Luận án tiến sĩ về nghiên cứu cellulase tự nhiên và tái tổ hợp từ nấm sợi tại Việt Nam

Nghiên cứu đặc tính cellulase tự nhiên và tái tổ hợp từ nấm sợi tại Việt Nam, góp phần phát triển công nghệ sinh học và ứng dụng trong sản xuất.

• Tác giả: Trịnh Đình Khá
• Người hướng dẫn: PGS. Quyền Đình Thi
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Hóa sinh học
• Đề tài: Tinh sạch và nghiên cứu đặc tính của cellulase tự nhiên và tạo cellulase tái tổ hợp từ nấm sợi tại Việt Nam
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Thái Nguyên

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Đặc Tính Cellulase Tự Nhiên Từ Nấm Sợi

Nghiên cứu về cellulase tự nhiên từ nấm sợi tại Việt Nam đang thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học. Cellulase là enzyme quan trọng trong quá trình phân hủy cellulose, có nhiều ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, sản xuất thức ăn chăn nuôi và xử lý chất thải. Việc tìm hiểu đặc tính của cellulase từ nấm sợi không chỉ giúp nâng cao hiệu quả sản xuất mà còn mở ra hướng đi mới cho công nghệ sinh học tại Việt Nam.

1.1. Đặc Điểm Của Cellulase Tự Nhiên Từ Nấm Sợi

Cellulase tự nhiên từ nấm sợi có cấu trúc phức tạp, bao gồm nhiều loại enzyme khác nhau như endoglucanase, exoglucanase và β-glucosidase. Mỗi loại enzyme này có vai trò riêng trong quá trình phân hủy cellulose, tạo ra glucose và các đường đơn giản.

1.2. Tầm Quan Trọng Của Cellulase Trong Công Nghiệp

Cellulase được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như sản xuất bia, giấy, và chất tẩy rửa. Việc tối ưu hóa quy trình sản xuất cellulase từ nấm sợi có thể giúp giảm chi phí và nâng cao hiệu quả sản xuất.

II. Vấn Đề Và Thách Thức Trong Nghiên Cứu Cellulase Tại Việt Nam

Mặc dù có nhiều tiềm năng, việc nghiên cứu và ứng dụng cellulase tại Việt Nam vẫn gặp nhiều thách thức. Năng lực sinh tổng hợp của các chủng nấm sợi còn hạn chế, và việc khai thác nguồn enzyme tự nhiên chưa được tối ưu hóa. Điều này dẫn đến khó khăn trong việc sản xuất cellulase với số lượng lớn và chất lượng cao.

2.1. Hạn Chế Về Nguồn Enzyme Tự Nhiên

Năng lực sinh tổng hợp của các chủng nấm sợi tại Việt Nam chưa được khai thác triệt để. Nhiều chủng nấm có khả năng sinh tổng hợp cellulase cao nhưng chưa được nghiên cứu và ứng dụng.

2.2. Khó Khăn Trong Việc Tối Ưu Hóa Quy Trình Sản Xuất

Việc tối ưu hóa quy trình sản xuất cellulase từ nấm sợi gặp khó khăn do thiếu thông tin về điều kiện nuôi cấy và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Cellulase Từ Nấm Sợi Tái Tổ Hợp

Nghiên cứu về cellulase tái tổ hợp từ nấm sợi sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại. Việc tách dòng gen mã hóa cellulase và biểu hiện trong các hệ thống khác nhau như E. coli và nấm men giúp tạo ra enzyme với hoạt tính cao hơn và ổn định hơn.

3.1. Kỹ Thuật Tách Dòng Gen Mã Hóa Cellulase

Kỹ thuật tách dòng gen cho phép phân lập và khuếch đại gen mã hóa cellulase từ nấm sợi, tạo điều kiện cho việc nghiên cứu và ứng dụng enzyme trong công nghiệp.

3.2. Biểu Hiện Cellulase Trong Hệ Thống Nấm Men

Biểu hiện cellulase trong nấm men Pichia pastoris cho phép sản xuất enzyme với số lượng lớn và dễ dàng tinh sạch, mở ra cơ hội mới cho ứng dụng trong công nghiệp.

IV. Ứng Dụng Cellulase Trong Công Nghiệp Tại Việt Nam

Cellulase có nhiều ứng dụng trong công nghiệp, từ sản xuất thực phẩm đến xử lý chất thải. Việc ứng dụng cellulase từ nấm sợi không chỉ giúp nâng cao hiệu quả sản xuất mà còn góp phần bảo vệ môi trường.

4.1. Ứng Dụng Trong Ngành Thực Phẩm

Cellulase được sử dụng trong ngành thực phẩm để cải thiện chất lượng sản phẩm, tăng cường khả năng tiêu hóa và hấp thu dinh dưỡng cho vật nuôi.

4.2. Ứng Dụng Trong Xử Lý Chất Thải

Cellulase có khả năng phân hủy cellulose trong chất thải nông nghiệp, giúp chuyển hóa thành các sản phẩm có giá trị, đồng thời giảm thiểu ô nhiễm môi trường.

V. Kết Luận Về Nghiên Cứu Cellulase Từ Nấm Sợi Tại Việt Nam

Nghiên cứu về cellulase tự nhiên và tái tổ hợp từ nấm sợi tại Việt Nam đang mở ra nhiều cơ hội mới cho công nghệ sinh học. Việc tối ưu hóa quy trình sản xuất và ứng dụng cellulase sẽ góp phần nâng cao hiệu quả sản xuất và bảo vệ môi trường.

5.1. Tương Lai Của Nghiên Cứu Cellulase

Nghiên cứu và phát triển cellulase từ nấm sợi sẽ tiếp tục được đẩy mạnh, với mục tiêu tạo ra các chế phẩm enzyme chất lượng cao phục vụ cho nhu cầu công nghiệp.

5.2. Đề Xuất Hướng Nghiên Cứu Mới

Cần nghiên cứu sâu hơn về các chủng nấm sợi mới và tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy để nâng cao năng suất và chất lượng cellulase, đồng thời mở rộng ứng dụng trong các lĩnh vực khác.

Trích đoạn nội dung tài liệu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRỊNH ĐÌNH KHÁ TINH SẠCH VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH CỦA CELLULASE TỰ NHIÊN VÀ TẠO CELLULASE TÁI TỔ HỢP TỪ NẤM SỢI TẠI VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRỊNH ĐÌNH KHÁ TINH SẠCH VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH CỦA CELLULASE TỰ NHIÊN VÀ TẠO CELLULASE TÁI TỔ HỢP TỪ NẤM SỢI TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: HÓA SINH HỌC Mã số: 62 42 01 16 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. Quyền Đình Thi 2. Nghiêm Ngọc Minh THÁI NGUYÊN - 2015 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Quyền Đình Thi và PGS. Nghiêm Ngọc Minh. Một số kết quả cùng cộng tác với các đồng tác giả. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả. Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Mọi trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc. Thái Nguyên, ngày 02 tháng 10 năm 2015 Tác giả Trịnh Đình Khá ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới PGS. Quyền Đình Thi , Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn, sửa luận án, biên tập bản thảo bài báo và tạo mọi điều kiện hóa chất, thiết bị, cũng như kinh phí để tôi có thể hoàn thành Bản luận án này. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới PGS. Nghiêm Ngọc Minh, Viện nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã chỉ bảo, định hướng nghiên cứu, hướng dẫn, sửa luận án và động viên tôi trong suốt thời gian nghiên cứu. Tôi xin cảm ơn Phòng Đào tạo, Ban Giám hiệu trường Đại học Khoa học, Ban Đào tạo - Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi hoàn thành mọi thủ tục cần thiết trong quá trình làm nghiên cứu. Tôi xin cảm ơn tập thể Phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã chỉ bảo, giúp đỡ tận tình cho tôi trong quá trình thực nghiệm cũng như chia sẻ những kinh nghiệm chuyên môn quý báu. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Chủ nhiệm Khoa, các thầy cô giáo trong khoa Khoa học Sự sống, trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã luôn quan tâm, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài luận án. Cuối cùng tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã giúp đỡ, tạo điều kiện và động viên tôi trong suốt thời gian học tập. Thái Nguyên, ngày 02 tháng 10 năm 2015 Tác giả Trịnh Đình Khá iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN . ii MỤC LỤC . iii DANH MỤC NHỮNG TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT . viii DANH MỤC CÁC BẢNG . x DANH MỤC CÁC HÌNH . xi MỞ ĐẦU . Mục tiêu nghiên cứu . Nội dung nghiên cứu . Những đóng góp mới của luận án . Ý nghĩa khoa học thực tiễn của luận án . Ý nghĩa khoa học . Ý nghĩa thực tiễn . TỔNG QUAN TÀI LIỆU . Nguồn gốc và phân loại. Cấu trúc của cellulase . Tinh sạch và đánh giá tính chất của cellulase . Tinh sạch cellulase . Tính chất của cellulase . Ứng dụng của cellulase . Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm. Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi. Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ. Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy. Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa và công nghệ xử lý rác thải. Nghiên cứu tạo cellulase tái tổ hợp . Biểu hiện gen mã hóa cellulase trong E. Biểu hiện gen mã hóa cellulase trong nấm men . Biểu hiện gen mã hóa cellulase trong Bacillus. Biểu hiện gen mã hóa cellulase trong nấm mốc . Biểu hiện gen mã hóa cellulase trong động vật và thực vật. Trong thực vật . Trong động vật . Nghiên cứu cellulase và biểu hiện gen cellulase ở Việt Nam. Nấm Peniophora sp. và Aspergillus niger . VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . Vật liệu, hóa chất và địa điểm nghiên cứu . Hóa chất, dung dịch và môi trường thí nghiệm. Dung dịch và đệm . Môi trường . Địa điểm nghiên cứu. Thiết bị thí nghiệm . Phương pháp nghiên cứu . Các phương pháp vi sinh vật. Các phương pháp sinh học phân tử . Tách chiết DNA tổng số của nấm mốc . Tách chiết DNA tổng số nấm men . Tách DNA plasmid . Cắt plasmid bằng enzyme giới hạn . Tinh sạch phân đoạn DNA . Nhân bản gen bằng PCR . Phản ứng nối ghép gen . Biến nạp bằng sốc nhiệt . Biến nạp bằng xung điện . Giải trình tự nucleotide . Các phương pháp hóa sinh . Xác định hoạt tính cellulase theo đường kính thủy phân trên đĩa thạch . Xác định hoạt độ cellulase . Tinh sạch cellulase tự nhiên . Tinh sạch protein tái tổ hợp . Điện di gel polyacrylamide (PAGE) . Điện di SDS-PAGE nhuộm hoạt tính . Xác định hàm lượng protein tổng số. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố lý hóa lên hoạt tính và độ bền của endoglucanase tự nhiên và tái tổ hợp . Xác định sản phẩm thủy phân bằng kỹ thuật TLC . Phương pháp xử lý số liệu. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU . Tinh sạch và nghiên cứu đặc tính của cellulase tự nhiên từ nấm sợi tại Việt Nam . Tuyển chọn và phân loại chủng nấm sợi sinh tổng hợp cellulase . Tối ưu điều kiện môi trường nuôi cấy sinh tổng hợp cellulase . Thời gian nuôi cấy thích hợp . Ảnh hưởng của pH ban đầu của môi trường và nhiệt độ nuôi cấy . Ảnh hưởng của chất cảm ứng . Ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết khoai tây bổ sung . Ảnh hưởng của nguồn cacbon . Ảnh hưởng của nguồn nitơ . Ảnh hưởng của một số nguồn khoáng . So sánh khả năng sinh tổng hợp enzyme trong môi trường tối ưu và chưa tối ưu . Tinh sạch và đánh giá tính chất cellulase của chủng Peniophora sp. Tinh sạch cellulase . Động học cơ chất của cellulase. Đặc hiệu cơ chất của cellulase . Sản phẩm thủy phân cơ chất của cellulase . Nhiệt độ phản ứng tối ưu và độ bền nhiệt độ của endoglucanase . pH phản ứng tối ưu và độ bền pH của endoglucanase . Ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính endoglucanase . Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ và chất tẩy rửa đến hoạt tính endoglucanase . Nhân dòng và biểu hiện gen meglA từ chủng Aspergillus niger VTCC- F021 trong Pichia pastoris . Nhân dòng gen meglA . Thiết kế vector biểu hiện meglA . Biểu hiện rmEglA trong P. Xây dựng hệ thống biểu hiện P. pastoris GS115/pPmeglA. Sàng lọc các dòng P. pastoris GS115/pPmeglA sinh tổng hợp rmEglA mạnh. Tối ưu một số thành phần mội trường và điều kiện lên men sản xuất rmEglA. Lựa chọn môi trường thích hợp . Nồng độ cao nấm men tối ưu . Nồng độ peptone tối ưu . pH ban đầu của môi trường . Ảnh hưởng của nhiệt độ . Ảnh hưởng của nồng độ methanol cảm ứng . Ảnh hưởng của thời gian đến năng suất biểu hiện rmEglA. So sánh năng suất biểu hiện rmEglA trong môi trường tối ưu và chưa tối ưu. Tinh sạch rmEglA . Tính chất của rmEglA . Động học cơ chất của rEglA . Xác định tính đặc hiệu cơ chất của rmEglA . Sản phẩm thủy phân của rmEglA . Nhiệt phản ứng tối ưu và độ bền nhiệt độ của rmEglA . pH phản ứng tối ưu và độ bền pH của rmEglA . Ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính của rmEglA . Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ và chất tẩy rửa. Tinh sạch và nghiên cứu đặc tính của cellulase tự nhiên từ nấm sợi tại Việt Nam . Nhân dòng và biểu hiện gen meglA từ chủng Aspergillus niger VTCC-F021 trong Pichia pastoris . 98 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 103 CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN . 104 TÀI LIỆU THAM KHẢO . 127 viii DANH MỤC NHỮNG TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt BLAST Basic local alignment search tool bp Base pair Cặp bazơ nitơ cDNA Complement DNA DNA bổ sung CMC Carboxymethyl cellulose DNA Deoxyribonucleic acid DNase Deoxyribonuclease dNTP 2-Deoxynucleoside 5- triphosphate ĐC Đối chứng đtg Đồng tác giả EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid eglA Gen mã hóa endoglucanase A chứa peptide tín hiệu EglA Endoglucanase A Endoglucanase A chứa peptide tín hiệu EtBr Ethidium bromide M Marker NBB Native Binding Buffer Đệm gắn mẫu NEB Native Elution Buffer Đệm thôi mẫu NWB Native Wash Buffer Đệm rửa kb Kilo base kDa Kilo Dalton meglA Gen mã hóa endoglucanase A không chứa peptide tín hiệu mEglA Mature endoglucanase A Endoglucanase A không chứa peptide tín hiệu ix Chữ viết tắt Tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt OD Optical density Mật độ quang PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi tổng hợp RNA Ribonucleic acid RNase Ribonuclease rEglA Recombinant endoglucanase A Endoglucanase A chứa peptide tín hiệu tái tổ hợp rmEglA Recombinant mature Endoglucanase A không chứa endoglucanase A peptide tín hiệu tái tổ hợp rpm Revolutions per minute Số vòng/phút SDS Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate Điện di trên gel polyacrylamide gel polyacrylamide có SDS electrophoresis Taq Thermus aquaticus TBE Tris-boric-acid EDTA TE Tris - EDTA TEMED N,N,N,N- Tetramethylethylenediamine TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng v/v Volume/volume Thể tích/thể tích w/v Weight/volume Khối lượng/thể tích x DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2. Các cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR nhân gen . Thành phần PCR . Thông số kỹ thuật các bước tinh sạch cellulase từ chủng Peniophora sp. Hằng số động học cơ chất của cellulase tinh sạch từ Peniophora sp. Đặc hiệu cơ chất của cellulase từ chủng Peniophora sp. Ảnh hưởng của ion kim loại và một số thuốc thử đến hoạt tính endoglucanase của chủng Peniophora sp. Hoạt tính rmEglA của các dòng P. pastoris GS115/pPmeglA tái tổ hợp . Thông số kỹ thuật các bước tinh sạch rmEglA. Hằng số động học cơ chất của rmEglA tinh sạch . Mức độ đặc hiệu cơ chất của rmEglA . Ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính rmEglA . So sánh một số đặc điểm của rmEglA và rEglA . Các hóa chất thí nghiệm chính . Thành phần các loại đệm và dung dịch . Các môi trường thí nghiệm . Các thiết bị thí nghiệm . Hoạt tính cellulase của các chủng nấm sợi . Trình tự nucleotide đoạn gen rRNA của chủng Peniophora sp. 133 xi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. Hình ảnh mô hình sự sắp xếp các chuỗi cellulose trong thành tế bào thực vật .