Luận văn thạc sĩ phân tích sự methyl hóa gen shox2 ở bệnh ung thư phổi

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu phân tích sự methyl hóa gen shox2 ở bệnh ung thư phổi, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề xuất giải pháp cải thiện thực tiễn.

• Tác giả: Nguyễn Thùy Ngân
• Người hướng dẫn: PGS. Võ Thị Thương Lan
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Phân Tích Sự Methyl Hóa Gen SHOX2 Ở Bệnh Ung Thư Phổi
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Ung thƣ phổi
• 1.2. DNA tự do tuần hoàn trong dịch cơ thể – ccfDNA (circulating cell-free DNA)
• 1.3. Methyl hóa gen SHOX2 và ung thƣ phổi
• 1.4. Mối liên quan giữa methyl hóa gen SHOX2 và ung thư phổi
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Mẫu nghiên cứu
• 2.2. Các plasmid tái tổ hợp
• 2.3. Nguyên liệu, hóa chất
• 2.4. Trang thiết bị
• 2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu
• 2.5.1. Tách DNA từ mẫu FFPE
• 2.5.2. Tách ccfDNA từ mẫu huyết tương
• 2.5.3. Phản ứng PCR
• 2.5.4. Xử lý mẫu DNA với bisulfite
• 2.6. Tạo mẫu chuẩn cho kỹ thuật định lượng PCR
• 2.7. Định lượng PCR (Realtime PCR)
• 2.8. Phương pháp phân tích thống kê
• KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Tách chiết DNA
• 3.2. Tách chiết DNA tổng số từ mẫu FFPE
• 3.3. Tách chiết ccfDNA từ mẫu huyết tương
• 3.4. Tạo mẫu chuẩn cho phƣơng pháp định lƣợng PCR
• 3.5. Phân tích mức độ methyl hóa gen SHOX2 trong mẫu FFPE và mẫu huyết tƣơng
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về sự methyl hóa gen SHOX2 ở bệnh ung thư phổi

Bệnh ung thư phổi đang gia tăng nhanh chóng và là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong trên toàn cầu. Trong bối cảnh này, sự methyl hóa gen SHOX2 đã được nghiên cứu như một yếu tố tiềm năng trong chẩn đoán và điều trị bệnh. Methyl hóa DNA là một quá trình sinh học quan trọng, ảnh hưởng đến biểu hiện gen và có thể dẫn đến sự phát triển của ung thư. Gen SHOX2, một gen liên quan đến sự phát triển và tăng trưởng tế bào, đã được phát hiện có sự methyl hóa bất thường trong các trường hợp ung thư phổi. Nghiên cứu này nhằm mục đích phân tích mức độ methyl hóa của gen SHOX2 và mối liên hệ của nó với bệnh ung thư phổi.

1.1. Methyl hóa gen và vai trò của gen SHOX2

Methyl hóa gen là một quá trình sinh học quan trọng, ảnh hưởng đến cách thức biểu hiện của gen. Gen SHOX2, có vai trò trong sự phát triển và điều hòa tế bào, đã được chứng minh có liên quan đến sự phát triển của ung thư phổi. Nghiên cứu cho thấy sự methyl hóa của gen này có thể dẫn đến sự giảm biểu hiện gen, từ đó ảnh hưởng đến sự phát triển của khối u.

1.2. Tình hình ung thư phổi tại Việt Nam

Theo thống kê, ung thư phổi là một trong những loại ung thư phổ biến nhất tại Việt Nam, với hàng chục ngàn ca mắc mới mỗi năm. Tỷ lệ tử vong cao cho thấy sự cần thiết phải có các phương pháp chẩn đoán và điều trị hiệu quả hơn. Việc nghiên cứu sự methyl hóa gen SHOX2 có thể mở ra hướng đi mới trong việc phát hiện sớm và điều trị ung thư phổi.

II. Thách thức trong việc chẩn đoán ung thư phổi hiện nay

Chẩn đoán ung thư phổi gặp nhiều khó khăn do triệu chứng không rõ ràng và thường chỉ được phát hiện khi bệnh đã tiến triển. Các phương pháp chẩn đoán hiện tại như chụp X-quang, CT, và nội soi phế quản có những hạn chế nhất định. Việc phát hiện sớm ung thư phổi là rất quan trọng để nâng cao tỷ lệ sống sót cho bệnh nhân. Sự methyl hóa gen SHOX2 có thể là một chỉ thị sinh học hữu ích trong việc phát hiện sớm bệnh.

2.1. Hạn chế của các phương pháp chẩn đoán hiện tại

Các phương pháp chẩn đoán như chụp X-quang và CT thường không phát hiện được các tổn thương nhỏ, dẫn đến việc chẩn đoán muộn. Nội soi phế quản có thể gây ra các biến chứng và không thể tiếp cận các tổn thương ngoại vi. Do đó, cần có các phương pháp chẩn đoán ít xâm lấn và hiệu quả hơn.

2.2. Tầm quan trọng của việc phát hiện sớm

Phát hiện sớm ung thư phổi có thể cải thiện đáng kể tỷ lệ sống sót cho bệnh nhân. Việc áp dụng các chỉ thị sinh học như sự methyl hóa gen SHOX2 có thể giúp phát hiện bệnh ở giai đoạn sớm hơn, từ đó nâng cao hiệu quả điều trị.

III. Phương pháp nghiên cứu sự methyl hóa gen SHOX2

Nghiên cứu này sử dụng kỹ thuật PCR định lượng đặc hiệu methyl (qMSP) để phân tích mức độ methyl hóa của gen SHOX2 trong các mẫu bệnh phẩm từ bệnh nhân ung thư phổi. Kỹ thuật này cho phép định lượng chính xác mức độ methyl hóa, từ đó đánh giá mối liên hệ giữa sự methyl hóa và tình trạng bệnh. Các mẫu được thu thập từ bệnh nhân tại các bệnh viện lớn, đảm bảo tính đại diện và độ tin cậy của kết quả.

3.1. Quy trình thu thập mẫu và xử lý

Mẫu bệnh phẩm được thu thập từ bệnh nhân ung thư phổi tại các bệnh viện. Sau đó, DNA được tách chiết và xử lý bằng bisulfite để chuyển đổi cytosine thành uracil, giúp phân tích sự methyl hóa. Quy trình này đảm bảo độ chính xác cao trong việc xác định mức độ methyl hóa của gen SHOX2.

3.2. Kỹ thuật PCR định lượng đặc hiệu methyl

Kỹ thuật PCR định lượng đặc hiệu methyl (qMSP) được sử dụng để định lượng mức độ methyl hóa của gen SHOX2. Kỹ thuật này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cho phép phát hiện sự khác biệt trong mức độ methyl hóa giữa các mẫu bệnh phẩm. Kết quả từ kỹ thuật này sẽ cung cấp thông tin quan trọng về mối liên hệ giữa methyl hóa gen và ung thư phổi.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy sự methyl hóa gen SHOX2 có mối liên hệ chặt chẽ với tình trạng bệnh ung thư phổi. Mức độ methyl hóa cao của gen này có thể là một chỉ thị sinh học hữu ích trong việc chẩn đoán và tiên lượng bệnh. Việc áp dụng các phương pháp phân tích methyl hóa gen trong thực tiễn có thể giúp nâng cao hiệu quả chẩn đoán và điều trị ung thư phổi.

4.1. Phân tích kết quả methyl hóa gen SHOX2

Kết quả phân tích cho thấy mức độ methyl hóa của gen SHOX2 ở nhóm bệnh nhân ung thư phổi cao hơn so với nhóm đối chứng. Điều này cho thấy sự methyl hóa gen này có thể đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của bệnh. Các nghiên cứu trước đây cũng đã chỉ ra rằng sự methyl hóa gen SHOX2 có thể ảnh hưởng đến biểu hiện gen và sự phát triển của khối u.

4.2. Ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị

Sự methyl hóa gen SHOX2 có thể được sử dụng như một chỉ thị sinh học trong chẩn đoán sớm ung thư phổi. Việc phát hiện sớm có thể giúp cải thiện tỷ lệ sống sót cho bệnh nhân. Ngoài ra, nghiên cứu này cũng mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các phương pháp điều trị cá thể dựa trên sự methyl hóa gen.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu về sự methyl hóa gen SHOX2 ở bệnh ung thư phổi đã chỉ ra rằng gen này có thể là một chỉ thị sinh học hữu ích trong việc chẩn đoán và tiên lượng bệnh. Việc áp dụng các phương pháp phân tích methyl hóa gen có thể giúp nâng cao hiệu quả chẩn đoán và điều trị ung thư phổi. Tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu để xác định rõ hơn vai trò của sự methyl hóa gen trong sự phát triển của ung thư phổi.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu tiếp theo

Nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc xác định cơ chế tác động của sự methyl hóa gen SHOX2 đối với sự phát triển của ung thư phổi. Điều này sẽ giúp hiểu rõ hơn về vai trò của gen này trong bệnh lý và mở ra hướng đi mới trong điều trị.

5.2. Hướng phát triển các phương pháp chẩn đoán mới

Cần phát triển các phương pháp chẩn đoán ít xâm lấn và hiệu quả hơn dựa trên sự methyl hóa gen. Việc áp dụng công nghệ mới trong phân tích methyl hóa có thể giúp nâng cao độ chính xác trong chẩn đoán ung thư phổi, từ đó cải thiện tỷ lệ sống sót cho bệnh nhân.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Ung thư phổi là một trong những bệnh ung thư phổ biến và gây tử vong hàng đầu trên thế giới, chiếm khoảng 12% tổng số ca mắc mới với hơn 2 triệu ca mỗi năm và tỷ lệ tử vong lên tới 18,4%. Tại Việt Nam, năm 2018 ghi nhận khoảng 23.667 ca mắc mới và hơn 20.000 ca tử vong do ung thư phổi, đứng thứ hai ở nam giới và thứ ba ở nữ giới về tỷ lệ mắc mới. Tỷ lệ sống sót sau 5 năm của bệnh nhân ung thư phổi rất thấp, chủ yếu do bệnh thường được phát hiện ở giai đoạn muộn (III, IV), chiếm tới 84,3% trong một nghiên cứu hồi cứu tại các bệnh viện lớn. Việc phát hiện sớm ung thư phổi là yếu tố then chốt giúp nâng cao hiệu quả điều trị và tăng tỷ lệ sống sót.

Hiện nay, các phương pháp chẩn đoán ung thư phổi bao gồm chụp X-quang, chụp cắt lớp vi tính (CT), nội soi phế quản, chụp cộng hưởng từ (MRI) và xét nghiệm mô bệnh học. Tuy nhiên, các phương pháp này còn hạn chế về độ nhạy, độ đặc hiệu hoặc tính xâm lấn. Do đó, việc tìm kiếm các dấu chuẩn sinh học mới, ít xâm lấn và có độ chính xác cao là rất cần thiết. Methyl hóa DNA, đặc biệt là methyl hóa gen SHOX2, được xem là dấu chuẩn tiềm năng hỗ trợ chẩn đoán và tiên lượng ung thư phổi. Mục tiêu nghiên cứu là phân tích và định lượng mức độ methyl hóa gen SHOX2 trong mẫu mô và mẫu huyết tương của bệnh nhân ung thư phổi tại Việt Nam, nhằm phát triển phương pháp chẩn đoán sớm, góp phần nâng cao hiệu quả điều trị và giảm gánh nặng bệnh tật.

Phạm vi nghiên cứu tập trung vào các mẫu bệnh phẩm thu thập từ năm 2014 đến 2018 tại các bệnh viện lớn ở Hà Nội và TP. Hồ Chí Minh, với trọng tâm là các bệnh nhân ung thư phổi giai đoạn III và IV. Nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc ứng dụng kỹ thuật định lượng methyl hóa DNA bằng realtime PCR để phát hiện sớm ung thư phổi, từ đó cải thiện tỷ lệ sống sót và giảm chi phí điều trị.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Methyl hóa DNA: Là quá trình gắn nhóm methyl vào vị trí số 5 của cytosine trong vùng CpG của DNA, chủ yếu ở vùng promoter, do enzyme DNA methyltransferase (DNMT) xúc tác. Methyl hóa quá mức tại promoter gen ức chế khối u có thể làm câm gen, góp phần vào sự phát triển ung thư. Ngược lại, methyl hóa dưới mức có thể kích hoạt oncogene, làm tăng nguy cơ ung thư.

• Gen SHOX2: Thuộc họ gen homeobox, mã hóa nhân tố phiên mã có vai trò trong phát triển xương và biệt hóa tế bào. Methyl hóa quá mức gen SHOX2 đã được chứng minh liên quan mật thiết đến ung thư phổi, có thể dùng làm dấu chuẩn sinh học để chẩn đoán và tiên lượng bệnh.

• Kỹ thuật realtime PCR và qMSP: Kỹ thuật PCR định lượng đặc hiệu methyl (qMSP) dựa trên realtime PCR cho phép định lượng chính xác mức độ methyl hóa DNA. Phương pháp này sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho vùng methyl hóa và không methyl hóa sau xử lý bisulfite, kết hợp với phân tích đường cong nóng chảy để đảm bảo tính đặc hiệu.

Các khái niệm chính bao gồm: methyl hóa DNA, CpG island, ctDNA (DNA khối u tuần hoàn), bisulfite treatment, ΔΔCt method, độ nhạy và độ đặc hiệu xét nghiệm.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Nghiên cứu sử dụng 76 mẫu mô FFPE ung thư phổi và 51 mẫu mô phổi lành tính từ Bệnh viện Quân Y 175 (TP. Hồ Chí Minh), cùng 20 mẫu huyết tương ung thư phổi và 22 mẫu huyết tương người bình thường từ Bệnh viện Quân Y 103 (Hà Nội). Các mẫu mô chủ yếu thuộc giai đoạn III và IV.

• Tách chiết DNA: DNA tổng số được tách từ mẫu FFPE bằng kit QIAamp DNA FFPE, ccfDNA tách từ huyết tương bằng kit QIAamp Circulating Nucleic Acid. DNA sau đó xử lý bisulfite để biến đổi cytosine không methyl thành uracil, giữ nguyên cytosine methyl hóa.

• Tạo mẫu chuẩn: Sử dụng plasmid tái tổ hợp chứa trình tự gen SHOX2 methyl hóa và không methyl hóa, chuyển sang dạng thẳng bằng enzyme giới hạn ScaI hoặc PCR đảo, phối trộn với DNA tổng số người bình thường để tạo các mẫu chuẩn với tỷ lệ methyl hóa đã biết.

• Phân tích realtime PCR: Thực hiện với hai cặp mồi đặc hiệu cho vùng methyl hóa (Me-SHOX2) và không methyl hóa (Un-SHOX2). Tỷ lệ methyl hóa được tính theo phương pháp ΔΔCt, đảm bảo hiệu suất khuếch đại của hai cặp mồi tương đương (độ dốc đồ thị ΔCt gần 0).

• Phân tích thống kê: Độ nhạy, độ đặc hiệu được tính dựa trên kết quả dương tính và âm tính thật. Đường cong ROC và diện tích dưới đường cong (AUC) được xây dựng để đánh giá hiệu quả chẩn đoán. Giá trị cut-off được xác định bằng chỉ số Youden, chọn sao cho tỷ lệ dương tính giả ≤ 5%. Kiểm định Mann-Whitney và Fisher’s exact được sử dụng để so sánh và đánh giá mối liên quan giữa methyl hóa và đặc điểm bệnh học.

• Timeline nghiên cứu: Thu thập mẫu từ 2014-2018, phân tích và xử lý mẫu từ 2017-2019, hoàn thiện luận văn năm 2019.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Chất lượng và nồng độ DNA tách chiết: DNA tổng số từ mẫu FFPE có nồng độ trung bình 153,49 ng/µl, tuy nhiên có sự đứt gãy DNA do quá trình cố định mẫu. DNA ccfDNA từ huyết tương có nồng độ thấp, trung bình khoảng 3-15 ng/µl sau xử lý bisulfite, có lẫn DNA tổng số do bạch cầu vỡ trong quá trình thu nhận mẫu.

2. Hiệu quả tách chiết và xử lý bisulfite: DNA sau xử lý bisulfite đủ chất lượng để thực hiện realtime PCR. Các mẫu ccfDNA có thể khuếch đại được đoạn gen tham chiếu SHOX2, chứng tỏ DNA đủ nguyên vẹn cho phân tích.

3. Tỷ lệ methyl hóa gen SHOX2: Mức độ methyl hóa gen SHOX2 trong mẫu FFPE ung thư phổi cao hơn đáng kể so với mẫu phổi lành tính (p < 0.05). Tương tự, mẫu huyết tương của bệnh nhân ung thư phổi cũng có tỷ lệ methyl hóa cao hơn nhóm người bình thường. Độ nhạy và độ đặc hiệu của phân tích methyl hóa SHOX2 trên mẫu FFPE lần lượt đạt trên 94% và 98%, trên mẫu huyết tương đạt khoảng 64-78% và trên 90%.

4. Giá trị chẩn đoán: Đường cong ROC cho thấy AUC của xét nghiệm methyl hóa SHOX2 trên mẫu FFPE đạt gần 0,95, trên mẫu huyết tương khoảng 0,85, cho thấy độ chính xác cao trong phân biệt bệnh nhân ung thư phổi và nhóm đối chứng.

Thảo luận kết quả

Sự methyl hóa quá mức gen SHOX2 được xác nhận là dấu chuẩn sinh học có giá trị trong chẩn đoán ung thư phổi, phù hợp với các nghiên cứu quốc tế. Mức độ methyl hóa cao hơn ở các mẫu giai đoạn muộn (III, IV) phản ánh sự tiến triển bệnh và có thể hỗ trợ tiên lượng. Độ nhạy thấp hơn trên mẫu huyết tương so với mẫu mô có thể do nồng độ ctDNA thấp và sự pha loãng với DNA bình thường, cũng như ảnh hưởng của DNA tổng số từ bạch cầu vỡ.

Kết quả cho thấy kỹ thuật realtime PCR kết hợp xử lý bisulfite và sử dụng mẫu chuẩn plasmid dạng thẳng là phương pháp hiệu quả, có thể áp dụng trong thực tế lâm sàng để phát hiện methyl hóa SHOX2. Việc lựa chọn mẫu huyết tương giúp giảm xâm lấn, thuận tiện cho sàng lọc và theo dõi bệnh nhân. Tuy nhiên, cần cải tiến quy trình thu nhận và xử lý mẫu huyết tương để giảm thiểu DNA tổng số gây nhiễu.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ phân bố tỷ lệ methyl hóa giữa các nhóm, đường cong ROC minh họa hiệu quả chẩn đoán, bảng so sánh độ nhạy, độ đặc hiệu giữa các loại mẫu và giai đoạn bệnh.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Áp dụng kỹ thuật realtime PCR định lượng methyl hóa SHOX2 trong chẩn đoán sàng lọc ung thư phổi: Khuyến khích các cơ sở y tế triển khai kỹ thuật này trên mẫu huyết tương để phát hiện sớm, giảm thiểu xâm lấn, nâng cao tỷ lệ phát hiện giai đoạn sớm trong vòng 1-2 năm tới.

2. Cải tiến quy trình thu nhận và xử lý mẫu huyết tương: Sử dụng ống thu máu chuyên dụng chứa chất bảo quản tế bào bạch cầu, điều chỉnh quy trình ly tâm để giảm DNA tổng số gây nhiễu, nâng cao độ nhạy xét nghiệm, thực hiện trong 6-12 tháng.

3. Phát triển bộ kit xét nghiệm methyl hóa SHOX2 phù hợp với điều kiện Việt Nam: Tối ưu hóa chi phí, thiết bị và quy trình chuẩn hóa, nhằm phổ biến rộng rãi trong các bệnh viện tuyến tỉnh và trung ương trong 2-3 năm tới.

4. Tăng cường đào tạo nhân lực và nâng cao nhận thức về vai trò của methyl hóa DNA trong chẩn đoán ung thư: Tổ chức các khóa tập huấn cho bác sĩ, kỹ thuật viên xét nghiệm để đảm bảo chất lượng và hiệu quả ứng dụng kỹ thuật mới, triển khai liên tục hàng năm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Bác sĩ chuyên khoa ung bướu và hô hấp: Nắm bắt kiến thức về dấu chuẩn sinh học mới, áp dụng trong chẩn đoán và theo dõi điều trị ung thư phổi, nâng cao hiệu quả lâm sàng.

2. Nhà nghiên cứu sinh học phân tử và di truyền y học: Tham khảo phương pháp phân tích methyl hóa DNA, kỹ thuật realtime PCR và xử lý mẫu, làm cơ sở phát triển nghiên cứu sâu hơn về dấu chuẩn ung thư.

3. Kỹ thuật viên xét nghiệm y học: Học hỏi quy trình tách chiết DNA, xử lý bisulfite, thiết kế và thực hiện realtime PCR định lượng methyl hóa, đảm bảo kết quả chính xác và tin cậy.

4. Quản lý y tế và nhà hoạch định chính sách: Hiểu rõ tiềm năng ứng dụng công nghệ sinh học phân tử trong chẩn đoán sớm ung thư, từ đó xây dựng chính sách hỗ trợ phát triển xét nghiệm phân tử tại các cơ sở y tế.

Câu hỏi thường gặp

1. Methyl hóa gen SHOX2 là gì và tại sao quan trọng trong ung thư phổi?
   Methyl hóa gen SHOX2 là quá trình gắn nhóm methyl vào vùng promoter của gen này, làm giảm biểu hiện gen. Sự methyl hóa quá mức liên quan đến ung thư phổi, giúp chẩn đoán và tiên lượng bệnh chính xác hơn.

2. Phương pháp realtime PCR định lượng methyl hóa DNA hoạt động như thế nào?
   Realtime PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho vùng methyl hóa và không methyl hóa sau xử lý bisulfite, đo tín hiệu huỳnh quang theo chu kỳ để tính toán tỷ lệ methyl hóa dựa trên phương pháp ΔΔCt.

3. Tại sao cần xử lý DNA bằng bisulfite trước khi phân tích methyl hóa?
   Bisulfite biến đổi cytosine không methyl thành uracil, trong khi cytosine methyl hóa giữ nguyên, giúp phân biệt chính xác các vị trí methyl hóa khi thực hiện PCR.

4. Mức độ methyl hóa SHOX2 có thể dùng để tiên lượng bệnh không?
   Có, mức độ methyl hóa cao thường liên quan đến giai đoạn muộn và thời gian sống ngắn hơn, giúp đánh giá hiệu quả điều trị và tiên lượng bệnh nhân.

5. Ưu nhược điểm của việc sử dụng mẫu huyết tương so với mẫu mô trong phân tích methyl hóa?
   Mẫu huyết tương ít xâm lấn, thuận tiện cho sàng lọc và theo dõi, nhưng có nồng độ ctDNA thấp và dễ bị nhiễu bởi DNA tổng số. Mẫu mô cho độ nhạy cao hơn nhưng cần sinh thiết xâm lấn.

Kết luận

• Phân tích methyl hóa gen SHOX2 bằng realtime PCR là phương pháp hiệu quả, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao trong chẩn đoán ung thư phổi.
• Mức độ methyl hóa SHOX2 tăng rõ rệt ở bệnh nhân ung thư phổi giai đoạn muộn so với nhóm đối chứng.
• Mẫu huyết tương có thể sử dụng để phát hiện methyl hóa SHOX2, mở ra hướng tiếp cận không xâm lấn trong chẩn đoán sớm.
• Cần cải tiến quy trình thu nhận và xử lý mẫu huyết tương để nâng cao độ nhạy và độ chính xác xét nghiệm.
• Khuyến nghị triển khai kỹ thuật này trong thực tế lâm sàng tại Việt Nam nhằm nâng cao hiệu quả phát hiện và điều trị ung thư phổi.

Next steps: Hoàn thiện quy trình thu nhận mẫu huyết tương, phát triển bộ kit xét nghiệm phù hợp, đào tạo nhân lực và triển khai thử nghiệm lâm sàng quy mô lớn.

Call to action: Các cơ sở y tế và nhà nghiên cứu cần phối hợp để ứng dụng công nghệ phân tích methyl hóa SHOX2, góp phần cải thiện sức khỏe cộng đồng và giảm gánh nặng ung thư phổi tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Ung thƣ đang ngày càng gia tăng và là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới. Trong các bệnh ung thƣ, ung thƣ phổi chiếm khoảng 12% với khoảng 2 triệu ca mắc mới và chiếm tỷ lệ tử vong lên tới 18,4 %. Tại Việt Nam, ung thƣ phổi là một trong những bệnh ung thƣ thƣờng gặp nhất ở cả hai giới. Theo thống kê, năm 2018, tỷ lệ ngƣời mắc bệnh đã lên tới 23 000 ca mắc mới và hơn 20 000 ca tử vong mỗi năm.

Ung thƣ phổi có thể đƣợc điều trị dứt điểm nếu nhƣ đƣợc phát hiện sớm. Hiện nay, có nhiều phƣơng pháp đƣợc sử dụng trong chẩn đoán ung thƣ phổi nhƣ chụp X-quang ngực, chụp cắt lớp vi tính (CT), nội soi phế quản, chụp cộng hƣởng từ (MRI)… Để tăng tính chính xác, methyl hóa DNA đƣợc coi là một dấu chuẩn hỗ trợ chẩn đoán và tiên lƣợng ung thƣ đầy tiềm năng. Mặc dù chƣa có nghiên cứu nào khẳng định sự methyl hóa quá mức gen SHOX2 là nguyên nhân gây ung thƣ phổi, nhƣng việc sử dụng methyl hóa của gen này trong chẩn đoán, sàng lọc ung thƣ phổi đã đƣợc chứng minh khá rõ trong nhiều công bố khoa học. Do đó, việc định lƣợng mức độ methyl hóa DNA trên gen SHOX2 đƣợc coi nhƣ một cách tiếp cận mới để hỗ trợ phát hiện, chẩn đoán ung thƣ phổi.

Hiện nay, có nhiều kỹ thuật phân tích methyl hóa DNA, mỗi kỹ thuật đều có những ƣu nhƣợc điểm nhất định. Kỹ thuật PCR định lƣợng đặc hiệu methyl (qMSP) đƣợc phát triển dựa trên nền tảng của kỹ thuật realtime PCR với độ nhạy và độ đặc hiệu cao là lựa chọn tốt để thực hiện mục đích trên. Áp dụng kỹ thuật này, chúng tôi thực hiện đề tài ―Phân tích methyl hóa gen SHOX2 ở bệnh ung thƣ phổi‖ với mục tiêu phát hiện và định lƣợng mức độ methyl hóa gen SHOX2 trong bệnh ung thƣ này. 1 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.

Ung thƣ phổi Theo thống kê của tổ chức Y tế Thế giới WHO năm 2018, ung thƣ là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu ở cả nam và nữ với hơn 18 triệu ca mắc mới [86]. Trong đó, ung thƣ phổi là loại ung thƣ phổ biến nhất trong vài thập kỷ trở lại đây. Theo GLOBOCAN, ƣớc tính có khoảng 1,7 triệu ca tử vong và 2,1 triệu ca mắc mới ung thƣ phổi, đứng đầu trong tất cả các loại ung thƣ năm 2018. Tỷ lệ sống sót sau 5 năm của ung thƣ phổi thấp hơn 2 – 4 lần so với ung thƣ vú, đại tràng, tuyến tiền liệt cho thấy mức độ nguy hiểm của loại ung thƣ này [86].

Tại Việt Nam, năm 2018, có 23 667 ca mắc mới và 20 710 ca tử vong ung thƣ phổi ở cả hai giới [86]. Đây là loại ung thƣ đứng thứ hai ở nam giới chỉ sau ung thƣ gan và đứng thứ ba ở nữ giới chỉ sau ung thƣ vú và ung thƣ đại tràng về tỷ lệ mắc mới. Trung bình có khoảng 60 ca mắc mới mỗi ngày [86]. Tỷ lệ sống sót sau 5 năm thấp do ít đƣợc chẩn đoán và phát hiện ở các giai đoạn sớm.

Thực tế hiện nay, hầu hết bệnh nhân chỉ đến khám tại các cơ sở y tế khi có các triệu chứng hô hấp kéo dài hoặc khi ung thƣ phổi đã tiến triển quá mức. Vì vậy đa số bệnh nhân ung thƣ phổi khi đƣợc chẩn đoán lần đầu đều ở giai đoạn III và IV. Trong một nghiên cứu hồi cứu ở năm bệnh viện lớn tại Việt Nam vào năm 2009, kết quả chỉ ra có tới 84,3 % bệnh nhân ung thƣ phổi đƣợc phát hiện ở giai đoạn muộn [14]. Theo hệ thống phân loại năm 2004 của Tổ chức Y tế thế giới WHO, ung thƣ phổi bao gồm hai loại chính là ung thƣ phổi tế bào nhỏ (UTPTBN) và ung thƣ phổi không tế bào nhỏ (UTPKTBN), tùy thuộc vào hình dạng tế bào dƣới kính hiển vi [73].

UTPTBN thƣờng xuất hiện ở những ngƣời sử dụng thuốc lá và hiếm thấy ở ngƣời không hút thuốc, chiếm khoảng 15% - 20% các trƣờng hợp ung thƣ phổi [65]. Đây là loại ung thƣ phát triển mạnh, có khả năng di căn đến các bộ phận khác của cơ thể, bao gồm hai giai đoạn phát triển chính: - Giai đoạn hạn chế: giai đoạn ung thƣ còn khu trú ở một bên phổi. - Giai đoạn mở rộng: giai đoạn khi ung thƣ đã di căn sang phổi đối diện hoặc các cơ quan khác nhƣ não, gan, xƣơng…[65] 2 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Ngƣợc lại, UTPKTBN phát triển chậm, ít xâm lấn, chiếm khoảng 80 – 85 % các trƣờng hợp ung thƣ phổi, nếu đƣợc phát hiện sớm thì cơ hội chữa khỏi cao. UTPKTBN bao gồm ung thƣ phổi tế bào vảy, ung thƣ biểu mô tuyến và ung thƣ phổi tế bào lớn.

Trong đó, ung thƣ biểu mô tuyến là loại ung thƣ phổ biến nhất ở những ngƣời hút thuốc và không hút thuốc, chiếm 40 % các trƣờng hợp ung thƣ phổi. Tiếp đến là ung thƣ phổi tế bào vảy chiếm 25 – 30 % và ung thƣ phổi tế bào lớn chiếm 5 – 10 % các trƣờng hợp, thƣờng xảy ra ở những ngƣời hút thuốc [80]. Hiện nay, Hiệp hội Quốc tế kiểm soát bệnh ung thƣ (The Union for International Cancer Control's - UICC) đã đƣa ra hệ thống phân loại TNM (Tumor – Node – Metastasis) cho UTPKTBN [73]. Phân loại theo TNM là sự phân chia bệnh nhân vào những nhóm có tiên lƣợng khác nhau dựa trên những tiêu chuẩn gồm kích thƣớc khối u (Tumor), sự hình thành hạch (Node) và mức độ di căn (Metastasis) [73].

Đối với UTPTBN, tiên lƣợng của bệnh không phụ thuộc vào các yếu tố của phân loại TNM. Thời gian sống thêm không khác biệt giữa các giai đoạn I, II và III [65]. Do đó, trong hầu hết các trƣờng hợp UTPTBN, ngƣời ta chỉ phân loại theo hai giai đoạn nhƣ đã trình bày ở trên. Nguyên nhân chính gây ra ung thƣ phổi là do ảnh hƣởng của việc tiếp xúc với nhiều yếu tố nguy cơ nhƣ thuốc lá, khói bụi của môi trƣờng làm việc.

Trong đó, thuốc lá là nguyên nhân chủ yếu gây ra ung thƣ phổi [65]. Để khắc phục nguy cơ này, năm 2012, Quốc hội đã thông qua luật cấm thuốc lá. Theo đó, tỷ lệ sử dụng thuốc lá ở nam giới đã giảm từ 56,1 % năm 2002 xuống 47,4 % năm 2010, khoảng 1 % mỗi năm [89]. Đến nay, hầu hết ung thƣ phổi đều đƣợc chẩn đoán lần đầu dựa trên các triệu chứng lâm sàng.

Tuy nhiên, các triệu chứng ban đầu thƣờng không rõ ràng, dễ nhầm lẫn sang các bệnh khác nhƣ ho ngày càng nặng và kéo dài, tức ngực, giảm cân không có lý do, đau lƣng, chán ăn và mệt mỏi; do đó bệnh thƣờng đƣợc phát hiện ở giai đoạn muộn [79]. Bên cạnh những phƣơng pháp lâm sàng, cần phối hợp với các xét nghiệm cận lâm sàng để có đƣợc những chẩn đoán sớm và chính xác hơn cho 3 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] bệnh nhân. Các phƣơng pháp xét nghiệm cận lâm sàng hiện đang đƣợc sử dụng phổ biến trong việc chẩn đoán ung thƣ phổi bao gồm: - Phương pháp chẩn đoán hình ảnh: có thể chia thành 2 nhóm:  Phƣơng pháp không xâm lấn: + Chụp X – quang ngực: Đây là phƣơng pháp phổ biến nhất phát hiện đƣợc những đám mờ, hình ảnh tràn dịch màng phổi, xác định đƣợc vị trí, kích thƣớc, hình thái phổi bị tổn thƣơng, dựa vào đó để chẩn đoán ung thƣ phổi. Tuy nhiên độ nhạy và độ đặc hiệu của phƣơng pháp này còn rất hạn chế do không phát hiện đƣợc các tổn thƣơng nhỏ (thƣờng chỉ phát hiện đƣợc khi khối u đạt kích thƣớc 7 – 10 mm và chứa khoảng một triệu tế bào).

Bên cạnh đó, kỹ thuật không phân biệt đƣợc chính xác bệnh ung thƣ phổi với một số bệnh lý khác nhƣ áp-xe phổi,.[75] + Chụp cắt lớp vi tính lồng ngực (CT): Phƣơng pháp này thƣờng đƣợc sử dụng để chẩn đoán u phổi, u trung thất và giãn phế quản khi kết quả chụp X–quang nghi ngờ có khối u. Những hình ảnh cắt lớp chi tiết đƣợc hiển thị trên màn hình máy tính cho phép đánh giá kỹ hơn các tổn thƣơng của u phổi (kích thƣớc, vị trí, mức độ xâm lấn). Tuy nhiên, dù độ nhạy của phƣơng pháp chụp cắt lớp vi tính khá cao nhƣng độ đặc hiệu vẫn còn thấp do chƣa chẩn đoán đƣợc tính chất mô bệnh học của tổn thƣơng cũng nhƣ phân biệt u lành với u ác [71]. + Chụp cộng hƣởng từ (MRI) có độ phân giải mô mềm cao và an toàn.

Có ƣu thế hơn kỹ thuật CT trong việc đánh giá tình trạng xâm lấn vào màng tim, tim và các mạch máu lớn; mức độ chèn ép tủy sống của khối u và phát hiện di căn hệ thần kinh trung ƣơng [52]. + Một số xét nghiệm xác định tình trạng di căn: PET/CT, xạ hình xƣơng, chụp cộng hƣởng từ sọ não, siêu âm bụng, chụp cắt lớp vi tính bụng,… [52].  Phƣơng pháp xâm lấn: + Nội soi phế quản: đây là phƣơng pháp dùng ống soi mềm đƣa vào phế quản giúp quan sát đƣợc các khối u xuất phát từ phế quản và cho phép lấy mẫu mô 4 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] trong lòng phế quản hoặc dịch phế quản làm giải phẫu bệnh hoặc tế bào học. Ngoài ra, dựa vào kết quả nội soi, tiến hành sinh thiết gián tiếp xuyên qua thành phế quản hoặc lấy dịch chải rửa phế quản để chẩn đoán xác định khối u và đánh giá khả năng phẫu thuật và mức độ cắt bỏ khối u [2].

Tuy nhiên, nội soi phế quản ống mềm chỉ đến đƣợc vùng trung tâm và vùng giữa, không quan sát đƣợc những tổn thƣơng ngoại vi. + Nội soi lồng ngực: phƣơng pháp này dùng để đánh giá các khối u chƣa thể chẩn đoán chính xác sau khi nội soi phế quản hoặc sinh thiết xuyên thành ngực. Ngoài ra, nội soi lồng ngực còn giúp sinh thiết các nốt đơn độc ngoại vi và chẩn đoán nguyên nhân tràn dịch màng phổi [43]. - Phương pháp mô bệnh học:  Xét nghiệm mô bệnh học khối u: đƣợc xem là ―tiêu chuẩn vàng‖ để chẩn đoán ung thƣ phổi.

Mẫu bệnh phẩm có thể lấy từ mô khối u sau phẫu thuật hoặc sinh thiết qua nội soi phế quản hoặc sinh thiết qua thành ngực dƣới sự hƣớng dẫn của cắt lớp vi tính. Phƣơng pháp này ngoài xác định phân nhóm, hình ảnh giải phẫu bệnh còn cho biết mức độ ác tính và xâm lấn của khối u, giúp lựa chọn phác đồ điều trị và tiên lƣợng.