Khảo sát biểu hiện miRNA-141 trong ung thư vòm họng bằng Real-time PCR

Nghiên cứu biểu hiện bất thường của miRNA-141 bằng kỹ thuật stem-loop real-time PCR. Tìm hiểu ứng dụng tiềm năng trong chẩn đoán bệnh. Kết quả khảo sát chi tiết.

• Tác giả: Đặng Thanh Giang
• Người hướng dẫn: TS. Lao Đức Thuận
• Trường học: Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Khảo Sát Tính Chất Biểu Hiện Bất Thường Của MiRNA-141 Bằng Phương Pháp Stem-Loop Real-Time PCR
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Tp. Hồ Chí Minh

Tóm tắt

I. miRNA 141 Là Gì Tổng Quan Về Dấu Ấn Sinh Học Ung Thư

Ung thư vòm họng (UTVH) là một loại ung thư ác tính phổ biến ở Việt Nam và nhiều khu vực khác trên thế giới. Việc phát hiện sớm và chính xác là yếu tố then chốt để cải thiện tiên lượng bệnh. Trong những năm gần đây, các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu các dấu ấn sinh học tiềm năng, và miRNA-141 nổi lên như một ứng cử viên sáng giá. miRNA-141 là một phân tử sinh học phân tử nhỏ, không mã hóa protein, nhưng đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa biểu hiện gen. Nghiên cứu cho thấy sự biểu hiện bất thường của miRNA-141 có liên quan mật thiết đến sự phát triển và tiến triển của nhiều loại ung thư, bao gồm cả UTVH. Vì vậy, việc tìm hiểu vai trò của miRNA-141 trong UTVH có thể mở ra những hướng đi mới trong chẩn đoán ung thư, tiên lượng ung thư và điều trị ung thư vòm họng.

1.1. miRNA 141 Chìa Khóa Sinh Học Phân Tử Trong Tế Bào

miRNA-141 thuộc nhóm các miRNA có kích thước nhỏ, khoảng 19-24 nucleotide. Chúng không trực tiếp mã hóa protein, nhưng có khả năng điều hòa biểu hiện gen bằng cách liên kết với các phân tử mRNA (RNA thông tin), từ đó ức chế quá trình dịch mã hoặc thúc đẩy sự phân hủy mRNA. Điều này ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protein và các hoạt động chức năng của tế bào. Sự biểu hiện của miRNA-141 có thể thay đổi trong các điều kiện sinh lý và bệnh lý khác nhau, khiến nó trở thành một biomarker ung thư tiềm năng. Các nghiên cứu sử dụng phương pháp sinh học phân tử đã chứng minh sự liên quan của miRNA-141 đến nhiều quá trình quan trọng trong tế bào, bao gồm tăng sinh, chết theo chương trình, di căn và kháng thuốc.

1.2. Ung Thư Vòm Họng Gánh Nặng Bệnh Tật Và Nhu Cầu Chẩn Đoán Sớm

Ung thư vòm họng (UTVH), hay còn gọi là NasoPharyngeal Carcinoma (NPC), là một loại ung thư phổ biến ở khu vực Đông Nam Á và đặc biệt là Việt Nam. Bệnh thường khởi phát âm thầm và khó phát hiện ở giai đoạn sớm, dẫn đến việc chẩn đoán muộn và giảm hiệu quả điều trị. Các phương pháp chẩn đoán hiện tại như nội soi, sinh thiết, và chẩn đoán hình ảnh có những hạn chế nhất định. Do đó, việc tìm kiếm các biomarker mới, nhạy bén và đặc hiệu là vô cùng cần thiết để cải thiện chẩn đoán sớm và cải thiện tiên lượng cho bệnh nhân UTVH.

II. Vấn Đề Nhức Nhối Chẩn Đoán Sớm Ung Thư Vòm Họng

Việc chẩn đoán ung thư vòm họng ở giai đoạn sớm là một thách thức lớn. Các triệu chứng ban đầu thường không rõ ràng, dễ bị nhầm lẫn với các bệnh lý thông thường khác. Nhiều bệnh nhân chỉ được phát hiện bệnh khi đã ở giai đoạn tiến triển, khi các khối u đã lan rộng và gây ra các biến chứng nghiêm trọng. Điều này làm giảm đáng kể khả năng điều trị thành công và kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân. Do đó, cần có những phương pháp chẩn đoán ung thư mới, chính xác và nhanh chóng hơn để phát hiện bệnh ở giai đoạn sớm, khi các phương pháp điều trị có hiệu quả cao nhất.

2.1. Hạn Chế Của Các Phương Pháp Chẩn Đoán Ung Thư Vòm Họng Hiện Tại

Các phương pháp chẩn đoán ung thư vòm họng hiện tại, như nội soi, sinh thiết, và chẩn đoán hình ảnh (CT scan, MRI), có những hạn chế nhất định. Nội soi và sinh thiết là các phương pháp xâm lấn, có thể gây khó chịu và biến chứng cho bệnh nhân. Chẩn đoán hình ảnh có thể không phát hiện được các khối u nhỏ ở giai đoạn sớm. Ngoài ra, việc dự đoán bệnh và tiên lượng ung thư dựa trên các phương pháp này cũng còn nhiều hạn chế.

2.2. Tìm Kiếm Dấu Ấn Sinh Học Hy Vọng Mới Trong Chẩn Đoán Sớm

Trong bối cảnh đó, việc tìm kiếm và ứng dụng các dấu ấn sinh học (biomarkers) trở thành một hướng đi đầy hứa hẹn. Biomarker ung thư có thể là các phân tử protein, DNA, RNA, hoặc các chất chuyển hóa có mặt trong máu, nước tiểu, hoặc các mô của cơ thể. Sự thay đổi về nồng độ hoặc cấu trúc của các biomarker này có thể chỉ ra sự hiện diện của ung thư ở giai đoạn sớm.

III. Cách Phát Hiện Biểu Hiện miRNA 141 Bất Thường qPCR Microarray

Nhiều phương pháp đã được phát triển để phát hiện và định lượng biểu hiện miRNA bao gồm miRNA-141, trong đó qPCR (Quantitative Polymerase Chain Reaction) và microarray là hai phương pháp phổ biến nhất. qPCR, đặc biệt là Stem-loop qPCR, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cho phép phát hiện sự thay đổi nhỏ trong biểu hiện miRNA. Microarray cho phép phân tích đồng thời biểu hiện gen của nhiều miRNA khác nhau, cung cấp cái nhìn tổng quan về sự điều hòa gen trong tế bào ung thư.

3.1. qPCR Real time PCR Chìa Khóa Mở Cánh Cửa Định Lượng miRNA 141

qPCR, hay còn gọi là Real-time PCR, là một kỹ thuật sinh học phân tử mạnh mẽ được sử dụng để khuếch đại và định lượng DNA hoặc RNA. Trong nghiên cứu về miRNA-141, qPCR được sử dụng để đo lường mức độ biểu hiện miRNA trong các mẫu sinh học khác nhau. Kỹ thuật này có độ nhạy cao và độ đặc hiệu cao, cho phép phát hiện và định lượng chính xác ngay cả với lượng miRNA rất nhỏ. Một biến thể cải tiến của qPCR, là Stem-loop qPCR, sử dụng các mồi đặc biệt có cấu trúc vòng thân (stem-loop) để tăng cường độ đặc hiệu và độ nhạy trong việc phát hiện miRNA-141.

3.2. Microarray Bức Tranh Toàn Cảnh Biểu Hiện Gen Trong Tế Bào Ung Thư

Microarray là một công nghệ cho phép phân tích đồng thời biểu hiện gen của hàng ngàn gen hoặc miRNA khác nhau trong một mẫu. Trong nghiên cứu về ung thư vòm họng, microarray có thể được sử dụng để so sánh biểu hiện miRNA giữa các tế bào ung thư và tế bào bình thường, từ đó xác định các miRNA có biểu hiện bất thường, bao gồm cả miRNA-141. Kết quả microarray cung cấp một cái nhìn tổng quan về sự điều hòa gen trong tế bào ung thư, giúp các nhà khoa học hiểu rõ hơn về cơ chế sinh bệnh và tìm kiếm các mục tiêu điều trị tiềm năng.

3.3. Giải Trình Tự Thế Hệ Mới NGS Phân Tích Toàn Diện Bộ Gen

Giải trình tự thế hệ mới (NGS) là một công nghệ sinh học phân tử tiên tiến cho phép giải trình tự DNA hoặc RNA với tốc độ cao và chi phí thấp. Trong nghiên cứu về miRNA-141 và ung thư vòm họng, NGS có thể được sử dụng để xác định các biến thể di truyền hoặc các thay đổi trong biểu hiện gen liên quan đến sự phát triển của bệnh. NGS cũng có thể được sử dụng để phát hiện các miRNA mới hoặc các mục tiêu điều trị tiềm năng.

IV. Nghiên Cứu Cho Thấy miRNA 141 Liên Quan Ung Thư Vòm Họng

Các nghiên cứu gần đây cho thấy miRNA-141 có vai trò quan trọng trong sự phát triển và tiến triển của ung thư vòm họng. Một số nghiên cứu cho thấy miRNA-141 có biểu hiện tăng cao trong các tế bào ung thư vòm họng so với các tế bào bình thường. Sự biểu hiện quá mức của miRNA-141 có thể thúc đẩy sự tăng sinh, di căn và kháng thuốc của tế bào ung thư.

4.1. Vai Trò Của miRNA 141 Trong Quá Trình Di Căn Ung Thư Vòm Họng

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng miRNA-141 có thể thúc đẩy quá trình di căn của tế bào ung thư vòm họng. miRNA-141 có thể ảnh hưởng đến các phân tử tham gia vào quá trình di chuyển và xâm lấn của tế bào, giúp tế bào ung thư lan rộng sang các mô và cơ quan khác. Ức chế miRNA-141 có thể làm giảm khả năng di căn của tế bào ung thư vòm họng.

4.2. miRNA 141 Và Khả Năng Kháng Thuốc Của Tế Bào Ung Thư Vòm Họng

miRNA-141 cũng có thể đóng vai trò trong việc phát triển khả năng kháng thuốc của tế bào ung thư vòm họng. Các nghiên cứu cho thấy miRNA-141 có thể ảnh hưởng đến các protein vận chuyển thuốc hoặc các protein tham gia vào quá trình sửa chữa DNA, giúp tế bào ung thư trở nên ít nhạy cảm hơn với các thuốc hóa trị. Ức chế miRNA-141 có thể làm tăng độ nhạy của tế bào ung thư vòm họng với các thuốc hóa trị.

4.3. Ảnh Hưởng Của miRNA 141 Đến Chu Kỳ Tế Bào Ung Thư Vòm Họng

miRNA-141 có thể ảnh hưởng đến chu kỳ tế bào, quá trình phân chia và sinh sôi của tế bào ung thư vòm họng. Điều này có thể dẫn đến sự tăng sinh không kiểm soát của tế bào ung thư, góp phần vào sự phát triển và tiến triển của bệnh.

V. Ứng Dụng miRNA 141 Trong Chẩn Đoán Điều Trị Ung Thư Vòm Họng

Với những bằng chứng về vai trò của miRNA-141 trong ung thư vòm họng, các nhà khoa học đang nỗ lực phát triển các ứng dụng lâm sàng tiềm năng. miRNA-141 có thể được sử dụng như một dấu ấn sinh học trong chẩn đoán ung thư vòm họng, giúp phát hiện bệnh ở giai đoạn sớm và phân biệt các loại ung thư khác nhau. Ngoài ra, miRNA-141 cũng có thể là một mục tiêu điều trị tiềm năng, với các liệu pháp nhắm vào việc ức chế biểu hiện hoặc hoạt động của miRNA-141 trong tế bào ung thư.

5.1. miRNA 141 Dấu Ấn Sinh Học Tiềm Năng Cho Chẩn Đoán Sớm

Việc sử dụng miRNA-141 làm dấu ấn sinh học có thể giúp cải thiện chẩn đoán sớm ung thư vòm họng. Các xét nghiệm dựa trên miRNA-141 có thể được thực hiện trên mẫu máu hoặc dịch sinh học khác, giúp phát hiện bệnh ở giai đoạn sớm, khi các phương pháp điều trị có hiệu quả cao nhất. Các nghiên cứu cần tập trung vào việc xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm miRNA-141 trong việc chẩn đoán ung thư vòm họng.

5.2. Liệu Pháp Gen Dựa Trên miRNA 141 Hướng Đi Mới Trong Điều Trị

Các liệu pháp gen nhắm vào miRNA-141 có thể là một hướng đi mới trong điều trị ung thư vòm họng. Các liệu pháp này có thể sử dụng các phân tử RNA can thiệp (RNAi) hoặc inhibitor miRNA để ức chế biểu hiện hoặc hoạt động của miRNA-141 trong tế bào ung thư. Hoặc sử dụng mimic miRNA để đưa miRNA-141 vào tế bào. Các thử nghiệm lâm sàng cần được tiến hành để đánh giá tính an toàn và hiệu quả của các liệu pháp này.

VI. Kết Luận Tương Lai Của miRNA 141 Trong Điều Trị Ung Thư

miRNA-141 là một dấu ấn sinh học đầy hứa hẹn trong chẩn đoán và điều trị ung thư vòm họng. Các nghiên cứu đã chứng minh vai trò quan trọng của miRNA-141 trong sự phát triển và tiến triển của bệnh. Tuy nhiên, cần có thêm nhiều nghiên cứu để hiểu rõ hơn về cơ chế tác động của miRNA-141 và phát triển các ứng dụng lâm sàng hiệu quả.

6.1. Nghiên Cứu Sâu Hơn Về Cơ Chế Tác Động Của miRNA 141

Cần có thêm nhiều nghiên cứu để tìm hiểu cơ chế tác dụng của miRNA-141 ở cấp độ phân tử, giúp xác định các mục tiêu điều trị tiềm năng và phát triển các liệu pháp nhắm trúng đích.

6.2. Thử Nghiệm Lâm Sàng Đánh Giá Hiệu Quả Của Liệu Pháp miRNA 141

Các thử nghiệm lâm sàng cần được tiến hành để đánh giá tính an toàn và hiệu quả của các liệu pháp nhắm vào miRNA-141 trong điều trị ung thư vòm họng.

6.3. Điều Trị Cá Nhân Hóa Dựa Trên Hồ Sơ miRNA 141 Của Bệnh Nhân

Trong tương lai, việc phân tích biểu hiện miRNA-141 có thể giúp điều trị cá nhân hóa cho bệnh nhân ung thư vòm họng, lựa chọn các phương pháp điều trị phù hợp nhất dựa trên hồ sơ miRNA của từng bệnh nhân.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1: Giới thiệu Chương 2: Tổng quan tài liệu Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Chương 4: Kết quả và biện luận Chương 5: Kết luận và kiến nghị Tài liệu tham khảo Phụ lục 7 CHƯƠNG II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 8 1. Ung thư vòm họng Hình 2.1: Khu vực vòm họng theo giải phẫu (Vinmec) Ung thư vòm họng (UTVH) (Nasopharyngeal carcinoma) là bệnh tương đối phổ biến xuất hiện nhiều nơi trên thế giới có khối u ác tính ở vùng vòm họng và khu vực trước sau vùng mũi họng. Ung thư này liên quan đến đặc điểm chủng tộc và phân bố địa lý, là một trong những loại ung thư xuất hiện nhiều ở vùng Nam Á với tỷ lệ mắc bệnh cao hơn khoảng 100 lần so với vùng không có nguy cơ (Cho, 2007).

Theo thống kê trên Globocan năm 2020, UTVH là loại ung thư nằm trong top 10 về mức độ lưu hành ở Việt Nam với số người chết lên đến 3706 ca (3,0%) trên tổng số 6040 trường hợp mắc chiếm tỷ lệ 3,3% cho cả hai giới. Các con số trên đang có chiều hướng không ngừng gia tăng. Do đó, UTVH trở thành vấn đề y tế toàn cầu và ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe cộng đồng. Cho đến nay, các nghiên cứu khoa học thực tiễn đã đưa ra một vài giả thuyết cũng như các bằng chứng về nguyên nhân gây nên UTVH.

Có nhiều nguyên nhân gây nên và rất phức tạp nhưng có thể phân thành ba nhóm nguyên nhân lớn sau: (1) Di truyền ; (2) Lây nhiễm từ Epstein Barr Virus (EBV)và (3) Do tiếp xúc với các chất độc hại có khả năng gây ung thư từ môi trường (Frappier, 2012; Q. Hiện nay, việc chẩn đoán UTVH chủ yếu thông qua các xét nghiệm cận lâm sàng như: chẩn đoán hình ảnh (chụp X quang, chụp MRI, chụp CT…), sinh thiết mô, xét nghiệm mô, … Người mắc bệnh UTVH ở giai đoạn đầu thường có dấu hiệu nhẹ (nhức đầu âm ỉ thoáng qua, ù tai, chảy mũi mủ…) hoặc người bệnh không cảm nhận được các triệu chứng nên dễ cho qua và gây nhầm lẫn sang bệnh khác. Khi các biểu hiện bệnh nặng thêm thì bệnh đã ở những giai đoạn gần cuối (đau đầu dữ dội, nghe kém hoặc điếc, chảy máu mũi…), bệnh nhân đau đớn nhiều hơn gây ảnh hưởng đến sinh hoạt và cuộc sống, do các khối u đã lớn dần lên xâm lấn các cơ quan vì vậy việc điều trị sẽ rất khó khăn và khả năng sống sót sẽ thấp xuống. Tuy nhiên, việc nhận biết các dấu hiệu sớm của ung thư vòm họng đang còn gặp nhiều thách thức và chưa rõ ràng trong việc ứng dụng công nghệ khoa học vào việc phát hiện và chẩn đoán bệnh.

Vì vậy, việc nghiên cứu và ứng dụng các dấu chứng sinh học (biomarker) nhằm hỗ trợ trong việc tiên lượng, chẩn đoán sớm là rất cần thiết. Ung thư vòm họng là một loại bệnh lý liên quan đến ung thư ác tính được chia thành 4 giai đoạn, mỗi giai đoạn được phân cấp theo kích thước và sự lan tỏa của khối u như hình 2.2: Giai đoạn 0: Dạng ung thư biểu mô tại chỗ. Giai đoạn này xuất hiện các tế bào lạ thường trong niêm mạc họng và phải được theo dõi tiếp. Giai đoạn I: Giai đoạn này phát hiện khối u nhỏ hơn 2cm và không tìm thấy các hạch bạch huyết.

Giai đoạn II: Khối u lớn dần từ 2-4cm và cũng chưa xuất hiện hạch bạch huyết. Giai đoạn III: Khối u lớn hơn 4cm và đã xuất hiện tại hạch bạch huyết.2: Các giai đoạn bệnh ung thư vòm họng (Hội ung thư Hoa Kỳ AJCC) Giai đoạn IV: Đây là giai đoạn bệnh phát triển khá nhanh và đã đi lan qua một số cơ quan hay khu vực lân cận khác như miệng, tuyến giáp, thực quản… Theo phân loại của Tổ chức Y tế thế giới WHO-1978, Ung thư vòm họng được chia thành ba tuýp (Wei et al., 2011) theo giải phẫu bệnh như sau: Tuýp 1: Ung thư biểu bì tế bào có vảy hóa sừng, nghĩa là biểu hiện tế bào biểu bì có vảy hóa sừng nhưng chúng không xâm lấn sang tế bào khác. Đặc điểm vảy hóa sừng thể hiện sự biến đổi của tế bào, khi chúng trở thành tế bào giống tế bào biểu bì mà ta thường thấy trên da, với lớp vảy keratinized (sừng) bên ngoài. Khi xem qua kính hiển vi, các tế bào này có hình dạng đặc trưng, thường có nhân tế bào lớn, biên rìa không đều.

Tuýp 2: Ung thư biểu mô không hóa sừng, biệt hóa. Trái ngược với tuýp 1, tuýp 2 thường không có sự vảy hóa sừng rõ ràng trong biểu mô của chúng. Thay vào đó, chúng có xu hướng tạo ra các cấu trúc biểu mô với tính chất tương tự với cấu trúc của tuyến, nang, hoặc các cơ quan khác. Ung thư tuýp 2 thường có các biểu hiện về sự biệt hóa tế bào, có nghĩa là tế bào ung thư có xu hướng giống với tế bào bình thường của các cơ quan mà chúng bắt nguồn.

Điều này có thể dẫn đến sự hiện diện của các cấu trúc tương tự như các tế bào của tuyến nang, tuyến tụy, hoặc các loại tế bào khác. Khi xem dưới kính hiển vi, sẽ thấy tế bào có xu hướng hình thành cấu trúc tuyến tính hoặc có đặc điểm biểu mô, chứ không phải là vảy hóa sừng. 11 Tuýp 3: Ung thư biểu mô không hóa sừng, không biệt hóa. Ung thư loại này thường không có sự vảy hóa sừng hoặc các đặc điểm biểu mô rõ ràng trong tế bào.

Chúng thường có tế bào không biệt hóa rõ ràng do đó không tạo ra các cấu trúc tuyến tính hoặc có đặc điểm biểu mô nhất định. Tế bào ung thư thường thiếu các biểu hiện rõ ràng của biệt hóa, làm cho chúng khó nhận diện và phân loại dưới kính hiển vi. Tổng quan về microRNAs (miRNAs) 2.1 MicroRNAs (miRNAs) MicroRNA bản chất là RNA có chiều dài từ 19 đến 24 nucleotide, chúng không mã hóa và chỉ có trong thế bào nhân thật. Các miRNAs có nhiều vai trò trong hầu hết các quá trình sinh học trong tế bào nhưng quan trọng nhất là tham gia vào việc điều hòa sau phiên mã (Ardekani & Naeini, 2010; Filipowicz et al.

Theo các tài liệu khoa học trước đây, các gene mã hóa miRNA chiếm khoảng 5% bộ gene của con người và tham gia điều hòa ít nhất 30% tổng số mRNA (Zen & Zhang, 2012). Đầu những năm 1990, nhà khoa học Vitor đã phát hiện ra hai RNA nhỏ là sản phẩm của miRNA lin-4 trong Caenorhabditis elegans (Vitor Ambros et al). Ở động vật hữu nhũ, có khoảng 2.200 gene miRNA được các nhà khoa học tìm ra, các thông tin về miRNA được tổng hợp và cất giữ trên ngân hàng miRNA (Ardekani & Naeini, 2010) (http://www. Chúng ta có thể tìm thấy các phân tử miRNA trong nhiều loại bệnh phẩm hay dịch tiết trên cơ thể người, chẳng hạn như huyết thanh, huyết tương, nước tiểu, nước bọt… (Zen & Zhang, 2012).

Tuy nhiên, đối với mẫu bệnh huyết tương và huyết thanh thì chúng ta dễ dàng phát hiện được các phân tử miRNA vì chúng có nhiều và luôn ổn định trong loại mẫu này (Zen & Zhang, 2012). Nhiều nhà khoa học trước đây đã làm các phân tích hóa học đối với phân tử miRNA bằng cách cho chúng hoạt động trong môi trường có các RNase với nhiệt độ và pH không phù hợp, kết quả cho thấy rằng các phân tử miRNA hầu như không bị ảnh hưởng (Chen et al., 2008; Mitchell et al., 2008), điều đó cho thấy phân tử miRNA ổn định.2 Quá trình sinh tổng hợp microRNAs 12 Hình 2.3: Tóm tắt quá trình sinh tổng hợp miRNA trưởng thành (Ardekani & Naeini, 2010) Việc sinh tổng hợp miRNA trưởng thành (mature microRNAs) gồm hai quá trình như sau: 1. Quá trình thứ nhất: xảy ra trong nhân được thực hiện bắt đầu từ miRNA của gene kết hợp với phân tử Drosha và phân tử Pasha tạo thành pre- miRNA thứ cấp. Quá trình thứ hai: pre-miRNA từ trong nhân được đưa ra tế bào chất để tiếp tục biến đổi thành miRNA trưởng thành với sự tham gia của phân tử Dicer.

MiRNA trưởng thành là các RNAs nhỏ dài khoảng 22 nucleotide có hoạt tính điều hòa biểu hiện gene sau phiên mã. Cả hai phân tử tham gia vào quá trình phân cắt đều thuộc nhóm RNase III có bản chất endonuclease (Ardekani & Naeini, 2010; Denli et al. 13 Tại nhân, các RNA polymerase II bám lên đoạn gene intron mã hóa cho miRNA để phiên mã tạo thành phân tử miRNA sơ cấp (primary miRNA, pri- miRNA), gene mã hóa này thường dài khoảng 70 nucleotides. Cấu trúc mạch đôi của phân tử pri-miRNA sau khi được tạo thành có từ một đến hai cấu trúc kẹp tóc được mô tả như sau: đầu 5’ được gắn mũ chụp (5’cap) và đầu 3’ có cấu trúc dạng poly(A) (Ardekani & Naeini, 2010).

Tiếp theo, phân tử Drosha kết hợp với phân tử Pasha với sự trợ giúp của nhân tố pri-miRNA để tạo thành phân tử pre-miRNA hay còn gọi là precursor miRNA thứ cấp dài 22nt có đầu 5’ phosphate và 3’ có 2 nucleotide lộ ra (Denli et al., 2004; Sun et al. Protein Drosha có cấu tạo bởi ba domain (dsRBD - dsRNA-binding domain). Chức năng của hai domain trong số đó là enzym RNase III và domain còn lại được gắn với RNA mạch đôi (Hình 2.4: Cấu trúc phân tử Drosha ở người (Lee et al., 2003) Theo các nghiên cứu trước đây, phân tử Drosha có chức năng thiết yếu trong sự hình thành miRNA. Drosha là một protein có hoạt tính phân cắt RNA, được tìm thấy trong nhân và trong bộ máy Golgi của tế bào.

Drosha hoạt động cùng với một protein có tên là Pasha (ở Drosophila) hoặc DGCR8 (ở động vật hữu nhũ) để tạo thành một phức hợp có tính năng phân chia và tiêu hủy từ pri-miRNA thành pre- miRNA. Pri-miRNA là một phân tử RNA dài, được tổng hợp bởi RNA polymerase II. Pri-miRNA có chứa một vùng miRNA (miRNA seed) ở đầu 3' và một vùng đuôi (hairpin loop) ở đầu 5'. Drosha và Pasha/DGCR8 sẽ phân cắt pri-miRNA thành một đoạn RNA ngắn, bao gồm vùng miRNA seed và một số nucleotide ở đầu 5'.

Đoạn RNA này được gọi là pre-miRNA. Pre-miRNA sau đó được vận chuyển đến bộ máy Golgi, nơi nó sẽ được xử lý tiếp theo để tạo thành miRNA. Trong bộ máy Golgi, pre-miRNA sẽ được phân cắt bởi một enzyme có tên là Dicer thành hai đoạn RNA ngắn, mỗi đoạn có chứa một 14 miRNA. Các miRNA này sau đó sẽ được gắn vào các protein Argonaute và tham gia vào quá trình điều hòa biểu hiện gen ở giai đoạn sau phiên mã.

Như vậy, phức hợp Drosha -Pasha/DGCR8 tham gia vào quá trình hình thành phân tử pre-miRNA từ phân tử pri-miRNA.