenzidine (DAB). Khi có mặt virus, phản ứng enzyme tạo kết tủa màu nâu vàng rõ rệt dưới kính hiển vi quang học. Ba khái niệm then chốt được vận dụng xuyên suốt gồm: teo thoái hóa lông nhung ruột non, chỉ số tỷ lệ chiều cao lông nhung trên tuyến Lieberkühn, và phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược (RT-PCR).

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu xuất phát từ 64 ca lợn Landrace nghi mắc PED tại các trang trại thuộc Hải Dương, Hưng Yên, Thái Bình và Bắc Ninh trong giai đoạn từ tháng 9/2016 đến tháng 5/2017. Nghiên cứu áp dụng phương pháp chọn mẫu có chủ đích, phân tầng thành 5 nhóm tuổi: 1-6 ngày tuổi (18 con), 7-14 ngày tuổi (16 con), 15-21 ngày tuổi (11 con), sau cai sữa (13 con) và lợn choai (6 con).

Quy trình phân tích kết hợp đa phương pháp:

• Phương pháp sinh học phân tử RT-PCR: Tách chiết ARN tổng số bằng bộ kit QIAamp Viral RNA Mini Kit, sử dụng cặp mồi PS1/PS2 khuếch đại phân đoạn gen S kích thước 651 bp qua 35 chu kỳ nhiệt, kiểm tra qua điện di gel agarose 1,2% ở điện áp 100V trong 30 phút.
• Phương pháp mô bệnh học thường quy: Mổ khám 22 lợn đơn nhiễm PED, thu mẫu ruột, dạ dày, phổi, gan, lách, thận, hạch lympho; cố định trong formol 10%, đúc khối paraffin, cắt mảnh dày 3-5 µm và nhuộm Hematoxylin - Eosin (HE).
• Phương pháp Hóa mô miễn dịch gián tiếp: Xử lý tiêu bản khử sáp, bộc lộ kháng nguyên ở 121°C trong 5 phút bằng đệm PBS, ức chế peroxidase nội sinh với H2O2 3% trong methanol, ủ kháng thể sơ cấp kháng PEDV ở 37°C trong 60 phút, gắn kháng thể thứ cấp và hiện màu bằng DAB trong 5-8 phút.
• Nuôi cấy phân lập virus: Gây nhiễm dịch nghiền bệnh phẩm lên dòng tế bào Vero-NIH với môi trường DMEM bổ sung 10 µg/ml Trypsin ở điều kiện 37°C và 5% CO2.

Lý do lựa chọn chuỗi phương pháp này là nhằm kết hợp độ nhạy cao của RT-PCR trong việc sàng lọc mầm bệnh phân tử với khả năng định vị trực quan không gian của kỹ thuật IHC, khắc phục hoàn toàn nhược điểm âm tính giả do mẫu phân bị phân hủy.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Phân tích chẩn đoán trên 64 ca lợn nghi mắc PED bằng kỹ thuật RT-PCR xác định có 30 mẫu dương tính, đạt tỷ lệ nhiễm chung là 46,87%. Tỷ lệ dương tính có sự phân hóa mạnh mẽ theo từng nhóm tuổi: lợn từ 1 đến 6 ngày tuổi ghi nhận tỷ lệ mắc cao nhất đạt 66,70% (12/18 con), nhóm 7-14 ngày tuổi đạt 56,30% (9/16 con), nhóm 15-21 ngày tuổi đạt 36,40% (4/11 con), nhóm sau cai sữa đạt 30,76% (4/13 con), và thấp nhất là nhóm lợn choai chỉ chiếm 16,70% (1/6 con). Sau khi loại trừ các ca nhiễm ghép với TGEV, Rotavirus, PRRSV và Circovirus, 22 lợn Landrace đơn nhiễm PED được đưa vào đánh giá bệnh lý chi tiết.

Về bệnh tích đại thể trên 22 ca mổ khám, biến đổi xuất hiện tập trung tại hệ tiêu hóa và hệ lympho:

• 100% lợn mắc bệnh (22/22 con) có thành ruột non mỏng trong suốt, căng phồng chứa đầy dịch màu vàng và có xuất huyết.
• 100% trường hợp (22/22 con) ghi nhận hạch màng treo ruột sưng to, sung huyết và xuất huyết.
• 77,27% ca bệnh (17/22 con) xuất hiện dạ dày căng phồng chứa thức ăn và sữa không tiêu, niêm mạc xung huyết, xuất huyết.
• Thận có tổn thương xuất huyết điểm chiếm tỷ lệ 63,63% (14/22 con); phổi viêm và xuất huyết chiếm 40,91% (9/22 con).

Trên tiêu bản vi thể nhuộm HE, cấu trúc lông nhung ruột non bị tổn thương nghiêm trọng với hiện tượng teo ngắn, đứt nát, tỷ lệ chiều cao lông nhung trên tuyến ruột sụt giảm mạnh từ mức bình thường 7:1 xuống còn khoảng 3:1. Các tế bào biểu mô trụ thoái hóa không bào, hoại tử và bong tróc hàng loạt vào xoang ruột. Kết quả nhuộm IHC khẳng định tín hiệu bắt màu nâu vàng của kháng nguyên PEDV tập trung với mật độ cao nhất tại các tế bào biểu mô lông nhung và tế bào tuyến ruột non.

Tỷ lệ dương tính PED theo nhóm tuổi (%)
1-6 ngày tuổi   : [████████████████████] 66.70%
7-14 ngày tuổi  : [████████████████]     56.30%
15-21 ngày tuổi : [███████████]         36.40%
Sau cai sữa     : [█████████]           30.76%
Lợn choai       : [█████]               16.70%

Thảo luận kết quả

Cơ chế bệnh sinh chính dẫn đến tỷ lệ chết cao ở lợn con 1-6 ngày tuổi bắt nguồn từ ái lực đặc hiệu của virus PED với tế bào biểu mô nhung mao ruột non. Khi virus nhân lên trong bào tương, các liên kết vòng bịt bị phá hủy làm tế bào bong tróc, kéo theo sự sụt giảm nghiêm trọng của các enzyme tiêu hóa bề mặt như lactase. Hậu quả là sữa mẹ không được hấp thu, tạo áp suất thẩm thấu cao hút nước vào lòng ruột, gây tiêu chảy ồ ạt, mất nước cấp tính và rối loạn điện giải dẫn đến tử vong nhanh chóng sau 2-4 ngày phát bệnh.

So sánh với các nghiên cứu trước đây, kết quả này hoàn toàn tương đồng với báo cáo của các tác giả tại Hàn Quốc và nghiên cứu trong nước của nhóm chuyên gia miền Đông Nam Bộ (ghi nhận tỷ lệ dương tính ở ruột đạt 58,14%, cao hơn hẳn mẫu phân 16,96%). Điểm mới nổi bật của công trình là việc ứng dụng thành công kỹ thuật IHC gián tiếp, chứng minh trực quan sự hiện diện của virus trong cấu trúc vi thể mô ruột. Toàn bộ dữ liệu lâm sàng, đại thể và vi thể có thể được hệ thống hóa rõ ràng thông qua bảng đối chiếu tỷ lệ tổn thương cơ quan và biểu đồ cột biểu diễn mức độ mẫn cảm giảm dần theo độ tuổi của đàn lợn.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Chuẩn hóa quy trình chẩn đoán mô bệnh học kết hợp IHC tại các trung tâm xét nghiệm: Triển khai áp dụng quy trình nhuộm IHC gián tiếp với kháng thể đặc hiệu và chất hiện màu DAB, tập trung thu thập mẫu ruột non còn chất chứa trong vòng 24-48 giờ đầu sau khi lợn phát bệnh. Mục tiêu đạt độ chính xác chẩn đoán trên 95%, hoàn thành chuyển giao kỹ thuật cho 100% phòng thí nghiệm thú y tuyến tỉnh trong giai đoạn 2024-2025 do Chi cục Chăn nuôi và Thú y chủ trì.

2. Thiết lập hệ thống giám sát dịch tễ chủ động bằng RT-PCR: Thực hiện lấy mẫu phân và chất chứa đường ruột định kỳ hàng tháng tại các cơ sở nhân giống lợn Landrace để phát hiện sớm đoạn gen S kích thước 651 bp của PEDV. Target metric đặt ra là phát hiện ổ dịch trong vòng 24 giờ đầu, giảm tỷ lệ lây lan toàn đàn xuống dưới 15% trong vòng 6 tháng tới; chủ thể thực hiện là cán bộ thú y cơ sở và kỹ thuật viên trang trại.

3. Thắt chặt hàng rào an toàn sinh học và kiểm soát phương tiện vận chuyển: Áp dụng quy trình tiêu độc khử trùng nghiêm ngặt đối với xe chở lợn và dụng cụ chăn nuôi bằng dung dịch sát trùng chuyên dụng trước khi vào cổng trại, cách ly tuyệt đối lợn mới nhập tối thiểu 14 ngày. Giải pháp này giúp giảm 80% nguy cơ lây nhiễm chéo mầm bệnh từ bên ngoài, thực hiện liên tục hàng ngày bởi ban quản lý trang trại.

4. Đẩy mạnh nghiên cứu và sản xuất vắc-xin nhược độc từ chủng virus nội địa: Tiếp tục tối ưu hóa quy trình nuôi cấy cấy truyền virus PED trên dòng tế bào Vero-NIH bổ sung Trypsin 10 µg/ml nhằm tạo ra chủng vắc-xin an toàn, nâng tỷ lệ bảo hộ kháng thể qua sữa mẹ cho lợn nái lên trên 85% trong lộ trình 1-2 năm tới; chủ thể thực hiện là các viện nghiên cứu và doanh nghiệp sản xuất sinh phẩm thú y.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

• Bác sĩ thú y và cán bộ kiểm soát dịch bệnh cơ sở: Sử dụng luận văn như cẩm nang tra cứu thực địa nhằm nhận diện nhanh các triệu chứng đặc trưng (lợn nằm dồn đống, nôn mửa, phân lỏng màu vàng) và bệnh tích đại thể (ruột căng mỏng 100%, dạ dày ứ sữa 77,27%), từ đó đưa ra quyết định cách ly kịp thời mà không bị nhầm lẫn với dịch tả lợn hoặc TGE.
• Chủ trang trại và kỹ sư quản lý trại giống lợn Landrace: Nắm bắt quy luật mẫn cảm của các nhóm tuổi, đặc biệt là giai đoạn 1-6 ngày tuổi có tỷ lệ nhiễm lên đến 66,70%, để xây dựng phác đồ hộ lý chuồng đẻ, kiểm soát nhiệt độ và bổ sung chất điện giải chủ động.
• Học viên cao học, nghiên cứu sinh chuyên ngành Thú y và Bệnh lý học: Tham khảo khung thiết kế nghiên cứu thực nghiệm chuẩn mực, quy trình cắt đúc mô paraffin 3-5 µm, kỹ thuật nhuộm kép HE và phương pháp chuẩn độ kháng thể trong hóa mô miễn dịch.
• Kỹ thuật viên xét nghiệm tại các phòng phân tích sinh học phân tử: Áp dụng chi tiết chu kỳ nhiệt phản ứng RT-PCR khuếch đại gen S 651 bp và quy trình cấy chuyển tế bào Vero-NIH đạt hiệu quả CPE 80-90% phục vụ công tác chẩn đoán dịch tễ chuyên sâu.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao bệnh PED lại gây tỷ lệ tử vong cao tới gần 100% ở lợn sơ sinh dưới 5 ngày tuổi? Lợn sơ sinh có hệ miễn dịch chưa hoàn thiện và phụ thuộc hoàn toàn vào kháng thể mẹ truyền. Virus PED tấn công trực tiếp vào tế bào biểu mô nhung mao ruột non, làm giảm tỷ lệ chiều cao lông nhung từ 7:1 xuống 3:1 chỉ sau 24-36 giờ. Sự phá hủy này làm mất hoàn toàn men tiêu hóa đường sữa, gây tiêu chảy thẩm thấu, mất nước nghiêm trọng và kiệt sức dẫn đến tử vong nhanh chóng.

2. Bệnh tích đại thể điển hình nhất để phân biệt lợn Landrace mắc PED là gì? Bệnh tích điển hình nhất được ghi nhận ở 100% ca bệnh là toàn bộ đoạn ruột non căng phồng, thành ruột bị bào mỏng đến mức gần như trong suốt và chứa dịch lỏng màu vàng xám có bọt khí. Đồng thời, 77,27% trường hợp có dạ dày căng đầy các cục sữa đông vón không tiêu và 100% hạch màng treo ruột sưng to, xuất huyết rõ rệt.

3. Kỹ thuật Hóa mô miễn dịch (IHC) mang lại lợi thế gì so với phương pháp RT-PCR? Mặc dù RT-PCR có độ nhạy cao trong phát hiện ARN virus (đạt 46,87% trong nghiên cứu), phương pháp này không chỉ ra được vị trí tổn thương thực tế. Kỹ thuật IHC gián tiếp sử dụng phức hợp kháng thể gắn DAB cho phép định vị trực tiếp kháng nguyên virus bắt màu nâu vàng ngay trên bề mặt tế bào biểu mô lông nhung, giúp đánh giá chính xác mức độ hoại tử mô học.

4. Khảo sát thực địa ghi nhận tình hình nhiễm PED tại miền Bắc Việt Nam như thế nào? Trong tổng số 64 ca bệnh nghi nhiễm được thu thập tại 4 tỉnh chăn nuôi trọng điểm (Hải Dương, Hưng Yên, Thái Bình, Bắc Ninh), có tới 30 ca dương tính với PEDV qua kiểm tra RT-PCR. Tỷ lệ nhiễm tập trung cao nhất ở đàn lợn con theo mẹ dưới 14 ngày tuổi với tỷ lệ mắc vượt trên 56%, cho thấy mầm bệnh đang lưu hành thành dịch địa phương nguy hiểm.

5. Mẫu bệnh phẩm nào là phù hợp nhất để chẩn đoán chính xác bệnh PED bằng kỹ thuật IHC? Mẫu bệnh phẩm tối ưu nhất là các đoạn ruột non (đặc biệt là không tràng và hồi tràng) còn chứa chất dịch bên trong, được mổ khám thu thập từ những con lợn mới phát bệnh tiêu chảy trong 24 đến 48 giờ đầu. Mẫu bệnh phẩm lấy từ lợn đã chết tự nhiên lâu ngày thường bị thối rữa niêm mạc, làm mất kháng nguyên bề mặt và dẫn đến kết quả âm tính giả.

Kết luận

• Luận văn đã xác định chính xác tỷ lệ nhiễm virus PED trên 64 ca lợn Landrace nghi mắc tại 4 tỉnh phía Bắc đạt 46,87%, khẳng định PEDV là tác nhân gây bệnh tiêu chảy cấp tính chủ yếu trên đàn lợn con.
• Xác lập đặc điểm lâm sàng và dịch tễ học rõ nét với nhóm lợn 1-6 ngày tuổi có tỷ lệ nhiễm cao nhất đạt 66,70%, giảm dần theo độ tuổi xuống mức 16,70% ở lợn choai.
• Mô tả chi tiết tổn thương giải phẫu bệnh học với 100% ca bệnh có thành ruột mỏng căng phồng dịch vàng, 100% hạch màng treo ruột sưng xuất huyết và chiều cao lông nhung ruột non sụt giảm nghiêm trọng từ 7:1 xuống 3:1.
• Chuẩn hóa thành công quy trình nhuộm Hóa mô miễn dịch (IHC) gián tiếp bằng kháng thể đặc hiệu và chất hiện màu DAB, chứng minh kháng nguyên virus tập trung đậm đặc tại tế bào biểu mô lông nhung và tuyến ruột.
• Đóng góp nguồn ngữ liệu khoa học thực chứng có giá trị chuyển giao công nghệ cho các cơ sở chẩn đoán xét nghiệm thú y và cung cấp nền tảng phục vụ phân lập virus trên tế bào Vero-NIH.

Kế hoạch tiếp theo trong vòng 12 tháng tới cần tập trung mở rộng quy mô tinh sạch kháng thể và hoàn thiện quy trình sản xuất sinh phẩm vắc-xin phòng bệnh. Các trang trại chăn nuôi và cơ quan quản lý thú y cần chủ động áp dụng ngay quy trình giám sát phân tử kết hợp kiểm soát an toàn sinh học để khống chế triệt để dịch PED, bảo vệ an toàn cho đàn lợn giống quốc gia.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ YẾN NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA BỆNH TIÊU CHẢY THÀNH DỊCH (PED) TRÊN LỢN LANDRACE VÀ ÁP DỤNG KỸ THUẬT HÓA MÔ MIỄN DỊCH TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH Ngành: Thú y Mã số: 60.01 Người hướng dẫn khoa học: PGS. Nguyễn Thị Lan NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Yến i LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình.

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc PGS. Nguyễn Thị Lan đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Bộ môn Bệnh lý thú y, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học thú y và bộ môn Bệnh lý thú y đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn. Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Yến ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN. II MỤC LỤC. III DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .VI DANH MỤC BẢNG.

VII DANH MỤC HÌNH. VIII TRÍCH YẾU LUẬN VĂN. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI.

PHẠM VI NGHIÊN CỨU. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI. Ý NGHĨA KHOA HỌC.

Ý NGHĨA THỰC TIỄN. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH PED TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH PED TRONG NƯỚC.

TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH PED NGOÀI NƯỚC. MỘT SỐ THÔNG TIN VỀ VIRUS GÂY BỆNH PED. PHÂN LOẠI VÀ HÌNH THÁI CỦA VIRUS GÂY BỆNH PED. CẤU TRÚC PHÂN TỬ CỦA VIRUS GÂY BỆNH.

TÍNH CHẤT NUÔI CẤY. SỨC ĐỀ KHÁNG CỦA VIRUS GÂY BỆNH PED. TRUYỀN NHIỄM HỌC. TRIỆU CHỨNG VÀ BỆNH TÍCH.

PHÒNG BỆNH. 18 iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. SƠ LƯỢC VỀ HÓA MÔ MIỄN DỊCH. LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN.

KHÁNG NGUYÊN (ANTIGEN). KHÁNG THỂ (ANTIBODY). CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHÁNG THỂ. CÁC PHƯƠNG PHÁP NHUỘM.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU. ĐỐI TƯỢNG/VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU.

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. PHƯƠNG PHÁP THEO DÕI TRIỆU CHỨNG LÂM SÀNG. PHƯƠNG PHÁP RT-PCR.

PHƯƠNG PHÁP MỔ KHÁM, QUAN SÁT BỆNH TÍCH ĐẠI THỂ. PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN VI THỂ VÀ QUAN SÁT BỆNH TÍCH TRÊN TIÊU BẢN. PHƯƠNG PHÁP NHUỘM HÓA MÔ MIỄN DỊCH. PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY TẾ BÀO.

PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VIRUS. XỬ LÝ SỐ LIỆU. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA LỢN LANDRACE MẮC PED.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CÁC TRIỆU CHỨNG LÂM SÀNG CHỦ YẾU CỦA LỢN LANDRACE MẮC PED. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ ĐẠI THỂ CỦA LỢN LANDRACE MẮC PED. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ VI THỂ CỦA LỢN LANDRACE MẮC PED. KẾT QUẢ NHUỘM HÓA MÔ MIỄN DỊCH.

50 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. KẾT QUẢ NHUỘM HÓA MÔ MIỄN DỊCH. SO SÁNH KẾT QUẢ NHUỘM HÓA MÔ MIỄN DỊCH VỚI CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN KHÁC. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.

57 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 58 v LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt CPE - Cytopathogenic effect DAB - 3,3'-Diaminobenzidine DMEM - Dµlbecco's Modified Eagle's medium DMSO - Dimethyl sµlfoxide E - Envelop Protein EDTA - Ethylendiamin Tetraacetic Acid ELISA - Enzym Linked Immunorobent Assay FBS - Fetal bovine serum IHC - Immunohistochemistry N - Nuclecapxit protein M - Membrain protein ORF3 - Open reading frame 3 PBS - Phosphat buffer salin PED - Porcine Epidemic Diarrhea PEDV - Porcine Epidemic Diarrhea virus RNA - Ribonucleic acid RT-PCR - Reverse transcription polymerase chain reaction S - Spike protein TBE - Tris-borate-EDTA buffer TGE - Transmissible gastroenteritis TPB - Tryptose Phosphate Broth vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC BẢNG Bảng 3. Thành phần phản ứng RT-PCR. Nhiệt độ và thời gian trong từng giai đoạn của chu kỳ nhiệt phản ứng RT-PCR.

Thông tin các ca bệnh chẩn đoán PED. Kết quả chẩn đoán PED bằng phản ứng RT-PCR. Kết quả phản ứng RT-PCR và PCR xác định sự có mặt của một số virus gây tiêu chảy trên lợn. Kết quả nghiên cứu triệu chứng lâm sàng của lợn Landrace mắc PED.

Bệnh tích đại thể trên một số cơ quan của lợn Landrace mắc PED. Kết quả nghiên cứu bệnh tích vi thể ở ruột của lợn mắc tiêu chảy do virus (PED). Bệnh tích vi thể ở một số cơ quan của lợn con mắc tiêu chảy do virus (PED). Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch mẫu ruột của lợn Landrace mắc PED.

So sánh kết quả của một số phương pháp chẩn đoán virus PED. 54 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC HÌNH Hình 2. Những không bào trong bào tương của một tế bào hấp thu ở ruột non lợn, chứa các hạt virus PED có đường kính từ 90-190 nm (x20. Virus PED chủng KPEDV-9 phân lập tại Hàn Quốc nhuộm với urany acetat 2%.

Chiều dài thanh nằm ngang tương đương 100nm. Mô hình cấu trúc bộ gen virus PED. Mô hình nguyên lý của phản ứng RT-PCR. Hình ảnh Test chẩn đoán nhanh bệnh PED.

Kháng thể đa dòng và kháng thể đơn dòng. Một số phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch (IHC). Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR. Lợn sút cân, gầy còm.

Lợn mệt mỏi. Lợn nằm dồn đống. Phân dính hậu môn, chân. Phân lỏng màu vàng.

Lợn bị tiêu chảy. Dạ dày, ruột căng, thành mỏng. Hạch màng treo ruột sưng to. Thành ruột mỏng, xuất huyết.

Ống dưỡng chất sung huyết. Dạ dày xuất huyết. Lách sẫm màu. Phổi chứa nhiều bọt.

Hạch bẹn nông sưng. Thận xuất huyết điểm. Biểu mô dạ dày đứt nát (HE 10X). Hoại tử tế bào biểu mô ruột (HE 20X).

49 viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Tĩnh mạch chứa nhiều hồng cầu (HE 10X). Ruột thấm nước phù ở hạ niêm mạc ruột (HE 10X). Lông nhung ruột đứt nát (HE 10X).

Thâm nhiễm tế bào viêm ở ruột (HE 10X). Phổi nhiều tế bào viêm, tổ chức kẽ phổi tăng sinh (HE 10X). Sung huyết hạ niêm mạc ruột (HE 20X). Hồng cầu tràn lan ở hạch (HE 10X).

Lông nhung ruột tù đầu (HE 10X). Virus ở tế bào biểu mô ruột. Virus tập trung ở phần lông nhung bị đứt nát. Virus ở tế bào biểu mô ruột.

Virus tập trung ở phần lông nhung bị đứt nát. Tế bào Vero bình thường. Tế bào Vero khi bắt đầu có bệnh tích. Bệnh tích tế bào đang phát triển.

Tế bào bị Phá hủy hoàn toàn. 53 ix LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Thị Yến Tên Luận văn: Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của bệnh tiêu chảy thành dịch (PED) trên lợn Landrace và áp dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch trong chẩn đoán bệnh Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60.01 Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Giúp chẩn đoán nhanh và chính xác bệnh do virus PED gây ra trên lợn. Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng của lợn Landrace mắc bệnh PED. Nghiên cứu bệnh tích đại thể của lợn Landrace mắc bệnh PED.

Nghiên cứu bệnh tích vi thể của lợn Landrace mắc bệnh PED. Nghiên cứu áp dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch trong chẩn đoán bệnh. Máy chuyển đúc mẫu tự động, máy cắt tổ chức Microtom, máy làm khô tiêu bản, kính hiển vi quang học, máy ly tâm, máy gia nhiệt PCR. Formol 10%, paraffin, xylen, thuốc nhuộm Hematoxilin – Eosin, 10% FBS, dung dịch đệm EDTA; dòng tế bào Vero-NIH; DMEM, FBS, kit tách chiết RNA tổng số, cặp mồi gene S, kit phản ứng RT-PCR, đệm TBE, agarose.

Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu của lợn Landrace mắc bệnh PED bằng các phương pháp: phương pháp khám lâm sàng; phương pháp RT- PCR; phương pháp mổ khám, quan sát bệnh tích đại thể; phương pháp làm tiêu bản vi thể và quan sát bệnh tích trên tiêu bản; phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch, phương pháp phân lập virus. Kết quả chính và kết luận Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra một số đặc điểm bệnh lý trên 22 lợn Landrace mắc PED là: - Triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn mắc PED: sốt, ủ rũ, mệt mỏi, gầy sút, giảm ăn, nằm dồn đống, sốt, nôn. - Bệnh tích đại thể của lợn mắc PED: Bệnh tích ở ruột: Ruột căng phồng, thành mỏng, chứa dịch vàng, xuất huyết (100%). Bệnh tích ở dạ dày: dạ dày căng phồng, chứa thức ăn không tiêu, xuất huyết (77,27%).

Hạch lympho lâm ba sưng to, xuất huyết, sung huyết (100%). Phổi viêm, xuất huyết (40,91%). Thận xuất huyết điểm (63,63%). - Bệnh tích vi thể ở ruột: Ruột non: lông nhung đứt nát, ngắn lại; tế bào biểu mô bong tróc, thoái hóa, hoại tử, thâm nhiễm tế bào viêm và xuất huyết ở lớp đệm, lớp hạ x LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] niêm mạc; ruột già: Tuyến Lieberkuun đứt nát, tế bào biểu mô bong tróc.

Bệnh tích ở dạ dày: Tế bào niêm mạc bong tróc, viêm. Bệnh tích hạch màng treo ruột: viêm hạch, xuất huyết.