Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ vật lý chuyên ngành Vật lý Chất rắn (mã số: 62440104) của tác giả Chu Tiến Dũng, được thực hiện tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội năm 2018 dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Nguyễn Hoàng Nam và PGS. Trần Thị Hồng, mang tiêu đề: "Hạt nano đa chức năng trên cơ sở $\text{Fe}_3\text{O}_4$ – $\text{Ag}$ – $\text{ZnS:Mn}$ và thử nghiệm phát hiện tế bào ung thư".

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Vật liệu nano đa chức năng tích hợp các hạt nano từ tính với các hạt nano kim loại quý hoặc nano bán dẫn chấm lượng tử đang thu hút sự chú ý trong vật lý ứng dụng và y – sinh học. Hệ vật liệu này cho phép kết hợp đồng thời các đặc tính vật lý đơn lẻ: tính chất siêu thuận từ với từ độ bão hòa ($M_s$) cao của hạt $\text{Fe}_3\text{O}_4$ (giúp phân tách tế bào, dẫn truyền thuốc hướng đích, tăng độ tương phản ảnh cộng hưởng từ MRI, nhiệt từ trị); tính chất hấp thụ cộng hưởng plasmon bề mặt cục bộ (LSPR) và tán xạ Raman tăng cường bề mặt (SERS) của hạt nano kim loại quý $\text{Ag}$ (giúp phát hiện, đánh dấu thực thể sinh học, quang nhiệt trị liệu); cùng tính chất phát huỳnh quang (PL) mạnh, ổn định của hạt nano bán dẫn $\text{ZnS:Mn}$ (giúp ghi ảnh huỳnh quang sinh học và quang động lực).

Mặc dù có tiềm năng ứng dụng lớn, các nghiên cứu trong nước trước đó về hệ nano từ – kim loại ($\text{Fe}_3\text{O}_4/\text{SiO}_2/\text{Au}$, $\text{Ag}/\text{Fe}_3\text{O}_4\text{-CS}$, $\alpha\text{-Fe}_2\text{O}_3\text{-Ag}$, $\text{MnFe}_2\text{O}_4\text{-Ag}$) còn gặp hạn chế do quy trình chế tạo phức tạp, giá trị $M_s$ thấp trong khi lực kháng từ ($H_c$) và từ dư ($M_r$) còn lớn, làm giảm hiệu quả phân tách và định hướng từ. Trên thế giới, các phương pháp chế tạo cấu trúc lõi – vỏ hay nano composite nhiều thành phần thường đòi hỏi điều kiện khắt khe (nhiệt độ, áp suất cao), thiết bị phức tạp và chi phí lớn, chưa phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm thực tế tại Việt Nam; đồng thời việc sử dụng các chất cản quang chứa ion $\text{Gd}^{3+}$ hay chấm lượng tử chứa kim loại nặng ($\text{Cd}, \text{Te}, \text{Se}$) tiềm ẩn độc tính sinh học cao. Do đó, việc nghiên cứu chế tạo hạt nano đa chức năng trên cơ sở $\text{Fe}_3\text{O}_4$, $\text{Ag}$ và $\text{ZnS:Mn}$ bằng các phương pháp hóa học đơn giản, chi phí thấp, có độ tương thích sinh học cao và thử nghiệm định hướng phát hiện tế bào ung thư là vấn đề có tính cấp thiết thực tiễn.

Mục tiêu nghiên cứu

Chế tạo vật liệu nano composite đa chức năng chứa đồng thời các hạt nano $\text{Fe}_3\text{O}_4$ và nano kim loại quý ($\text{Ag}$) hoặc nano bán dẫn ($\text{ZnS:Mn}$) bằng phương pháp hóa học đơn giản, chi phí thấp, thể hiện đồng thời tính chất siêu thuận từ ($M_s$ cao) và tính chất quang đặc trưng (đỉnh LSPR, phổ SERS của $\text{Ag}$ hoặc tín hiệu PL ổn định của $\text{ZnS:Mn}$), từ đó ứng dụng để phát hiện, bắt cặp, đánh dấu và phân tách một số dòng tế bào ung thư.

Nội dung và giới hạn nghiên cứu

Theo văn bản luận án, các nội dung nghiên cứu cụ thể được xác định gồm 4 phần:

  1. Nghiên cứu chế tạo hạt nano đa chức năng từ tính – kim loại $\text{Fe}_3\text{O}_4\text{-Ag@SiO}_2$ và từ tính – bán dẫn $\text{Fe}_3\text{O}_4\text{-ZnS:Mn@SiO}_2$ trên nền silica ($\text{SiO}_2$) bằng phương pháp vi nhũ tương đảo và Stöber.
  2. Nghiên cứu chế tạo hạt nano composite đa chức năng từ tính – kim loại $\text{Fe}_3\text{O}_4/\text{Ag}$ thông qua khử ion phức chất $[-\text{Ag}(\text{NH}_3)_2]^+$ hình thành giữa ion $\text{Ag}^+$ với nhóm amin ($-\text{NH}_2$) được chức năng hóa trên bề mặt $\text{Fe}_3\text{O}_4$; khảo sát ảnh hưởng của pH và lượng tiền chất (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES).
  3. Nghiên cứu chế tạo hạt nano composite đa chức năng $\text{Fe}_3\text{O}_4\text{@SiO}_2/\text{Ag}$ thông qua khử ion phức chất $[-\text{Ag}(\text{NH}_3)_2]^+$ trên bề mặt $\text{Fe}_3\text{O}_4$ bọc silica; khảo sát quy trình bọc silica và chức năng hóa APTES đồng thời.
  4. Bước đầu thử nghiệm sử dụng các hạt nano composite $\text{Fe}_3\text{O}_4/\text{Ag}$ và $\text{Fe}_3\text{O}_4\text{@SiO}_2/\text{Ag}$ trong việc gắn kết phân tử sinh học (kháng thể anti-EGFR, phân tử aptamer) để phát hiện, bắt cặp, phân tách và đánh dấu các dòng tế bào ung thư da SK-Mel 28, tế bào da thường Hacat và tế bào ung thư phổi A549.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu: Vật liệu nano siêu thuận từ $\text{Fe}_3\text{O}_4$, nano kim loại $\text{Ag}$, nano bán dẫn $\text{ZnS:Mn}$; các hệ nano đa chức năng $\text{Fe}_3\text{O}_4\text{-Ag@SiO}_2$, $\text{Fe}_3\text{O}_4\text{-ZnS:Mn@SiO}_2$, $\text{Fe}_3\text{O}_4/\text{Ag}$, $\text{Fe}_3\text{O}_4\text{@SiO}_2/\text{Ag}$; các liên hợp sinh học với phân tử chỉ thị 4-aminothiophenol (4ATP), kháng thể thụ thể yếu tố tăng trưởng thượng bì (anti-EGFR) và đoạn oligonucleotide aptamer mạch đơn.
  • Phạm vi nghiên cứu: Khảo sát thực nghiệm quy trình tổng hợp, cấu trúc vi mô, tính chất từ và tính chất quang tại phòng thí nghiệm; thử nghiệm in vitro khả năng bắt cặp, đánh dấu trên ba dòng tế bào: SK-Mel 28 (ung thư hắc tố da), Hacat (tế bào biểu mô da lành tính) và A549 (ung thư biểu mô phổi người).

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước được tác giả điểm lại

Tác giả đã tổng thuật các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến từng nhóm vật liệu đơn lẻ và vật liệu tổ hợp:

  • Vật liệu nano từ tính $\text{Fe}_3\text{O}_4$: Được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi nhờ tính chất siêu thuận từ khi kích thước dưới 30 nm, không xuất hiện từ trễ ($H_c \approx 0, M_r \approx 0$). Các nghiên cứu của Tartaj P. (2003), Dobson J. (2006), Laurent S. (2008), Mody V.V. (2013) đã khẳng định vai trò của hạt từ trong phân tách tế bào, dẫn truyền thuốc và nhiệt từ trị (ở dải nhiệt độ $42^\circ\text{C} - 45^\circ\text{C}$). Tại Việt Nam, nhóm tác giả Nguyễn Xuân Phúc, Trần Đại Lâm (2010) khảo sát hạt từ bọc polyme định hướng nhiệt từ trị và tăng tương phản MRI; nhóm Nguyễn Hoàng Lương, Đào Văn Quy (2013) sử dụng $\text{Fe}_3\text{O}_4\text{@SiO}_2$ phát hiện virus gây bệnh.
  • Hạt nano kim loại quý ($\text{Ag}, \text{Au}$): Dựa trên hiện tượng LSPR xuất phát từ nghiên cứu của Michael Faraday (1857) và hiệu ứng SERS được Fleischmann M. phát hiện năm 1974. El-Sayed I.H. và cộng sự (2005) đã gắn anti-EGFR lên hạt nano vàng để chẩn đoán tế bào biểu mô ác tính HSC 3 so với tế bào thường Hacat bằng kính hiển vi trường tối; Tai S. và cộng sự (2007) sử dụng hạt nano $\text{Ag}$ gắn anti-Her-2 làm tác nhân tương phản; Boca S. và cộng sự (2011) so sánh hạt nano $\text{Ag-CS}$ và thanh nano $\text{Au-PEG}$ trên dòng tế bào ung thư phổi NCI-H460 và tế bào lành HEK; AshaRani P. và cộng sự (2009) nghiên cứu độc tính và khả năng chống ung thư của nano $\text{Ag}$ bọc tinh bột trên tế bào u não U251.
  • Hạt nano bán dẫn chấm lượng tử: Nghiên cứu của Shi C. và cộng sự (2008) ứng dụng chấm lượng tử thương mại (QD-605, 655, 565 nm) trong hóa mô miễn dịch huỳnh quang trên tế bào ung thư tuyến tiền liệt; Zahavy E. và cộng sự phát triển kỹ thuật nhuộm đa màu trên tế bào T và B; Trần Hồng Nhung và cộng sự (2010, 2012) sử dụng QD-655 và CdTe gắn kháng thể phage Her-2 để nhận diện tế bào ung thư. Nhằm khắc phục độc tính của các ion $\text{Cd}^{2+}, \text{Te}^{2-}$, các hệ bán dẫn trên cơ sở $\text{ZnS}$, $\text{ZnS:Mn}$ được đưa vào nghiên cứu (Sooklal K., 1996; Bol A.A., 2001).
  • Hạt nano đa chức năng: Các nghiên cứu quốc tế phát triển hệ cấu trúc lõi – vỏ ($\text{Fe}_3\text{O}_4/\text{CdS}$, $\text{Co/CdSe}$, $\text{Co@Au}$, $\text{FePt@CdS}$, $\text{Fe}_3\text{O}_4\text{@Ag}$) và composite dị thể ($\text{Au-Fe}_3\text{O}_4$ dạng quả tạ của Sun S., $\text{CdS/Fe}_3\text{O}_4$ cấu trúc lông nhím của Wang L. và Wu Z.). Ở trong nước, các hệ $\text{Fe}_3\text{O}_4/\text{SiO}_2/\text{Au}$ (Trần Hồng Nhung), $\text{Ag/Fe}_3\text{O}_4\text{-CS}$ (Trần Đại Lâm), $\alpha\text{-Fe}_2\text{O}_3\text{-Ag}$ (Lê Anh Tuấn), $\text{MnFe}_2\text{O}_4\text{-Ag}$ (Lê Thành Huy) đã được công bố nhưng còn tồn tại nhược điểm về quy trình chế tạo hoặc đặc tính từ dư lớn.

Khoảng trống nghiên cứu luận án lựa chọn giải quyết

Luận án tập trung giải quyết việc thiết lập quy trình chế tạo hóa học đơn giản, có sự hỗ trợ của sóng siêu âm để tổng hợp các hệ hạt nano đa chức năng gồm $\text{Fe}_3\text{O}_4$ kết hợp với $\text{Ag}$ hoặc $\text{ZnS:Mn}$ (trên nền silica hoặc dạng liên kết composite trực tiếp qua cầu nối amin APTES). Mục tiêu là tạo ra vật liệu vừa duy trì được độ từ hóa bão hòa cao không từ trễ ở nhiệt độ phòng, vừa có cường độ phát xạ quang/tín hiệu SERS mạnh, không chứa thành phần kim loại nặng độc hại, đồng thời kiểm soát thành công việc gắn kết các phối tử sinh học (anti-EGFR, aptamer) để nhận biết đặc hiệu tế bào ung thư.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

  • Hiện tượng siêu thuận từ: Khi kích thước tinh thể hạt từ tính nhỏ hơn kích thước đơn đô-men tới hạn ($< 30\text{ nm}$ đối với $\text{Fe}_3\text{O}_4$), năng lượng kích thích nhiệt ở nhiệt độ phòng thắng thế năng lượng dị hướng từ, làm mômen từ định hướng hỗn loạn khi không có từ trường ngoài ($H_c = 0, M_r = 0$). Khi có từ trường ngoài, hệ đạt độ bão hòa nhanh chóng theo hàm Langevin: $$M(H) = M_s \left[ \coth\left(\frac{\mu H}{k_B T}\right) - \frac{k_B T}{\mu H} \right]$$
  • Hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt cục bộ (LSPR): Xảy ra khi tần số điện trường ánh sáng kích thích cộng hưởng với dao động tập thể của các điện tử tự do trên bề mặt hạt nano kim loại, bước sóng đỉnh hấp thụ cực đại $\lambda_{max}$ phụ thuộc vào chiết suất môi trường $n_m$: $$\lambda_{max} = \lambda_p \sqrt{2n_m^2 + 1}$$
  • Tán xạ Raman tăng cường bề mặt (SERS): Sự tương tác giữa điện từ trường cục bộ tăng cường tại các điểm nối hạt nano kim loại với các phân tử hữu cơ gắn trên bề mặt làm tăng cường độ tán xạ Raman không đàn hồi từ $10^4$ đến $10^5$ lần.
  • Cơ chế huỳnh quang của $\text{ZnS:Mn}$: Sự pha tạp ion $\text{Mn}^{2+}$ vào mạng nền $\text{ZnS}$ tạo ra tâm phát xạ đặc trưng tương ứng với bước chuyển mức năng lượng nội tại $^4T_1 \rightarrow ,^6A_1$ của ion $\text{Mn}^{2+}$, tạo đỉnh phát huỳnh quang màu cam bước sóng xấp xỉ 598 nm khi bị kích thích bởi tia cực tím.
  • Cơ chế bắt cặp sinh học: Kháng thể anti-EGFR nhận diện đặc hiệu vùng ngoại bào của thụ thể EGFR biểu hiện quá mức trên màng tế bào ung thư da SK-Mel 28. Phân tử aptamer (đoạn oligonucleotide mạch đơn) có cấu trúc không gian bậc ba tương thích để liên kết chọn lọc với các thụ thể bề mặt của tế bào ung thư phổi A549.

Phương pháp thực nghiệm và kỹ thuật phân tích

  • Phương pháp chế tạo:
    • Đồng kết tủa hóa học để tổng hợp hạt nano $\text{Fe}_3\text{O}_4$ từ muối $\text{FeCl}_2\cdot 4\text{H}_2\text{O}$ và $\text{FeCl}_3\cdot 6\text{H}_2\text{O}$.
    • Phương pháp hóa ướt tổng hợp hạt nano bán dẫn $\text{ZnS:Mn}$ với các tỷ lệ pha tạp ion $\text{Mn}^{2+}$ từ 0% đến 12%.
    • Phương pháp vi nhũ tương đảo (hệ cyclohexane, chất hoạt động bề mặt Igepal CO-520, nước, $\text{NH}_4\text{OH}$, TEOS) và phương pháp Stöber cải tiến để gói đồng thời các hạt nano vào nền silica.
    • Phương pháp hóa học có sự hỗ trợ của sóng siêu âm (bể siêu âm Elmasonic S15H tần số 37 kHz và hệ điện hóa siêu âm VCX 750 công suất 750 W, tần số 20 kHz) để khử phức chất $[-\text{Ag}(\text{NH}_3)_2]^+$ bằng $\text{NaBH}_4$ trên bề mặt hạt từ đã chức năng hóa nhóm amin.
  • Hệ thiết bị khảo sát cấu trúc và tính chất:
    • Nhiễu xạ tia X (XRD) trên hệ D5005 Siemens và D8 Advance Bruker (bước sóng $\text{Cu-}K\alpha = 1,5406\text{ \AA}$).
    • Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM, HRTEM) và nhiễu xạ điện tử lựa chọn vùng (SAED) trên thiết bị JEOL JEM-1010 và JEM-2100F.
    • Phổ tán sắc năng lượng tia X (EDS) trên hệ Oxford Instruments tích hợp trong kính hiển vi điện tử quét FESEM Hitachi S-4800.
    • Phổ quang điện tử tia X (XPS) trên hệ K-Alpha Thermo Scientific.
    • Phổ hấp thụ tử ngoại – khả kiến (UV-Vis) trên máy đo JASCO V-670.
    • Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR) trên máy quang phổ Nicolet Impact 410.
    • Phổ tán xạ Raman/SERS trên hệ đo MacroRAM và LabRAM HR800 (laser kích thích bước sóng 632,8 nm và 785 nm).
    • Phổ phát huỳnh quang (PL) đo bằng hệ kích thích laser He-Cd (bước sóng 325 nm).
    • Từ kế mẫu rung (VSM) trên hệ DMS-880 và Lake Shore 7404 đo đường cong từ hóa $M-H$ trong từ trường ngoài đến $\pm 12\text{ kOe}$ ở nhiệt độ phòng.
    • Kính hiển vi quang học trường sáng – trường tối (Olympus BX51) gắn camera kỹ thuật số phân giải cao; tính toán mật độ cường độ sáng bằng phần mềm ImageJ.

Nguồn tư liệu, hóa chất và mẫu sinh học

  • Hóa chất có độ sạch từ 97% đến 99,9% gồm: $\text{FeCl}_2\cdot 4\text{H}_2\text{O}$, $\text{FeCl}_3\cdot 6\text{H}_2\text{O}$, $\text{AgNO}_3$, TEOS, APTES, $\text{Zn}(\text{NO}_3)_2\cdot 6\text{H}_2\text{O}$, $\text{Mn}(\text{NO}_3)_2\cdot 4\text{H}_2\text{O}$, $\text{Na}_2\text{S}\cdot 9\text{H}_2\text{O}$, $\text{NaBH}_4$, 4ATP, EDC, BSA từ Merck và Sigma-Aldrich.
  • Thực thể sinh học: Kháng thể anti-EGFR (CLS Cell Lines Service, Đức); phân tử aptamer có trình tự $5'\text{-(CH}_2)_6\text{-SH-ACGCT CGGAT GCCAC TACAG GGTTG CATGC CGTGG GGAGG GGGGT GGGTT TTATA GCGTA CTCAG CTCAT GGACG TGCTG GTGAC-}3'$ (ATCC, Hoa Kỳ).
  • Dòng tế bào nuôi cấy: Tế bào ung thư hắc tố da SK-Mel 28, tế bào biểu bì thường Hacat và tế bào ung thư phổi A549.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan về vật liệu nano, ứng dụng trong y - sinh học

Chương này tổng kết cơ sở lý thuyết về hạt nano từ tính ($\text{Fe}_3\text{O}_4$), hạt nano kim loại quý ($\text{Ag}, \text{Au}$), hạt nano bán dẫn chấm lượng tử ($\text{ZnS:Mn}$) và các dạng cấu trúc hạt đa chức năng. Luận án phân tích chi tiết:

  • Cơ chế vật lý của hiện tượng siêu thuận từ, ứng dụng dẫn truyền thuốc hướng đích thông qua gradient từ trường và nguyên lý nâng cao tương phản ảnh MRI dựa trên sự rút ngắn thời gian hồi phục $T_1, T_2$ của proton phân tử nước.
  • Cơ chế cộng hưởng plasmon bề mặt cục bộ (LSPR) và hiệu ứng khuếch đại điện trường sinh ra tín hiệu tán xạ Raman tăng cường bề mặt (SERS), ứng dụng của hiển vi trường tối quang học và liệu pháp quang nhiệt tiêu diệt khối u.
  • So sánh ưu điểm vượt trội của nano $\text{Ag}$ so với $\text{Au}$ về chi phí, hoạt tính kháng khuẩn và cường độ tăng cường SERS lớn do đỉnh LSPR nằm tại vùng tử ngoại – khả kiến ($\sim 400\text{ nm}$).
  • Khả năng phát quang bền vững của chấm lượng tử bán dẫn $\text{ZnS:Mn}$ với bước chuyển $^4T_1 \rightarrow ,^6A_1$ ít độc tính so với các vật liệu bán dẫn chứa $\text{Cd}$ hoặc $\text{Pb}$.
  • Cơ chế tác động của sóng siêu âm trong việc tạo các vi bọt khí xâm thực, sinh nhiệt độ và áp suất cục bộ cực cao, hỗ trợ quá trình phân tán và tăng tốc phản ứng khử hóa học trên bề mặt nano.
  • Đặc điểm sinh học của tế bào ung thư, sự biểu hiện quá mức của các thụ thể EGFR trên màng tế bào ác tính và cơ chế bắt cặp của kháng thể, aptamer đối với tế bào đích.

Chương 2: Thực nghiệm chế tạo, ứng dụng và các phương pháp khảo sát vật liệu

Trình bày chi tiết danh mục hóa chất, thông số kỹ thuật của trang thiết bị chế tạo và các bước thực nghiệm:

  • Chế tạo hạt đơn tính chất: Tổng hợp $\text{Fe}_3\text{O}_4$ kích thước $10 - 12\text{ nm}$ bằng phương pháp đồng kết tủa; tổng hợp hạt nano bán dẫn $\text{ZnS:Mn}$ với các nồng độ pha tạp $\text{Mn}^{2+}$ thay đổi từ 0%, 4%, 6%, 8%, 10% đến 12%; tổng hợp hạt nano $\text{Ag}$ gắn chất chỉ thị 4ATP ($\text{Ag-4ATP}$).
  • Chế tạo hạt nano đa chức năng trên nền silica: Sử dụng phương pháp vi nhũ tương đảo (mẫu ký hiệu -V) và phương pháp Stöber cải tiến (mẫu ký hiệu -S) để bọc đồng thời hạt $\text{Fe}_3\text{O}_4$ và $\text{Ag-4ATP}$ tạo thành $\text{Fe}_3\text{O}_4\text{-Ag@SiO}_2$; bọc đồng thời hạt $\text{Fe}_3\text{O}_4$ và $\text{ZnS:Mn}$ tạo thành $\text{Fe}_3\text{O}_4\text{-ZnS:Mn@SiO}_2$.
  • Chế tạo vật liệu composite $\text{Fe}_3\text{O}_4/\text{Ag}$ và $\text{Fe}_3\text{O}_4\text{@SiO}_2/\text{Ag}$: Biến tính bề mặt hạt từ bằng nhóm $-\text{NH}_2$ của APTES, hấp phụ ion $\text{Ag}^+$ tạo phức $[-\text{Ag}(\text{NH}_3)_2]^+$ và khử hóa học tạo các mầm nano $\text{Ag}$ bám trực tiếp trên bề mặt hạt từ dưới tác động của sóng siêu âm; tiến hành khảo sát các dải pH từ 5 đến 11, thể tích APTES từ $1\text{ mL}$ đến $6\text{ mL}$, và nồng độ $\text{AgNO}_3$ từ $50\text{ mmol}$ đến $100\text{ mmol}$.
  • Quy trình gắn kết sinh học và thử nghiệm tế bào: Chức năng hóa bề mặt $\text{Fe}_3\text{O}_4/\text{Ag}$ với 4ATP làm cầu nối và gắn kháng thể anti-EGFR nhờ chất hoạt hóa EDC; gắn kết aptamer mang đầu biến tính thiol ($-\text{SH}$) với hạt composite $\text{Fe}_3\text{O}_4/\text{Ag}$ và $\text{Fe}_3\text{O}_4\text{@SiO}_2/\text{Ag}$; ủ với các dòng tế bào SK-Mel 28, Hacat và A549 trong các khoảng thời gian 1 giờ và 6 giờ, quan sát và ghi nhận tín hiệu bằng kính hiển vi trường sáng – trường tối.

Chương 3: Hạt nano đa chức năng trên nền silica: $\text{Fe}_3\text{O}_4\text{-Ag@SiO}_2$ và $\text{Fe}_3\text{O}_4\text{-ZnS:Mn@SiO}_2$

Chương 3 tập trung phân tích cấu trúc vi mô, hình thái và các đặc tính từ, quang của hai hệ vật liệu nano đa chức năng được bọc trong nền silica:

Thông số / Đặc tính Hệ hạt $\text{Fe}_3\text{O}_4\text{-Ag@SiO}_2$ Hệ hạt $\text{Fe}_3\text{O}_4\text{-ZnS:Mn@SiO}_2$
Phương pháp chế tạo Vi nhũ tương đảo (-V) và Stöber (-S) Vi nhũ tương đảo (-V) và Stöber (-S)
Cấu trúc pha (XRD) Tinh thể spinel $\text{Fe}_3\text{O}_4$ + lập phương tâm mặt $\text{Ag}$ + $\text{SiO}_2$ vô định hình Tinh thể spinel $\text{Fe}_3\text{O}_4$ + cubic Sphalerite $\text{ZnS}$ + $\text{SiO}_2$ vô định hình
Kích thước hạt (TEM) Lõi $\text{Fe}_3\text{O}_4$ ($10 - 12\text{ nm}$), $\text{Ag}$ ($8 - 10\text{ nm}$); vỏ silica khối $\sim 40 - 60\text{ nm}$ Lõi $\text{Fe}_3\text{O}_4$ ($10 - 12\text{ nm}$), $\text{ZnS:Mn}$ ($3 - 5\text{ nm}$); vỏ silica $\sim 50\text{ nm}$
Độ từ hóa bão hòa ($M_s$) $44,5\text{ emu/g}$ (mẫu -V); $38,2\text{ emu/g}$ (mẫu -S) $39,5\text{ emu/g}$ (mẫu -S); $32,1\text{ emu/g}$ (mẫu -V)
Tính chất từ Siêu thuận từ ($H_c \approx 0, M_r \approx 0$), tách lọc nhanh bằng nam châm Siêu thuận từ ($H_c \approx 0, M_r \approx 0$), phản ứng nhanh với từ trường ngoài
Đặc trưng quang học Hấp thụ LSPR tại $\sim 410 - 430\text{ nm}$ Đỉnh phát huỳnh quang màu cam tại bước sóng $\lambda = 598\text{ nm}$
Tín hiệu phân tích Phổ SERS 4ATP tại $1078, 1145, 1443, 1587\text{ cm}^{-1}$ Cường độ PL cực đại khi nồng độ pha tạp $\text{Mn}^{2+}$ đạt 10% (vùng cấm $E_g \approx 3,68\text{ eV}$)

Các kết quả chứng minh nền silica đã bảo vệ hiệu quả các hạt nano từ tính khỏi bị oxy hóa, đồng thời ngăn chặn sự kết tụ của các hạt kim loại và bán dẫn mà vẫn bảo toàn đầy đủ các đáp ứng quang và từ của từng thành phần.

Chương 4: Vật liệu nano composite đa chức năng $\text{Fe}_3\text{O}_4/\text{Ag}$, $\text{Fe}_3\text{O}_4\text{@SiO}_2/\text{Ag}$ và thử nghiệm đánh dấu tế bào

Chương này công bố các kết quả thực nghiệm tối ưu hóa quy trình tổng hợp nano composite và thử nghiệm ứng dụng sinh học:

  • Khảo sát ảnh hưởng của pH và APTES đối với hệ $\text{Fe}_3\text{O}_4/\text{Ag}$:
    • Tại điều kiện $\text{pH} = 11$, hạt composite đạt độ bền liên kết và ổn định cao nhất; khi ủ nhiệt ở $100^\circ\text{C}$ trong 8 giờ không xảy ra hiện tượng tách pha, từ độ bão hòa $M_s$ đạt $39,6\text{ emu/g}$ và xuất hiện đỉnh hấp thụ LSPR rõ nét tại $445\text{ nm}$.
    • Khi thay đổi lượng APTES ($x = 1; 3; 4,5; 6\text{ mL}$), giá trị $x = 3\text{ mL}$ tạo ra mật độ nhóm $-\text{NH}_2$ tối ưu trên bề mặt hạt từ, giúp quá trình tạo mầm và phát triển hạt $\text{Ag}$ đồng đều nhất.
  • Khảo sát hệ $\text{Fe}_3\text{O}_4\text{@SiO}_2/\text{Ag}$:
    • Tổng hợp thành công thông qua phản ứng thủy phân – ngưng tụ đồng thời TEOS và APTES để tạo lớp vỏ silica chức năng hóa amin, sau đó phát triển hạt nano $\text{Ag}$ với nồng độ $\text{AgNO}_3$ thay đổi ($50 - 100\text{ mmol}$).
    • Mẫu đạt từ độ bão hòa $M_s = 42,7\text{ emu/g}$, hấp thụ LSPR tại bước sóng $423\text{ nm}$; phổ XPS đỉnh $\text{N}1s$ tại $399,6\text{ eV}$ khẳng định liên kết hóa học giữa nhóm $-\text{NH}_2$ và nano $\text{Ag}$.
  • Thử nghiệm gắn kháng thể anti-EGFR nhận diện tế bào SK-Mel 28 và Hacat:
    • Hạt $\text{Fe}_3\text{O}_4/\text{Ag}$ gắn 4ATP và liên hợp với anti-EGFR (hệ MF-anti EGFR) cho phổ SERS mạnh tại các số sóng đặc trưng $1140\text{ cm}^{-1}$ và $1439\text{ cm}^{-1}$.
    • Hiệu suất gắn kết tế bào của hệ hạt đối với tế bào ung thư da SK-Mel 28 đạt $91,9%$, trong khi đối với tế bào da thường Hacat chỉ đạt $33,1%$, phản ánh chính xác sự biểu hiện quá mức của thụ thể EGFR trên màng tế bào ác tính. Ảnh trường tối cho thấy cường độ sáng phát xạ từ tế bào SK-Mel 28 gắn hạt nano cao vượt trội so với tế bào thường.
  • Thử nghiệm gắn aptamer bắt cặp tế bào ung thư phổi A549:
    • Cả hai hệ hạt $\text{Fe}_3\text{O}_4/\text{Ag-aptamer}$ và $\text{Fe}_3\text{O}_4\text{@SiO}_2/\text{Ag-aptamer}$ đều bắt cặp đặc hiệu với tế bào A549, thể hiện qua sự tăng vọt cường độ sáng trên ảnh hiển vi trường tối sau 1 giờ và 6 giờ ủ.
    • Sau 6 giờ tiếp xúc, tế bào ung thư A549 có hiện tượng co cụm và biến đổi hình thái dưới tác động ức chế của nano $\text{Ag}$.
    • Phân tích định lượng bằng phần mềm ImageJ cho thấy tỉ số cường độ sáng của tế bào A549 khi gắn phức hệ $\text{Fe}_3\text{O}_4\text{@SiO}_2/\text{Ag-aptamer}$ so với khi gắn $\text{Fe}_3\text{O}_4/\text{Ag-aptamer}$ đạt $1,92$ (sau 1 giờ) và $1,89$ (sau 6 giờ), khẳng định hệ hạt có vỏ silica liên hợp aptamer đạt hiệu suất định vị và gắn kết tế bào cao hơn.

Kết quả và những đóng góp mới

Các đóng góp mới của luận án

Theo văn bản luận án, công trình có các đóng góp mới sau:

  1. Sử dụng silica gói thành công đồng thời các hạt nano $\text{Fe}_3\text{O}_4$ với nano $\text{Ag}$ hoặc với nano $\text{ZnS:Mn}$ tạo thành hạt nano đa chức năng, mở ra hướng ứng dụng trong y – sinh học nhằm phát hiện, chẩn đoán sớm, chính xác tế bào ung thư, khối u bằng các tín hiệu quang học; đồng thời tách chiết, dẫn truyền hướng đích nhờ tính chất siêu thuận từ với giá trị $M_s$ cao dưới tác dụng của từ trường ngoài.
  2. Chế tạo thành công các hạt nano composite đa chức năng $\text{Fe}_3\text{O}_4/\text{Ag}$ và $\text{Fe}_3\text{O}_4\text{@SiO}_2/\text{Ag}$ có cấu trúc bền vững nhờ khử các ion phức $[-\text{Ag}(\text{NH}_3)_2]^+$ hình thành giữa ion $\text{Ag}^+$ với các nhóm $-\text{NH}_2$ được chức năng hóa trên bề mặt các hạt nano $\text{Fe}_3\text{O}_4$ và nano $\text{Fe}_3\text{O}_4$ bọc silica tương ứng.
  3. Khảo sát, đánh giá định lượng được sự ảnh hưởng của pH dung dịch và lượng tiền chất APTES đến thành phần, cấu trúc, hình thái và tính chất của nano composite $\text{Fe}_3\text{O}_4/\text{Ag}$.
  4. Gắn kết thành công kháng thể anti-EGFR lên các hạt nano composite $\text{Fe}_3\text{O}_4/\text{Ag}$ và thử nghiệm phát hiện, bắt cặp, phân biệt được hai dòng tế bào ung thư da SK-Mel 28 và da thường Hacat.
  5. Gắn kết thành công các phân tử aptamer với các hạt nano composite $\text{Fe}_3\text{O}_4/\text{Ag}$, $\text{Fe}_3\text{O}_4\text{@SiO}_2/\text{Ag}$ và thử nghiệm phát hiện, bắt cặp và đánh dấu tế bào ung thư phổi ở người A549.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

  • Ứng dụng quy trình hóa học có sự hỗ trợ của sóng siêu âm như một giải pháp chế tạo vật liệu nano đa chức năng đơn giản, kiểm soát được hình thái, độ lặp lại cao và chi phí thấp, phù hợp với điều kiện cơ sở vật chất phòng thí nghiệm trong nước.
  • Đề xuất mô hình hạt nano tích hợp tính chất từ – quang để thay thế các chất cản quang truyền thống chứa gadolini ($\text{Gd}^{3+}$) hoặc các chấm lượng tử chứa kim loại nặng độc hại trong các kỹ thuật chẩn đoán hình ảnh đa phương thức (kết hợp MRI, hiển vi huỳnh quang và hiển vi trường tối).

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

  • Luận án mới dừng lại ở việc thử nghiệm đánh giá khả năng phát hiện, bắt cặp và phân tách tế bào ung thư ở quy mô phòng thí nghiệm (in vitro), chưa triển khai các thử nghiệm độc tính chuyên sâu và đánh giá đáp ứng sinh học trên cơ thể động vật (in vivo).
  • Hình thái các hạt nano composite tổng hợp được đôi lúc chưa đạt độ cầu hoàn hảo, dải phân bố kích thước hạt còn phụ thuộc vào sự đồng đều của quá trình tạo mầm và phân tán trong môi trường phản ứng.

Định hướng nghiên cứu tiếp theo

Theo công bố của tác giả ở phần cuối luận án, các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào:

  • Tối ưu hóa quy trình chế tạo hạt nano composite đa chức năng nhằm thu được các hạt có kích thước phù hợp, phân tán đồng đều hơn, hạn chế kết đám và tăng độ cầu của hạt; nghiên cứu sử dụng thêm các chất hoạt hóa bề mặt trong quá trình chế tạo và đa dạng hóa các nhóm chức sinh học trên bề mặt vật liệu.
  • Sử dụng các hạt nano composite đa chức năng đã chế tạo để thử nghiệm độc tính sinh học toàn diện, mở rộng thử nghiệm phát hiện, phân tách và đánh dấu trên nhiều dòng tế bào ung thư và tế bào đối chứng khác nhau nhằm củng cố các bằng chứng thực nghiệm phục vụ định hướng ứng dụng y – sinh học.

Giá trị tham khảo

Đối tượng thụ hưởng

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học ngành Vật lý chất rắn, Khoa học vật liệu và Hóa học: Tham khảo quy trình thực nghiệm tổng hợp nano đa chức năng (vi nhũ tương đảo, Stöber cải tiến, khử hóa học hỗ trợ sóng siêu âm) và phương pháp xử lý số liệu cấu trúc tinh thể, từ tính, quang học.
  • Giảng viên và nhà nghiên cứu công nghệ nano sinh học, dược học: Sử dụng các dữ liệu về biến tính bề mặt hạt bằng silane (APTES), kỹ thuật gắn kết kháng thể, phân tử aptamer và kỹ thuật phân tích SERS làm tài liệu đối sánh.
  • Cán bộ kỹ thuật và chuyên gia y học hạt nhân, chẩn đoán hình ảnh: Tham khảo giải pháp ứng dụng hạt nano siêu thuận từ thay thế chất cản quang truyền thống và phương pháp định vị tế bào đích qua kính hiển vi quang học trường tối.

Các nội dung có giá trị tham khảo cao trong văn bản

  • Quy trình chi tiết chức năng hóa nhóm amin ($-\text{NH}_2$) bằng phản ứng thủy phân – ngưng tụ đồng thời TEOS và APTES trên hạt từ tính $\text{Fe}_3\text{O}_4$.
  • Dữ liệu phổ SERS của phân tử chỉ thị 4ATP với các vị trí đỉnh dao động đặc trưng khi đính kết trên hạt nano $\text{Ag}$ và composite từ – kim loại.
  • Phương pháp tính toán định lượng tỷ số cường độ sáng tế bào trên ảnh hiển vi trường tối bằng phần mềm ImageJ để đánh giá mức độ bắt cặp sinh học phân tử.

Câu hỏi thường gặp

1. Tỷ lệ nồng độ pha tạp ion $\text{Mn}^{2+}$ tối ưu trong hạt nano bán dẫn $\text{ZnS:Mn}$ là bao nhiêu để đạt cường độ huỳnh quang mạnh nhất?
Trong dải khảo sát từ 0% đến 12%, mẫu có nồng độ pha tạp 10% ion $\text{Mn}^{2+}$ (mẫu ZnS:Mn10) đạt cường độ phát huỳnh quang cực đại tại bước sóng $\lambda = 598\text{ nm}$ (huỳnh quang màu cam) khi kích thích bằng chùm laser bước sóng $325\text{ nm}$, tương ứng với độ rộng vùng cấm $E_g \approx 3,68\text{ eV}$.

2. Điều kiện tối ưu về pH và lượng tiền chất APTES để chế tạo hạt nano composite $\text{Fe}_3\text{O}_4/\text{Ag}$ là gì?
Điều kiện chế tạo tối ưu được xác định là môi trường dung dịch có $\text{pH} = 11$ và thể tích tiền chất APTES sử dụng là $3\text{ mL}$. Tại thông số này, hạt nano composite đạt độ ổn định và bền nhiệt cao nhất (không tách pha sau khi ủ nhiệt $100^\circ\text{C}$ trong 8 giờ), từ độ bão hòa đạt $M_s = 39,6\text{ emu/g}$ và xuất hiện đỉnh cộng hưởng plasmon bề mặt tại $445\text{ nm}$.

3. Hiệu suất bắt cặp của hệ nano composite $\text{Fe}_3\text{O}_4/\text{Ag}$ gắn kháng thể anti-EGFR đối với tế bào ung thư da SK-Mel 28 và tế bào da thường Hacat khác nhau như thế nào?
Hiệu suất gắn kết tế bào của hệ hạt nano composite $\text{Fe}_3\text{O}_4/\text{Ag}$ chức năng hóa kháng thể anti-EGFR đạt $91,9%$ đối với tế bào ung thư biểu bì da SK-Mel 28, trong khi đối với tế bào da thường Hacat chỉ đạt $33,1%$. Kết quả này phản ánh sự biểu hiện thụ thể EGFR với mật độ vượt trội trên bề mặt tế bào ung thư so với tế bào lành.

4. Kết quả định lượng tỉ số cường độ sáng ảnh trường tối của tế bào ung thư phổi A549 gắn hệ $\text{Fe}_3\text{O}_4\text{@SiO}_2/\text{Ag-aptamer}$ so với hệ $\text{Fe}_3\text{O}_4/\text{Ag-aptamer}$ bằng phần mềm ImageJ là bao nhiêu?
Tỉ số cường độ sáng của tế bào A549 khi gắn phức hệ $\text{Fe}_3\text{O}_4\text{@SiO}_2/\text{Ag-aptamer}$ so với $\text{Fe}_3\text{O}_4/\text{Ag-aptamer}$ được tính toán qua ảnh hiển vi trường tối là $1,92$ lần sau 1 giờ ủ và $1,89$ lần sau 6 giờ ủ, chứng minh hệ hạt có bọc silica hỗ trợ quá trình bắt cặp phân tử aptamer lên tế bào hiệu quả hơn.

5. Phân tử 4ATP đóng vai trò gì trong cấu trúc hạt nano composite đa chức năng?
Phân tử 4-aminothiophenol (4ATP) đóng vai trò kép: liên kết với bề mặt hạt nano $\text{Ag}$ qua nhóm thiol ($-\text{SH}$) và cung cấp đầu nhóm amin ($-\text{NH}_2$) tự do để liên kết peptit với kháng thể hoặc aptamer; đồng thời đóng vai trò là chất chỉ thị tín hiệu quang học SERS với các đỉnh tán xạ đặc trưng rõ nét tại các số sóng $1078\text{ cm}^{-1}$, $1140 - 1145\text{ cm}^{-1}$, $1439 - 1443\text{ cm}^{-1}$ và $1587\text{ cm}^{-1}$.

Kết luận

Luận án của tác giả Chu Tiến Dũng đã hoàn thành việc chế tạo thực nghiệm các hệ hạt nano đa chức năng $\text{Fe}_3\text{O}_4\text{-Ag@SiO}_2$, $\text{Fe}_3\text{O}_4\text{-ZnS:Mn@SiO}_2$, $\text{Fe}_3\text{O}_4/\text{Ag}$ và $\text{Fe}_3\text{O}_4\text{@SiO}_2/\text{Ag}$ bằng các phương pháp hóa học có sự hỗ trợ của sóng siêu âm. Các hệ vật liệu thu được đồng thời thể hiện tính chất siêu thuận từ với từ độ bão hòa cao ($38,2 - 44,5\text{ emu/g}$) và các đặc tính quang học chọn lọc (tín hiệu SERS mạnh, hấp thụ LSPR hoặc phát huỳnh quang màu cam tại $598\text{ nm}$). Thử nghiệm liên hợp sinh học với kháng thể anti-EGFR và phân tử aptamer đã chứng minh khả năng bắt cặp đặc hiệu, phân biệt rõ rệt giữa tế bào ung thư da SK-Mel 28 với tế bào thường Hacat, đồng thời định vị và đánh dấu hiệu quả tế bào ung thư phổi A549 trên ảnh hiển vi trường tối.