Đặt vấn đề Cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học hiện đại, công nghệ enzyme đã có bước phát triển vượt bậc, ngày càng có nhiều thành tựu và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghịêp, đem lại lợi ích to lớn cho con người. Trong số các enzyme đang được ứng dụng hiện nay, cellulase là một trong những enzyme có nhiều ứng dụng trong thực tiễn. Cellulase xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết β-1,4-glycoside trong phân tử cellulose và các dẫn xuất tạo thành glucose và các đường đơn giản. Do đó, cellulase được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, sản xuất thức ăn chăn nuôi, sản xuất bia, bột giấy, ngành công nghiệp chất tẩy rửa, ngành công nghiệp dệt may, nhiên liệu và hóa chất, quản lý chất thải và xử lý ô nhiễm môi trường.
Cellulase là một phức hệ enzyme gồm 3 loại enzyme chính gồm: endoglucanase, exoglucanase và -glucosidase. Trong đó, endoglucanase là loại enzyme có khả năng thủy phân mạnh phân tử cellulose ở vùng vô định hình, có nhiều tiềm năng ứng dụng trong thực tiễn và được tập trung nghiên cứu nhiều nhất hiện nay. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về cellulase, những nghiên cứu về cellulase chủ yếu tập trung vào việc tách dòng gen mã hoá cellulase, tinh sạch và nghiên cứu đặc điểm hoá sinh của cellulase, tối ưu những điều kiện nuôi cấy thu nhận chế phẩm enzyme từ các loài nấm mốc, vi khuẩn và xạ khuẩn. Nhiều công ty trên thế giới đã tạo ra những chế phẩm cellulase thương mại và ứng dụng vào thực tiễn.
Ở Việt Nam đã có những nghiên cứu về tinh sạch, nghiên cứu đặc điểm hoá sinh từ một số chủng nấm sợi như: Penicillium, Aspergillus, Trichoderma; xạ khuẩn Actinomyces được công bố. Tuy nhiên, việc khai thác ứng dụng cellulase từ nguồn tự nhiên gặp nhiều hạn chế do năng lực sinh tổng hợp của chủng giống, không chủ động nguồn enzyme, khó can thiệp thay đổi tính chất về động học enzyme, độ bền nhiệt độ và pH, khả năng hoạt động trong những điều kiện nồng độ cao chất tẩy rửa và dung môi hữu cơ. 2 Bằng các kỹ thuật tái tổ hợp DNA đã cho phép các nhà công nghệ sinh học phân lập và khuếch đại một gen đơn từ hệ gen của một sinh vật để có thể nghiên cứu, biến đổi và chuyển nó vào cơ thể sinh vật khác tạo protein tái tổ hợp. Sản xuất enzyme bằng con đường tái tổ hợp có thể chủ động về nguồn nguyên liệu cung cấp enzyme ban đầu ; nâng cao năng suất , chất lượng enzyme ; dễ dàng công nghệ hóa quá trì nh sản xuất và giảm giá thành sản phẩm.
Trên thế giới, đã có nhiều phương pháp được đưa ra để nâng cao năng suất cellulase như là tuyển chọn các chủng có khả năng sinh tổng hợp cellulase cao, tối ưu hóa các điều kiện lên men nhằm thu được lượng lớn enzyme này. Đặc biệt với sự phát triển của công nghệ, một số gen mã hóa cellulase của vi sinh vật và thực vật đã được tách dòng và biểu hiện ở các hệ biểu hiện khác nhau (biểu hiện ở E. coli, nấm men, nấm sợi). Ở Việt Nam, việc nghiên cứu cellulase chủ yếu dừng ở việc phân lập tuyển chọn các chủng vi sinh vật sản xuất enzyme cao và đánh giá một số tính chất của enzyme để ứng dụng trong công nghệ sinh học và xử lý môi trường.
Việc nghiên cứu tạo chế phẩm cellulase tái tổ hợp và ứng dụng các chế phẩm này còn hạn chế. Nấm sợi ở Việt Nam rất đa dạng và phong phú. Hơn nữa, nấm sợi có khả năng sinh tổng hợp nhiều loại enzyme có hoạt lực cao và tính chất ưu việt. Trong đó, cellulase là một trong những enzyme được nấm sợi sinh tổng hợp mạnh và có nhiều tiềm năng ứng dụng trong thực tiễn Việt Nam.
Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Tinh sạch và nghiên cứu đặc tính của cellulase tự nhiên và tạo cellulase tái tổ hợp từ nấm sợi tại Việt Nam”. Mục tiêu nghiên cứu (i) Tinh sạch và đánh giá được đặc tính của cellulase tự nhiên từ chủng nấm sợi tuyển chọn; (ii) Tạo được endoglucanase tái tổ hợp không chứa peptide tín hiệu từ nguồn gen đã được phân lập từ chủng nấm sợi tuyển chọn tại Việt Nam. Nội dung nghiên cứu 3. Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm sợi có khả năng sinh tổng hợp cellulase mạnh trong bộ sưu tập từ nhiều nguồn khác nhau; 3.
Nghiên cứu tối ưu thành phần môi trường, điều kiện lên men quy mô phòng thí nghiệm phù hợp với chủng nấm sợi tuyển chọn làm cơ sở sản xuất cellulase tự nhiên; 3. Tinh sạch và phân tích tính chất lý hóa của cellulase tinh sạch từ chủng nấm sợi chọn lọc tại Việt Nam; 3. Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa endoglucanase A không chứa peptide tín hiệu từ chủng nấm sợi Aspergillus niger VTCC-F021 trong Pichia pastoris GS115 và tối ưu môi trường lên men phù hợp để sản xuất endoglucanase tái tổ hợp không chứa peptide tín hiệu; 3. Tinh sạch và phân tích tính chất lý hóa của endoglucanase A tái tổ hợp không chứa peptide tín hiệu.
Những đóng góp mới của luận án (i) Endoglucanase từ chủng nấm sợi Peniophora sp. NDVN01 tuyển chọn tại Việt Nam được tinh sạch có kích thước khoảng 32 kDa. Endoglucanase có độ bền cao trong khoảng nhiệt độ 30-37°C và pH 4,0-7,0. Enzyme này bền đối với dung môi acetone ở nồng độ 1-20%; ethanol và n-butanol ở nồng độ 1-5%; isopropanol ở nồng độ 1-15% và độ bền cao đối với chất tẩy rửa Tween 20, Tween 80, Triton X-100 và triton X-114.
niger VTCC-F021 đã đư ợc bi ểu hiện thành công trong P. Endoglucanase A tái tổ hợp (rmEglA) tinh sạch có kích thước khoảng 32 kDa. Enzyme hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 50°C, pH 3,5, bền ở 30-37°C và rất bền trong khoảng pH 3,0-8,0. Enzyme có độ bền cao đối với chất tẩy rửa Tween 20, Tween 80, Triton X-100 và triton X-114.
Ý nghĩa khoa học thực tiễn của luận án 5. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu góp phần làm sáng tỏ đặc điểm hóa sinh của endoglucanase có nguồn gốc từ nấm sợi thuộc chi Peniophora và góp phần làm sáng tỏ ảnh hưởng của peptide tín hiệu đến tính chất endoglucanase A của chủng A. niger VTCC-F021 biểu hiện trong nấm men Pichia pastoris. Kết quả tạo endoglucanase A tái tổ hợp không chứa peptide tín hiệu đã củng cố thêm cơ sở khoa học trong hướng cải biến hoạt tính và tính chất enzyme tái tổ hợp bằng cách cắt bỏ đoạn peptide tín hiệu.
Các bài báo khoa học công bố trên tạp chí khoa học chuyên ngành quốc tế và trong nước cùng với trình tự gen công bố trên cơ sở dữ liệu Ngân hàng gen Quốc tế là những tài liệu có giá trị tham khảo trong nghiên cứu và giảng dạy. Ý nghĩa thực tiễn Endoglucanase từ chủng nấm sợi Peniophora sp. NDVN01 và endoglucanase A tái tổ hợp không chứa peptide tín hiệu có tính chất phù hợp với hướng ứng dụng sản xuất chế phẩm bổ sung vào thức ăn chăn nuôi để chuyển hóa hợp chất glucan nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn và tăng trọng vật nuôi. Đồng thời, hai enzyme này có thể sử dụng trong chuyển hóa sinh học nguyên liệu, chất thải nông nghiệp giàu cellulose thành đường sử dụng trong công nghiệp lên men.
Thành phần môi trường và điều kiện lên men tối ưu đối với chủng nấm sợi Peniophora sp. NDVN01 và chủng nấm men P. pastoris tái tổ hợp có thể được sử dụng để lên men lượng lớn, phù hợp để sản xuất chế phẩm endoglucanase tự nhiên và tái tổ hợp trong điều kiện thực tiễn tại Việt Nam. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.
Nguồn gốc và phân loại 1. Nguồn gốc Cellulase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng cắt mối liên kết -1,4-O- glycoside trong phân tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide và một số cơ chất tương tự khác. Cellulase có thể được tổng hợp từ rất nhiều nguồn khác nhau trong tự nhiên, trong đó vi sinh vật được xem là nguồn cung cấp enzyme với nhiều ưu điểm nổi bật và có tính chất độc đáo vượt xa so với enzyme có nguồn gốc từ động vật, thực vật. Quá trình phân giải cellulose bởi vi sinh vật là một trong những chu trình quan trọng nhất của tự nhiên.
Trong tự nhiên có rất nhiều chủng vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm sợi và một số loại nấm men có khả năng sinh tổng hợp cellulase [24]. Nấm sợi là một trong những vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất. Nhiều chủng nấm sợi thuộc các chi Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Phanerochaete đã được nghiên cứu cho thấy có khả năng sinh tổng hợp cellulase mạnh như: A. reesei [135], Penicillium sp.
DTQ- HK1 [13], Penicillium persicinum, P. Bên cạnh nấm sợi, vi khuẩn cũng được xem là một trong những đối tượng có khả năng sinh tổng hợp cellulase khá phong phú với ưu thế chu kỳ sinh trưởng trong thời gian ngắn. Nhiều loài vi khuẩn hiếu khí đã được nghiên cứu là có khả năng sinh tổng hợp cellulase mạnh như Acidothemus cellulobuticus [37], Bacillus pumilis [68], Cellulomonas flavigena, C. Không chỉ có các vi khuẩn hiếu khí mà một số vi khuẩn kỵ khí cũng có khả năng sinh tổng hợp cellulase mạnh như Clostridium [156].
6 Nhiều chủng xạ khuẩn thuộc chi Actinomyces, Streptomyces cũng có khả năng sinh tổng hợp cellulase mạnh như: Actinomyces griseus [16], Streptomyces reticuli [168]. Năm 1955, hoạt động phân giải cellulose bởi vi sinh vật sống cộng sinh trong dạ cỏ của các động vật nhai lại đã được chứng minh [36]. Đến năm 1971, người ta đã phân lập được một số loài vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose trong dạ cỏ. Trong đó có hai chủng được nghiên cứu kĩ hơn cả là Ruminococus albus và R.
Ngoài ra, cellulase còn được sinh tổng hợp ở thực vật Arabidopsis [40], ở động vật nguyên sinh và một số động vật không xương sống khác như mối [171], ở động vật thân mềm như vẹm xanh Mytilus edulis [178]. Phân loại Theo Ủy ban danh pháp của Hiệp hội Hóa sinh và Sinh học phân tử Quốc tế, cellulase thuộc lớp 3 (hydrolase): các enzyme xúc tác phản ứng thủy phân; tổ 2 (glycosidase): các enzyme thủy phân các liên kết glycoside; nhóm 1: các enzyme thủy phân liên kết O- và S-glycoside [189]. Cellulase là một phức hệ gồm nhiều loại enzyme khác nhau. Tùy theo quan điểm của từng tác giả mà các enzyme thuộc phức hệ cellulase được xếp thành các nhóm khác nhau.
Trước đây, cellulase được chia làm hai nhóm: nhóm enzyme C1 và nhóm enzyme Cx. Các enzyme C1 có khả năng thủy phân sợi cellulose tự nhiên, có tính đặc hiệu không rõ ràng. Các enzyme Cx được chia thành hai loại: exo -1,4-glucanase (E.21) xúc tác cho phản ứng cắt đứt gốc glucose từ đầu không khử của chuỗi cellulose; endo -1,4-glucanase (E.
