BỘ GIÁO DUC VA DAO TAO TRUONG DAI HOC BACH KHOA HA NOI ĐINH TIH THU TRANG DE TALNGHIEN CỨU TÁCH DÒNG GEN MÃ HÓA ENZYM FIBRINAZA CUA MOT SO CHUNG VI KHUAN PHAN LAP DUOC TY DAU TUONG LEN MEN LUAN VAN TITAC 81 KITOA TIOC NGÀNH:CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS.NGUYEN LAN HUONG HÀ NỘI - 2010 Binh Thi Thu Ts Mục lục eae Lời mẻ đầu. ChươngI TỔNG QUAN TÀI LIỆU mm 11. Cơ chế hình thành Ñbrin trong cơ thể. Cơ chế phân hãy Fiồrhn trong cơ (hŠ người.
Cấu tạo va tinh chai 13. Cư chỗ táo động của Fibrinaza 15 13. Các ví sinh vật cả khả nang sink ting hop enzyme Fibrinaza 14. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng ensym Fibrinaza trên thể giới và tại Nam - 20 1.
Sử dụng kỹ thuật gen vào nghiên cứu lạo chủng tái tổ hợp 22 ESA, Vector th M608 oes scssssatesiioavissencisiustanisveatianasinnind2 F55. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Nguyên vật liệu, hóa chất và thiết bị sử dụng. ng eeeeeiooe TỔ 11.
Môi trường. Thiết bị sử dụng - 28 TI. Phương pháp nghiên cứu. Phương pháp ví sinh VẬT,.
Phương pháp hóa sinh. Điện di DNA trên gel agarose 34 11. Tách chiết DA của vì khuẩn 35 Khoa Công nghệ Bình học 1 Lớp cao học kB10 Binh Thi Thu Ts 112.6 Phương pháp khuyách đại DN-4 bằng phản ing chuéi polymerase (Polymerase Chairs Reaction- PCR). Xứ lý DNA bằng snayme gigi htenvcuueneneninenenmnanenaneneedd 112.
Ghép nỗi DNÀ. Biến nạp vector tải lỗ hợp và lễ bảo ví khuẩn E.colt bằng phương pháp sốc nhiệt 4 11.10 Tách chiết và tinh sack DNA plasmid. Kiém tra plasmid mang sén phdm PCR mong mudn 44 Chương IIL - 45 KRT QUA VA THAO LUAN 45 TH. Tuyên chọn các chẳng vi khuẩn sinh tổng hợp fibrinaza.
Định tên chủng vi khuẩn nghiền cửu. Nghiên cửu tạo chủng tải tổ hợp mang gen mã hóa fibrinaza. Š2 HEIL, Tach DNA otha vi KhIẪN, co keneeeeoeoooeoeooS2 -HỊ 3. Nhân đoạn gen mã hóa enspm fibrinasa 53 1H1.
Xử lý sản phdm PCR bang enzym gidi han 55 HL 3. Ghép néi gen mit hoa enzym fibrinaza va vector phT-226f |). Bién nap vector tai t6 hop vao té hao F. calt bang phương pháp sốc nhiật.
Chọn lọc dòng pET-22b(+) mang gen mã hóa JiriwazA.S8 KÉT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ. ác nenereeieserrrrieeosoeoue Ø2 Khoa Công nghệ Bình học 2 Lớp cao học kB10 Binh Thi Thu Ts Danh mục các kí hiệu và chữ cái viết tắt Amp Ampieilin Bp Cp bazo dNTP Deoxynucleoside triphosphate DNA Deoxynucleic acid B. cai Escherichia coli EDTA Rthylene Diamine Tetraacelic Acid EtBr Tthidiurn bromide Kb Kilo bazơ LB Luria — Bertani PCR Phan ứng day chuyén polymerase (Polymerase Chain Reaction) RNA Ribomuclease SDS Sodium Dodecyi Sulphate TAE Tris — acelalc - EDTA TE Tris - EDTA tPA Tissue — type plasminogen activator (chat hoat héa plasminogen md} Urokinase type plasminogen activator (Chit hoat hoa urokinase) Khoa Céng nghé Sinh hoc 3 Lớp cao học kB10 Binh Thi Thu Ts Danh mục các bang Bang 1.1: Vikhudn Bacillus sp. phan lép duoc tir mét sé Suge phẩm lên men truyền thẳng Béng 1.
Dée tinh của một số ensym fibrinaza sinh tông hợp từ vi sinh vật Rang 1. Thanh phan cdu tao cha vector pET-22b(+) Bảng 22 Các hỏa chất sử dụng trong nghiên cửu Bang 2. Thanh phan phan ing PCR khuyéch dai gen Bang 2. Chế độ nhiệt cho phan ứng PCR "Bảng 2.
Thành phần phân ứng xử lý plasmnd bằng enzym giới hạn Bảng 2. Thành phần phân ứng xử lý sân phẩm PCR bằng en=ym giới hạa Bảng 3. Khả năng lên men của các chững nghiên cửa. 1loạt lực của ensym tách chiết được từ các chùng bằng phương pháp do vòng thủu phân và phương pháp so màu ảng 3.
Tình thái khuẩn lạc và hình thái tổ bào của các chủng Khoa Công nghệ Bình học 4 Lớp cao học kB10 Binh Thi Thu Ts Danh mục các hình Hình 1.1: Cúc sợi fibrin làm động tụ máu Hinh 1.2 Quả trình hình thành fibrin Hinh } 3 Cấu trúc vòng xoắn của nattokinase Linh 2. Vector pET-22b( } Linh 3. Linh thai khudn lac va té bao cha cdc ching nghién cit Tinh 3 2. Két qua định tên bing b6 Kit APT SOCITB cata 3 ching T19, T21 va T23 Hinh 3.
DNA tng sé ctta MT Hinh 3.4, San phim PCR nhân đoạn gen mẽ hỏa Ñbrinaza cia ching M, T19, T21 vis T23 Hinh 3. Sén phim PCR nhân đoạn gen mỡ hỏa fibrinaza cha ching M1 Hinh 3. Kết quả xử lý bằng enzpm giới hạn Hinh 3. Kết qua tinh sach plasmid hình 3.8 Kết quả biển nạp vector tải tổ hop vio B.9 Chọn dòng pET-226{ |) mang gen ngoai lai mất.
hóa enxym ftbrinaza THình 3. Kiểm tra vector tái tổ hợp mang gen mi héa enzyme fibrinaza bang phương pháp # lý enaye giới han Hình 3. Kiểm tra vector tải tổ hơn mang gen mã hóa en=yme fibrimaza bằng byt thuật PCR Khoa Công nghệ Bình học 5 Lớp cao học kB10 Binh Thi Thu Ts Lời mớ đầu Trong những năm gẫn đây, bệnh tim mạch lả nguyên nhân hàng đầu gây lử vong trên thế giới. Theo lỗ chức Y tẻ thế giới (WHO), cứ 2 giây có 1 người chếi vì bệnh tím mạch, cứ 5 giây thủ có 1 trường hợp nhồi mau co tim va cit 6 giấy thủ có một trường họp đột quy [46] Nguyên nhân chỉnh của các căn bệnh này do sự mắt cân bằng giữa hai quá trinh: quá trình đồng tụ máu và quá trình hòa tan các cụo máu, đông, do trong cơ thể có tới hơn 20 loại enzym gây đồng máu nhưng chỉ cỏ mỗi một loại duy nhất có khả năng phá vỡ các cục máu đông là plasrnin [34] Năm 1980, tiến sĩ Hiroyuki Sumi tại khoa hỏa sinh trường đại học Dược Chícago (Mỹ) và các cộng sự đã phát hiện ra một loại enzym có khả năng (hủy phân fibrin (nguyén nhan chinh gay dng man) do vi kbudn Bacillus trong quả trình lên men đậu lương tiết ra.
Đỏ chỉnh là enzym fibrinaza, cnzym này được chiết xuất từ đậu tương lên men truyển thống của Nhật Bản - Nato nên còn được gọi lả Nattokinase. Ở nước ta, theo thống kê của Bộ y tế tai các bệnh viên trong cà nước những, năm gần đây cho thấy, tý lệ mắc và tỷ lệ tử vong của các bệnh tìm mạch khá cao. Một số hãng dược phẩm nước ngoài của Mỹ và Nhật Bản đã đưa ra thị trường một số sản phẩm chứa enzym fibrinaza như: Naffolcinase, Mattok, Fibrinaza. tuy nhiên các sản phâm này thường rất đắt so với thu nhập của người dân Việt Nam.
Tỉnh đến nay trên thể gởi đã có nhiều nghiên cứu đi sâu vào lựa chọn các chúng vi sinh vật sinh enzym íilrinaza cũng nh nghiên cửu đặc điểm của enzym nảy. Bên cạnh đỏ để thu được cnzym fibrinaza có boại lục cao việc nghiên cứu để tạo chủng lãi lỗ hợp mang gen mã hỏa enzyrn fibrinaza là rải cẩn thiết. Tuy nhiên ở nước ta các nghiên cửu mới chỉ dừng lại ở việc phân lập và tối ưu điều kiện sinh trướng của một số chủng sinh tổng hợp enzym fiDrinaza, chưa có một nghiên cửu nảo về tạo chúng tải tổ hợp của enzymn nảy. Hơn nữa, nước ta với nguồn đậu tương, déi dào đây là điều kiện thuận lợi đề chủng ta tiền hành các nghiên cứu nhằm tạo ra.
sản phẩm mang thương hiện Việt Nam. Khoa Công nghệ Sinh học 6 Lớp cao học kB10 Binh Thi Thu Ts Xuất phát từ các lý đo trên, chủng tôi tiền hành để tải "Nghidn cen tach dong gen mã hảu engpm fibrinaga cũa một số chẳng vì khuẩn phân lập từ. đậu tương lên mien”. Khoa Công nghệ Bình học Lớp cao học kB10 Luận vẫn cao học Dinh Thi Thu Trang Chuong I TONG QUAN TAI LIEU L1.
Fibrin Eibin là một loại protein dạng sợi được polyme hỏa để tạo thành dạng lưới bao. quanh vết thương có tác dụng cảm mau. được tạo thành từ chất tạo tơ huyết hay còn gọi là fñbrinogen nhờ sự hoạt đông của thrombin. Khi đó, ñbrin được tạo thành sẽ liên kết với nhau bởi nhân tô VIII đẻ tạo thành các cục mau.
Ngoai ra, fibrin con tham gia vào một số quá trình sinh học trong cơ thể như: truyền tin hiệu, đông tu máu trong mạch máu và polyme hỏa protein. Cơ chế hình thành fibrin trong cơ thê Khi co the binh thudng fibrin ton tai ở dạng tiên chất không có hoạt tính, đó là dang fibrinogen. Khi co thé bi ton thuong, dang tién chat fibrinogen hoa tan trong máu sẽ được chuyển hỏa thảnh ñbrin không hòa tan trong máu tao nên cục máu đông bịt kín chỗ tổn thương một cách vững chắc. Quả trình nảy có sự tham gia của Khoa Công nghệ Sinh học § Lớp cao học k8§10 Binh Thi Thu Ts các thành phan gay đông máu có trang huyết tương theo hai con đường nội sinh và ngoại sinh.
Titrinogcn là một loại glycoprntcin 340-HD được sinh tổng hợp ở gan và có nông đô khoảng 1,5 +4,0 g/l trong huyết tương, Do đó đối với những nguời bệnh suy gan hoặc mắc các bệnh vẻ di truyền liên quan đến gen ở nhiễm sắc thể số 4 cỏ thể din đến việc giảm nông độ và chất lượng ñbrinogen gây ra bệnh trầm kha về mau. Fibrinogen đóng vai trò chính trong việc tạo cầu nổi các sợi tơ huyết bằng việc kết hợp các protein bề mặt GbIIb/IHa của chúng lại với nhan và hình thành fibrin dé cdm mau [34] Fibrinogen có cấu trúc đối xứng 6 cặp chuỗi polypeptit (chuỗi alpha, beta va gramma). Trên chuỗi alpha và beta cỏ mội trình lự peptit ngẩn được gọi là fibrinopeptit. Chinh cac chudi peplit ngắn này cản trở việc fibrinogen bi polyme hda bởi chính nó một cách tủy tiện [34].
+ Một số vấn tá chính tham gia vào quả trình chuyén héa fibrinogen thank fibrin ~ Nhóm yếu tổ liếp xúc: gồm các yêu tổ XI, XI, prekallikrein. Các yêu tổ thuộc. nhỏm nảy hoại động không cân sự có mặt của ion Ca”” cũng như vitamin K. - Nhém yén té prothrombin: gdm cac yéu té ïI, VII, IX, X.
Đặc điểm chung của nhm náy là cân sự có mnặt của vitaanin E để các yếu tỏ này gắn được với ion Ca. ~ Nhẻm fibrinogen: gỗm Íbrìnogen, V, VIIL, XTIL. Nhỏm này chin tác dựng của thrombin, kém bên vững. Tên của mội số yêu lế chính tham gìa vào quá Irinh đồng máu: 1 Yếu tổ I: fibrinogen + Yêu tễ 3: potlrombin 1 Yêu tô 3: Itroboplastin của mê 1 Yếu tổ IV: on Ca + Yéu té V: proacceletin Khoa Céng nghé Sinh hoc 9 Lớp cao học kB10 Binh Thi Thu Ts 1 Yếu tổ VII: precanvertin.
+ Yêu tổ VI: globulin A 1 Yéu t6 IX: globulinB 1 Yéu té X: Stuart — Power 1 Yéu té XE: globulin C + Yéu té XIE Hageman + Yéuté XIII ổn dinh fibrin Quá tình chuyển hỏa fibrinogen thành ñbrin được mô tả đưới hình sau Hệ thông nội sinli thông ngaal sinh L—HMw.