Luận Văn Thạc Sĩ: Nghiên Cứu Tạo Dòng Và Phân Tích Trình Tự Gen Mã Hóa Leucoanthocyanidin Reductase (LAR) Trong Cây Chè

• Tác giả: Phạm Thị Hằng
• Người hướng dẫn: TS. Hoàng Thị Thu Yến - Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Khoa học
• Trường học: Đại học Thái Nguyên - Trường Đại học Khoa học
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Tạo dòng và phân tích trình tự gen mã hóa leucoanthocyanidin reductase ở cây chè
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Thái Nguyên

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG I: MỞ ĐẦU
• 1.1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI
• 1.2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI
• 1.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
• 1.4. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.4.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY CHÈ
• 1.4.1.1. Nguồn gốc và phân loại của cây chè
• 1.4.1.2. Đặc điểm sinh học chung của cây chè
• 1.4.1.3. Thành phần hóa học của chè
• 1.4.2. TÌNH HÌNH SẢN XUẤT CHÈ TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM
• 1.4.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CHÈ TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM
• 1.4.4. CATECHINS VÀ LEUCOANTHOCYANIDIN REDUCTASE Ở CHÈ
• 2. CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Hóa chất, thiết bị
• 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.2.1. Phương pháp thu mẫu lá chè
• 2.2.2. Phương pháp tách chiết RNA tổng số từ lá chè
• 2.2.3. Điện di RNA tổng số
• 2.2.4. Tổng hợp cDNA
• 2.2.5. Nhân gen CsLAR1 bằng kỹ thuật RT –PCR
• 2.2.6. Tách dòng gen CsLAR1
• 2.2.7. Xác định và phân tích trình tự
• 2.2.8. Tạo vector biểu hiện gen CsLAR1
• 2.2.9. Biểu hiện gen CsLAR1
• 3. CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. KHUẾCH ĐẠI GEN CsLAR1 TỪ MẪU CHÈ NGHIÊN CỨU
• 3.2. TẠO DÒNG GEN, XÁC ĐỊNH VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA LEUCOANTHOCYANIDIN REDUCTASE
• 3.2.1. Tạo dòng gen CsLAR1
• 3.2.2. Xác định và phân tích trình tự gen CsLAR1
• 3.3. BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CsLAR1 TỪ CHÈ TRUNG DU XANH TRONG VI KHUẨN E.
• 3.3.1. Tạo cấu trúc biểu hiện mang gen CsLAR1 vào vi khuẩn E.
• 3.3.2. Biểu hiện gen CsLAR1
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Giới thiệu về cây chè

Cây chè, có tên khoa học là Camellia sinensis (L) O. Kuntze, là một loại cây công nghiệp lâu năm, được trồng phổ biến trên toàn thế giới. Cây chè không chỉ mang lại giá trị kinh tế cao mà còn có nhiều lợi ích cho sức khỏe con người. Nước chè được biết đến với khả năng giải khát, chống mệt mỏi, và phòng ngừa nhiều bệnh lý như ung thư, tiểu đường và bệnh tim mạch. Theo thống kê, khoảng 2,5 triệu tấn chè khô được sản xuất mỗi năm, trong đó chè đen chiếm 78%. Các hợp chất polyphenol, đặc biệt là catechins, đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra các đặc tính có lợi cho sức khỏe của chè. Nghiên cứu về thành phần hóa học của chè, đặc biệt là hàm lượng polyphenol, là rất cần thiết để nâng cao chất lượng sản phẩm chè.

1.1 Nguồn gốc và phân loại của cây chè

Cây chè thuộc họ Theaceae, được phân loại theo hệ thống phân loại thực vật. Cây chè có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới và Á nhiệt đới, hiện nay được trồng ở hơn 58 quốc gia. Tại Việt Nam, cây chè được trồng chủ yếu ở các vùng như Hà Giang, Tuyên Quang, và Thái Nguyên. Nghiên cứu về nguồn gốc cây chè cho thấy rằng cây chè dại có khả năng tổng hợp các hợp chất catechins khác nhau, từ đó xác định được nguồn gốc và sự tiến hóa của cây chè. Việc hiểu rõ về nguồn gốc và phân loại của cây chè sẽ giúp trong việc nghiên cứu và phát triển giống chè mới có chất lượng cao.

II. Tình hình nghiên cứu chè trên thế giới và Việt Nam

Nghiên cứu về cây chè đã được thực hiện rộng rãi trên thế giới, đặc biệt là trong lĩnh vực sinh học phân tử và công nghệ sinh học. Các nghiên cứu này tập trung vào việc phân tích thành phần hóa học, cơ chế sinh tổng hợp các hợp chất có lợi trong chè, và vai trò của các enzyme như leucoanthocyanidin reductase (LAR) trong quá trình tổng hợp catechins. Tại Việt Nam, nghiên cứu về cây chè còn hạn chế, đặc biệt là trong việc phân tích di truyền và cấu trúc gen. Việc nghiên cứu gen mã hóa enzyme LAR sẽ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế sinh tổng hợp catechins, từ đó nâng cao chất lượng chè và phát triển các giống chè mới có giá trị kinh tế cao.

2.1 Tình hình nghiên cứu chè trên thế giới

Trên thế giới, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng enzyme LAR đóng vai trò quan trọng trong việc tổng hợp catechins, một trong những hợp chất chính có trong chè. Các nghiên cứu này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế sinh tổng hợp mà còn mở ra hướng đi mới trong việc cải thiện chất lượng chè thông qua công nghệ sinh học. Việc phân tích trình tự gen mã hóa LAR sẽ cung cấp thông tin quý giá cho các nhà khoa học trong việc phát triển các giống chè có hàm lượng catechins cao hơn, từ đó nâng cao giá trị sản phẩm chè trên thị trường.

III. Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu trong luận văn này bao gồm việc thu mẫu lá chè, tách chiết RNA tổng số, và khuếch đại gen mã hóa LAR bằng kỹ thuật RT-PCR. Các bước này được thực hiện để tạo dòng và phân tích trình tự gen CsLAR1 từ cây chè. Việc sử dụng các kỹ thuật hiện đại trong công nghệ sinh học như điện di RNA, tổng hợp cDNA, và xác định trình tự gen sẽ giúp đảm bảo độ chính xác và tin cậy của kết quả nghiên cứu. Các phương pháp này không chỉ giúp xác định cấu trúc gen mà còn mở ra khả năng ứng dụng trong việc tạo ra các giống chè mới có giá trị dinh dưỡng cao.

3.1 Phương pháp thu mẫu và tách chiết RNA

Mẫu lá chè được thu thập từ các giống chè khác nhau tại Thái Nguyên. Sau đó, RNA tổng số được tách chiết bằng phương pháp phenol-chloroform, đảm bảo độ tinh khiết và chất lượng của RNA. Kỹ thuật điện di RNA được sử dụng để kiểm tra chất lượng RNA trước khi tiến hành tổng hợp cDNA. Việc tách chiết RNA và tổng hợp cDNA là bước quan trọng trong việc nghiên cứu cấu trúc gen mã hóa LAR, giúp đảm bảo rằng các kết quả thu được là chính xác và có thể tái lập.

IV. Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy gen CsLAR1 được khuếch đại thành công từ mẫu chè và trình tự gen đã được xác định. Phân tích trình tự gen cho thấy sự tương đồng cao với các trình tự đã được công bố trên GenBank. Điều này chứng tỏ rằng gen CsLAR1 có vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp catechins ở cây chè. Việc hiểu rõ về gen này không chỉ giúp nâng cao chất lượng chè mà còn mở ra hướng đi mới trong nghiên cứu và phát triển giống chè có giá trị dinh dưỡng cao.

4.1 Phân tích trình tự gen CsLAR1

Trình tự gen CsLAR1 được phân tích cho thấy có nhiều điểm tương đồng với các gen mã hóa LAR từ các loài khác. Sự khác biệt trong trình tự nucleotide có thể ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme LAR, từ đó ảnh hưởng đến hàm lượng catechins trong chè. Nghiên cứu này không chỉ cung cấp thông tin quý giá về cấu trúc gen mà còn mở ra khả năng ứng dụng trong việc tạo ra các giống chè mới có hàm lượng catechins cao hơn, từ đó nâng cao giá trị sản phẩm chè trên thị trường.