HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN VĂN TÂM ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TRUNG HÒA ĐỘC TỐ NỌC ĐỘC RẮN HỔ MANG (NAJA NAJA) BẰNG KHÁNG THỂ LÒNG ĐỎ (IGY) KHÁNG NỌC RẮN Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.01 Người hướng dẫn khoa học: TS. Lê Văn Phan TS. Nguyễn Hữu Đức NHÀ XUÂT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2018 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 01 tháng 10 năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Văn Tâm i LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ quý báu của quý thầy cô, các anh chị và các bạn. Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cám ơn chân thành tới các thầy cô giáo khoa Công nghệ Sinh học, các thầy cô giáo Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã chia sẻ tri thức và tâm huyết của mình để truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng tôi trong suốt thời gian học tập tại trường.
Đặc biệt tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy TS. Lê Văn Phan, Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam và thầy TS. Nguyễn Hữu Đức, Bộ mộn Công nghệ sinh học Động vật, Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình chỉ bảo, luôn giúp đỡ hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện khóa luận. Tôi xin được gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo cùng toàn thể các anh chị, các bạn trong Công ty TNHH Một Thành Viên AVAC Việt Nam, đặc biệt là các anh chị tại phòng R&D Lab nơi tôi công tác đã tận tình hướng dẫn chỉ bảo, chia sẻ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, các bạn trong tập thể lớp CH24 CNSHC, những người luôn động viên, giúp đỡ tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập, nghiên cứu để hoàn thành tốt luận văn này. Hà Nội, ngày 01 tháng 10 năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Văn Tâm ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN. II MỤC LỤC.
III DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT. VI DANH MỤC BẢNG. VII DANH MỤC HÌNH. VIII TRÍCH YẾU LUẬN VĂN.
IX THESIS ABSTRACT. Tính cấp thiết của đề tài. Mục tiêu đề tài. Phạm vi nghiên cứu.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn. Ý nghĩa khoa học. Ý nghĩa thực tiễn. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.
Tình hình tai nạn do rắn độc cắn trên thế giới và việt nam. Tình hình tai nạn do rắn độc cắn trên Thế giới. Tình hình tai nạn do rắn độc cắn ở Việt Nam. Tổng quan về các loài rắn độc ở việt nam.
Các loài rắn độc ở Việt Nam. Độc tố nọc rắn độc. Các triệu chứng lâm sàng khi rắn độc độc cắn. Phương pháp sơ cứu và điều trị khi rắn độc cắn.
Tống quan về huyết thanh kháng nọc rắn (htknr). Cơ sở miễn dịch học. Kháng thể kháng nọc rắn. Kháng thể lòng đỏ (IgY) kháng nọc rắn.
Tình hình nghiên cứu HTKNR trên Thế giới và Việt Nam. 21 iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Địa điểm nghiên cứu.
Thời gian nghiên cứu. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu. Đối tượng nghiên cứu. Vật liệu nghiên cứu.
Nội dung nghiên cứu. Phương pháp nghiên cứu. Phương pháp xác định liều gây chết 50% trên chuột (LD50). Phương pháp gây miễn dịch cho gà mái với kháng nguyên nọc độc rắn.
Phương pháp đánh giá đáp ứng miễn dịch của gà với kháng nguyên nọc rắn bằng phản ứng ELISA. Phương pháp xác định đặc tính và hàm lượng kháng thể lòng đỏ (IgY) kháng nọc rắn. Phương pháp đánh giá khả năng trung hòa độc tố nọc rắn hổ mang (Naja naja) bằng kháng thể IgY kháng nọc rắn. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.
Kết quả xác định liều nọc rắn gây chết 50% trên chuột (LD50). Kết quả đánh giá đáp ứng miễn dịch của gà mái với kháng nguyên nọc độc rắn. Kết quả tách chiết kháng thể IgY. Kết quả định lượng hàm lượng kháng thể IgY kháng nọc rắn.
Kết quả trung hòa độc tố nọc rắn bằng kháng thể IgY kháng nọc rắn trên tế bào. Kết quả trung hòa độc tố nọc rắn bằng kháng thể IgY kháng nọc rắn trên chuột. Đáp ứng miễn dịch của gà mái với kháng nguyên nọc độc rắn hổ mang (Naja naja). Đặc tính và hàm lượng kháng thể IgY kháng nọc rắn.
45 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Khả năng trung hòa độc tố nọc rắn hổ mang (Naja naja) bằng kháng thể IgY kháng nọc rắn. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 48 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO.
53 v LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt HTKNR Huyết thanh kháng nọc rắn LD50 Lethal Dose 50 FCA Freund’s complete adjuvant FIA Freund’s incomplete adjuvant PBS Phosphate buffered saline µl Microlit µg Microgarm IgY Yolk Immunoglobulin IgG Immuno Globulin G CT50 Killed 50% of the cell ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay FBS Fetal bovine serum BSA Bovine serum albumin SDS Sodium dodecyl sulfate vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. DANH MỤC BẢNG Bảng 2. Triệu chứng rắn độc cắn thuộc họ rắn hổ.
So sánh một số đặc tính của kháng thể (KT) sản xuất từ huyết thanh động vật (IgG) và kháng thể sản xuất từ trứng gia cầm (IgY) (Schade, Calzado et al, 2005). Quy trình gây miễn dịch cho gà mái với kháng nguyên nọc độc rắn. Tỷ lệ chết của chuột ở các lô chuột thí nghiệm được tiêm nọc rắn tại các nồng độ khác nhau. Tỷ lệ của gà xuất hiện các triệu chứng sau gây miễn dịch gà với nọc độc rắn.
Giá trị OD540 và tỷ lệ chết của tế bào khi sử dụng lượng nọc rắn khác nhau được đánh giá bằng phương pháp nhuộm Neutral Red. Giá trị OD540 và tỷ lệ chết của tế bào Vero khi trung hòa độc tố nọc rắn bằng kháng thể IgY – đối chứng và 56 ngày trên tế bào. Tỷ lệ chuột chết ở các lượng kháng thể IgY khác nhau trung hòa độc tố nọc rắn. vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.
DANH MỤC HÌNH Hình 2. Sơ đồ cơ chê gây độc thần kinh qua xi-nap. Sự truyền các loại kháng thể từ huyết thanh sang trứng gà. Hình thái và cấu trúc kháng thể IgG và IgY.
Hình ảnh chuột chết trong các lô thí nghiệm. Giá trị OD405 của các mẫu ở các độ pha loãng khác nhau. Biến động hàm lượng kháng thể của gà sau khi gây miễn dịch với kháng nguyên là nọc độc rắn. Điên di SDS – PAGE kháng thể IgY sau tách chiết.
Hình thái tế bào Vero trong thí nghiệm khi nhuộm Neutral Red. viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Văn Tâm Tên Luận văn: Đánh giá khả năng trung hòa độc tố nọc độc rắn hổ mang (Naja naja) bằng kháng thể lòng đỏ (IgY) kháng nọc rắn. Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60620301 Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch của gà mái cũng như hàm lượng kháng thể thụ động từ gà mái truyền sang trứng đối với kháng nguyên là nọc độc rắn hổ mang Naja naja để làm cơ sở cho nghiên cứu sản xuất kháng thể IgY kháng nọc rắn từ lòng đỏ trứng gà.
Phương pháp nghiên cứu Nọc độc rắn được gây miễn dịch cho gà mái giai đoạn hậu bị (16 – 18 tuần tuổi) với liều gây miễn dịch dựa vào cơ sở xác định liều gây chết 50% trên chuột thí nghiệm (LD50). Phương pháp ELISA được sử dụng để đánh giá hàm lượng kháng thể kháng nọc rắn có trong huyết thanh gà và kháng thể thụ động từ gà mẹ truyền sang trứng. Các phản ứng trung hòa độc tố nọc độc rắn hổ mang (Naja naja) được thực hiện trên môi trường tế bào và trên chuột thí nghiệm. Kết quả chính và kết luận Độc tính của nọc độc rắn hổ mang Naja naja được xác định trên chuột cho kết quả giá trị LD50 = 1,46µg/g.
Kết quả đánh giá hàm lượng kháng thể có trong huyết thanh bằng phản ứng ELISA cho thấy nồng độ kháng thể của gà kháng nọc rắn đạt cao nhất vào ngày 49 và kéo dài đến ngày 111 sau khi gây miễn dịch. Hàm lượng kháng thể thụ động từ gà mẹ truyền qua trứng giá trị cao nhất vào ngày 56 sau gây miễn dịch và kéo dài đến ngày 91. Kết quả đánh giá khả năng trung hòa nọc rắn của kháng thể IgY trong lòng đỏ trứng gà cũng được tiến hành trên chuột Swiss và trên môi trường nuôi cấy tế bào Vero, cho thấy kháng thể IgY tách chiết từ lòng đỏ trứng gà của gà được gây miễn dịch với kháng nguyên là nọc rắn có khả năng trung hòa độc tố của nọc độc rắn (2LD50) trên chuột Swiss cũng như có khả năng trung hòa 5µg nọc rắn bổ sung vào môi trường nuôi cấy của 104 tế bào Vero. Như vậy, với các kết quả trên cho thấy kháng thể IgY thu từ trứng của gà được gây miễn dịch với nọc rắn có khả năng trung hòa độc tố nọc rắn hổ mang (Naja naja).
ix LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. THESIS ABSTRACT Master candidate: Nguyen Van Tam Thesis title: Evaluate the ability to neutralize cobra venom (Naja naja) with anti-venom antibody (IgY) Major: Biotechnology Code: 60620301 Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives This study was conducted to evaluate the ability of the hen's immune response as well as the passive antibody content from hen to the egg for antigen Naja naja as the basis for the study. Production of IgY antibody against snake venom from egg yolk. Materials and Methods Snake venom was immunized to hens at 16 to 18 weeks of age with a dose based on 50% lethal dose in mice (LD50).
ELISA was used to evaluate the anti-venom antibody content of chicken serum and the passive antibody from broilers fed to the eggs.