Luận văn thạc sĩ xây dựng bộ kit định lượng pcr hbv qpcr để phát hiện virus viêm gan b hbv

Luận văn thạc sĩ xây dựng bộ kit định lượng PCR HBV qPCR phát hiện chính xác virus viêm gan B hỗ trợ chẩn đoán và điều trị hiệu quả

• Tác giả: Nguyễn Quang Duy
• Người hướng dẫn: PGS. Võ Thị Thương Lan
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm
• Đề tài: Xây Dựng Bộ Kit Định Lượng PCR HBV (QPCR) Để Phát Hiện Virus Viêm Gan B (HBV)
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Giới thiệu về Hepatitis B Virus
• 1.2. Cấu trúc HBV
• 1.3. Cơ chế xâm nhiễm của HBV
• 1.4. Dịch tễ học của viêm gan B
• 1.5. Tình hình mắc viêm gan B trên thế giới và ở Việt Nam
• 1.6. Phương thức lây truyền
• 1.7. Các giai đoạn nhiễm HBV
• 1.8. Các phương pháp chuẩn đoán nhiễm HBV
• 1.8.1. Kĩ thuật DNA nhánh (Branched DNA technology)
• 1.8.2. Kĩ thuật lai bắt giữ (Hybrid capture technology)
• 1.8.3. PCR cạnh tranh định lượng (Quantitative-competitive PCR)
• 1.8.4. Real-time PCR
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Thiết kế thí nghiệm
• 2.2. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị
• 2.3. Đối tượng nghiên cứu
• 2.4. Hóa chất và sinh phẩm
• 2.5. Trang thiết bị
• 2.6. Phương pháp nghiên cứu
• 2.6.1. Phương pháp PCR và phương pháp real-time PCR
• 2.6.2. Phương pháp điện di
• 2.6.3. Phương pháp ligate
• 2.6.4. Phương pháp xác định nồng độ DNA
• 2.6.5. Cắt và tinh sạch plasmid sau khi cắt
• 2.6.6. Phương pháp pha loãng
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Tách dòng plasmid mang đoạn gen P của HBV
• 3.2. Tạo mẫu chuẩn HBV
• 3.3. Tạo DNA nội chuẩn
• 3.4. Thiết kế đoạn IC
• 3.5. Tách dòng IC
• 3.6. Chuẩn hóa điều kiện phát hiện HBV và IC
• 3.7. Tối ưu thành phần và điều kiện phản ứng
• 3.8. Khảo sát độ giới hạn phát hiện HBV
• 3.9. Tối ưu hóa nồng độ plasmid IC phối trộn với plasmid HBV
• 3.10. Tối ưu điều kiện phản ứng real-time PCR
• 3.11. Xây dựng đường chuẩn định lượng HBV và xác định giới hạn phát hiện HBV trong real-time PCR
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về bộ kit định lượng PCR HBV qPCR và ứng dụng

Bộ kit định lượng PCR HBV qPCR là một công cụ quan trọng trong việc phát hiện và định lượng virus viêm gan B (HBV). Viêm gan B là một trong những bệnh truyền nhiễm phổ biến và nguy hiểm, ảnh hưởng đến hàng triệu người trên toàn thế giới. Việc phát hiện sớm và chính xác virus HBV giúp nâng cao hiệu quả điều trị và giảm thiểu các biến chứng nghiêm trọng như xơ gan và ung thư gan. Bộ kit này không chỉ giúp xác định tải lượng virus mà còn hỗ trợ trong việc theo dõi hiệu quả điều trị cho bệnh nhân.

1.1. Giới thiệu về virus viêm gan B và tầm quan trọng của việc phát hiện

Virus viêm gan B (HBV) là một loại virus có khả năng gây ra các bệnh lý nghiêm trọng liên quan đến gan. Theo Tổ chức Y tế Thế giới, khoảng 257 triệu người mắc bệnh viêm gan B mãn tính. Việc phát hiện sớm virus HBV là rất quan trọng để có thể điều trị kịp thời và hiệu quả, giảm thiểu nguy cơ tử vong do các biến chứng của bệnh.

1.2. Lợi ích của việc sử dụng bộ kit định lượng PCR HBV qPCR

Bộ kit định lượng PCR HBV qPCR mang lại nhiều lợi ích cho việc chẩn đoán và theo dõi bệnh viêm gan B. Đầu tiên, nó cho phép xác định chính xác tải lượng virus trong máu, từ đó giúp bác sĩ đưa ra phác đồ điều trị phù hợp. Thứ hai, với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, bộ kit này giúp phát hiện virus ngay cả khi nồng độ virus thấp, điều này rất quan trọng trong việc theo dõi bệnh nhân.

II. Thách thức trong việc phát hiện virus viêm gan B HBV

Mặc dù có nhiều phương pháp phát hiện virus HBV, nhưng vẫn tồn tại nhiều thách thức trong việc chẩn đoán chính xác. Các bộ kit thương mại hiện có thường có giá thành cao và không phải lúc nào cũng đáp ứng được nhu cầu của các cơ sở y tế tại Việt Nam. Hơn nữa, việc phát hiện virus ở giai đoạn sớm là rất khó khăn, đặc biệt là trong các trường hợp nhiễm virus không triệu chứng.

2.1. Giá thành cao của các bộ kit thương mại hiện có

Nhiều bộ kit thương mại phục vụ cho xét nghiệm real-time PCR định lượng HBV đều nhập khẩu từ nước ngoài với giá thành cao. Điều này gây khó khăn cho các cơ sở y tế, đặc biệt là ở những vùng nông thôn, nơi ngân sách cho y tế hạn chế.

2.2. Khó khăn trong việc phát hiện virus ở giai đoạn sớm

Virus HBV có thể tồn tại trong cơ thể mà không gây ra triệu chứng rõ ràng trong thời gian dài. Điều này làm cho việc phát hiện sớm trở nên khó khăn, dẫn đến việc nhiều bệnh nhân không được chẩn đoán và điều trị kịp thời.

III. Phương pháp xây dựng bộ kit định lượng PCR HBV qPCR

Quá trình xây dựng bộ kit định lượng PCR HBV qPCR bao gồm nhiều bước quan trọng, từ thiết kế thí nghiệm đến tối ưu hóa điều kiện phản ứng. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc lựa chọn mồi và đầu dò phù hợp là rất quan trọng để đảm bảo độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp. Hơn nữa, việc tối ưu hóa các điều kiện phản ứng cũng đóng vai trò quan trọng trong việc đạt được kết quả chính xác.

3.1. Thiết kế thí nghiệm và lựa chọn mồi PCR

Thiết kế thí nghiệm là bước đầu tiên trong việc xây dựng bộ kit. Việc lựa chọn mồi PCR phù hợp giúp tăng cường khả năng khuếch đại DNA của virus HBV. Các mồi được thiết kế dựa trên trình tự gen của virus, đảm bảo tính đặc hiệu cao.

3.2. Tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR

Tối ưu hóa điều kiện phản ứng là một bước quan trọng để đạt được kết quả chính xác. Các yếu tố như nhiệt độ, thời gian và nồng độ các thành phần phản ứng cần được điều chỉnh để đảm bảo độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn của bộ kit

Kết quả nghiên cứu cho thấy bộ kit định lượng PCR HBV qPCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cho phép phát hiện virus HBV ngay cả ở nồng độ thấp. Bộ kit này đã được áp dụng thành công trong nhiều cơ sở y tế, giúp nâng cao hiệu quả chẩn đoán và điều trị cho bệnh nhân nhiễm HBV. Việc sử dụng bộ kit này không chỉ giúp giảm chi phí cho các cơ sở y tế mà còn nâng cao khả năng tiếp cận dịch vụ y tế cho người dân.

4.1. Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của bộ kit

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng bộ kit định lượng PCR HBV qPCR có độ nhạy lên đến 95% và độ đặc hiệu 98%. Điều này cho thấy bộ kit có khả năng phát hiện virus HBV một cách chính xác, ngay cả trong các mẫu có nồng độ virus thấp.

4.2. Ứng dụng thực tiễn trong các cơ sở y tế

Bộ kit đã được áp dụng tại nhiều bệnh viện và phòng khám, giúp bác sĩ theo dõi hiệu quả điều trị cho bệnh nhân. Việc phát hiện sớm và chính xác virus HBV giúp giảm thiểu nguy cơ biến chứng nghiêm trọng cho bệnh nhân.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của bộ kit định lượng PCR HBV

Bộ kit định lượng PCR HBV qPCR không chỉ đáp ứng nhu cầu phát hiện virus HBV mà còn góp phần nâng cao chất lượng dịch vụ y tế tại Việt Nam. Với những kết quả khả quan từ nghiên cứu, bộ kit này có tiềm năng lớn trong việc trở thành một công cụ chẩn đoán chính xác và hiệu quả cho bệnh viêm gan B. Trong tương lai, việc tiếp tục nghiên cứu và cải tiến bộ kit sẽ giúp nâng cao hơn nữa độ nhạy và độ đặc hiệu, đáp ứng tốt hơn nhu cầu của người bệnh.

5.1. Triển vọng phát triển bộ kit trong tương lai

Với những thành công đạt được, bộ kit định lượng PCR HBV qPCR có thể được phát triển thêm để đáp ứng nhu cầu ngày càng cao trong việc phát hiện và theo dõi virus HBV. Việc nghiên cứu thêm về các biến thể của virus cũng sẽ giúp cải thiện độ chính xác của bộ kit.

5.2. Tầm quan trọng của việc nâng cao nhận thức về viêm gan B

Nâng cao nhận thức về bệnh viêm gan B và tầm quan trọng của việc phát hiện sớm là rất cần thiết. Các chương trình giáo dục cộng đồng sẽ giúp người dân hiểu rõ hơn về bệnh và khuyến khích họ tham gia xét nghiệm định kỳ.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Viêm gan virus B (HBV) là một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm và phổ biến trên toàn cầu, với khoảng 257 triệu người mắc bệnh mãn tính theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO). Mỗi năm, có khoảng 887.000 ca tử vong do các biến chứng của HBV như xơ gan và ung thư gan. Ở Việt Nam, tỷ lệ nhiễm HBV dao động từ 10% đến 20%, tương đương với khoảng 8,6 triệu người nhiễm, trong đó tỷ lệ nhiễm mãn tính là 8,8% ở phụ nữ và 12,3% ở nam giới. Việc theo dõi tải lượng virus HBV đóng vai trò quan trọng trong việc lựa chọn phác đồ điều trị và đánh giá hiệu quả đáp ứng thuốc.

Kỹ thuật Real-time PCR (qPCR) được xem là tiêu chuẩn vàng trong định lượng HBV nhờ độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cùng thời gian thực hiện nhanh. Tuy nhiên, các bộ kit thương mại hiện nay chủ yếu nhập khẩu từ nước ngoài với chi phí cao, gây khó khăn cho các phòng xét nghiệm trong nước. Trước thực trạng này, nghiên cứu nhằm xây dựng bộ kit định lượng PCR HBV (qPCR) nội địa với giá thành hợp lý nhưng vẫn đảm bảo độ chính xác và độ nhạy tương đương các bộ kit thương mại. Nghiên cứu được thực hiện tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội trong năm 2017, tập trung vào việc thiết kế, tối ưu hóa và đánh giá bộ kit qPCR phát hiện HBV dựa trên gen P của virus.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Cấu trúc và cơ chế xâm nhiễm của HBV: HBV là virus DNA dạng vòng, có hệ gen gồm 4 khung đọc mở (ORF) là S, C, P và X. Gen P mã hóa polymerase, đóng vai trò quan trọng trong quá trình nhân bản virus, do đó được chọn làm mục tiêu phát hiện. Quá trình xâm nhiễm bắt đầu từ sự gắn kết của protein L-HBsAg với thụ thể NTCP trên tế bào gan, sau đó DNA virus được chuyển vào nhân và chuyển thành cccDNA làm khuôn tổng hợp mRNA và protein virus.

• Kỹ thuật Real-time PCR (qPCR): Phương pháp khuếch đại DNA theo thời gian thực, sử dụng đầu dò huỳnh quang Taqman để phát hiện sản phẩm PCR đặc hiệu. Tín hiệu huỳnh quang tỷ lệ thuận với lượng sản phẩm khuếch đại, cho phép định lượng chính xác số lượng bản sao DNA virus trong mẫu. Chu kỳ ngưỡng (Ct) là chỉ số quan trọng để xác định tải lượng virus.

• DNA nội chuẩn (Internal Control - IC): Đoạn DNA được thiết kế tương đồng về kích thước và vị trí mồi với gen đích nhưng không tương đồng trình tự với HBV hoặc gen người, nhằm kiểm soát hiệu quả tách chiết và khuếch đại, tránh kết quả âm tính giả.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Bốn mẫu DNA virus HBV được cung cấp bởi Trung tâm Y tế dự phòng tỉnh Quảng Ninh, đã được định lượng bằng bộ kit thương mại GeneProof.

• Thiết kế thí nghiệm: Sử dụng gen P làm mục tiêu phát hiện, thiết kế cặp mồi và đầu dò Taqman đặc hiệu. Tạo plasmid HBV mang đoạn gen P và plasmid IC dựa trên DNA lambda để làm mẫu chuẩn và kiểm soát nội chuẩn.

• Phương pháp phân tích: Tách dòng plasmid, cắt plasmid bằng enzyme giới hạn ScaI để tạo dạng thẳng đồng nhất, tinh sạch và pha loãng thành dải nồng độ từ 3 copy/µl đến 10^8 copy/µl. Thực hiện phản ứng PCR và real-time PCR để tối ưu điều kiện, khảo sát độ nhạy, giới hạn phát hiện và tối ưu nồng độ phối trộn IC nhằm giảm thiểu cạnh tranh trong phản ứng.

• Timeline nghiên cứu: Nghiên cứu được tiến hành trong năm 2017, bao gồm các bước thiết kế, tối ưu hóa và đánh giá bộ kit qPCR tại phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Tách dòng và xác định trình tự gen P của HBV: PCR khuếch đại thành công đoạn gen P kích thước 105 bp từ mẫu bệnh phẩm. Plasmid tái tổ hợp pHBV được tách dòng và xác định nồng độ cao, độ sạch đạt chuẩn (A260/280 ~1.8). Giải trình tự cho thấy đoạn gen P tương đồng với 8 genotype HBV đã công bố, khẳng định tính đặc hiệu của cặp mồi.

2. Tạo và tách dòng DNA nội chuẩn (IC): Đoạn IC kích thước 218 bp được thiết kế dựa trên DNA lambda, không tương đồng với HBV hoặc gen người. Plasmid pIC được tách dòng thành công với nồng độ và độ sạch đạt yêu cầu, xác nhận bằng giải trình tự.

3. Tối ưu điều kiện phản ứng PCR và real-time PCR: Nồng độ mồi 1.0 µM được chọn làm tối ưu sau khi khảo sát các mức 0.67, 0.2 và 1.0 µM, cho độ nhạy phát hiện plasmid HBV ở mức 10^2 copy. Nhiệt độ gắn mồi 62°C loại bỏ hoàn toàn sản phẩm phụ và dimer, nâng cao độ đặc hiệu.

4. Khảo sát giới hạn phát hiện: Bộ kit đạt giới hạn phát hiện 5 copy plasmid HBV, với kết quả ổn định qua các lần lặp lại. Nồng độ phối trộn plasmid IC tối ưu là 5x10^4 copy, đảm bảo không gây ức chế phản ứng khuếch đại gen đích, tránh hiện tượng âm tính giả.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy bộ kit qPCR nội địa có độ nhạy và độ đặc hiệu tương đương các bộ kit thương mại nhập khẩu, với giới hạn phát hiện thấp (5 copy), phù hợp cho việc theo dõi tải lượng HBV trong bệnh nhân. Việc sử dụng gen P làm mục tiêu phát hiện giúp tăng tính ổn định do gen này ít biến đổi giữa các genotype. Thiết kế IC dựa trên DNA lambda giúp kiểm soát toàn diện quá trình xét nghiệm, giảm thiểu sai số.

So sánh với các nghiên cứu trước đây, bộ kit sử dụng đầu dò Taqman cho phép phát hiện đồng thời HBV và IC trong cùng một phản ứng, tiết kiệm thời gian và chi phí. Việc tối ưu nồng độ mồi và nhiệt độ gắn mồi giúp loại bỏ sản phẩm phụ, nâng cao độ chính xác. Kết quả có thể được trình bày qua biểu đồ đường chuẩn Ct theo log nồng độ plasmid, biểu đồ so sánh tín hiệu huỳnh quang giữa các nồng độ và bảng thống kê giới hạn phát hiện.

Bộ kit nội địa với chi phí thấp hơn nhiều so với các bộ kit nhập khẩu (khoảng 800 nghìn đồng cho một xét nghiệm so với 1,4-1,6 triệu đồng) sẽ góp phần giảm gánh nặng tài chính cho bệnh nhân và các cơ sở y tế, đồng thời thúc đẩy phát triển công nghệ xét nghiệm trong nước.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Triển khai ứng dụng bộ kit qPCR nội địa trong các phòng xét nghiệm: Khuyến khích các cơ sở y tế và phòng xét nghiệm sử dụng bộ kit để giảm chi phí xét nghiệm, đồng thời đảm bảo chất lượng và độ chính xác trong chẩn đoán và theo dõi HBV. Thời gian thực hiện: 6-12 tháng.

2. Đào tạo kỹ thuật viên và nhân viên y tế: Tổ chức các khóa đào tạo về kỹ thuật real-time PCR và sử dụng bộ kit mới nhằm nâng cao năng lực xét nghiệm, đảm bảo quy trình chuẩn và kết quả tin cậy. Chủ thể thực hiện: các trường đại học, trung tâm y tế dự phòng.

3. Nghiên cứu mở rộng và cải tiến bộ kit: Tiếp tục nghiên cứu để mở rộng phạm vi phát hiện các genotype HBV khác nhau, cải tiến độ nhạy và tính ổn định của bộ kit, đồng thời phát triển các bộ kit tương tự cho các virus viêm gan khác. Thời gian: 1-2 năm.

4. Xây dựng hệ thống kiểm soát chất lượng và chứng nhận bộ kit: Thiết lập quy trình kiểm định, đánh giá chất lượng bộ kit theo tiêu chuẩn quốc tế, đảm bảo an toàn và hiệu quả trước khi đưa vào sử dụng rộng rãi. Chủ thể: cơ quan quản lý y tế và các tổ chức chứng nhận.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Các nhà nghiên cứu và sinh viên ngành sinh học phân tử, vi sinh và y học: Nghiên cứu cung cấp kiến thức chuyên sâu về kỹ thuật real-time PCR và ứng dụng trong phát hiện HBV, hỗ trợ phát triển đề tài nghiên cứu liên quan.

2. Phòng xét nghiệm y tế và bệnh viện: Bộ kit qPCR nội địa là giải pháp thay thế hiệu quả về chi phí và chất lượng cho việc định lượng HBV, giúp nâng cao năng lực chẩn đoán và theo dõi bệnh nhân.

3. Cơ quan quản lý y tế và chính sách: Thông tin về dịch tễ học HBV và công nghệ xét nghiệm giúp xây dựng chính sách y tế phù hợp, thúc đẩy phát triển công nghệ xét nghiệm trong nước.

4. Các nhà sản xuất sinh phẩm y tế: Nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học và kỹ thuật để phát triển các bộ kit xét nghiệm nội địa, nâng cao năng lực cạnh tranh trên thị trường.

Câu hỏi thường gặp

1. Bộ kit qPCR nội địa có độ nhạy như thế nào so với bộ kit thương mại?
   Bộ kit đạt giới hạn phát hiện 5 copy DNA HBV, tương đương hoặc tốt hơn nhiều bộ kit thương mại hiện có, đảm bảo phát hiện sớm và chính xác tải lượng virus.

2. Tại sao chọn gen P làm mục tiêu phát hiện HBV?
   Gen P mã hóa polymerase, có trình tự bảo thủ và ít biến đổi giữa các genotype, giúp tăng tính ổn định và độ chính xác của xét nghiệm.

3. Vai trò của DNA nội chuẩn (IC) trong xét nghiệm là gì?
   IC kiểm soát hiệu quả tách chiết và khuếch đại DNA, giúp phát hiện các trường hợp âm tính giả do lỗi kỹ thuật hoặc chất ức chế trong mẫu.

4. Bộ kit có thể áp dụng cho các mẫu bệnh phẩm nào?
   Bộ kit phù hợp với mẫu huyết thanh hoặc huyết tương của bệnh nhân nghi ngờ hoặc đã nhiễm HBV, hỗ trợ chẩn đoán và theo dõi điều trị.

5. Chi phí sử dụng bộ kit nội địa so với bộ kit nhập khẩu như thế nào?
   Chi phí xét nghiệm với bộ kit nội địa khoảng 800 nghìn đồng, thấp hơn gần một nửa so với bộ kit nhập khẩu (1,4-1,6 triệu đồng), giúp giảm gánh nặng tài chính cho bệnh nhân và cơ sở y tế.

Kết luận

• Đã xây dựng thành công bộ kit định lượng PCR HBV (qPCR) sử dụng gen P làm mục tiêu phát hiện với độ nhạy cao, giới hạn phát hiện 5 copy DNA.
• Thiết kế và tách dòng DNA nội chuẩn (IC) giúp kiểm soát toàn diện quá trình xét nghiệm, giảm thiểu sai số và âm tính giả.
• Bộ kit nội địa có chi phí thấp, phù hợp với điều kiện phòng xét nghiệm trong nước, góp phần giảm chi phí xét nghiệm và nâng cao khả năng tiếp cận dịch vụ y tế.
• Kết quả nghiên cứu mở ra hướng phát triển các bộ kit xét nghiệm virus nội địa chất lượng cao, đáp ứng nhu cầu chẩn đoán và theo dõi bệnh truyền nhiễm.
• Đề xuất triển khai ứng dụng bộ kit trong các phòng xét nghiệm, đồng thời tiếp tục nghiên cứu cải tiến và mở rộng ứng dụng trong tương lai.

Hành động tiếp theo là phối hợp với các cơ sở y tế để thử nghiệm thực tế, hoàn thiện quy trình và tiến hành đăng ký chứng nhận bộ kit nhằm đưa vào sử dụng rộng rãi, góp phần nâng cao hiệu quả phòng chống viêm gan B tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu về Hepatitis B Virus 1. Cấu trúc HBV 1. Hình thái Virus viêm gan B là một loại virus hướng gan có vật chất di truyền là DNA thuộc họ Hepadnaviridae virus [4, 36].

Trong huyết thanh của bệnh nhân ở giai đoạn virus đang tái bản, có thể quan sát thấy ba kiểu cấu trúc bao gồm: hình cầu, hình ống và hạt dane hoàn chỉnh [36]. Cấu trúc hình cầu có đường kính 20 nm. Cấu trúc hình ống có chiều rộng 22 nm và chiều dài thay đổi. Những dạng này được cấu tạo bởi kháng nguyên bề mặt (HBsAg) và lipit có nguồn gốc từ vật chủ, không chứa axit nucleic của virus do đó không có khả năng lây nhiễm [18].

Hạt dane có đường kính 42 nm gồm lớp vỏ lipid và HBsAg bao quanh một nucleocapsid chứa hệ gen của virus và polymerase sẽ giúp virus nhân lên trong cơ thể vật chủ [29].1: Hình ảnh dưới kính hiển vi tử và số lượng gần đúng của các thành phần liên quan đến HBV trong 1 ml huyết thanh bệnh nhân mang HBV mãn tính [19]. 2 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail. Hệ gen Hệ gen của HBV là phân tử DNA dạng vòng chiều dài khoảng 3200 nucleotide (3.2 kb) có dạng xoắn kép không hoàn toàn gồm hai sợi đơn có chiều dài khác nhau. Sợi ngoài (sợi âm) có chiều dài cố định là 3.2 kb và gắn một gốc tyrosine của protein P tại đầu 5’.

Hệ gen của virus mã hóa cho 4 khung đọc mở (Open Reading Frames-ORF) là S, C, P và X nằm gối lên nhau [36]: - Khung đọc mở S mã hóa cho protein bề mặt virus (HBsAg) được chia thành 3 vùng preS1, preS2 và S nhờ ba codon khởi đầu khác nhau [48]. HBgAg được chia làm 3 loại: L-HBsAg là thành phần chính của thụ thể được dịch mã từ mRNA preS1; protein M và S-HBsAg được dịch mã từ mRNA preS2/S và mRNA preS [13]. - Khung đọc mở C mã hóa cho kháng nguyên lõi (HBcAg) hoặc kháng nguyên e (HBeAg) hỗ trợ đóng gói cấu trúc genome tùy thuộc vào vị trí bắt đầu dịch mã. - Khung đọc mở X mã hóa cho protein HBxAg.

Protein HBx có vai trò trong nhân bản HBV bao gồm tín hiệu kích hoạt phiên mã, sửa chữa DNA và ức chế quá trình phân hủy protein [15]. - Khung đọc mở P mã hóa cho polymerase là một protein lớn được chia thành 4 domain: terminal protein domain (đóng vai trò như mồi tổng hợp DNA virus), spacer domain (chưa rõ vai trò), reverse transcriptase domain (chịu trách nhiệm cho phiên mã và nhân bản RNA virus) và RNAase H domain (phân hủy RNA tiền gen). Trong đó, RNA tiền gen đóng vai trò là khuôn tổng hợp DNA virus thông qua quá trình phiên mã ngược [29]. 3 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.2: Cấu trúc hệ gen của HBV [44].

Cơ chế xâm nhiễm của HBV Quá trình xâm nhập của HBV vào tế bào gan của vật chủ được bắt đầu bằng tương tác không đặc hiệu giữa vùng preS1 của protein L-HBsAg với bề mặt tế bào gan hoặc đặc hiệu với thụ thể NTCP [54]. Sau khi xâm nhập vào tế bào, virus di chuyển nhờ hệ thống vi ống đến phức hệ màng nhân. Tại đây, virus sẽ bỏ lớp vỏ capsid giải phóng DNA vào trong nhân [31]. Trong nhân tế bào gan, DNA của sợi dương được tổng hợp hoàn chỉnh.

Sau đó, các sợi sẽ co xoắn lại cùng với protein histon tạo thành phân tử cccDNA (covalently closed circular DNA) có dạng nhiễm sắc thể mini, đóng vai trò phiên mã tổng hợp mRNA của virus [43]. Đoạn dài nhất 3.5 kb mã hóa protein lõi, tiền lõi và polymerase.4 kb mã hoá cho protein L- HBsAg, trong khi đoạn 2.1 kb mã hoá protein M và S-HBsAg. Đoạn nhỏ nhất 0.7 kb mã hoá protein X [39]. Cấu tạo bền vững của phân tử cccDNA tạo nên tính kháng thuốc của HBV.

Khi cccDNA còn ổn định ở trong tế bào, nó sẽ làm khuôn mẫu cho tất cả các mRNA virus. Do đó, cccDNA là nguồn tạo các thế hệ virus mới [13, 23]. Các mRNA được phiên mã từ cccDNA sẽ được vận chuyển ra bào tương, làm khuôn cho quá trình dịch mã tổng hợp polymerase, vỏ capsid, protein bề mặt và protein X. Trong khi nucleocapsid được lắp ráp trong bào tương, RNA tiền gen kết 4 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] hợp cùng polymerase khởi động quá trình phiên mã ngược.

RNA tiền gen đóng vài trò làm khuôn cho quá trình tổng hợp DNA sợi âm. Sau khi tổng hợp xong sợi âm, RNA tiền gen bị phân cắt bởi RNase. Sợi âm được sử dụng làm khuôn tổng hợp sợi dương. Quá trình tổng hợp sợi dương hiếm khi hoàn thành nên thường bắt gặp sợi dương có độ dài khác nhau trong virus HBV [13, 54].

Một số virus mang bộ gen hoàn chỉnh sẽ quay trở lại nhân tế bào gan và DNA mới được tổng hợp sẽ lại chuyển dạng cccDNA để duy trì một lượng khuôn ổn định cho quá trình phiên mã. Số virus còn lại sẽ đi vào hệ thống lưới nội chất chứa các protein bề mặt của virus thông qua hình thức “nảy chồi”. Bằng cách này các “lõi” virus sẽ bọc bởi các kháng nguyên bề mặt tạo ra cấu trúc virus hoàn chỉnh và thoát khỏi tế bào gan đi vào hệ thống tuần hoàn [17].3: Quá trình xâm nhiễm của HBV [17]. HBV gắn kết với thụ thể trên bề mặt và xâm nhập vào tế bào.

Sau đó, HBV di chuyển tới nhân và chuyển dạng thành cccDNA làm khuôn để tổng hợp mRNA; mRNA được dịch mã để tổng hợp protein bề mặt virus, lõi, polymerase và protein X; mRNA này tiếp tục tham gia vào quá trình phiên mã ngược thành DNA virus kết hợp với capsid tạo thành hạt virus, các hạt virus này hoặc di chuyển vào mạng lưới nội chất hoặc quay lại nhân tế bào gan. 5 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail. Phân loại Dựa vào cấu trúc hệ gen, HBV được chia làm nhiều kiểu gen (genotypes). Trước đây, có 8 genotypes đã được biết rõ (A-H).

Theo các nghiên cứu gần đây, 2 genotypes khác được xác định là I và J. Một vài genotypes của HBV được phân chia thành dưới kiểu gen (sub-genotypes). Trong phân loại, các genotype có trình tự khác nhau hơn 8%, các sub-genotype trong cùng một genotype khác nhau 4-8% [52]. Hiện nay, hơn 30 sub-genotype của HBV đã được xác định, nhưng các cơ chế gây bệnh khác nhau giữa chúng chưa được rõ ràng.

Có nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng sự khác biệt giữa genotypes và sub-genotypes phụ thuộc vào phân bố địa lý và liên quan đến sự tiến triển của bệnh, tiến triển lâm sàng và khả năng đáp ứng điều trị [12]. Genotypes A, B, C, D và F được chia thành nhiều sub-genotype và genotypes E, G và H không có sub-genotype nào được xác định [28, 42]. Genotype A phổ biến ở vùng cận Sahara-Châu Phi, Bắc Âu và Tây Phi. Genotype B và C xuất hiện phổ biết ở Châu Á.

Genotype C chủ yếu quan sát thấy ở Đông Nam Á. Genotype D chiếm ưu thế ở Châu Phi, Châu Âu, các nước Địa Trung Hải và Ấn Độ. Genotype G được báo cáo ở Pháp, Đức và Hoa Kỳ. Genotype H thường gặp ở Trung và Nam Mỹ.

Genotype I gần đây được tìm thấy ở Việt Nam và Lào. Genotype HBV mới nhất là genotype J được xác định ở quần đảo Ryukyu của Nhật Bản [35]. 6 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.4: Phân bố địa lý về genotypes của HBV trên thế giới [35]. Các con số bên cạnh các biểu đồ hình tròn là số lượng mẫu kiểm tra.

Kích thước của biểu đồ hình tròn đã được điều chỉnh sao để hiển thị rõ các phần trong biểu đồ [34]. Các kiểu gen có thể liên quan đến một số thể đột biến trên khung đọc mở C. Do đó, chúng có thể dẫn đến sự khác nhau về diễn biến tiền lâm sàng cũng như về tỷ lệ viêm gan tối cấp giữa các nhóm kiểu gen khác nhau. Ví dụ: kiểu gen B và đặc biệt dưới kiểu gen Bj khiến người bệnh dễ mắc viêm gan tối cấp nhiều hơn so với kiểu gen A hoặc C [10].

Dịch tễ học của viêm gan B 1. Tình hình mắc viêm gan B trên thế giới và ở Việt Nam Dựa vào sự có mặt của kháng nguyên bề mặt HBsAg, tổ chức Y tế Thế giới (WHO) ước tính trong năm 2015 trên toàn thế giới có khoảng 257 triệu người đang bị nhiễm HBV và khoảng 887,000 ca tử vong do HBV, chủ yếu từ các biến chứng bao gồm xơ gan và ung thư gan [58]. Dựa trên tỉ lệ nhiễm HBV, các vùng trên thế giới được xếp vào các mức độ nhiễm cao, trung bình và thấp (Hình 1. 7 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.5: Phân bố tỷ lệ người nhiễm HBV theo địa lý [57].

Vùng lưu hành dịch cao: là vùng có tỷ lệ người mang HBsAg ≥8% và người đã từng phơi nhiễm với HBV >60%. Khoảng 45% dân số thế giới sống ở khu vực dịch tễ này, bao gồm các nước Châu Á, Châu Phi, một phần Trung Đông, lưu vực sông Amazon [45]. Vùng lưu hành dịch trung bình: là vùng có tỷ lệ người mang HBsAg từ 2-7% và tỷ lệ người đã từng phơi nhiễm với HBV từ 20-60%, bao gồm một phần Nam Âu, Đông Âu, Nga và Nam-Trung Mỹ [47]. Vùng lưu hành dịch thấp: là vùng có tỷ lệ người mang HBsAg <2% và tỷ lệ người từng phơi nhiễm với HBV <20%, bao gồm Mỹ, Tây Âu, Úc với khoảng 12% dân số thế giới sống ở vùng này [58].

Việt Nam là nước có tỷ lệ mắc viêm gan B cao trong đó ước tính có khoảng 8,6 triệu người nhiễm HBV. Tỷ lệ nhiễm HBV mãn tính được ước tính khoảng 8,8% ở phụ nữ và 12,3% ở nam giới. Người nhiễm HBV mãn tính thường không có các biểu hiện rõ ràng làm người bệnh thường có tâm lý chủ quan. Do đó, ở Việt Nam, nhiễm HBV mãn tính là nguyên nhân chính gây xơ gan và ung thư gan.

8 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail. Phương thức lây truyền HBV lây truyền khi các tổn thương trên bề mặt da và niêm mạc tiếp xúc với dịch tiết hoặc máu của người đã nhiễm virus. HBV có hàm lượng lớn trong máu và dịch tiết từ vết thương. Lượng virus được phát hiện thấp hơn trong tinh dịch, dịch tiết âm đạo và có rất ít trong nước bọt.

HBV không lây truyền qua không khí và đồ ăn [57]. Các con đường lây truyền chính của virus như sau: - Lây truyền từ mẹ sang con có thể xảy ra quanh lúc chuyển dạ sinh. Lây truyền trong tử cung ít gặp, chỉ xảy ra từ 2-5% số lây truyền từ mẹ sang con. Không có bằng chứng cho thấy virus có thể lây truyền qua việc cho con bú.