Chương 1. Cơ sở lý luận của nghiên cứu Bacillus subtilis là chủng chủ tiềm năng được sử dụng trong nghiên cứu và sản xuất protein tái tổ hợp. Các hệ thống biéu hiện cho B. subtilis được phát triển dé tăng cường mức độ biểu hiện protein như cải thiện độ mạnh của promoter và độ bên của mRNA.
Ngoài việc tôi ưu đê tăng mức độ biêu hiện protein thì việc thu nhận protein sau khi biểu hiện cũng là vấn đề cần quan tâm, đặc biệt là các protein cần độ tỉnh sạch cao. Các khó khăn trong quá trình biểu hiện và thu nhận protein như protein mục tiêu có mức độ biểu hiện thấp, mắt hoạt tính sinh học do sự hình thành liên kết tạo thé vùi, tốn công lao động và chỉ phí cao đề tinh chế protein. Những khó khăn này được giải quyết bằng việc phát triển các đuôi dung hợp giúp hỗ trợ quá trình tinh chế cũng như cải thiện mức độ biểu hiện và độ hòa tan của protein mục tiêu. Trong các đuôi dung hợp ái lực dùng dé tinh chế protein thì His-tag được sử dụng phổ biến nhất.
Tuy nhiên, một số nghiên cứu trên các plasmid biểu hiện cảm ứng bằng IPTG dựa trên họ promoter Pgrac ghi nhận rằng His-tag làm giảm mức độ biểu hiện của các protein biểu hiện cao ở B. Hiện nay, chưa có thông tin rõ ràng về tác động của đuôi dung hợp đầu N lên mức độ biểu hiện của các gen biểu hiện cao và gen biêu hiện thấp B. Đề đánh giá được ảnh hưởng của His-tag lên mức độ biểu hiện của protein dung hợp, luận án này được thực hiện và tập trung vào hai nội dung nghiên cứu chính liên quan đến ảnh hưởng của các đuôi dung hợp His-tag và LysSN-His-tag đầu N lên sự biểu hiện nội bào các protein BgaB, GFP+ và EGFP ở B. Trong đó, LysSN-xHis-tag là đuôi dung hợp kép kết hợp vùng N- terminus của Lysyl tRNA synthetase có nguồn gốc B.
subtilis (LysSN) và His-tag. Mục đích nghiên cứu Luận án này xác định sự ảnh hưởng của các trình tự His-tag ở đầu N đến mức độ biểu hiện các protein biểu hiện cao và biểu hiện thấp 6 B. subtilis và đánh giá tiềm năng sử dụng đuôi dung hợp kép LysSN-xHis-tag trong biểu hiện và tỉnh chế protein tái tổ hợp biểu hiện nội bao ở B. Đối tượng nghiên cứu Các đuôi dung hợp His-tag và LysSN-xHis-tag được gắn vào đầu N của protein B-galactosidase chịu nhiệt (BgaB) và các protein phát huỳnh quang lục GFP+ mang đột biến, có codon tối ưu cho biểu hiện ở E.
coli, biểu hiện cao ở B. subtilis và protein EGFP có codon tối ưu cho tế bào động vật hữu nhũ. Các protein dung hợp được biểu hiện nội bào ở B. subtilis và sử dụng hệ thống biểu hiện pHT mang promoter Pgrac212.
Nội dung nghiên cứu Đề tài gồm có hai nội dung nghiên cứu chính về ảnh hưởng của các đuôi dung hợp đầu N lên mức độ biểu hiện protein nội bào ở Ö. Nội dung nghiên cứu thứ nhất là “Nghiên cứu ảnh hưởng của các trình tự His-tag gắn ở đầu N lên mức độ biểu hiện nội bào của protein tái tổ hợp ở B. Trước tiên để tài đánh giá ảnh hưởng của 8xHis-tag ở đầu N lên mức độ biểu hiện của các protein biểu hiện cao GFP+ và BgaB. Sau đó, dé tài khảo sát ảnh hưởng của ba trình tự His-tag khác nhau (M-6xHis-Thrombin c/s, MEA-8xHis và MRGS-8xHis) dung hợp ở đầu N lên mức độ biểu hiện của protein phát huỳnh quang GFP+ (biểu hiện cao) và protein EGFP (biểu hiện thấp) ở B.
Ngoài ra, đề tài cũng đánh giá mức độ biểu hiện của hai protein phát huỳnh quang này ở B. subtilis và khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung histidine vào môi trường nuôi cấy lên mức độ biểu hiện các protein dung hợp His-tag ở đầu N. Nội dung thứ hai của đề tài “Đánh giá đuôi dung hợp kép LysSN-xHis ở dau N lên mức độ biểu hiện và tỉnh chế protein nội bào ở B. subtilis” được thực hiện thông qua các nội dung: so sánh ảnh hưởng của đuôi dung hợp kép LysSN-6xHis lên mức độ biểu hiện với His-tag và khảo sát số lượng histidine (6x, 8x, 10x) trong đuôi dung hợp kép LysSN-xHis lên mức độ biểu hiện và khả năng tỉnh chế các protein dung hợp.
Kết quả nội dung nghiên cứu này cho thấy tiềm năng của đuôi dung hợp kép LysSN-xHis-tag trong việc tăng cường mức độ biêu hiện nội bao protein dung hợp ở B. subtilis và thuận lợi trong quá trình tinh chế. Phạm vi nghiên cứu Đề tài đánh giá các đuôi dung hợp His-tag và LysSN-His-tag dùng trong biểu hiện nội bào ở B. subtilis sử dụng các gen chi thị egfp, gfp+ và bgaB.
Mức độ biểu hiện của các protein dung hợp này ở B. subtilis sẽ được đánh giá dựa trên quá trình khảo sát biểu hiện. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của nghiên cứu Ý nghĩa khoa học: Xác định được ảnh hưởng của trình tự His-tag ở đầu N lên mức độ biểu hiện protein trên hai nhóm gen biểu hiện cao và biểu hiện thấp ở8. Đánh giá hiệu quả của đuôi dung hợp kép LysSN-xHis lên mức độ biểu hiện và tinh chế protein dung hợp biểu hiện nội bào ở B.
Y nghĩa thực tiễn: Phát triển hệ thống biểu hiện ở B. subtilis có thé tối ưu trình tự đuôi dung hợp đầu N dé làm tăng mức độ biểu hiện của protein dung hợp. Bên cạnh đó, việc nghiên cứu và phát triển duôi dung hợp kép sẽ cung cắp các dit liệu làm cơ sở dé phát triển các vector biểu hiện có đuôi dung hợp cho Ö. subtilis va giúp dong góp kiến thức trong việc phát triển đuôi dung hợp ứng dụng trong biểu hiện và tỉnh chế protein tái tổ hợp biểu hiện nội bào ở B.
Ching chủ Bacillus subtilis B. subtilis là đại diện của vi khuẩn Gram dương có tốc độ tăng trưởng nhanh, hiếu khí, hình que với chiều đài khoảng 2-6 pm và đường kính nhỏ hơn 1 um [34]. Nhiệt độ tăng trưởng tối ưu khoảng 30-35°C và thời gian nhân đôi của tế bao khoảng 20 phút [34]. Hình ảnh tế bào B.
subtilis dưới kính hiền vi điện tử quét được hiển thi ở Hình 2. subtilis thường được tìm thấy trong đất, không gây bệnh, có khả năng hình thành bào tử chịu nhiệt và được Ferdinand Cohn đặt tên vào năm 1872 [91]. Bộ gen của B. subtilis đã được Kunst và cộng sự giải trình tự vào năm 1997, chứa 4.810 bp với hàm lượng GC 43,5% và mã hóa khoảng 4.
Theo hệ thống phân loại Bergey vào năm 2004 [37], B. subtilis thuộc: Giới: Vi khuẩn Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillles Họ: Bacillaceae Giống: Bacillus Loài: B.Tế bao Bacillus subtilis du6i kính hiển vi điện tử quét [140] B. subtilis được FDA công nhận là vi sinh vật an toàn GRAS với các đặc điểm như không gây bệnh, không tạo độc tố và có thể dùng được trong thực phẩm [77]. subtilis có các ưu điểm vượt trội như: (i) môi trường nuôi cấy đơn giản với chỉ phí thấp, chu kỳ lên men ngắn và có khả năng tăng trưởng ở mật độ cao khi lên men quy mô lớn [107]; (ii) bộ gen được giải trình tự hoàn chỉnh và các gen thiết yếu đã được xác định [35]; (iii) có kha năng tiết protein trực tiếp vào môi trường nuôi cấy [127]; (iv) hau hết các protein được tạo ra có trình tự và cấu trúc bậc ba ít sai sót [102].
subtilis là vì khuẩn có nhiều ưu điểm dé sử dụng làm tế bào chủ lý tưởng trong sản xuất protein tái tổ hợp và việc nghiên cứu, ứng dụng B. subtilis ngày càng được day mạnh. subtilis được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như kỹ thuật di truyền, y học, vật liệu sinh học, nông nghiệp, sản xuất các hóa chất và enzyme công nghiệp. subtilis được ding dé sản xuất một số sản phẩm thương mại quan trọng bao gồm các enzyme [31], các protein ngoại lai [27], các loại khang sinh [17], vitamin [1], axit amin [124], đáng chú ý là protease va amylase [91].
subtilis 168 được phân lập sau khi gây đột biến B. subtilis Marburg bằng tia X bởi hai nhà khoa học Paul Burkholder va Norman Giles [13]. Trong nghiên cứu, B. subtilis 168 là chủng được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu và sản xuất công nghiệp.
Tuy nhiên, việc sử dụng chủng B. subtilis này còn tồn tại một số nhược điểm như: thiếu hệ thống biéu hiện hiệu quả [86], tạo ra một nhóm 8 protease phân cắt các protein ngoại bào [98]; plasmid thiếu tính ồn định, dé thất thoát sau nhiều lần phân chia tế bào [87]. Để khắc phục các nhược điểm trên, các chủng như B. subtilis WB600, WB800 được phát triên từ chủng B.
subtilis 168 và mang đột biến loại bỏ lần lượt sáu và tám protease ngoại bao, giúp hạn chế sự phân cắt protein ngoại bao [87]. subtilis 1012 mang đột biến ở các gen /eu48 metB5 rpC2 hsdRMII, được sử dụng trong nghiên cứu vì sức sống mạnh và có thể đễ đàng nuôi cấy trong phòng thí nghiệm [87]. Ngoài ra, cũng có thể sử dụng các phương pháp kỹ thuật sinh học như thay đổi cấu trúc gen đề tăng mức độ biểu hiện protein. Để thu nhận protein tái tổ hợp với hiệu suất cao trong B.
subtilis, bên cạnh việc chọn chủng chủ biểu hiện thích hợp thì các yếu tố như sự ôn định của mRNA, hiệu suất tái tổ hợp, phiên mã và tổng hợp protein phải được tối ưu hóa. Đặc biệt, việc lựa chọn hệ thống promoter phù hợp, tối ưu hoá điều kiện môi trường, và tối ưu hóa quá trình xử lý protein sau khi được sản xuất để đảm bảo hiệu suất và chất lượng của protein. Do đó, việc phát triển các hệ thống biểu hiện phù hợp cho Ö. subtilis và tăng cường mức độ biểu hiện của protein mục tiêu là cần thiết dé ứng dụng rộng rãi B.
subtilis trong nghiên cứu và sản xuất công nghiệp quy mô lớn. Hệ thống biểu hiện ở B. Một số hệ thống biểu hiện ở B. subtilis Promoter cần thiết cho quá trình điều hòa mức độ phiên mã vì promoter kiểm soát sự gắn của RNA polymerase vào DNA.) là trình tự DNA.
được nhận diện bởi nhân tố sigma (ø) của RNA polymerase trong quá trình phiên mã có cấu trúc co bản gồm có: (i) Lõi promoter (Core promoter region) từ vùng -35 đến +20; (ii) Vùng -35 có trình tự bảo tồn TTGACA và vùng -10 có trình tự bảo tồn TATAAT, đây là nơi RNA polymerase holoenzyme bám vào và khởi đầu phiên mã tại vị tri +1. Ở vi khuẩn, RNA polymerase gồm có nhiều tiêu don vị được bảo tồn với lõi do B, B’, @ va hai a hợp thành. Sự kết hợp giữa nhân tố ø với enzyme lõi tạo thành holoenzyme quyết định tính đặc hiệu của promoter; (iii) Yếu tố UP (UP element) nằm ở thượng nguồn (upstream) của vùng -35 và giàu AT.