Tổng quan luận án
Luận án tiến sĩ hóa học của tác giả Nguyễn Thị Thanh Hải có tiêu đề "Tổng hợp vật liệu nano đa chức năng trên nền chitosan oligosaccharide và ứng dụng", được thực hiện tại Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế vào năm 2021 dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Nguyễn Thị Thu Thủy, thuộc chuyên ngành Hóa lý thuyết và hóa lý (Mã số: 9 44 01 19).
Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu
Nông nghiệp đóng vai trò cung cấp nguồn lương thực chính cho hơn 60% dân số tại các quốc gia đang phát triển. Theo dự báo của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (FAO), nhu cầu lương thực toàn cầu sẽ gia tăng khoảng 70% vào năm 2050, kéo theo việc sử dụng hơn 2 triệu tấn thuốc bảo vệ thực vật mỗi năm. Tuy nhiên, các thống kê khoa học chỉ ra rằng chỉ khoảng 0,1% lượng hoạt chất trong thuốc bảo vệ thực vật tiếp cận hiệu quả đến sinh vật gây hại mục tiêu, trong khi 99,9% lượng hóa chất còn lại bị thất thoát vào môi trường đất, nước và không khí do phân tán, lắng đọng và phân hủy quang học. Sự lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học đã dẫn đến tình trạng ô nhiễm môi trường, tích tụ dư lượng độc hại trong nông sản và thúc đẩy các chủng nấm bệnh hình thành tính kháng thuốc.
Công nghệ nano mở ra hướng tiếp cận mới trong quản lý dịch hại nông nghiệp thông qua việc phát triển các dạng thuốc trừ bệnh và phân bón nano có khả năng giải phóng hoạt chất chậm. Các hạt nano kim loại như đồng (Cu) và bạc (Ag) sở hữu hoạt tính kháng vi sinh vật phổ rộng, đồng thời có độc tính đối với tế bào động vật có vú thấp hơn từ 7 đến 50 lần so với các dạng ion kim loại tương ứng. Mặc dù vậy, quá trình tổng hợp nano kim loại, đặc biệt là nano đồng, gặp phải rào cản lớn do kim loại dễ bị oxy hóa thành các dạng oxit bền nhiệt động ($Cu_2O$, $CuO$) và có xu hướng kết tụ cao. Việc sử dụng môi trường khí trơ (như argon hoặc nitơ) làm tăng chi phí sản xuất ở quy mô lớn.
Bên cạnh đó, việc tận dụng nguồn phụ phẩm nông nghiệp tại Việt Nam như vỏ trấu để chế tạo nano silica vô định hình có hoạt tính sinh học cao và sử dụng polymer tự nhiên chitosan oligosaccharide (COS) làm chất mang phân tán sinh học vẫn chưa được tích hợp đồng bộ. Đặc biệt, việc kết hợp giữa phương pháp hóa học tính toán (mô phỏng docking phân tử) để định hướng cơ chế tác động lên các thụ thể protein của nấm bệnh trước khi tiến hành thực nghiệm tổng hợp hệ nano đa thành phần (Cu-Ag/silica trên nền COS) vẫn còn là khoảng trống nghiên cứu cần được giải quyết.
Mục tiêu nghiên cứu
Luận án xác định hai mục tiêu nghiên cứu cụ thể như sau:
- Nghiên cứu lý thuyết khả năng ức chế một số loại nấm gây bệnh trên cây trồng của các phức chứa bạc và đồng bằng phương pháp docking phân tử, từ đó định hướng nghiên cứu tổng hợp các vật liệu có hoạt tính kháng nấm.
- Tổng hợp các vật liệu có khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh và kích thích tăng trưởng cây trồng để ứng dụng trong nông nghiệp.
Nội dung nghiên cứu
Để hiện thực hóa hai mục tiêu trên, luận án triển khai bốn nội dung nghiên cứu:
- Nghiên cứu lý thuyết khả năng ức chế của các phức bạc đơn nhân bạc-tetrylene và phức bạc đa nhân bis-bạc-tetrylene (gồm Ag-E và bis-Ag-E với E là C và Si) đối với protein 4G9M của nấm Rhizoctonia solani và protein 6JBR của nấm Magnaporthe oryzae gây bệnh khô vằn và đạo ôn trên cây lúa; đồng thời nghiên cứu khả năng ức chế của các phức COS-Cu, COS-Ag, Ag-COS-Cu đối với protein 6KD3 của nấm Phytophthora capsici và protein 1JFA của nấm Fusarium sporotrichioides gây bệnh chết nhanh và chết chậm trên cây tiêu.
- Điều chế chitosan oligosaccharide (COS), đánh giá khả năng ứng dụng kích thích nảy mầm hạt đậu nành; đồng thời ứng dụng COS làm chất mang để phân tán và giải phóng chậm các hạt nano đồng và bạc, làm tăng hiệu quả hoạt động kháng vi sinh vật của chúng.
- Tổng hợp vật liệu nano silica và ứng dụng làm chất mang để phân tán các vật liệu nano kim loại như đồng, bạc, hỗ trợ nâng cao khả năng kháng nấm của các vật liệu nano, đồng thời đáp ứng nhu cầu thiết yếu của một số cây trồng trong quá trình sinh trưởng và phát triển.
- Tổng hợp một số vật liệu nano đồng, nano bạc và nano đa chức năng chứa các thành phần nano đồng, nano bạc, nano silica trên nền chất mang là polymer COS; đồng thời đánh giá khả năng ứng dụng của các vật liệu nano trong ức chế một số nấm gây bệnh khô vằn và đạo ôn trên cây lúa, bệnh chết nhanh trên cây tiêu, và đánh giá khả năng kích thích tăng trưởng cây lúa.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu:
- Hệ vật liệu nano kim loại đơn và đa thành phần: hạt nano đồng (CuNPs), nano bạc (AgNPs), nano lưỡng kim đồng-bạc (Cu-AgNPs), nano silica vô định hình tách từ vỏ trấu, và phức hệ nano đa chức năng Cu-Ag/silica trên nền chitosan oligosaccharide (MFNPs/COS).
- Các thụ thể protein của nấm: protein 4G9M (Rhizoctonia solani), protein 6JBR (Magnaporthe oryzae), protein 6KD3 (Phytophthora capsici) và protein 1JFA (Fusarium sporotrichioides).
- Đối tượng thử nghiệm sinh học: các chủng nấm bệnh thực vật (M. oryzae, R. solani, P. capsici), hạt giống đậu nành và cây lúa (Oryza sativa L.).
- Phạm vi nghiên cứu:
- Không gian: Thí nghiệm hóa học tính toán mô phỏng docking phân tử; tổng hợp và đặc trưng hóa lý vật liệu tại phòng thí nghiệm; khảo nghiệm hoạt tính kháng nấm in vitro trong đĩa petri và khảo nghiệm sinh học in vivo trong điều kiện nhà lưới tại Đại học Huế.
- Thời gian: Công trình luận án hoàn thành và bảo vệ vào năm 2021.
Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án
Các hướng nghiên cứu tiền nhiệm
Luận án đã hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến công nghệ nano trong bảo vệ thực vật, tổng hợp vật liệu nano kim loại và ứng dụng polymer tự nhiên:
| Tác giả & Năm công bố |
Vật liệu / Chế phẩm |
Đối tượng sinh học khảo sát |
Kết quả chính được điểm lại |
| Jo và cs (2009) [84] |
Nano bạc (AgNPs) |
Bipolaris sorokiniana, Magnaporthe grisea |
Ức chế sự phát triển của nấm gây bệnh trên cây trồng. |
| Lamsal và cs (2011) [103] |
Nano bạc |
Raffaelea sp. |
Kiểm soát bệnh thán thư trên cây tiêu trong ống nghiệm và đồng ruộng. |
| Krishnaraj và cs (2012) [99] |
Nano bạc |
A. alternata, R. solani, B. cinerea, C. lunata |
Kháng nấm phổ rộng trên nhiều chủng gây bệnh nông nghiệp. |
| Kim và cs (2012) [94] |
Nano bạc |
14 loài nấm bệnh (F. oxysporum, P. spinosum...) |
Xác định nồng độ ức chế đối với các loại nấm gây hại cây trồng. |
| Chu và cs (2012) [42] |
Phức hệ Ag–silica |
Cây trồng |
Kích hoạt sự biểu hiện của các gen liên quan đến cơ chế phòng thủ. |
| Giannousi và cs (2013) [64] |
Nano đồng ($Cu_2O$, $CuO$, $Cu/Cu_2O$) |
Phytophthora infestans trên cà chua |
Hạt kích thước 11–14 nm có hiệu quả kháng khuẩn cao, không gây hại cây. |
| Brunel và cs (2013) [25] |
Nanogel chitosan–đồng |
Fusarium graminearum |
Phức hợp có tác dụng ức chế mạnh sự phát triển của nấm gây bệnh thực vật. |
| Yoon và cs (2007) [201] |
Nano Cu và nano Ag |
E. coli, Bacillus subtilis |
Hoàn toàn ức chế vi khuẩn ở nồng độ 60 $\mu$g/mL (Cu) và 70 $\mu$g/mL (Ag). |
| Mahmoodi và cs (2018) [117] |
Nano đồng |
S. aureus, B. subtilis, E. coli |
Xác định hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch. |
| Gerasimenko và cs (2004) [180] |
Chitosan oligosaccharide |
E. coli, L. plantarum, B. bifidum |
Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) phụ thuộc vào khối lượng phân tử và DDA. |
| Jeon và cs (2001) [81] |
COS (DDA 90%, 5–10 kDa) |
E. coli O-157, M. luteus, S. mutans |
Xác định MIC kháng khuẩn dao động từ 0,008% đến 0,12%. |
| Nguyễn Hồng Sơn & Dương Văn Hợp (2008) [210] |
Chế phẩm COS |
Bệnh sương mai, phấn trắng, chết ẻo |
Phun nồng độ 120–360 ppm đạt hiệu quả phòng bệnh cao trên cà chua, dưa chuột. |
Về phương pháp tổng hợp hạt nano đồng kim loại, các tác giả Phạm và cs [146], Abdulla-Al-Mamun và cs [5], Kobayashi và cs [98] đã sử dụng các chất ổn định như PVP, CTAB, axit citric dưới dòng khí bảo vệ argon hoặc nitơ để tránh oxy hóa hạt thành $Cu_2O$ và $CuO$. Vaseem và cs [190] sử dụng khí $N_2$ sinh ra từ phản ứng khử $CuCl_2$ bằng $N_2H_4$ để bảo vệ trong môi trường CTAB, nhưng hiệu quả ngăn oxy hóa chưa triệt để nếu có oxy hòa tan. Lai và cs [102] tổng hợp trong dung dịch PVP khử bằng $NaH_2PO_2$ không dùng khí bảo vệ nhưng phản ứng kéo dài tới 17 giờ. Zhang và cs [206] dùng gelatin nhưng sản phẩm khó tái phân tán trong nước ở nhiệt độ thường.
Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết
Từ tổng quan tài liệu, luận án tập trung giải quyết các khoảng trống:
- Khắc phục sự bất ổn định và hiện tượng oxy hóa của hạt nano đồng bằng cách sử dụng polymer sinh học alginate từ rong nâu làm chất bảo vệ trong môi trường nước ở điều kiện nhiệt độ phòng mà không cần dòng khí trơ.
- Tận dụng phế phẩm nông nghiệp (vỏ trấu) để tổng hợp nano silica vô định hình, sử dụng làm giá mang nhằm phân tán kim loại nano, hạn chế sự kết tụ và cung cấp dưỡng chất silica cho cây lúa.
- Xây dựng mô hình tính toán hóa học lượng tử và docking phân tử để đánh giá ái lực liên kết của các phức chất kim loại (Ag-tetrylene, bis-Ag-tetrylene, COS-Cu, COS-Ag, Ag-COS-Cu) đối với các protein đích đặc hiệu của nấm gây hại (M. oryzae, R. solani, P. capsici, F. sporotrichioides), tạo tiền đề lý thuyết vững chắc trước khi tiến hành thực nghiệm tổng hợp hệ nano đa chức năng MFNPs/COS.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu
Cơ sở lý thuyết và mô hình tính toán
- Cơ chế nhiệt động học và động học hình thành hạt nano: Quá trình khử hóa học tạo mầm hạt nano được mô tả qua sự biến thiên năng lượng tự do Gibbs:
$$\Delta G = \Delta G_v + 4\pi r^2 \gamma$$
Trong đó $\Delta G_v$ là năng lượng tự do của thể tích pha mới hình thành, $r$ là bán kính mầm và $\gamma$ là năng lượng tự do bề mặt trên một đơn vị diện tích. Bán kính tới hạn $r^$ tương ứng với cực đại năng lượng kích hoạt $\Delta G^$. Các mầm có $r > r^*$ sẽ phát triển tự phát thành hạt nano. Động học tăng trưởng hạt diễn ra qua các cơ chế bổ sung nguyên tử phân tử, tăng trưởng thứ cấp do va chạm và quá trình chín Ostwald (Ostwald ripening).
- Cơ chế kháng vi sinh vật của nano kim loại và COS:
- Hạt nano và ion phóng thích tích tụ trên màng tế bào, làm thay đổi tính thấm, rò rỉ lipopolysaccharide và protein nội bào, làm mất động lực proton.
- Tạo ra các dạng oxy hoạt động (ROS) gây tổn thương màng, oxy hóa lipid và đứt gãy DNA.
- Tương tác với nhóm thiol (-SH) của cysteine trong peptide làm biến tính protein; ức chế enzyme glycosyltransferase 6JBR tham gia sinh tổng hợp melanin trong appressoria của nấm M. oryzae.
- COS mang điện tích dương tương tác tĩnh điện với bề mặt vi sinh vật mang điện tích âm, kích thích cây tiết $H_2O_2$ và tăng cường hoạt tính các enzyme phòng vệ như peroxidase, phenylalanine ammonia-lyase (PAL).
- Phương pháp mô phỏng Docking phân tử:
- Cấu trúc các phức kim loại được tối ưu hóa hình học ở mức lý thuyết BP86/def2-SVP.
- Mô phỏng tương tác kết cặp phân tử (docking) với các protein thụ thể: 4G9M (R. solani), 6JBR (M. oryzae), 6KD3 (P. capsici), 1JFA (F. sporotrichioides).
- Đánh giá thông qua các chỉ số: Điểm Docking (Docking Score - DS, kcal/mol), độ lệch căn bậc hai trung bình (RMSD, Å), liên kết hydro, liên kết cation–$\pi$, liên kết $\pi$–$\pi$ và tương tác ion so sánh với các thuốc đối chứng (validamycin, tricyclazole).
Phương pháp thực nghiệm tổng hợp vật liệu
- Điều chế Chitosan Oligosaccharide (COS): Hòa tan 30 g chitosan trong 800 mL dung dịch axit lactic 1,5%, bổ sung $H_2O_2$ 30% và nước cất để thu được 1000 mL dung dịch chứa 3% chitosan và 1% $H_2O_2$. Phản ứng cắt mạch diễn ra ở nhiệt độ phòng. Điều chỉnh pH về 8 bằng dung dịch $NH_3$, kết tủa COS bằng ethanol ($C_2H_5OH$), ly tâm, rửa sạch nhiều lần bằng ethanol và sấy khô ở 40°C.
- Tổng hợp nano silica từ vỏ trấu: Tro trấu sau khi đốt sơ bộ được nung ở 550°C trong 3 giờ để thu được silica vô định hình màu trắng. Ngâm chất rắn trong dung dịch axit clohidric ($HCl$ 3 M) trong 30 phút để hòa tan và loại bỏ các oxit kim loại tạp chất. Rửa kết tủa bằng nước cất đến trung tính, sấy khô và tiến hành nghiền bi.
- Tổng hợp nano đồng (CuNPs) và Cu-silicaNPs: Khử muối đồng sunfat ($CuSO_4$) bằng hydrazine ($N_2H_4$) trong môi trường chất ổn định alginate, điều chỉnh pH bằng $NH_3$ ở nhiệt độ phòng. Đối với hệ Cu-silicaNPs, hạt nano đồng được gắn lên bề mặt silica vô định hình đã hoạt hóa kiềm với sự hỗ trợ phân tán của carboxymethyl cellulose (CMC).
- Tổng hợp nano bạc (AgNPs) và Ag-silicaNPs: Khử bạc nitrat ($AgNO_3$) bằng tác nhân khử natri citrat ($Na_3C_6H_5O_7$) với chất bảo vệ sodium alginate. Hệ Ag-silicaNPs được chế tạo bằng cách cố định nano bạc lên khung nano silica.
- Tổng hợp nano lưỡng kim Cu-AgNPs và hệ nano đa chức năng (MFNPs/COS): Tiến hành khử đồng thời tiền chất $Cu^{2+}$ và $Ag^+$ với các tỉ lệ nồng độ khác nhau trong dung dịch alginate. Hệ vật liệu nano đa chức năng MFNPs/COS được hoàn thiện bằng cách tích hợp nano Cu-Ag và nano silica phân tán đồng đều trong chất nền COS.
Phương pháp đặc trưng vật liệu
Luận án sử dụng hệ thống thiết bị và kỹ thuật phân tích hóa lý gồm:
- Phổ hấp thụ tử ngoại - khả kiến (UV-Vis) xác định dải hấp thụ cộng hưởng plasmon bề mặt (SPR) và bước sóng cực đại $\lambda_{max}$.
- Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR) xác định các nhóm chức hóa học và liên kết phối trí.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hydro ($^1H$ NMR) và Sắc ký gel thẩm thấu (GPC) xác định khối lượng phân tử trung bình số ($M_n$), khối lượng phân tử trung bình khối ($M_w$) và độ phân tán ($PI$) của COS.
- Nhiễu xạ tia X (XRD) xác định cấu trúc pha tinh thể và tính vô định hình.
- Kính hiển vi điện tử quét (SEM), Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) và Hiển vi điện tử truyền qua độ phân giải cao (HRTEM) khảo sát hình thái, kích thước hạt và khoảng cách mạng tinh thể $d$.
- Phổ tán sắc năng lượng tia X (EDX) và bản đồ phân bố nguyên tố (SEM-EDX mapping).
- Phân tích nhiệt trọng lượng (TG-DSC) đánh giá sự biến đổi nhiệt của nguyên liệu vỏ trấu.
Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học
- Khả năng kích thích nảy mầm hạt đậu nành: Đánh giá năng lượng nảy mầm (GE %) và tỷ lệ nảy mầm (GP %) vào ngày thứ 3 ở các dải nồng độ ngâm ủ COS khác nhau so với mẫu đối chứng nước cất.
- Thử nghiệm in vitro kháng nấm: Đánh giá hiệu lực ức chế sinh trưởng hệ sợi nấm M. oryzae, R. solani và P. capsici bằng phương pháp đo đường kính tản nấm trên môi trường thạch sau 3 và 5 ngày sau cấy (NSC).
- Thử nghiệm in vivo trong nhà lưới: Bố trí thí nghiệm trên cây lúa (Oryza sativa L.) nhằm đánh giá tỷ lệ bệnh (TLB %) và chỉ số bệnh (CSB %) đối với bệnh đạo ôn và khô vằn qua các ngày sau nhiễm (NSN); theo dõi động thái tăng trưởng chiều cao cây, khả năng đẻ nhánh, các yếu tố cấu thành năng suất, năng suất thực thu và đánh giá độ độc của vật liệu đối với cây trồng. Số liệu được xử lý thống kê bằng phép thử sai biệt nhỏ nhất có ý nghĩa (LSD) ở mức ý nghĩa $\alpha = 0,05$.
Nội dung chính theo từng chương
Chương 1: Tổng quan tài liệu
Chương này tổng thuật toàn diện các cơ sở lý thuyết về khoa học và công nghệ nano, phân loại các phương pháp chế tạo vật liệu nano (từ trên xuống - top-down và từ dưới lên - bottom-up), phân tích cơ chế tạo mầm và phát triển tinh thể theo quan điểm nhiệt động học và động học.
Tác giả đi sâu phân tích đặc tính hóa lý, phương pháp tổng hợp và hoạt tính sinh học của nano đồng, nano bạc và nano silica. Chương 1 cũng trình bày chi tiết về cấu trúc phân tử của polymer sinh học (alginate, CMC, chitosan và chitosan oligosaccharide), làm rõ cơ chế ổn định hạt nano chống kết tụ bằng lực cản không gian và tương tác tĩnh điện.
Cuối cùng, chương tổng quan phân tích đặc điểm sinh học của các loại bệnh hại nguy hiểm trên cây lúa gồm bệnh đạo ôn (Magnaporthe oryzae), bệnh khô vằn (Rhizoctonia solani), cơ chế gây bệnh qua enzyme glycosyltransferase 6JBR và các biện pháp phòng trừ hóa học hiện hành cùng những hạn chế của chúng.
Chương 2: Mục tiêu, nội dung và phương pháp nghiên cứu
Chương 2 mô tả chi tiết hóa chất, dụng cụ, quy trình thực nghiệm và các thông số công nghệ:
- Quy trình cắt mạch chitosan bằng $H_2O_2$ 1% trong axit lactic 1,5% ở nhiệt độ phòng.
- Quy trình tách nano silica từ tro vỏ trấu qua quá trình nung 550°C trong 3 giờ và rửa axit $HCl$ 3 M.
- Quy trình tổng hợp CuNPs, Cu-silicaNPs, AgNPs, Ag-silicaNPs, Cu-AgNPs và hệ phức hợp MFNPs/COS.
- Nguyên lý hoạt động và điều kiện đo của các phép phân tích UV-Vis, FT-IR, $^1H$ NMR, GPC, XRD, SEM, TEM, HRTEM, EDX, TG-DSC.
- Thiết lập thông số mô phỏng docking phân tử ở mức lý thuyết BP86/def2-SVP.
- Phương pháp bố trí thí nghiệm in vitro đo đường kính tản nấm và thí nghiệm nhà lưới đánh giá hiệu lực trừ bệnh và ảnh hưởng nông học trên cây lúa.
Chương 3: Kết quả và thảo luận
1. Mô phỏng docking phân tử đánh giá khả năng ức chế nấm gây bệnh
- Ức chế protein 4G9M (R. solani) và 6JBR (M. oryzae):
Kết quả tính toán cho thấy các phức bạc đơn nhân bạc-tetrylene (Ag-C, Ag-Si) và phức bạc đa nhân bis-bạc-tetrylene (bis-Ag-C, bis-Ag-Si) thể hiện năng lượng liên kết docking score (DS) âm sâu và giá trị RMSD nhỏ đối với protein 4G9M và 6JBR. Phức chất tạo thành các liên kết hydro bền vững, tương tác cation–$\pi$ và tương tác ion với các amino acid trong tâm hoạt động của thụ thể, thể hiện ái lực ức chế cạnh tranh tương đương hoặc vượt trội so với hai hoạt chất đối chứng thương mại là validamycin (đối với 4G9M) và tricyclazole (đối với 6JBR).
- Ức chế protein 6KD3 (P. capsici) và 1JFA (F. sporotrichioides):
Mô phỏng tương tác của các phức hợp COS-Ag, COS-Cu và Ag-COS-Cu với protein 6KD3 và 1JFA cho thấy phức dị nhân Ag-COS-Cu có điểm docking score tối ưu nhất, hình thành mạng lưới liên kết hydro dày đặc và tương tác tĩnh điện mạnh mẽ với các gốc amino acid then chốt, khẳng định hiệu ứng cộng hưởng khi tích hợp cả hai kim loại Cu và Ag trên nền COS.
2. Điều chế chitosan oligosaccharide (COS) và thử nghiệm sinh học
- Phản ứng cắt mạch chitosan bằng $H_2O_2$ diễn ra thuận lợi theo thời gian; mối tương quan giữa $1/M_w$ và thời gian phản ứng tuân theo quy luật động học bậc một.
- Phổ FT-IR và $^1H$ NMR xác nhận cấu trúc mạch oligosaccharide giữ nguyên các nhóm chức đặc trưng (-NH$_2$, -OH) của chitosan ban đầu. Phân tích sắc ký GPC xác định sản phẩm COS có khối lượng phân tử trung bình $M_w \approx 4500$ g/mol với độ phân tán ($PI$) hẹp.
- Thử nghiệm ngâm ủ hạt đậu nành với dung dịch COS cho thấy tỷ lệ nảy mầm (GP) và năng lượng nảy mầm (GE) vào ngày thứ 3 tăng rõ rệt so với đối chứng nước cất, chứng minh vai trò kích thích sinh trưởng của COS.
3. Tổng hợp và đặc trưng nano silica từ vỏ trấu
- Giản đồ nhiệt TG-DSC xác định khoảng nhiệt độ loại bỏ pha hữu cơ trong vỏ trấu, làm cơ sở chọn nhiệt độ nung 550°C.
- Giản đồ XRD của nano silica chỉ xuất hiện một pic nhiễu xạ dạng cầu rộng (halo peak) tại góc $2\theta \approx 22^\circ$, đặc trưng cho cấu trúc silica vô định hình.
- Ảnh SEM, TEM và phổ EDX cho thấy các hạt silica có kích thước nanomet, phân tán đồng đều và có độ tinh khiết cao sau khi xử lý bằng axit $HCl$ 3 M.
4. Tổng hợp và đặc trưng nano Cu, nano Ag và nano silica kết hợp
- Hệ nano Cu và Cu-silicaNPs: Phổ UV-Vis cho thấy pic hấp thụ plasmon đặc trưng của nano đồng tại bước sóng $\lambda_{max} \approx 570–590$ nm. Khảo sát các thông số thực nghiệm xác định nồng độ $CuSO_4$, alginate, $N_2H_4$, pH bổ sung $NH_3$ và nhiệt độ thích hợp giúp keo nano Cu bền vững. Giản đồ XRD và ảnh TEM xác nhận cấu trúc tinh thể lập phương tâm mặt của nano đồng kim loại ($Cu^0$), không xuất hiện pic của oxit đồng. Ảnh HRTEM xác định rõ khoảng cách cách tử $d$ của mạng tinh thể đồng. Phổ FT-IR và ảnh SEM-EDX mapping của hệ Cu-silicaNPs/CMC xác nhận nano Cu phân tán đều trên giá mang silica. Thử nghiệm in vitro cho thấy Cu-silicaNPs làm giảm mạnh đường kính tản nấm Phytophthora capsici theo nồng độ tăng dần từ 25 đến 125 ppm.
- Hệ nano Ag và Ag-silicaNPs: Phổ UV-Vis xác định pic cộng hưởng plasmon bề mặt của AgNPs tại $\lambda_{max} \approx 410–420$ nm. Phân tích XRD, SEM, HRTEM và phổ EDX chứng minh các hạt nano bạc hình cầu kích thước 10–30 nm phân bố đồng đều trên nền hạt nano silica vô định hình.
5. Tổng hợp nano lưỡng kim Cu-AgNPs và hệ nano đa chức năng MFNPs/COS
- Quá trình tổng hợp Cu-AgNPs được khảo sát qua sự thay đổi tỉ lệ nồng độ $Cu^{2+}/Ag^+$, nồng độ chất bảo vệ alginate, pH, nhiệt độ và thời gian phản ứng. Sự dịch chuyển của bước sóng hấp thụ cực đại $\lambda_{max}$ trên phổ UV-Vis và giản đồ XRD khẳng định sự hình thành cấu trúc hạt nano lưỡng kim Cu-Ag.
- Hệ nano đa chức năng MFNPs/COS được đặc trưng qua ảnh SEM, TEM và SEM-EDX mapping, cho thấy các hạt nano Cu-Ag kích thước nhỏ bám dính trên giá mang nano silica và được bao bọc, phân tán ổn định trong chất nền polymer COS.
6. Đánh giá khả năng phòng trừ bệnh hại trên cây lúa
- Khảo nghiệm in vitro kháng nấm: Kết quả đo đường kính tản nấm Magnaporthe oryzae (gây bệnh đạo ôn) và Rhizoctonia solani (gây bệnh khô vằn) tại thời điểm 5 ngày sau cấy (5 NSC) được tổng hợp cụ thể:
| Chủng nấm kiểm tra |
Công thức xử lý |
Nồng độ (ppm) |
Đường kính tản nấm (mm) |
Hiệu lực ức chế (%) |
| Magnaporthe oryzae |
Đối chứng (ĐC) |
0 |
Phát triển kín đĩa |
0,00 |
|
CuNPs |
Khảo sát theo bài |
Kích thước giảm rõ rệt |
Thể hiện hiệu lực ức chế |
|
Cu-silicaNPs |
Khảo sát theo bài |
Kích thước giảm |
Hiệu lực nâng cao |
|
AgNPs |
Khảo sát theo bài |
Kích thước giảm |
Hiệu lực cao |
|
Ag-silicaNPs |
Khảo sát theo bài |
Kích thước giảm mạnh |
Hiệu lực cao |
|
MFNPs/COS |
Khảo sát theo bài |
Tản nấm bị co cụm tối đa |
Hiệu lực ức chế cao nhất |
| Rhizoctonia solani |
Đối chứng (ĐC) |
0 |
Phát triển kín đĩa |
0,00 |
|
CuNPs |
Khảo sát theo bài |
Kích thước sợi nấm giảm |
Thể hiện hiệu lực ức chế |
|
Cu-silicaNPs |
Khảo sát theo bài |
Kích thước giảm |
Hiệu lực tăng cường |
|
AgNPs |
Khảo sát theo bài |
Kích thước giảm |
Hiệu lực cao |
|
Ag-silicaNPs |
Khảo sát theo bài |
Kích thước giảm mạnh |
Hiệu lực cao |
|
MFNPs/COS |
Khảo sát theo bài |
Sợi nấm bị ức chế tối đa |
Hiệu lực ức chế cao nhất |
- Khảo nghiệm nhà lưới trên cây lúa:
- Các công thức xử lý hạt nano đa chức năng MFNPs/COS làm giảm đáng kể tỷ lệ bệnh (TLB %) và chỉ số bệnh (CSB %) đối với cả bệnh đạo ôn và bệnh khô vằn qua các thời điểm theo dõi sau khi gây nhiễm nhân tạo.
- Về các chỉ tiêu nông học, cây lúa ở các công thức xử lý MFNPs/COS có sự phát triển vượt trội về chiều cao cây, khả năng đẻ nhánh hữu hiệu cao hơn mẫu đối chứng không xử lý.
- Các yếu tố cấu thành năng suất (số bông/khóm, số hạt chắc/bông, khối lượng 1000 hạt) và năng suất thực thu của cây lúa tăng lên rõ rệt.
- Đánh giá độ độc xác nhận vật liệu MFNPs/COS ở nồng độ khảo nghiệm an toàn sinh học đối với cây lúa, không gây hiện tượng cháy lá hay kìm hãm sinh trưởng.
Kết quả và những đóng góp mới
Những đóng góp mới về mặt khoa học và lý luận
- Luận án đã ứng dụng thành công phương pháp mô phỏng docking phân tử ở mức lý thuyết BP86/def2-SVP để làm sáng tỏ cơ chế ức chế ở mức độ nguyên tử của các phức kim loại đối với các protein đích đặc hiệu của nấm bệnh thực vật:
- Đánh giá cơ chế ức chế của các phức bạc đơn nhân bạc-tetrylene (Ag-C, Ag-Si) và bis-bạc-tetrylene (bis-Ag-C, bis-Ag-Si) đối với protein 4G9M (Rhizoctonia solani) và protein 6JBR (Magnaporthe oryzae).
- Đánh giá cơ chế ức chế của các phức hợp COS-Cu, COS-Ag và Ag-COS-Cu đối với protein 6KD3 (Phytophthora capsici) và protein 1JFA (Fusarium sporotrichioides).
- Xây dựng được mô hình lý thuyết định hướng cho việc thiết kế và tổng hợp các hệ vật liệu nano kim loại đa thành phần có hoạt tính kháng nấm cao trong nông nghiệp.
Những đóng góp mới về mặt thực tiễn
- Thiết lập quy trình công nghệ điều chế chitosan oligosaccharide ($M_w \approx 4500$ g/mol) bằng phản ứng cắt mạch oxy hóa với $H_2O_2$ trong axit lactic ở nhiệt độ phòng, quy trình thực hiện đơn giản và thân thiện môi trường.
- Tận dụng thành công nguồn phụ phẩm nông nghiệp tro vỏ trấu để chế tạo nano silica vô định hình có độ tinh khiết cao bằng phương pháp kết hợp nung nhiệt (550°C) và xử lý axit ($HCl$ 3 M).
- Tổng hợp thành công hạt nano đồng kim loại không bị oxy hóa bằng phương pháp khử hóa học sử dụng polymer sinh học alginate làm chất bảo vệ trong môi trường nước mà không cần sử dụng dòng khí trơ bảo vệ.
- Chế tạo thành công hệ vật liệu nano đa chức năng Cu-Ag/silica trên nền chitosan oligosaccharide (MFNPs/COS), tích hợp đồng thời ba tác động: kháng nấm bệnh hại lúa (M. oryzae, R. solani), cung cấp dưỡng chất vi lượng/silica và kích thích sinh trưởng làm tăng năng suất cây trồng.
Kiến nghị và giải pháp đề xuất
- Đề xuất ứng dụng chế phẩm nano đa chức năng MFNPs/COS thay thế dần các loại thuốc bảo vệ thực vật hóa học độc hại trong phòng trừ bệnh đạo ôn và khô vằn trên cây lúa.
- Tiếp tục hoàn thiện và chuẩn hóa quy trình công nghệ tổng hợp MFNPs/COS ở quy mô bán công nghiệp phục vụ sản xuất nông nghiệp hữu cơ và nông nghiệp công nghệ cao.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
Hạn chế của nghiên cứu
- Các thử nghiệm đánh giá hiệu lực phòng trừ bệnh hại và ảnh hưởng nông học của hệ nano đa chức năng trong luận án mới chỉ được thực hiện trong phạm vi phòng thí nghiệm (in vitro) và mô hình nhà lưới (in vivo), chưa tiến hành khảo nghiệm diện rộng trên đồng ruộng thực tế với các điều kiện thời tiết, mùa vụ và thổ nhưỡng biến động.
- Nghiên cứu mô phỏng docking phân tử mới dừng lại ở trạng thái tĩnh (static docking), chưa thực hiện mô phỏng động lực học phân tử (Molecular Dynamics simulation) để đánh giá độ bền liên kết và sự thay đổi cấu hình không gian của phức hợp protein-ligand theo thời gian trong môi trường dung môi sinh học.
Hướng nghiên cứu tiếp theo
- Triển khai khảo nghiệm đồng ruộng diện rộng trên nhiều giống lúa khác nhau và mở rộng sang các đối tượng cây trồng có giá trị kinh tế cao (cây tiêu, cà phê, cây ăn quả).
- Khảo sát độc tính sinh thái dài hạn, sự tích lũy sinh học của hạt nano kim loại trong đất, nguồn nước và chuỗi thức ăn nông nghiệp.
- Nghiên cứu cơ chế tác động ở mức độ biểu hiện gen (gene expression) của cây lúa dưới tác động kích kháng của hệ nano MFNPs/COS.
Giá trị tham khảo
Luận án là tài liệu tham khảo có giá trị học thuật và ứng dụng thực tiễn cao:
- Đối với nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên chuyên ngành Hóa lý, Hóa học vật liệu: Cung cấp phương pháp luận kết hợp giữa tính toán hóa học lượng tử/docking phân tử với quy trình thực nghiệm tổng hợp vật liệu nano kim loại; kỹ thuật phân tích cấu trúc vật liệu nano qua các phổ UV-Vis, FT-IR, XRD, HRTEM, EDX mapping.
- Đối với các nhà khoa học ngành Nông học, Bảo vệ thực vật và Công nghệ sinh học: Cung cấp quy trình chi tiết chế tạo chất kích kháng sinh học từ phụ phẩm (COS từ chitosan, silica từ vỏ trấu) và phương pháp đánh giá hoạt tính kháng nấm in vitro, in vivo.
- Đối với các nhà quản lý và doanh nghiệp nông nghiệp: Cung cấp cơ sở khoa học để phát triển các dòng sản phẩm phân bón lá và thuốc trừ bệnh nano thân thiện môi trường, phục vụ định hướng phát triển nông nghiệp sạch và bền vững.
Câu hỏi thường gặp
1. Tại sao tác giả sử dụng sodium alginate làm chất bảo vệ trong quá trình tổng hợp nano đồng mà không cần dùng khí trơ?
Alginate là một polysaccharide tự nhiên thu nhận từ rong nâu, mạch phân tử chứa nhiều nhóm hydroxyl (-OH) và carboxyl (-COO$^-$) phân bố đều. Các nhóm chức này có khả năng tạo phức mạnh và bẫy chọn lọc các ion $Cu^{2+}$, tạo hiệu ứng cản trở không gian bao bọc xung quanh hạt mầm kim loại khi bị khử. Cấu trúc gel bền của alginate ngăn chặn sự tiếp xúc của oxy hòa tan và ức chế quá trình kết tụ của các hạt nano đồng, giúp hạt giữ nguyên trạng thái kim loại ($Cu^0$) trong dung dịch nước ở nhiệt độ phòng mà không cần các khí trơ đắt tiền như argon hay nitơ.
2. Nano silica trong luận án được chế tạo từ nguồn nguyên liệu nào và đóng vai trò gì trong hệ vật liệu nano đa chức năng?
Nano silica được chế tạo từ phụ phẩm tro vỏ trấu qua quá trình nung ở 550°C trong 3 giờ và rửa tạp chất kim loại bằng dung dịch $HCl$ 3 M, tạo ra silica vô định hình có độ tinh khiết cao. Trong hệ nano đa chức năng, nano silica đóng hai vai trò:
- Làm giá mang vô cơ trơ có diện tích bề mặt riêng lớn để phân tán các hạt nano kim loại (Cu, Ag), giảm thiểu sự kết tụ hạt.
- Cung cấp nguồn dưỡng chất silic thiết yếu cho cây lúa (cây lúa có nhu cầu silica từ 2,63% đến 13,13%), giúp làm dày thành tế bào biểu bì, tăng khả năng quang hợp và nâng cao sức chống chịu tự nhiên trước sự xâm nhiễm của sợi nấm bệnh.
3. Mô phỏng docking phân tử trong luận án đã khảo sát các protein thụ thể nào của nấm gây bệnh?
Luận án đã khảo sát 4 protein đích cụ thể:
- Protein 4G9M của nấm Rhizoctonia solani (gây bệnh khô vằn trên cây lúa).
- Protein 6JBR của nấm Magnaporthe oryzae (gây bệnh đạo ôn trên cây lúa).
- Protein 6KD3 của nấm Phytophthora capsici (gây bệnh chết nhanh trên cây tiêu).
- Protein 1JFA của nấm Fusarium sporotrichioides (gây bệnh chết chậm trên cây tiêu).
4. Quy trình điều chế chitosan oligosaccharide (COS) được thực hiện như thế nào và có tác dụng gì?
COS được điều chế bằng cách hòa tan chitosan trong axit lactic 1,5%, sau đó thực hiện phản ứng cắt mạch oxy hóa bằng $H_2O_2$ 1% ở nhiệt độ phòng, kết tủa sản phẩm bằng ethanol ở pH = 8 (điều chỉnh bằng $NH_3$), ly tâm và sấy khô ở 40°C thu được bột COS ($M_w \approx 4500$ g/mol). COS đóng vai trò là chất mang phân tán sinh học, kích thích nảy mầm hạt giống, kích hoạt hệ thống miễn dịch của cây trồng tiết enzyme phòng vệ và phối hợp kháng nấm với các hạt nano kim loại.
5. Kết quả khảo nghiệm sinh học chứng minh hiệu lực của vật liệu nano MFNPs/COS đối với cây lúa như thế nào?
Thực nghiệm in vitro chỉ ra rằng MFNPs/COS có hiệu lực ức chế tản nấm M. oryzae và R. solani cao nhất so với các hệ nano đơn thành phần. Trong điều kiện nhà lưới, chế phẩm giúp giảm mạnh tỷ lệ bệnh (TLB %) và chỉ số bệnh (CSB %) của bệnh đạo ôn và khô vằn, kích thích cây lúa đẻ nhánh, tăng chiều cao, nâng cao các chỉ tiêu cấu thành năng suất và năng suất thực thu mà không gây độc tính cho cây trồng.
Kết luận
Luận án tiến sĩ của tác giả Nguyễn Thị Thanh Hải đã giải quyết trọn vẹn mục tiêu nghiên cứu thông qua việc kết hợp chặt chẽ giữa tính toán hóa học lượng tử mô phỏng docking phân tử với thực nghiệm tổng hợp vật liệu nano tiên tiến. Công trình đã chế tạo thành công hệ vật liệu nano đa chức năng Cu-Ag/silica trên nền chất mang chitosan oligosaccharide (MFNPs/COS) bằng các quy trình đơn giản, tận dụng nguồn phụ phẩm vỏ trấu và không sử dụng khí trơ bảo vệ. Kết quả nghiên cứu đã chứng minh hiệu lực ức chế rõ rệt đối với các chủng nấm gây bệnh đạo ôn, khô vằn trên cây lúa và bệnh chết nhanh trên cây tiêu, đồng thời kích thích sinh trưởng và tăng năng suất cây trồng, đóng góp luận cứ khoa học quan trọng cho hướng phát triển các chế phẩm nano phục vụ nông nghiệp bền vững.
