HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ YẾN NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA BỆNH TIÊU CHẢY THÀNH DỊCH (PED) TRÊN LỢN LANDRACE VÀ ÁP DỤNG KỸ THUẬT HÓA MÔ MIỄN DỊCH TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH Ngành: Thú y Mã số: 60.01 Người hướng dẫn khoa học: PGS. Nguyễn Thị Lan NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Yến i LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình.
Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc PGS. Nguyễn Thị Lan đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Bộ môn Bệnh lý thú y, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học thú y và bộ môn Bệnh lý thú y đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn. Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Yến ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN. II MỤC LỤC. III DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .VI DANH MỤC BẢNG.
VII DANH MỤC HÌNH. VIII TRÍCH YẾU LUẬN VĂN. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI.
PHẠM VI NGHIÊN CỨU. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI. Ý NGHĨA KHOA HỌC.
Ý NGHĨA THỰC TIỄN. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH PED TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH PED TRONG NƯỚC.
TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH PED NGOÀI NƯỚC. MỘT SỐ THÔNG TIN VỀ VIRUS GÂY BỆNH PED. PHÂN LOẠI VÀ HÌNH THÁI CỦA VIRUS GÂY BỆNH PED. CẤU TRÚC PHÂN TỬ CỦA VIRUS GÂY BỆNH.
TÍNH CHẤT NUÔI CẤY. SỨC ĐỀ KHÁNG CỦA VIRUS GÂY BỆNH PED. TRUYỀN NHIỄM HỌC. TRIỆU CHỨNG VÀ BỆNH TÍCH.
PHÒNG BỆNH. 18 iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. SƠ LƯỢC VỀ HÓA MÔ MIỄN DỊCH. LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN.
KHÁNG NGUYÊN (ANTIGEN). KHÁNG THỂ (ANTIBODY). CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHÁNG THỂ. CÁC PHƯƠNG PHÁP NHUỘM.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU. ĐỐI TƯỢNG/VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU.
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. PHƯƠNG PHÁP THEO DÕI TRIỆU CHỨNG LÂM SÀNG. PHƯƠNG PHÁP RT-PCR.
PHƯƠNG PHÁP MỔ KHÁM, QUAN SÁT BỆNH TÍCH ĐẠI THỂ. PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN VI THỂ VÀ QUAN SÁT BỆNH TÍCH TRÊN TIÊU BẢN. PHƯƠNG PHÁP NHUỘM HÓA MÔ MIỄN DỊCH. PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY TẾ BÀO.
PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VIRUS. XỬ LÝ SỐ LIỆU. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA LỢN LANDRACE MẮC PED.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CÁC TRIỆU CHỨNG LÂM SÀNG CHỦ YẾU CỦA LỢN LANDRACE MẮC PED. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ ĐẠI THỂ CỦA LỢN LANDRACE MẮC PED. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ VI THỂ CỦA LỢN LANDRACE MẮC PED. KẾT QUẢ NHUỘM HÓA MÔ MIỄN DỊCH.
50 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. KẾT QUẢ NHUỘM HÓA MÔ MIỄN DỊCH. SO SÁNH KẾT QUẢ NHUỘM HÓA MÔ MIỄN DỊCH VỚI CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN KHÁC. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.
57 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 58 v LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt CPE - Cytopathogenic effect DAB - 3,3'-Diaminobenzidine DMEM - Dµlbecco's Modified Eagle's medium DMSO - Dimethyl sµlfoxide E - Envelop Protein EDTA - Ethylendiamin Tetraacetic Acid ELISA - Enzym Linked Immunorobent Assay FBS - Fetal bovine serum IHC - Immunohistochemistry N - Nuclecapxit protein M - Membrain protein ORF3 - Open reading frame 3 PBS - Phosphat buffer salin PED - Porcine Epidemic Diarrhea PEDV - Porcine Epidemic Diarrhea virus RNA - Ribonucleic acid RT-PCR - Reverse transcription polymerase chain reaction S - Spike protein TBE - Tris-borate-EDTA buffer TGE - Transmissible gastroenteritis TPB - Tryptose Phosphate Broth vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC BẢNG Bảng 3. Thành phần phản ứng RT-PCR. Nhiệt độ và thời gian trong từng giai đoạn của chu kỳ nhiệt phản ứng RT-PCR.
Thông tin các ca bệnh chẩn đoán PED. Kết quả chẩn đoán PED bằng phản ứng RT-PCR. Kết quả phản ứng RT-PCR và PCR xác định sự có mặt của một số virus gây tiêu chảy trên lợn. Kết quả nghiên cứu triệu chứng lâm sàng của lợn Landrace mắc PED.
Bệnh tích đại thể trên một số cơ quan của lợn Landrace mắc PED. Kết quả nghiên cứu bệnh tích vi thể ở ruột của lợn mắc tiêu chảy do virus (PED). Bệnh tích vi thể ở một số cơ quan của lợn con mắc tiêu chảy do virus (PED). Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch mẫu ruột của lợn Landrace mắc PED.
So sánh kết quả của một số phương pháp chẩn đoán virus PED. 54 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC HÌNH Hình 2. Những không bào trong bào tương của một tế bào hấp thu ở ruột non lợn, chứa các hạt virus PED có đường kính từ 90-190 nm (x20. Virus PED chủng KPEDV-9 phân lập tại Hàn Quốc nhuộm với urany acetat 2%.
Chiều dài thanh nằm ngang tương đương 100nm. Mô hình cấu trúc bộ gen virus PED. Mô hình nguyên lý của phản ứng RT-PCR. Hình ảnh Test chẩn đoán nhanh bệnh PED.
Kháng thể đa dòng và kháng thể đơn dòng. Một số phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch (IHC). Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR. Lợn sút cân, gầy còm.
Lợn mệt mỏi. Lợn nằm dồn đống. Phân dính hậu môn, chân. Phân lỏng màu vàng.
Lợn bị tiêu chảy. Dạ dày, ruột căng, thành mỏng. Hạch màng treo ruột sưng to. Thành ruột mỏng, xuất huyết.
Ống dưỡng chất sung huyết. Dạ dày xuất huyết. Lách sẫm màu. Phổi chứa nhiều bọt.
Hạch bẹn nông sưng. Thận xuất huyết điểm. Biểu mô dạ dày đứt nát (HE 10X). Hoại tử tế bào biểu mô ruột (HE 20X).
49 viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Tĩnh mạch chứa nhiều hồng cầu (HE 10X). Ruột thấm nước phù ở hạ niêm mạc ruột (HE 10X). Lông nhung ruột đứt nát (HE 10X).
Thâm nhiễm tế bào viêm ở ruột (HE 10X). Phổi nhiều tế bào viêm, tổ chức kẽ phổi tăng sinh (HE 10X). Sung huyết hạ niêm mạc ruột (HE 20X). Hồng cầu tràn lan ở hạch (HE 10X).
Lông nhung ruột tù đầu (HE 10X). Virus ở tế bào biểu mô ruột. Virus tập trung ở phần lông nhung bị đứt nát. Virus ở tế bào biểu mô ruột.
Virus tập trung ở phần lông nhung bị đứt nát. Tế bào Vero bình thường. Tế bào Vero khi bắt đầu có bệnh tích. Bệnh tích tế bào đang phát triển.
Tế bào bị Phá hủy hoàn toàn. 53 ix LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Thị Yến Tên Luận văn: Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của bệnh tiêu chảy thành dịch (PED) trên lợn Landrace và áp dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch trong chẩn đoán bệnh Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60.01 Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Giúp chẩn đoán nhanh và chính xác bệnh do virus PED gây ra trên lợn. Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng của lợn Landrace mắc bệnh PED. Nghiên cứu bệnh tích đại thể của lợn Landrace mắc bệnh PED.
Nghiên cứu bệnh tích vi thể của lợn Landrace mắc bệnh PED. Nghiên cứu áp dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch trong chẩn đoán bệnh. Máy chuyển đúc mẫu tự động, máy cắt tổ chức Microtom, máy làm khô tiêu bản, kính hiển vi quang học, máy ly tâm, máy gia nhiệt PCR. Formol 10%, paraffin, xylen, thuốc nhuộm Hematoxilin – Eosin, 10% FBS, dung dịch đệm EDTA; dòng tế bào Vero-NIH; DMEM, FBS, kit tách chiết RNA tổng số, cặp mồi gene S, kit phản ứng RT-PCR, đệm TBE, agarose.
Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu của lợn Landrace mắc bệnh PED bằng các phương pháp: phương pháp khám lâm sàng; phương pháp RT- PCR; phương pháp mổ khám, quan sát bệnh tích đại thể; phương pháp làm tiêu bản vi thể và quan sát bệnh tích trên tiêu bản; phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch, phương pháp phân lập virus. Kết quả chính và kết luận Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra một số đặc điểm bệnh lý trên 22 lợn Landrace mắc PED là: - Triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn mắc PED: sốt, ủ rũ, mệt mỏi, gầy sút, giảm ăn, nằm dồn đống, sốt, nôn. - Bệnh tích đại thể của lợn mắc PED: Bệnh tích ở ruột: Ruột căng phồng, thành mỏng, chứa dịch vàng, xuất huyết (100%). Bệnh tích ở dạ dày: dạ dày căng phồng, chứa thức ăn không tiêu, xuất huyết (77,27%).
Hạch lympho lâm ba sưng to, xuất huyết, sung huyết (100%). Phổi viêm, xuất huyết (40,91%). Thận xuất huyết điểm (63,63%). - Bệnh tích vi thể ở ruột: Ruột non: lông nhung đứt nát, ngắn lại; tế bào biểu mô bong tróc, thoái hóa, hoại tử, thâm nhiễm tế bào viêm và xuất huyết ở lớp đệm, lớp hạ x LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com niêm mạc; ruột già: Tuyến Lieberkuun đứt nát, tế bào biểu mô bong tróc.
Bệnh tích ở dạ dày: Tế bào niêm mạc bong tróc, viêm. Bệnh tích hạch màng treo ruột: viêm hạch, xuất huyết.