Tổng quan luận án

Đề tài luận án tiến sĩ sinh học, chuyên ngành Công nghệ sinh học (mã số 9 42 02 01) của nghiên cứu sinh Hồ Văn Được, được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của GS. Nguyễn Thị Lang tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học thuộc Trường Đại học Cần Thơ, phối hợp cùng Bộ môn Di truyền - Chọn giống cây trồng thuộc Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long vào năm 2018.

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Cây lúa (Oryza sativa L.) là cây lương thực chủ lực cung cấp nguồn năng lượng cho hơn một nửa dân số toàn cầu, trong đó trên 90% sản lượng lúa gạo được sản xuất và tiêu thụ tại châu Á. Tại vùng Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL), nông dân trước đây duy trì tập quán canh tác các giống lúa thuần ngắn ngày, năng suất cao, chống chịu tốt với điều kiện dịch hại nhưng phẩm chất hạt gạo chưa cao, cơm khô, cứng và thiếu mùi thơm. Sự gia tăng thu nhập và nhu cầu tiêu dùng nội địa cũng như xuất khẩu đặt ra đòi hỏi cấp thiết về các giống lúa gạo chất lượng cao, có đặc tính mềm, dẻo và ngon cơm.

Chất lượng nấu nướng và độ mềm dẻo của hạt cơm phụ thuộc chủ yếu vào hàm lượng amylose (Amylose Content - AC). Tính trạng hàm lượng amylose được điều khiển chủ yếu bởi gen waxy định vị trên nhiễm sắc thể số 6. Trong công tác chọn giống truyền thống, việc chọn tạo các dòng lúa vừa mang hàm lượng amylose thấp (≤20%) vừa bảo đảm năng suất cao gặp nhiều rào cản do thời gian kéo dài (mất từ 6 đến 7 năm qua nhiều chu kỳ hồi giao), tốn kém chi phí, dễ bị tác động bởi điều kiện ngoại cảnh và gặp hiện tượng liên kết gen không mong muốn từ nguồn vật liệu hoang dại hoặc bố mẹ du nhập. Khoảng trống nghiên cứu tại thời điểm thực hiện đề tài là:

  • Nguồn vật liệu lúa địa phương và lúa cao sản thu thập tại ĐBSCL chưa được đánh giá và phân loại một cách hệ thống ở cả mức độ kiểu hình và kiểu gen liên quan đến tính trạng phẩm chất hạt.
  • Việc ứng dụng phương pháp lai hồi giao có sự hỗ trợ của chỉ thị phân tử (Marker-Assisted Backcrossing - MABC) kết hợp công cụ đồ họa kiểu gen (Graphical Genotypes - GGT) để chuyển gen waxy quy định hàm lượng amylose thấp vào các giống lúa cao sản chủ lực của vùng ĐBSCL vẫn còn hạn chế.

Mục tiêu nghiên cứu

Luận án xác định mục tiêu tổng quát và các mục tiêu cụ thể như sau:

Mục tiêu tổng quát: Nghiên cứu, chọn tạo các dòng/giống lúa có phẩm chất tốt liên quan đến chỉ tiêu hàm lượng amylose thấp dựa trên sự kết hợp giữa phương pháp lai hồi giao và chọn giống bằng chỉ thị phân tử.

Mục tiêu nghiên cứu cụ thể (được đánh số theo văn bản luận án):

  1. Khai thác gen liên quan đến chỉ tiêu hàm lượng amylose thấp thông qua đa dạng nguồn vật liệu ban đầu từ bộ lúa địa phương và bộ lúa cao sản ngắn ngày.
  2. Ứng dụng MABC trong chọn lọc các quần thể lai hồi giao thông qua đánh giá kiểu hình và phân tích kiểu gen dựa trên việc xác định gen waxy trên nhiễm sắc thể số 6 và các gen liên quan năng suất và thành phần năng suất được đánh dấu trên cá thể cây mẹ.
  3. Đánh giá đa dạng di truyền trên quần thể con lai và chọn lọc các cá thể mang gen mục tiêu mong muốn thông qua xây dựng bản đồ GGT trên các quần thể NILs.
  4. Chọn lọc các dòng lúa triển vọng có tính trạng hàm lượng amylose thấp (≤20%) và năng suất cao (từ 7 - 8 tấn/ha vụ Đông Xuân và 4 – 5 tấn/ha vụ Hè Thu) nhằm phục vụ cho công tác chọn tạo giống lúa mới.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu: Tập hợp 88 giống lúa địa phương thu thập từ các tỉnh ĐBSCL và 71 giống lúa cao sản từ Ngân hàng gen của Bộ môn Di truyền - Chọn giống cây trồng thuộc Viện Lúa ĐBSCL. Các giống bố cho gen (donor) gồm Jasmine85, Khao Dawk Mali 105 (KDML105), OM7347; các giống mẹ nhận gen (recipient) gồm OM6976, OM5930, OM6073; cùng các quần thể con lai hồi giao từ F1 đến thế hệ BC4F3.
  • Phạm vi không gian: Phòng phân tích phẩm chất, Phòng Sinh học phân tử, Nhà lưới và Ruộng thí nghiệm chọn dòng của Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long.
  • Phạm vi thời gian: Đề tài được triển khai liên tục từ tháng 10 năm 2013 đến tháng 06 năm 2017.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước mà tác giả điểm lại

Luận án hệ thống hóa tài liệu khoa học xoay quanh các chủ đề cốt lõi:

1. Cơ sở sinh hóa và phân loại hàm lượng amylose: Tinh bột chiếm 90% nội nhũ hạt lúa, cấu thành từ hỗn hợp amylose (chuỗi mạch thẳng liên kết α-1,4 glucan) và amylopectin (chuỗi phân nhánh liên kết α-1,4 và α-1,6 glucan) (Juliano, 2003; Fitzgerald et al., 2009a; Chen et al., 2008; Liu, 2005). Độ mềm dẻo của cơm có mối tương quan nghịch với hàm lượng amylose (Asghar et al., 2012; Patindol et al., 2010). Dựa theo tiêu chuẩn của Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế (IRRI, 1996), gạo được phân nhóm thành: nhóm nếp (waxy, AC từ 0-2%) và nhóm tẻ (nonwaxy, gồm AC rất thấp 3-9%, AC thấp 10-19% hoặc ≤20%, AC trung bình 20-25%, AC cao >25%). Các chỉ tiêu hóa lý đi kèm gồm độ bền thể gel (Gel Consistency - GC) điều khiển bởi gen geca và gecb (Cai et al., 1998; Tang et al., 1991, 2001) và độ trở hồ (Gelatinization Temperature - GT) dao động từ 55°C đến 79°C (Jennings et al., 1979; Khush và Ikehashi, 1979).

2. Cơ sở di truyền học phân tử của locus waxy: Enzyme Granule-bound Starch Synthase I (GBSSI) xúc tác kéo dài chuỗi amylose được mã hóa bởi gen waxy (Wx) định vị trên nhiễm sắc thể số 6 (Wang et al., 1990; Okagaki và Wessler, 1988). Trình tự gen waxy dài 5.499 bp gồm 14 exon và 13 intron. Sano (1984), Kumar và Khush (1986), Zhao et al. (2010) ghi nhận 3 alen chính: $Wx^a$ (phổ biến ở phụ loài indica, biểu hiện GBSSI cao, hàm lượng amylose cao), $Wx^b$ (ở phụ loài japonica, hàm lượng amylose thấp) và alen lặn wx (ở lúa nếp). Đột biến thay thế đơn nucleotide G thành T tại vị trí cắt nối intron 1 ở đầu 5' (trình tự AGGTATA ở $Wx^a$ biến đổi thành AGTTATA ở $Wx^b$) làm giảm hiệu quả xử lý phân tử mRNA thành thục, dẫn đến suy giảm tổng hợp enzyme GBSSI và hạ thấp hàm lượng amylose (Hirano et al., 1998; Bligh et al., 1998; Cai et al., 1998; Isshiki et al., 1998). Một số đột biến khác như biến đổi A $\rightarrow$ C tại exon 6 tạo alen $Wx^{in}$ quy định amylose trung bình (Chen et al., 2008; Mikami et al., 2008) hoặc đột biến lặp đoạn 23 bp ở exon 2 dẫn đến kết thúc sớm quá trình dịch mã tạo kiểu hình nếp (Wanchana et al., 2003). Vùng Quantitative Trait Loci (QTL) kiểm soát hàm lượng amylose trên nhiễm sắc thể số 6 giải thích tới 91,1% biến thiên kiểu hình (He et al., 1999; Bao et al., 2002).

3. Phương pháp lai hồi giao và chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MABC): Phương pháp lai hồi giao được khởi xướng bởi Harlan và Pope (1922). Sau 6 thế hệ hồi giao liên tiếp với giống tái tục (recurrent parent - RP), tỷ lệ phục hồi hệ gen nhận theo lý thuyết đạt 99,2% (Allard, 1960; Reyes, 2000). Tuy nhiên, phương pháp truyền thống đòi hỏi thời gian kéo dài và chịu trở ngại bởi liên kết không mong muốn (Acquaah, 2007, 2012). Việc tích hợp chỉ thị phân tử Simple Sequence Repeat (SSR) vào lai hồi giao (MABC) cho phép chọn lọc trực tiếp kiểu gen mong muốn ở giai đoạn sớm (Sorensen và Robertson, 1961; Tanksley và Nelson, 1996; Collard và Mackill, 1998, 2006). Mô hình toán của Frisch (1999) và Robert Koebner (2003) chứng minh rằng thông qua MABC kết hợp chọn lọc nền di truyền, chỉ cần 3 đến 4 thế hệ hồi giao là có thể phục hồi trên 96% hệ gen giống mẹ. Các ứng dụng MABC thành công đã được ghi nhận trong chuyển nạp gen kháng đạo ôn Piz-5, Piz-54 (Singh et al., 2011), gen kháng bạc lá Xa23 (Pan et al., 2003), gen kháng rầy nâu bph3, bph18 (Jairin et al., 2007; Suh et al., 2011), QTL chịu mặn Saltol (Huyen et al., 2012; Vu et al., 2012; Hasan et al., 2015), gen mùi thơm (Ahn et al., 1992; Yi et al., 2009; Begum et al., 2015) và các giống lúa OM tại Viện Lúa ĐBSCL như OM4495, OM4498, OM4900, OM6162, OM7347 (Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu, 2002, 2004; Nguyễn Thị Lang và ctv., 2014, 2016).

Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết

Luận án định vị trọng tâm vào việc khắc phục mâu thuẫn giữa tính trạng năng suất cao và phẩm chất cơm mềm dẻo tại ĐBSCL. Tác giả lựa chọn giải quyết việc chuyển gen waxy quy định tính trạng amylose thấp (≤20%) từ nguồn bố Jasmine85, KDML105 và OM7347 vào nền các giống lúa mẹ cao sản đạt năng suất cao nhưng có hàm lượng amylose cao (OM6976, OM5930, OM6073). Điểm mấu chốt là sử dụng hệ thống chỉ thị phân tử kép: vừa kiểm soát gen mục tiêu Wx, vừa giám sát các locus liên kết năng suất (RM240, RM162, RM256, RM257), kết hợp quét toàn bộ 12 nhiễm sắc thể bằng bản đồ GGT 2.0 ở thế hệ BC4F2 để loại trừ đoạn nhiễm sắc thể liên kết bất lợi từ giống cho, khôi phục 100% nền di truyền mẹ.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung phân tích và cơ sở lý thuyết

Nghiên cứu vận dụng lý thuyết di truyền phân tử về gen waxy, nguyên lý chọn lọc có sự hỗ trợ của chỉ thị phân tử (MAS/MABC) và lý thuyết di truyền số lượng:

  • Quy tắc di truyền locus Wx: Gen quy định hàm lượng amylose cao có tính trội không hoàn toàn hoặc tương tác cộng tính; kiểu gen đồng hợp tử lặn quy định hàm lượng amylose thấp.
  • Chiến lược chọn giống MABC: Kết hợp chọn lọc kiểu gen đích (foreground selection với chỉ thị Wx), chọn lọc tái tổ hợp các vùng lân cận locus mục tiêu và chọn lọc nền di truyền (background selection bằng hệ thống chỉ thị SSR bao phủ 12 nhiễm sắc thể thông qua bản đồ GGT).
  • Đánh giá thông số di truyền quần thể F2: Tính toán hệ số di truyền nghĩa rộng ($h^2_{BS}$) và hiệu quả chọn lọc dự tính (Genetic Advance - GA).

Phương pháp nghiên cứu thực tế

Nghiên cứu phối hợp chặt chẽ giữa kỹ thuật di truyền truyền thống, phân tích hóa sinh và công nghệ sinh học phân tử:

1. Đánh giá kiểu hình:

  • Phân tích hàm lượng amylose: Sử dụng phương pháp đo quang phổ sinh hóa của Seko (2003) với 3 lần lặp lại. Bột gạo nghiền (100 mg) được hồ hóa bằng ethanol 95% và NaOH 1N ở 100°C trong 10 phút, định mức 100 ml; lấy 5 ml dịch bổ sung CH3COOH 1M và dung dịch iod, ủ 30°C trong 20 phút và đo độ hấp thụ quang học ở bước sóng 620 nm trên máy quang phổ UV-Vis. Phân nhóm hàm lượng amylose theo thang IRRI (1996).
  • Khảo nghiệm nông học và năng suất: Bố trí thí nghiệm theo khối hoàn toàn ngẫu nhiên (RCBD) với 3 lần lặp lại, diện tích mỗi ô 5 m² (2,5 m × 2,0 m), cấy 1-2 dảnh/bụi, khoảng cách cấy 20 cm × 15 cm. Công thức bón phân: 100N - 40P₂O₅ - 30K₂O (kg/ha) cho vụ Đông Xuân và 80N - 40P₂O₅ - 30K₂O (kg/ha) cho vụ Hè Thu theo Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 01-55: 2011/BNNPTNT. Đo đếm thời gian sinh trưởng, chiều cao cây, chiều dài bông, số bông/bụi, số hạt chắc/bông, tỷ lệ lép, khối lượng 1000 hạt và năng suất thực tế quy về ẩm độ chuẩn 14%. Đo độ trở hồ (GT) và độ bền gel (GC) theo IRRI (1996).

2. Đánh giá kiểu gen (Sinh học phân tử):

  • Ly trích ADN: Thực hiện từ mẫu mô lá non (2-3 cm) theo quy trình đệm CTAB/SDS của IRRI (1996) và Nguyễn Thị Lang (2002). Dung dịch đệm gồm Tris 50 mM (pH = 8), EDTA 25 mM (pH = 8), NaCl 300 mM, SDS 1%. Tinh sạch bằng hỗn hợp Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1), kết tủa ADN bằng ethanol 100% lạnh, rửa tủa bằng ethanol 70%, hòa tan trong đệm TE (Tris 10 mM, EDTA 0,5 mM, pH = 8) và bảo quản tại -20°C.
  • Phản ứng PCR-SSR: Thể tích phản ứng 15 µl gồm: 8,5 µl nước cất hai lần; 1,5 µl đệm 10X PCR buffer (200 mM Tris-HCl pH 8,0-8,5, 500 mM KCl, 15 mM MgCl₂); 1,0 µl dNTP 1 mM; 1,0 µl mồi xuôi và ngược (5 µM); 1,0 µl Taq ADN polymerase (4 U/µl); 2,0 µl ADN tổng số (35 ng/µl). Phản ứng khuếch đại trên máy Thermal Cycler 9600 (Perkin Elmer, USA) với chu trình nhiệt: biến tính ban đầu, tiếp theo là 35 chu kỳ (94°C trong 30 giây, gắn mồi ở 55°C trong 30 giây, kéo dài ở 72°C trong 45 giây) và kéo dài chung cuộc ở 72°C.
  • Điện di sản phẩm PCR: Sử dụng gel polyacrylamide 6% hoặc agarose 3%, chạy trong đệm TAE hoặc TBE trong thời gian 1-2 giờ. Nhuộm gel bằng Ethidium Bromide 0,5% hoặc nhuộm bạc, quan sát và ghi nhận hình ảnh dưới ánh sáng tia tử ngoại (UV).

3. Phân tích số liệu và đồ họa kiểu gen:

  • Sử dụng phần mềm NTSYSpc (Rohlf, 1992) để tính ma trận tương đồng di truyền theo công thức Nei và Li (1979) ($S_{xy} = 2N_{xy} / [N_x + N_y]$), khoảng cách di truyền ($D_{xy} = 1 - S_{xy}$) và thiết lập giản đồ hình cây (dendrogram).
  • Sử dụng phần mềm GGT 2.0 (Graphical Genotypes 2) để phân tích tỷ lệ tái tổ hợp, đánh giá mức độ phục hồi hệ gen nền của giống nhận trên cả 12 nhiễm sắc thể.

Nguồn tư liệu và dữ liệu

Dữ liệu nghiên cứu bao gồm số liệu thực nghiệm gốc được theo dõi trực tiếp ngoài đồng ruộng thí nghiệm, số liệu phân tích hóa sinh từ phòng phân tích chất lượng lúa gạo và ảnh điện di ADN từ phòng thí nghiệm sinh học phân tử thuộc Viện Lúa ĐBSCL trong suốt các mùa vụ từ năm 2013 đến năm 2017.

Bảng dưới đây tổng hợp các chỉ thị phân tử cốt lõi được sử dụng trong quy trình chọn lọc MAS của đề tài:

STT Tên chỉ thị Vị trí nhiễm sắc thể (NST) Trình tự mồi (5' - 3') Trình tự lặp Kích thước phân đoạn (bp) Vai trò trong chọn giống
1 Wx NST 6 F: ctttgtctatctcaagacac
R: ttgcagatgttcttcctgatg		 (TC)n 210 - 220 Giám sát gen mục tiêu waxy
2 RM240 NST 2 F: ccttaatgggtagtgtgcac
R: tgtaaccattccttccatcc		 (CT)21 150 - 200 Giám sát gen năng suất cây mẹ
3 RM162 NST 6 F: gccagcaaaaccagggatccgg
R: caaggtcttgtgcggcttgcgg		 (AC)20 250 - 300 Giám sát gen năng suất cây mẹ
4 RM256 NST 8 F: gacagggagtgattgaaggc
R: gttgatttcgccaagggc		 (CT)21 100 - 200 Giám sát gen năng suất cây mẹ
5 RM257 NST 9 F: cagttccgagcaagagtactc
R: ggatcggacgtggcatatg		 (CT)24 150 - 250 Giám sát gen năng suất cây mẹ

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Giới thiệu

Chương 1 đặt vấn đề về áp lực chuyển đổi cơ cấu sản xuất lúa gạo tại ĐBSCL từ tập trung sản lượng sang nâng cao giá trị chất lượng. Tác giả luận giải tính cấp thiết của việc kiểm soát hàm lượng amylose ở mức thấp (≤20%) nhằm tạo hạt cơm mềm, dẻo. Chương này xác định rõ mục tiêu nghiên cứu, 5 nội dung nghiên cứu lớn, ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài, tính ứng dụng, đối tượng nghiên cứu (88 giống địa phương và 71 giống cao sản) cùng phạm vi triển khai tại Viện Lúa ĐBSCL.

Chương 2: Tổng quan tài liệu

Chương 2 trình bày chi tiết bức tranh lý thuyết về cấu trúc hạt tinh bột lúa gạo, bản chất sinh hóa và di truyền của hàm lượng amylose, độ bền thể gel và nhiệt độ trở hồ. Tác giả tổng thuật toàn diện các cơ chế đột biến tại locus waxy trên nhiễm sắc thể số 6; phân tích ưu điểm và hạn chế của phương pháp lai hồi giao cổ điển; luận giải cơ sở khoa học của phương pháp MABC giúp rút ngắn chu kỳ hồi giao nhờ sự trợ giúp của chỉ thị SSR; đồng thời điểm lại các thành tựu ứng dụng MABC trong chọn tạo giống lúa kháng sâu bệnh, chịu hạn mặn và nâng cao phẩm chất hạt trong và ngoài nước.

Chương 3: Phương pháp nghiên cứu

Chương 3 mô tả chi tiết phương pháp luận và kỹ thuật thực nghiệm:

  • Bố trí thời gian nghiên cứu (10/2013 - 06/2017) và vật liệu thực nghiệm.
  • Chi tiết hóa 5 nội dung nghiên cứu thực nghiệm.
  • Quy trình phân tích hóa sinh đo hàm lượng amylose theo Seko (2003) và tiêu chuẩn IRRI (1996).
  • Quy trình khảo nghiệm đồng ruộng theo QCVN 01-55: 2011/BNNPTNT.
  • Thao tác lai tạo trong nhà lưới (khử đực bông mẹ vào buổi chiều mát 15-17 giờ, thụ phấn vào sáng hôm sau).
  • Quy trình ly trích ADN bằng đệm SDS/CTAB, công thức phản ứng PCR-SSR, quy trình chạy điện di gel agarose 3% và polyacrylamide 6%.
  • Phương pháp xử lý số liệu di truyền bằng NTSYSpc và xây dựng bản đồ đồ họa kiểu gen bằng phần mềm GGT 2.0.

Chương 4: Kết quả và thảo luận

Chương 4 là chương thực nghiệm trọng tâm, thể hiện kết quả nghiên cứu qua các bước:

1. Đánh giá bộ vật liệu bố mẹ:

  • Phân tích 88 giống lúa địa phương và 71 giống lúa cao sản về hàm lượng amylose, thời gian sinh trưởng, năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất.
  • Phân tích đa dạng di truyền kiểu hình thông qua phần mềm NTSYSpc, kết hợp khảo sát đa hình kiểu gen với 40 chỉ thị phân tử SSR và chỉ thị Wx.
  • Tuyển chọn được 3 giống bố cho gen amylose thấp (donor): Jasmine85, KDML105, OM7347; và 3 giống mẹ nhận gen (recipient) có năng suất cao nhưng hàm lượng amylose cao: OM6976, OM5930, OM6073.

2. Đánh giá hiệu quả di truyền của các tổ hợp lai ở thế hệ F2:

  • Khảo sát các thông số di truyền bao gồm phương sai kiểu hình, phương sai di truyền, hệ số di truyền nghĩa rộng ($h^2_{BS}$) và hiệu quả chọn lọc (GA).
  • Dựa trên giá trị $h^2_{BS}$ và GA đối với tính trạng hàm lượng amylose và năng suất, tác giả xác định 3 tổ hợp lai có tiềm năng di truyền cao nhất để đưa vào quy trình hồi giao: OM6976/Jasmine85, OM6976/KDML105 và OM5930/OM7347.

3. Chọn tạo quần thể lai hồi giao bằng MAS (từ BC1F1 đến BC4F1):

  • Các tổ hợp lai được hồi giao liên tục với giống mẹ tái tục tương ứng: OM6976/Jasmine85//OM6976, OM6976/KDML105//OM6976 và OM5930/OM7347//OM5930.
  • Tại mỗi thế hệ từ BC1F1 đến BC4F1, kỹ thuật MAS được áp dụng: sàng lọc chỉ thị Wx để giữ lại các cá thể mang alen dị hợp tử (Wx/wx), đồng thời sàng lọc 4 chỉ thị SSR (RM240, RM162, RM256, RM257) để chọn lọc cá thể mang các alen đồng hợp tử quy định năng suất của cây mẹ.
  • Kết quả ở thế hệ BC4F1 đã chọn lọc được:
    • Tổ hợp OM6976/Jasmine85//OM6976: chọn được 10 cá thể.
    • Tổ hợp OM6976/KDML105//OM6976: chọn được 2 cá thể.
    • Tổ hợp OM5930/OM7347//OM5930: chọn được 1 cá thể. Tất cả các cá thể này đều mang gen waxy ở trạng thái dị hợp tử và mang 4 gen tái tổ hợp năng suất ở trạng thái đồng hợp tử giống mẹ.

4. Chọn lọc các quần thể hồi giao BC4F2 thông qua lập bản đồ GGT:

  • Cho các cá thể BC4F1 ưu tú tự thụ phấn để tạo quần thể BC4F2 nhằm phân ly và cố định alen lặn wx ở trạng thái đồng hợp tử (wxwx).
  • Kiểm tra kiểu gen của các cá thể BC4F2 trên toàn bộ 12 nhiễm sắc thể bằng 27 chỉ thị phân tử SSR đa hình giữa bố và mẹ.
  • Phân tích bản đồ GGT 2.0 xác định được các dòng mang gen waxy đồng hợp tử lặn và đạt 100% kiểu gen đồng hợp tử của giống nhận trên toàn bộ 12 nhiễm sắc thể:
    • Tổ hợp OM6976/Jasmine85//OM6976: chọn được 4 dòng gồm BC4F2-1, BC4F2-3, BC4F2-20 và BC4F2-25.
    • Tổ hợp OM6976/KDML105//OM6976: chọn được 1 dòng là BC4F2-44.
    • Tổ hợp OM5930/OM7347//OM5930: chọn được 2 dòng gồm BC4F2-16 và BC4F2-40.

5. Đánh giá và chọn lọc dòng ưu tú ở thế hệ BC4F3 trên đồng ruộng:

  • Các dòng chọn lọc ở thế hệ BC4F2 tiếp tục được gieo trồng và đánh giá kiểu hình trên đồng ruộng trong vụ Đông Xuân 2016-2017 tại Viện Lúa ĐBSCL.
  • Kiểm tra phẩm chất hạt (hàm lượng amylose, độ trở hồ, độ bền gel) kết hợp đo đếm năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất.
  • Kết quả đã tuyển chọn được 8 dòng lúa triển vọng nhất: D75, D131, D142, D150, D296, D233, D230 và D397. Các dòng này đạt hàm lượng amylose thấp (~20%), phẩm chất cơm dẻo, mềm và năng suất thực tế đạt xấp xỉ 7,0 tấn/ha trong vụ Đông Xuân.

Bảng tổng hợp tiến trình chọn lọc kiểu gen qua các thế hệ từ BC4F1 đến BC4F3:

Tổ hợp lai hồi giao Số cá thể chọn ở BC4F1 (Wx dị hợp + 4 gen mẹ đồng hợp) Các dòng chọn ở BC4F2 (Mang gen Wx đồng hợp + 100% nền gen mẹ trên 12 NST) Các dòng lúa triển vọng được chọn ở BC4F3 (AC ~20%, Năng suất ~7 tấn/ha)
OM6976/Jasmine85//OM6976 10 BC4F2-1, BC4F2-3, BC4F2-20, BC4F2-25 D75, D131, D142, D150
OM6976/KDML105//OM6976 2 BC4F2-44 D296
OM5930/OM7347//OM5930 1 BC4F2-16, BC4F2-40 D233, D230, D397

Chương 5: Kết luận và đề nghị

Chương 5 đúc kết toàn bộ các kết quả đạt được về việc hoàn thiện quy trình MABC kết hợp GGT để tạo ra 8 dòng lúa có hàm lượng amylose thấp và năng suất cao; đồng thời nêu rõ các kiến nghị tiếp tục khảo nghiệm VCU và đánh giá tính chống chịu sâu bệnh trên các vùng sinh thái của ĐBSCL.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học và lý luận

  • Đã phân tích, đánh giá có hệ thống mức độ đa dạng di truyền về kiểu hình và kiểu gen trên tập đoàn 88 giống lúa địa phương và 71 giống lúa cao sản tại ĐBSCL, làm sáng tỏ tiềm năng nguồn gen kiểm soát tính trạng phẩm chất và năng suất.
  • Xác lập cơ sở khoa học cho quy trình chọn giống hồi giao kết hợp chỉ thị phân tử (MABC) hai giai đoạn: kiểm soát đồng thời locus gen mục tiêu waxy trên nhiễm sắc thể số 6 bằng chỉ thị Wx và bảo toàn các locus quy định năng suất của cây mẹ bằng 4 chỉ thị SSR (RM240, RM162, RM256, RM257).
  • Chứng minh hiệu quả thực nghiệm của việc ứng dụng công cụ đồ họa kiểu gen GGT 2.0 ở thế hệ BC4F2 với 27 chỉ thị SSR bao phủ 12 nhiễm sắc thể, cho phép kiểm soát hoàn toàn nền di truyền của giống nhận, hạn chế tối đa hiện tượng kéo theo liên kết không mong muốn (linkage drag) từ giống cho.

Đóng góp mới về mặt thực tiễn

  • Rút ngắn chu kỳ chọn tạo dòng thuần mang gen mục tiêu so với phương pháp hồi giao truyền thống (hoàn tất việc chọn lọc và phục hồi nền gen ở thế hệ BC4F2).
  • Tạo ra 8 dòng lúa triển vọng thế hệ BC4F3 gồm D75, D131, D142, D150, D296, D233, D230 và D397 mang gen waxy đồng hợp tử, có hàm lượng amylose thấp (~20%), năng suất thực tế vụ Đông Xuân đạt xấp xỉ 7,0 tấn/ha.
  • Bổ sung nguồn vật liệu di truyền quý mang các đặc tính phẩm chất tốt và năng suất cao cho chương trình chọn tạo giống lúa phục vụ nhu cầu tiêu thụ nội địa và xuất khẩu tại ĐBSCL.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất của tác giả

  • Tiếp tục duy trì, nhân dòng và theo dõi tính ổn định kiểu hình của 8 dòng lúa triển vọng (D75, D131, D142, D150, D296, D233, D230, D397) qua các thế hệ tiếp theo.
  • Đưa các dòng lúa ưu tú vào mạng lưới khảo nghiệm diện rộng VCU (giá trị canh tác và giá trị sử dụng) tại các tiểu vùng sinh thái khác nhau của ĐBSCL trong cả vụ Đông Xuân và vụ Hè Thu.
  • Đánh giá bổ sung phản ứng của các dòng lúa chọn tạo đối với các áp lực sinh học chính trong vùng như bệnh đạo ôn, bệnh cháy bìa lá vi khuẩn và rầy nâu, cũng như các tính trạng chịu mặn, chịu phèn.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của luận án

  • Khảo nghiệm đồng ruộng đối với thế hệ BC4F3 mới được tiến hành tập trung tại Ruộng thí nghiệm của Viện Lúa ĐBSCL trong vụ Đông Xuân 2016-2017; chưa có số liệu khảo nghiệm nhiều vụ liên tiếp trên diện rộng ngoài sản xuất thực tế.
  • Các tính trạng chất lượng hạt mới tập trung chủ yếu vào chỉ tiêu hàm lượng amylose, độ trở hồ và độ bền gel; chưa đánh giá chuyên sâu về hàm lượng vi chất dinh dưỡng, tính chất lưu biến của tinh bột và hàm lượng protein tổng số.
  • Nghiên cứu chưa tích hợp các chỉ thị phân tử giám sát đồng thời các gen kháng sâu bệnh quan trọng (như rầy nâu, đạo ôn) trong cùng một chu trình chọn lọc.

Hướng nghiên cứu tiếp

  • Mở rộng khảo nghiệm đa điểm và đa vụ tại các vùng sinh thái đặc thù của ĐBSCL (vùng phù sa ngọt ven sông Tiền, sông Hậu; vùng đất phèn Đồng Tháp Mười, Tứ giác Long Xuyên; vùng đất nhiễm mặn ven biển Bán đảo Cà Mau).
  • Ứng dụng kỹ thuật quy tụ gen (gene pyramiding) nhờ chỉ thị phân tử để tích hợp thêm các gen mùi thơm (fgr) và gen kháng sâu bệnh (Xa21, Pib, Bph) vào nền các dòng lúa D75, D131, D142, D150, D296, D233, D230 và D397.
  • Hoàn thiện hồ sơ khảo nghiệm VCU để đăng ký công nhận giống lúa mới theo quy định quản lý giống cây trồng hiện hành.

Giá trị tham khảo

Nhóm đối tượng thụ hưởng và ứng dụng

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Công nghệ sinh học, Di truyền và Chọn giống cây trồng: Luận án là tài liệu tham khảo chi tiết về quy trình kỹ thuật lai hồi giao MABC, từ thiết kế thí nghiệm, kỹ thuật tách chiết ADN, tối ưu hóa PCR-SSR, điện di gel polyacrylamide và agarose, đến phương pháp vận dụng phần mềm NTSYSpc và GGT 2.0 trong xử lý dữ liệu di truyền học.
  • Giảng viên và cán bộ nghiên cứu tại các trường đại học, viện nghiên cứu nông nghiệp: Tài liệu cung cấp minh chứng thực nghiệm về việc phối hợp giữa phương pháp chọn giống kiểu hình truyền thống và công nghệ sinh học phân tử để nâng cao hiệu quả chọn lọc các tính trạng số lượng phức tạp.
  • Nhà chọn giống tại các trung tâm giống và doanh nghiệp giống cây trồng: Cung cấp nguồn vật liệu bố mẹ đã được định danh kiểu gen rõ ràng (OM7347, KDML105, Jasmine85, OM6976, OM5930) và các dòng lúa thuần BC4F3 có phẩm chất hạt gạo mềm dẻo kết hợp năng suất cao.

Các hợp phần giá trị nhất trong văn bản

  • Bảng trình tự mồi và thông số kích thước phân đoạn của 5 chỉ thị phân tử Wx, RM240, RM162, RM256, RM257 (Bảng 3.1).
  • Quy trình ly trích ADN bằng dung dịch đệm SDS/CTAB và thành phần đệm TE (Bảng 3.2).
  • Phương pháp phối hợp giữa chỉ thị phân tử Wx (kiểm soát gen đích) và 4 chỉ thị SSR liên kết năng suất mẹ trong chọn lọc con lai từ F1 đến BC4F1 (Chương 3 và Chương 4).
  • Phương pháp sử dụng bản đồ đồ họa kiểu gen GGT 2.0 trên 12 nhiễm sắc thể ở thế hệ BC4F2 để sàng lọc cá thể đồng hợp tử hoàn toàn về nền gen nhận (Mục 4.4).

Câu hỏi thường gặp

1. Cơ sở phân tử nào quyết định việc chọn gen waxy để hạ thấp hàm lượng amylose trong hạt gạo?

Gen waxy nằm trên nhiễm sắc thể số 6 mã hóa enzyme Granule-bound Starch Synthase I (GBSSI), là enzyme then chốt chịu trách nhiệm kéo dài chuỗi phân tử amylose trong nội nhũ lúa. Các nghiên cứu di truyền chứng minh tính trạng hàm lượng amylose cao chịu sự kiểm soát của alen trội $Wx^a$, trong khi hàm lượng amylose thấp và trung bình liên quan đến đột biến thay thế nucleotide G thành T tại vị trí cắt nối intron 1 (alen $Wx^b$) làm giảm hàm lượng mRNA thành thục và enzyme GBSSI. Việc định vị và chọn lọc các cá thể mang alen lặn của gen waxy ở trạng thái đồng hợp tử cho phép cố định tính trạng hàm lượng amylose thấp (≤20%), bảo đảm hạt cơm mềm, dẻo và không bị khô cứng khi nguội.

2. Các giống lúa nào được tác giả lựa chọn làm bố (cho gen) và làm mẹ (nhận gen) trong các tổ hợp lai?

Qua sàng lọc kiểu hình và kiểu gen từ 88 giống địa phương và 71 giống cao sản:

  • Giống bố cho gen (donor mang tính trạng amylose thấp): Jasmine85, Khao Dawk Mali 105 (KDML105) và OM7347.
  • Giống mẹ nhận gen (recipient có năng suất cao nhưng hàm lượng amylose cao): OM6976, OM5930 và OM6073. Từ kết quả phân tích hệ số di truyền ($h^2_{BS}$) và hiệu quả chọn lọc (GA) ở thế hệ F2, 3 tổ hợp lai có triển vọng nhất được chọn để thực hiện hồi giao là OM6976/Jasmine85, OM6976/KDML105 và OM5930/OM7347.

3. Quy trình chọn lọc bằng chỉ thị phân tử (MAS) từ thế hệ BC1F1 đến BC4F1 được thực hiện như thế nào?

Tại mỗi chu kỳ lai hồi giao với cây mẹ tái tục, tác giả áp dụng quy trình chọn lọc hai bước:

  • Bước 1 (Chọn gen đích): Dùng chỉ thị phân tử Wx (kích thước 210-220 bp) trên nhiễm sắc thể số 6 để phát hiện và giữ lại các cá thể mang gen waxy ở trạng thái dị hợp tử (Wx/wx).
  • Bước 2 (Chọn gen tái tổ hợp/nền mẹ): Dùng 4 chỉ thị SSR gồm RM240 (NST 2), RM162 (NST 6), RM256 (NST 8) và RM257 (NST 9) liên kết với các gen quy định năng suất của cây mẹ để chọn các cá thể mang alen đồng hợp tử giống mẹ. Đến thế hệ BC4F1, quy trình đã chọn được 10 cá thể ở tổ hợp OM6976/Jasmine85//OM6976, 2 cá thể ở tổ hợp OM6976/KDML105//OM6976 và 1 cá thể ở tổ hợp OM5930/OM7347//OM5930 thỏa mãn đồng thời cả hai tiêu chuẩn trên.

4. Bản đồ đồ họa kiểu gen GGT 2.0 có vai trò gì ở thế hệ BC4F2 và kết quả đạt được ra sao?

Bản đồ GGT 2.0 được sử dụng để khảo sát toàn diện 12 nhiễm sắc thể của các cá thể BC4F2 bằng 27 chỉ thị SSR đa hình nhằm đánh giá tỷ lệ phục hồi hệ gen mẹ và loại trừ các đoạn nhiễm sắc thể mang gen liên kết bất lợi từ giống cho. Kết quả phân tích GGT đã tuyển chọn được 7 dòng mang gen waxy đồng hợp tử lặn (wxwx) và đạt 100% kiểu gen đồng hợp tử của giống mẹ trên toàn bộ 12 nhiễm sắc thể, bao gồm: 4 dòng thuộc tổ hợp OM6976/Jasmine85//OM6976 (BC4F2-1, BC4F2-3, BC4F2-20, BC4F2-25), 1 dòng thuộc tổ hợp OM6976/KDML105//OM6976 (BC4F2-44), và 2 dòng thuộc tổ hợp OM5930/OM7347//OM5930 (BC4F2-16, BC4F2-40).

5. Những dòng lúa ưu tú nhất được ghi nhận ở thế hệ BC4F3 có đặc điểm kiểu hình như thế nào?

Ở thế hệ BC4F3, khảo nghiệm trên đồng ruộng vụ Đông Xuân 2016-2017 đã xác định 8 dòng lúa ưu tú nhất gồm D75, D131, D142, D150, D296, D233, D230 và D397. Các dòng này mang các đặc tính nông học ổn định: thời gian sinh trưởng ngắn ngày phù hợp cơ cấu mùa vụ ĐBSCL, hàm lượng amylose đạt mức thấp (~20%), cơm mềm dẻo, nhiệt trở hồ và độ bền gel đạt tiêu chuẩn gạo phẩm chất cao, đồng thời năng suất thực tế đạt xấp xỉ 7,0 tấn/ha.

Kết luận

Luận án của nghiên cứu sinh Hồ Văn Được đã giải quyết thành công mục tiêu tích hợp tính trạng hàm lượng amylose thấp (≤20%) vào các giống lúa cao sản chủ lực thông qua phương pháp lai hồi giao có sự hỗ trợ của chỉ thị phân tử (MABC). Bằng cách kết hợp chỉ thị Wx kiểm soát gen mục tiêu trên nhiễm sắc thể số 6, hệ thống 4 chỉ thị SSR giám sát các gen liên quan năng suất và phân tích bản đồ đồ họa kiểu gen GGT trên 12 nhiễm sắc thể, nghiên cứu đã rút ngắn thời gian chọn giống và cố định thành công kiểu gen mong muốn ở thế hệ BC4F2. Kết quả thực nghiệm tại thế hệ BC4F3 đã tạo ra 8 dòng lúa triển vọng (D75, D131, D142, D150, D296, D233, D230 và D397) vừa bảo đảm phẩm chất cơm mềm dẻo vừa đạt năng suất cao (~7,0 tấn/ha vụ Đông Xuân), đóng góp nguồn vật liệu chọn giống có giá trị cho vùng Đồng bằng sông Cửu Long.