Luận văn thạc sĩ xác định kiểu gen virus viêm gan c trong huyết thanh bệnh nhân viêm gan c bằng kỹ thuật sinh học phân tử rt pcr

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu xác định kiểu gen virus viêm gan C trong huyết thanh bệnh nhân bằng kỹ thuật sinh học phân tử RT PCR hiệu quả.

• Tác giả: Phương Thị Hà
• Người hướng dẫn: Ts.Bs Nguyễn Văn Tiến
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Xác định kiểu gen virus viêm gan C trong huyết thanh bệnh nhân viêm gan C bằng kỹ thuật sinh học phân tử RT-PCR
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2012
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Đặc điểm sinh học virut viêm gan C (HCV)
• 1.1.1. Lịch sử nghiên cứu và phân loại
• 1.1.2. Hình thái cấu trúc virut viêm gan C
• 1.1.3. Genome HCV
• 1.1.4. Gen và Protein
• 1.1.5. Vòng đời của virut viêm gan C

Tóm tắt

I. Tổng quan về virus viêm gan C và thách thức trong chẩn đoán

Virus viêm gan C (HCV) là một trong những nguyên nhân chính gây bệnh viêm gan mạn tính, xơ gan và ung thư gan. Theo Tổ chức Y tế Thế giới, khoảng 170 triệu người trên toàn cầu nhiễm HCV, trong đó Việt Nam có tỷ lệ nhiễm khoảng 6%. HCV có bộ gen ARN, với khả năng biến đổi cao, dẫn đến sự đa dạng về kiểu gen. Việc xác định kiểu gen HCV là rất quan trọng trong việc điều trị và tiên lượng bệnh. Tuy nhiên, việc chẩn đoán chính xác kiểu gen HCV vẫn gặp nhiều thách thức do sự đa dạng này.

1.1. Đặc điểm sinh học của virus viêm gan C

HCV thuộc nhóm virus ARN, có khả năng gây bệnh viêm gan mạn tính. Virus này có cấu trúc phức tạp với nhiều kiểu gen khác nhau, trong đó genotypes 1, 2 và 6 phổ biến ở Việt Nam. Sự đa dạng này làm cho việc chẩn đoán và điều trị trở nên khó khăn hơn.

1.2. Tình hình nhiễm virus viêm gan C tại Việt Nam

Tại Việt Nam, tỷ lệ nhiễm HCV cao, đặc biệt ở những người có nguy cơ như tiêm chích ma túy và người nhận máu. Việc phát hiện sớm và chính xác kiểu gen HCV là cần thiết để có phương pháp điều trị hiệu quả.

II. Phương pháp RT PCR trong xác định kiểu gen virus viêm gan C

Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) là một trong những phương pháp chính để xác định kiểu gen HCV. Phương pháp này cho phép phát hiện và định lượng ARN virus trong huyết thanh bệnh nhân. RT-PCR có nhiều ưu điểm như độ nhạy cao, thời gian thực hiện ngắn và chi phí hợp lý, phù hợp với điều kiện kinh tế của nhiều người dân Việt Nam.

2.1. Nguyên lý hoạt động của kỹ thuật RT PCR

RT-PCR hoạt động dựa trên nguyên lý chuyển đổi ARN thành ADN thông qua enzyme reverse transcriptase, sau đó khuếch đại ADN bằng phản ứng PCR. Phương pháp này cho phép phát hiện sự hiện diện của virus trong mẫu huyết thanh.

2.2. Ưu điểm và nhược điểm của RT PCR

RT-PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, giúp phát hiện virus ngay cả khi nồng độ thấp. Tuy nhiên, phương pháp này không thể phân biệt được các subtype của HCV, điều này có thể dẫn đến nhầm lẫn trong chẩn đoán.

III. Kết quả nghiên cứu về kiểu gen virus viêm gan C

Nghiên cứu đã xác định tỷ lệ người mang kiểu gen HCV bằng phương pháp RT-PCR sử dụng Taqman probe. Kết quả cho thấy kiểu gen 1 là phổ biến nhất, tiếp theo là kiểu gen 2 và 6. Việc xác định chính xác kiểu gen giúp bác sĩ có thể đưa ra phác đồ điều trị phù hợp cho bệnh nhân.

3.1. Tỷ lệ các kiểu gen HCV trong mẫu nghiên cứu

Kết quả cho thấy tỷ lệ kiểu gen 1 chiếm 60%, kiểu gen 2 chiếm 30% và kiểu gen 6 chiếm 10%. Điều này cho thấy sự phân bố không đồng đều của các kiểu gen HCV tại Việt Nam.

3.2. So sánh kết quả RT PCR và phương pháp giải trình tự gen

Kết quả từ RT-PCR được xác nhận bằng phương pháp giải trình tự gen (sequencing) trên đoạn gen NS5B. Phương pháp này cho thấy độ chính xác cao hơn trong việc xác định subtype của HCV.

IV. Ứng dụng thực tiễn của việc xác định kiểu gen HCV

Việc xác định kiểu gen HCV có ý nghĩa quan trọng trong việc lựa chọn phương pháp điều trị. Các kiểu gen khác nhau có thể phản ứng khác nhau với các loại thuốc điều trị. Do đó, việc xác định chính xác kiểu gen giúp tối ưu hóa hiệu quả điều trị và giảm thiểu tác dụng phụ.

4.1. Tác động của kiểu gen đến phác đồ điều trị

Các nghiên cứu cho thấy kiểu gen 1 thường khó điều trị hơn so với các kiểu gen khác. Việc xác định kiểu gen giúp bác sĩ lựa chọn thuốc điều trị phù hợp, từ đó nâng cao hiệu quả điều trị.

4.2. Vai trò của xét nghiệm huyết thanh trong quản lý bệnh viêm gan C

Xét nghiệm huyết thanh giúp theo dõi sự tiến triển của bệnh và hiệu quả điều trị. Việc xác định kiểu gen HCV cũng giúp đánh giá nguy cơ biến chứng như xơ gan và ung thư gan.

V. Kết luận và triển vọng tương lai trong nghiên cứu virus viêm gan C

Nghiên cứu về virus viêm gan C và các phương pháp xác định kiểu gen đang ngày càng được chú trọng. Việc áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử như RT-PCR không chỉ giúp chẩn đoán chính xác mà còn mở ra hướng đi mới trong điều trị bệnh viêm gan C. Tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu để cải thiện độ chính xác và hiệu quả của các phương pháp chẩn đoán.

5.1. Hướng nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực viêm gan C

Cần nghiên cứu sâu hơn về sự biến đổi gen của HCV và ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sự phát triển của virus. Điều này sẽ giúp cải thiện các phương pháp điều trị và phòng ngừa.

5.2. Tầm quan trọng của việc nâng cao nhận thức cộng đồng về viêm gan C

Nâng cao nhận thức về bệnh viêm gan C và các phương pháp phòng ngừa là rất cần thiết. Cần có các chương trình giáo dục sức khỏe để người dân hiểu rõ hơn về bệnh và cách phòng tránh.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Viêm gan C do virus viêm gan C (HCV) là một trong những bệnh lý truyền nhiễm có ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng toàn cầu. Theo Tổ chức Y tế Thế giới, khoảng 170 triệu người trên thế giới, tương đương 2-3% dân số, bị nhiễm HCV. Tại Việt Nam, tỷ lệ nhiễm HCV được ước tính khoảng 6%, thuộc nhóm các quốc gia có tỷ lệ nhiễm cao. Virus HCV có bộ gen ARN với khả năng biến đổi cao do men ARN polymerase không có chức năng sửa sai, dẫn đến sự đa dạng về kiểu gen. Hiện nay, trên thế giới đã xác định được 6 kiểu gen chính của HCV, trong đó tại Việt Nam phổ biến các kiểu gen 1, 2 và 6.

Việc xác định kiểu gen HCV đóng vai trò quan trọng trong tiên lượng điều trị và lựa chọn phác đồ phù hợp, bởi các kiểu gen khác nhau có mức độ đáp ứng điều trị và độc lực khác nhau. Mục tiêu nghiên cứu của luận văn là xác định tỷ lệ các kiểu gen HCV trong huyết thanh bệnh nhân viêm gan C tại Bệnh viện Bạch Mai bằng kỹ thuật sinh học phân tử RT-PCR, đồng thời xác định lại kiểu gen type 1 bằng phương pháp giải trình tự gen (sequencing) trên đoạn gen NS5B nhằm nâng cao độ chính xác trong chẩn đoán.

Nghiên cứu được thực hiện trong khoảng thời gian từ tháng 1/2011 đến tháng 1/2012 tại phòng xét nghiệm Khoa Truyền nhiễm, Bệnh viện Bạch Mai, với tổng số 239 mẫu huyết thanh bệnh nhân dương tính với anti-HCV. Kết quả nghiên cứu góp phần cung cấp dữ liệu dịch tễ học về phân bố kiểu gen HCV tại Việt Nam, hỗ trợ cải thiện hiệu quả điều trị và quản lý bệnh viêm gan C.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình nghiên cứu về virus viêm gan C, đặc biệt tập trung vào:

• Đặc điểm sinh học của HCV: Virus thuộc họ Flaviviridae, có bộ gen ARN đơn sợi dương, kích thước khoảng 9,6 kb, mã hóa cho các protein cấu trúc (Core, E1, E2) và không cấu trúc (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B). Sự đa dạng gen do men ARN polymerase không sửa sai tạo ra nhiều kiểu gen và subtype khác nhau.

• Phân loại kiểu gen HCV: Có 6 kiểu gen chính (1-6) và hơn 50 subtype, phân bố khác nhau theo vùng địa lý. Kiểu gen ảnh hưởng đến độc lực, khả năng gây bệnh và đáp ứng điều trị.

• Kỹ thuật sinh học phân tử trong xác định kiểu gen: RT-PCR sử dụng Taqman probe để phát hiện và định lượng HCV-ARN, kỹ thuật giải trình tự gen (sequencing) trên đoạn NS5B giúp xác định chính xác subtype, tránh nhầm lẫn giữa các kiểu gen gần nhau như type 1 và 6.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: 239 mẫu huyết thanh bệnh nhân dương tính với anti-HCV, thu thập tại Bệnh viện Bạch Mai từ tháng 1/2011 đến tháng 1/2012. Trong đó, 228 mẫu có số lượng virus ≥ 10^2 copies/ml được chọn để xác định kiểu gen.

• Phương pháp chọn mẫu: Mẫu huyết thanh được lựa chọn dựa trên tiêu chuẩn anti-HCV dương tính, không đồng nhiễm HBV, HGV, HIV và có số lượng virus đủ để phân tích.

• Phương pháp phân tích:

  • Tách chiết ARN từ mẫu huyết thanh bằng phương pháp hóa học dựa trên Guanidine và phenol.
  • Tổng hợp cDNA từ ARN bằng men phiên mã ngược với mồi ngẫu nhiên.
  • Định lượng HCV-ARN và xác định kiểu gen bằng kỹ thuật Real-time PCR sử dụng Taqman probe trên vùng 5’NC.
  • Giải trình tự gen đoạn NS5B trên 30 mẫu ngẫu nhiên thuộc kiểu gen 1 để xác định subtype và kiểm tra độ chính xác của RT-PCR.

• Timeline nghiên cứu: Thực hiện trong 12 tháng, từ tháng 1/2011 đến tháng 1/2012, bao gồm thu thập mẫu, phân tích phòng thí nghiệm và xử lý dữ liệu.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Tỷ lệ bệnh nhân dương tính với HCV-ARN: Trong 239 mẫu anti-HCV (+), có 228 mẫu (95,4%) dương tính với HCV-ARN, cho thấy tỷ lệ bệnh nhân viêm gan C mạn tính cao, phù hợp với các báo cáo dịch tễ học trước đó.

2. Phân bố kiểu gen HCV: Trong 228 mẫu xác định kiểu gen, type 1 chiếm tỷ lệ cao nhất với 66,23%, tiếp theo là type 6 chiếm 30,7%, type 2 chiếm 2,19%, không phát hiện type 3. Tỷ lệ này tương đồng với các nghiên cứu trong nước và khu vực.

3. Phân bố kiểu gen theo giới tính và độ tuổi: Nam giới chiếm 71,5% trong nhóm nghiên cứu, với tỷ lệ type 1 là 68,7%, type 6 là 29,5%. Ở nữ giới, type 1 chiếm 60%, type 6 chiếm 33,8%. Kiểu gen phân bố tương đối đồng đều giữa các giới. Nhóm tuổi 30-39 chiếm tỷ lệ nhiễm cao nhất (39,06%), ảnh hưởng lớn đến lực lượng lao động.

4. Độ chính xác của kỹ thuật RT-PCR so với giải trình tự gen: Trong 30 mẫu type 1 được chọn ngẫu nhiên, giải trình tự gen xác định 16 mẫu là type 1 (9 mẫu subtype 1a, 7 mẫu 1b), 11 mẫu thực chất là type 6 với các subtype 6k, 6e, 6f, 6h. Tỷ lệ nhầm lẫn giữa type 1 và 6 khi dùng RT-PCR là 40,74%. Giải trình tự gen không thực hiện được với mẫu có nồng độ virus thấp (<10^3 copies/ml).

Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy RT-PCR là phương pháp phù hợp về mặt kinh tế và kỹ thuật để xác định kiểu gen HCV trong điều kiện phòng thí nghiệm Việt Nam, đặc biệt với mẫu có nồng độ virus cao. Tuy nhiên, tỷ lệ nhầm lẫn đáng kể giữa type 1 và 6 do sự tương đồng trình tự vùng 5’NC làm ảnh hưởng đến độ chính xác, có thể dẫn đến sai lệch trong lựa chọn phác đồ điều trị, vì type 1 thường cần thời gian điều trị dài hơn.

Giải trình tự gen trên đoạn NS5B giúp phân biệt subtype chính xác hơn, giảm nhầm lẫn, nhưng chi phí và yêu cầu kỹ thuật cao, không phù hợp cho tất cả mẫu. Do đó, đề xuất sử dụng RT-PCR làm sàng lọc ban đầu, sau đó giải trình tự gen cho các mẫu type 1 có nồng độ virus >10^3 copies/ml để xác định chính xác subtype.

Phân bố kiểu gen tương đồng với các nghiên cứu trong khu vực Đông Nam Á, phản ánh đặc điểm dịch tễ và lịch sử lây truyền HCV tại Việt Nam. Tỷ lệ nhiễm cao ở nhóm tuổi lao động chính cảnh báo về gánh nặng kinh tế và xã hội của bệnh.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ cột thể hiện tỷ lệ các kiểu gen, biểu đồ tròn phân bố theo giới tính và nhóm tuổi, bảng so sánh kết quả RT-PCR và giải trình tự gen.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Áp dụng kỹ thuật RT-PCR làm phương pháp sàng lọc chính trong xác định kiểu gen HCV nhằm giảm chi phí và thời gian xét nghiệm, phù hợp với điều kiện kinh tế đa số bệnh nhân tại Việt Nam. Thời gian thực hiện: ngay khi có mẫu xét nghiệm.

2. Thực hiện giải trình tự gen đoạn NS5B cho các mẫu xác định là type 1 có nồng độ virus ≥ 10^3 copies/ml để xác định subtype chính xác, tránh nhầm lẫn với type 6, từ đó tối ưu hóa phác đồ điều trị. Chủ thể thực hiện: các trung tâm xét nghiệm chuyên sâu, thời gian: trong vòng 1-2 tuần sau khi có kết quả RT-PCR.

3. Tăng cường đào tạo kỹ thuật viên và nâng cấp trang thiết bị phòng xét nghiệm nhằm nâng cao chất lượng xét nghiệm phân tử, đảm bảo độ chính xác và tin cậy của kết quả. Chủ thể thực hiện: bệnh viện, cơ sở y tế, thời gian: kế hoạch 1-2 năm.

4. Xây dựng cơ sở dữ liệu quốc gia về phân bố kiểu gen HCV để theo dõi xu hướng dịch tễ, hỗ trợ hoạch định chính sách y tế và nghiên cứu phát triển thuốc, vaccine. Chủ thể thực hiện: Bộ Y tế, các viện nghiên cứu, thời gian: triển khai liên tục.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Bác sĩ chuyên khoa truyền nhiễm và gan mật: Nắm bắt kiến thức về phân bố kiểu gen HCV giúp lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp, nâng cao hiệu quả điều trị cho bệnh nhân.

2. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành vi sinh vật học, công nghệ sinh học phân tử: Tài liệu tham khảo về kỹ thuật RT-PCR và giải trình tự gen trong chẩn đoán virus, cũng như đặc điểm sinh học và dịch tễ học HCV.

3. Quản lý y tế và hoạch định chính sách: Cung cấp dữ liệu dịch tễ học về phân bố kiểu gen HCV tại Việt Nam, hỗ trợ xây dựng chiến lược phòng chống và điều trị viêm gan C.

4. Các phòng xét nghiệm y học phân tử: Hướng dẫn kỹ thuật và quy trình thực hiện xét nghiệm định kiểu gen HCV, giúp nâng cao chất lượng xét nghiệm và chuẩn hóa quy trình.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao phải xác định kiểu gen HCV trong điều trị viêm gan C?
   Xác định kiểu gen giúp lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp, vì các kiểu gen khác nhau có mức độ đáp ứng thuốc và thời gian điều trị khác nhau. Ví dụ, kiểu gen 1 thường cần điều trị lâu hơn so với các kiểu gen khác.

2. Kỹ thuật RT-PCR có ưu điểm gì trong xác định kiểu gen HCV?
   RT-PCR nhanh, chi phí thấp, dễ thực hiện và phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm đa số tại Việt Nam. Tuy nhiên, nó không phân biệt được subtype và có thể nhầm lẫn giữa một số kiểu gen gần nhau.

3. Giải trình tự gen (sequencing) có vai trò gì?
   Giải trình tự gen giúp xác định chính xác subtype của HCV, tránh nhầm lẫn giữa các kiểu gen tương tự, từ đó hỗ trợ điều trị hiệu quả hơn. Tuy nhiên, chi phí cao và yêu cầu kỹ thuật phức tạp.

4. Tỷ lệ nhiễm HCV tại Việt Nam hiện nay là bao nhiêu?
   Theo ước tính, khoảng 6% dân số Việt Nam bị nhiễm HCV, thuộc nhóm các quốc gia có tỷ lệ nhiễm cao trên thế giới.

5. Có thể xác định kiểu gen HCV khi nồng độ virus thấp không?
   Kỹ thuật RT-PCR có thể xác định kiểu gen khi nồng độ virus ≥ 10^2 copies/ml, nhưng giải trình tự gen thường không thực hiện được khi nồng độ virus dưới 10^3 copies/ml do hạn chế về độ nhạy.

Kết luận

• Tỷ lệ kiểu gen HCV tại Việt Nam chủ yếu là type 1 (66,23%) và type 6 (30,7%), type 2 chiếm tỷ lệ thấp, không phát hiện type 3 trong mẫu nghiên cứu.
• RT-PCR là phương pháp phù hợp để xác định kiểu gen HCV với chi phí và kỹ thuật phù hợp, nhưng có tỷ lệ nhầm lẫn 40,74% giữa type 1 và 6.
• Giải trình tự gen trên đoạn NS5B giúp xác định subtype chính xác, đặc biệt cần thiết với mẫu type 1 có nồng độ virus cao.
• Phân bố kiểu gen không khác biệt đáng kể theo giới tính, nhưng tập trung nhiều ở nhóm tuổi lao động chính.
• Đề xuất kết hợp RT-PCR và giải trình tự gen để nâng cao độ chính xác trong chẩn đoán và điều trị viêm gan C.

Next steps: Triển khai áp dụng quy trình kết hợp RT-PCR và giải trình tự gen trong các cơ sở y tế lớn, đồng thời mở rộng nghiên cứu phân bố kiểu gen trên diện rộng.

Call-to-action: Các chuyên gia y tế và nhà nghiên cứu nên phối hợp để cập nhật kỹ thuật xét nghiệm và chia sẻ dữ liệu nhằm nâng cao hiệu quả phòng chống và điều trị viêm gan C tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh viêm gan do virut C là có ảnh hưởng lớn đến tình trạng sức khỏe của con người trên toàn thế giới , bởi vì sau khi bị nhiễm virus viêm gan C cấp tính thì có khoảng 70-90% bệnh nhân chuyển từ giai đoạn cấp tính sang giai đoạn mạn tính và có tới 20-25% trong số bệnh nhân này sẽ chuyển qua giai đoạn xơ gan và ung thư gan [17,33,36]. Theo tổ chức y tế thế giới có khoảng 170 triệu người nhiễm virut viêm gan C (HCV), tương ứng với khoảng 2-3% tổng dân số toàn thế giới [14,26].Theo ghi nhận về tình hình nhiễm virut viêm gan C ở Việt Nam thì tỉ lệ người bình thường bị nhiễm căn bệnh này là khoảng 6% [42], xem như là thuộc nhóm các quốc gia có tỉ lệ nhiễm viêm gan C cao trên thế giới [13,42]. HCV là một virut có bộ gen là ARN, trong chu kỳ nhân đôi của virut phải sử dụng men ARN polymerase, mà men này không có khả năng sửa sai trong quá trình tổng hợp ARN, từ đó làm cho bộ gen của virus rất đa dạng nên người ta đã phân virus thành nhiều loại (type) khác nhau[7,50] và con đường lây nhiễm chủ yếu của HCV là qua đường máu. Sau khi xác định được người dương tính với anti-HCV, Bác sĩ trước khi cho chỉ đinh điều trị phải làm xét nghiệm hai yếu tố quan trọng có vai trò tiên lượng cho thành công cũng như thời gian điều trị cần thiết là định lượng số lượng siêu vi trong máu (HCV-ARN) và định kiểu gen của siêu vi gây viêm gan C (HCV Genotypes) [1,37].

Kiểu gen HCV phân bố khác nhau tùy theo vùng địa lý, mỗi châu lục hay mỗi nước có những kiểu gen nổi trội riêng [41,43]. Hiện nay trên thế giới đã biết được 6 loại genotypes và khoảng hơn 50 subtype (dưới type)[3,7], ở Việt Nam phổ biến genotypes 1,2, và 6, kiểu genotype 3 hiếm gặp [1,50]. Để xác định được genotypes HCV thì ngày nay với sự phát triển của công nghệ sinh học, đặc biệt là chuyên ngành công nghệ sinh học phân tử đã phát minh nhiều kỹ thuật để xác định kiểu gen HCV. Trên thế giới có nhiều công ty: Bayer, Beckman Coulter, QIAgen, Roche… đã cho ra đời các bộ kit xác định genotypes HCV với độ chính xác cao.

Tuy nhiên, giá thành của những bộ kit này còn cao nên chưa được áp dụng rộng rãi. Ở Việt Nam phổ biến hai kỹ thuật xác định genotypes 2 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học HCV: Real-time PCR (RT-PCR) và kỹ thuật giải trình tự gen (sequencing). Kỹ thuật Sequencing trong chuẩn đoán có nhiều tính ưu việt trong việc xác định kiểu gen là sự chính xác cao, tránh được những nhầm lẫn trên cùng một type hoặc subtype nhưng phương pháp này cần có các máy móc trang thiết bị hiện đại và điều kiện kỹ thuật cao nên gía thành cao chủ yếu được thực hiện tại các trung tâm nghiên cứu. Kỹ thuật RT-PCR được tiến hành ở tất cả các phòng thí nghiệm PCR do dễ thực hiện không đòi hỏi máy móc trang thiết bị và kỹ thuật cao, giá thành rẻ phù hợp với điều kiện kinh tế của đa số người dân ở Việt Nam,tuy nhiên không xác định được đến subtype và có sự nhầm lẫn giữa type1 và type6.

Với mục đích khuyến cáo bệnh nhân lựa chọn đúng phương pháp xác định genotype, vì vậy tôi chọn đề tài: “Xác định kiểu gen virus viêm gan C trong huyết thanh bệnh nhân viêm gan C bằng kỹ thuật sinh học phân tử RT-PCR”, với những mục tiêu như sau : 1) Xác định tỉ lệ người mang kiểu gen HCV bằng phương pháp RT-PCR sử dụng Taqman probe. 2) Xác định lại kiểu gen Type 1 bằng phương pháp giải trình tự gen (Sequencing) trên đoạn gen NS5B. 3 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Đặc điểm sinh học virut viêm gan C (HCV) 1.

Lịch sử nghiên cứu và phân loại Vào năm 1970, Harvey J.Alter Trưởng khoa nhiễm trùng của bộ phận truyền máu Viện Quốc gia Sức khỏe Hoa Kỳ chứng minh là nhiễm virut sau truyền máu phần lớn là do virut viêm gan không phải là A và cũng không phải là B và được đặt tên là virut không A-không B.Mười bảy năm sau (năm 1987) Michael Houghton, Qui-lim Choo và tập đoàn, Gorge K dung sinh học phân tử định clon để định tính virus không A không B , năm 1989 đã xác định virut không A không B có tên chính thức là virut viêm gan C và được công bố bằng 2 bài trên báo Science[7]. Virus viêm gan C ( Hepatitis C virus - HCV) thuộc nhóm IV (+ssARN) virus ARN. Họ Flaviridae, cùng họ với virus Dengue, Flavivirus West Nile, virus tiêu chảy ở bò ( Bovine viral diarrhea - BVDV). Thuộc loài Hepacivirus[4,8,9].

Virut Viêm gan C hiện nay được xem là nguyên nhân phổ biến nhất gây bệnh viêm gan mạn tính, xơ gan và ung thư gan nguyên phát [6,12]. Hình thái cấu trúc virut viêm gan C Virut viêm gan C là loại virut hướng gan dưới kính hiển vi điện tử người phát hiện HCV có hình cầu, hình đa diện hoặc hình que kích thước nhỏ (Hình 1.1 Hình thái của HCV dƣới kính hiển vi điện tử 4 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học Về cấu trúc của virut viêm gan C bao gồm lõi ARN, nhân core, gai glycoprotein và màng vỏ (Hình 1. Màng vỏ glycoprotein Core Màng vỏ ARN virus Kích thước khoảng 60nm Hình 1. Cấu trúc của virut viêm gan C 1.

Genome HCV Genome của HCV có một lõi chứa vật liệu di truyền là một sợi ARN có tính phân cực dương, bao quanh bởi một màng protein có chức năng bảo vệ tạo hình đa diện đều và gói lại bởi màng lipid từ nguồn của tế bào gan, kích thước của một chuỗi đơn ARN (+) là 9,6 kb. Giống như các chuỗi ARN dương của các loại virut khác, tổ chức genome của virut viêm gan C cũng mang vai trò như một ARN thông tin (mARN) truyền đạt thông tin di truyền cho protein của virut [17,40,47]. Tổ chức Genome của HCV được chia làm hai vùng Vùng cấu trúc mã hóa cho các protein cấu trúc gồm: - Gen C mã hóa cho protein nuclecapsit p22 làm nhiệm vụ gắn với ARN để tạo nuclecapsit. - Gen E1 mã hóa cho glycoprotein vỏ ngoài p33.

- Gen E2 mã hóa cho protein vỏ ngoài gp 70. Vùng không cấu trúc mã hóa cho các protein không cấu trúc bao gồm: 5 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học - Gen NS2 mã hóa cho protein gắn vào màng (p23). - Gen NS3 mã hóa cho proteaza và helicaza (p72). - Gen NS4 được chia thành NS4A mã hóa cho protein p10 và NS4B mã hóa cho protein p27.

- Gen NS5 được chia thành NS5a mã hóa cho replicaza và NS5b mã hóa cho ARN-Polymeraza phụ thuộc ARN cần cho quá trình sao chép. Phân tử ARN dạng mạch thẳng có chứa một đơn khung mở (ORF- open reading frame), mã hóa cho một tiền chuỗi protein với chiều dài khoảng 3000 gốc amino axit (Hình 1. Trong quá trình virrut sao chép chuỗi protein này sẽ được kích hoạt bởi enzyme virut giống như tế bào chủ trong ba protein cấu trúc (gồm nhân lõi-core, E1,E2) và bảy protein không cấu trúc (bao gồm: p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B)[31]. Một protein khác (kí hiệu F-Temed) hoặc ARF (khung đọc thay thế) được dự đoán là kết quả của khung đọc thay thế riboxome trong quá trình sao chép cùng với vùng nhân của hệ gen ARN[39,43,46].

Cấu trúc Không cấu trúc Tổng hợp chuỗi polyprotein Protein Core Glycoprotein vỏ Protease Proteaza và helicaza Replica và ARN-polymerase Hình 1.3: Tổ chức genome HCV 6 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học Các gen cấu trúc mã hóa cho lõi protein của virut và protein vỏ của virut là E1,E2 được đặt ở phần đuôi 5’ của khung đọc mở theo chiều ngược bởi vùng mã hóa cho các protein phi cấu trúc p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B (Hình 1. Các protein cấu trúc là hợp phần quan trọng của virut viêm gan C, do đó các protein phi cấu trúc sẽ không có sự gắn kết với virut xong lại cùng nằm trong quá trình sao chép ARN và morphogenesis virut [50]. ORF (Open reading frame) được cố định ở các vùng không bị mã hóa là vùng 5’ và vùng 3’ (NCRs- Noncoding regions) bao gồm các chuỗi nucleotit có liên quan đến sự điều chỉnh quá trình sao chép của virut. Tất cả các NCR đều có chứa các vùng miền bảo tồn cao so với các vùng protein mã hóa của genome HCV.

Mức độ chuyển hóa cao của các NCRs làm cho chúng thành mục tiêu nghiên cứu: + Nâng cao chất lượng việc chẩn đoán phân tử. + Nghiên cứu cho việc điều trị kháng virut. + Nghiên cứu kháng sinh chống HCV. Phần 5’ NCR có khoảng 341 nucleotit và nó có một cấu trúc phức thứ hai với bốn vùng khác nhau (I-IV) [30], 125 nucleotit đầu tiên của 5’ NCR được phân ba đều ra các vùng I và II là phần cơ bản của quá trình sao chép ARN trong virut [ 21,52].

Chuỗi 3’ NCR có chứa ba vùng chức năng khác nhau: một vùng có thể thay đổi, một chuỗi U/UC có chiều dài thay đổi và đuôi X đã chuyển đổi ở mức độ cao tại đuôi 3’ của hệ gen HCV, vùng thay đổi có chứa khoảng 40 nucleotit và không quan trọng đối với quá trình sao chép ARN. Tuy nhiên nếu bỏ đi chuỗi này có thể dẫn đến việc giảm sút đáng kể hiệu quả của quá trình sao chép[21]. Chiều dài của chuỗi vùng U/UC thay đổi theo các chuỗi HCV khác nhau và nằm trong khoảng từ 7 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Phương Thị Hà Luận văn Thạc sĩ khoa học 30- 80 nucleotit [35]. Chiều dài nhỏ nhất trong vùng này đối với quá trình sao chép ARN được cho là có chứa 26 nucleotit homouridine trong môi trường tế bào [22,49].

Đuôi X với mức chuyển hóa cao có khoảng 98 nucleotit có chứa ba stem-loops (SL1-SL3) [23] và quá trình tiêu hủy hoặc thay thế nucleotit trong các vùng này thường không gây tử vong [23]. Một cách gọi tên khác của quá trình tương tác giữa đuôi 3’ X và SL2 là “ kissing-loop” và một phần phức hợp của vùng mã hóa NS5B đã được mô tả [23,35]. Sự tương tác này bao gồm một cấu trúc ARN tertiary của genome HCV, đây chính là phần quan trọng của quá trình sao chép HCV trong hệ thống môi trường tế bào [23,49]. Cuối cùng cả NCRs đều xuất hiện để làm việc cùng với sự tương tác ARN-ARN theo chiều dài có thể sẽ hình thành một vòng tuần hoàn gen tạm thời [46].