Luận án tiến sỹ: Nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan từ rong nâu Việt Nam

Luận án tiến sĩ hóa học phân tích hóa học nghiên cứu đặc điểm cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan từ một số loài rong nâu, xây dựng cơ sở lý luận, kiểm chứng thực nghiệm,

• Tác giả: Bùi Văn Nguyên
• Người hướng dẫn: PGS. Bùi Minh Lý
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Hóa học các hợp chất thiên nhiên
• Đề tài: Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan từ một số loài rong nâu Việt Nam
• Loại tài liệu: Luận án tiến sỹ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan về rong nâu
• 1.1.1. Giới thiệu về rong biển
• 1.1.2. Giới thiệu về Rong Nâu
• 1.1.3. Phân loại và phân bố rong nâu trên thế giới
• 1.1.4. Phân loại và phân bố rong nâu ở Việt Nam
• 1.1.5. Thành phần hóa học của rong Nâu
• 1.1.5.1. Hợp chất phenolic
• 1.1.5.2. Hợp chất carotenoid
• 1.1.5.3. Hợp chất Terpenoid
• 1.1.5.4. Các hợp chất khác
• 1.2. Tổng quan về Sulfated polysaccharide (Fucoidan)
• 1.2.1. Giới thiệu chung về Fucoidan
• 1.2.2. Thành phần hóa học của fucoidan trong một số loài rong nâu
• 1.2.3. Cấu trúc hóa học của fucoidan
• 1.2.4. Tính chất hóa lý của fucoidan
• 1.2.5. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của fucoidan
• 1.2.5.1. Hoạt tính chống đông tụ máu và chống huyết khối
• 1.2.5.2. Hoạt tính chống virus
• 1.2.5.3. Hoạt tính kháng u và điều hòa miễn dịch
• 1.2.5.4. Hoạt tính chống oxy hóa
• 1.2.5.5. Kháng viêm
• 1.2.5.6. Chống lại các bệnh về gan
• 1.2.5.7. Hoạt tính kháng khuẩn
• 1.2.5.8. Tác dụng giảm lượng đường huyết trong máu
• 1.2.5.9. Các ứng dụng của fucoidan
• 1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam liên quan đến nội dung nghiên cứu của luận án
• 1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
• 1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Phương pháp chiết tách và phân đoạn fucoidan
• 2.2.1.1. Phương pháp tách chiết fucoidan
• 2.2.1.2. Phương pháp phân đoạn fucoidan
• 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu cấu trúc của fucoidan
• 2.2.2.1. Phương pháp phân tích liên kết bằng methyl hóa
• 2.2.2.2. Phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (GPC)
• 2.2.2.3. Phương pháp phổ IR
• 2.2.2.4. Phương pháp phổ NMR
• 2.2.2.5. Phương pháp phổ MS
• 2.2.2.6. Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS)
• 2.2.3. Phương pháp thử hoạt tính sinh học
• 2.2.3.1. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào in vitro
• 2.2.3.2. Phương pháp đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của khối tế bào ung thư trên thạch mềm
• 2.2.3.3. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính chống đông tụ máu
• 2.3. Thu thập và xử lý rong
• 2.4. Chiết tách và phân lập fucoidan từ rong nâu
• 2.5. Xác định thành phần và cấu trúc của fucoidan
• 2.5.1. Xác định hàm lượng tổng carbohydrate
• 2.5.2. Xác định thành phần monosaccharide
• 2.5.3. Xác định hàm lượng sulfate
• 2.5.4. Phương pháp khử sulfate
• 2.5.5. Xác định hàm lượng axít uronic
• 2.5.6. Phân tích liên kết bằng methyl hóa
• 2.5.7. Thủy phân tạo oligosaccharide
• 2.5.8. Sắc ký thẩm thấu gel (GPC)
• 2.5.9. Phổ ESI-MS/MS
• 2.5.10. Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS)
• 2.6. Đánh giá hoạt tính sinh học
• 2.6.1. Hoạt tính gây độc tế bào
• 2.6.2. Thử nghiệm hoạt tính ức chế hình thành khối u ba chiều trên thạch mềm
• 2.6.3. Thử nghiệm hoạt tính chống đông tụ máu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Nghiên cứu lựa chọn phương pháp chiết tách fucoidan
• 3.2. Hàm lượng fucoidan và một số polysaccharide tan trong nước của 06 loài rong nâu sinh trưởng ở biển Nha Trang, thành phần hóa học của các fucoidan thu được
• 3.3. Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc của các fucoidan từ hai loài rong nâu S.
• 3.3.1. Nội dung và kết quả nghiên cứu loài Sargassum binderi
• 3.3.2. Nội dung và kết quả nghiên cứu loài Sargassum duplicatum
• 3.4. Nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan phân lập từ rong nâu Sargassum aquifolium
• 3.4.1. Chiết xuất và làm sạch fucoidan
• 3.4.2. Xác định cấu trúc của fucoidan
• 3.4.2.1. Tách loại các nhóm sulfat (Desulfation)
• 3.4.2.2. Phổ NMR của FSA và các phân đoạn sắc ký anion của FSA
• 3.4.2.3. Phân tích liên kết bằng methyl hóa (Methylation analysis)
• 3.4.2.4. Tách 1,0M-deS trên cột sắc ký trao đổi anion. Các đặc điểm cấu trúc của deS-2 và deS-3
• 3.4.2.5. Các đặc điểm cấu trúc của deS-4
• 3.4.2.6. Các đặc điểm cấu trúc của deS-6
• 3.4.2.7. Các đặc điểm cấu trúc của deS-5
• 3.4.3. Nghiên cứu một số đặc điểm cấu trúc của phân đoạn FSA-1,5M bằng phương pháp phân tích methyl hóa kết hợp với phổ ESI-MS/MS
• 3.4.4. Đánh giá hoạt tính sinh học
• 3.4.4.1. Hoạt tính gây độc tế bào
• 3.4.4.2. Hoạt tính chống khối u in vitro
• 3.4.4.3. Hoạt tính chống đông tụ máu
• 3.5. Nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính gây độc tế bào của các fucoidan phân lập từ rong nâu Turbinaria decurrens
• 3.5.1. Chiết xuất, phân đoạn và xác định thành phần của các fucoidan từ rong nâu Turbinaria decurrens
• 3.5.2. Xác định cấu trúc của FTD-2,0N phân lập từ rong nâu Turbinaria decurrens
• 3.5.3. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của FTD-2,0M
• 3.6. Nghiên cứu kích thước và hình dáng của 6 fucoidan phân lập từ rong nâu Việt Nam, phân tích liên hệ của chúng với hoạt tính gây độc tế bào
• 3.6.1. Nghiên cứu kích thước và hình dáng của các fucoidan bằng phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ
• 3.6.2. Liên hệ giữa các đặc điểm cấu trúc của các mẫu fucoidan với hoạt tính gây độc tế bào
• CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về fucoidan và rong nâu Việt Nam

Fucoidan là một sulfated polysaccharide có nguồn gốc từ rong nâu, đặc biệt là các loài thuộc chi Sargassum, Hormophysa và Turbinaria. Rong nâu Việt Nam với hơn 143 loài được xác định, là nguồn nguyên liệu quý giá cho nghiên cứu và ứng dụng trong y học, thực phẩm chức năng và công nghiệp. Fucoidan được biết đến với nhiều hoạt tính sinh học như chống đông máu, kháng virus, kháng u, điều hòa miễn dịch và chống oxy hóa. Nghiên cứu này tập trung vào việc phân tích cấu trúc fucoidan và hoạt tính sinh học của nó từ các loài rong nâu Việt Nam, nhằm khám phá tiềm năng ứng dụng trong y học và sức khỏe.

1.1. Tổng quan về rong nâu

Rong nâu là một trong ba nhóm rong biển chính, cùng với rong lục và rong đỏ. Chúng phân bố rộng rãi ở vùng biển nhiệt đới và cận nhiệt đới, trong đó Việt Nam là một trong những quốc gia có nguồn rong nâu đa dạng nhất. Rong nâu không chỉ là nguồn thực phẩm giàu dinh dưỡng mà còn là nguyên liệu quan trọng để chiết xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học cao như fucoidan, alginate và phlorotannin.

1.2. Giới thiệu về fucoidan

Fucoidan là một sulfated polysaccharide phức tạp, chủ yếu được cấu tạo từ fucose và sulfate, cùng với các gốc đường khác như galactose, glucose và mannose. Cấu trúc đa dạng và phức tạp của fucoidan khiến nó có nhiều hoạt tính sinh học đáng chú ý, bao gồm khả năng chống đông máu, kháng virus, kháng u và điều hòa miễn dịch.

II. Cấu trúc hóa học của fucoidan

Cấu trúc fucoidan là một trong những yếu tố quyết định hoạt tính sinh học của nó. Fucoidan thường có cấu trúc phân nhánh, với các gốc fucose liên kết với nhau thông qua các liên kết glycoside. Các nhóm sulfate được gắn vào các vị trí khác nhau trên mạch polymer, tạo nên sự đa dạng về cấu trúc và hoạt tính sinh học. Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp phân tích hiện đại như phổ NMR, phổ IR và sắc ký để xác định chính xác cấu trúc của fucoidan từ các loài rong nâu Việt Nam.

2.1. Phương pháp phân tích cấu trúc

Các phương pháp như phổ NMR, phổ IR và sắc ký được sử dụng để phân tích cấu trúc fucoidan. Phổ NMR giúp xác định các liên kết glycoside và vị trí của các nhóm sulfate, trong khi phổ IR cung cấp thông tin về các nhóm chức hóa học. Sắc ký được sử dụng để tách và phân tích các phân đoạn khác nhau của fucoidan.

2.2. Kết quả phân tích cấu trúc

Kết quả phân tích cho thấy fucoidan từ các loài rong nâu Việt Nam có cấu trúc phức tạp với nhiều nhánh và các nhóm sulfate được gắn ở các vị trí khác nhau. Sự đa dạng này giải thích cho các hoạt tính sinh học đa dạng của fucoidan, bao gồm khả năng chống đông máu và kháng u.

III. Hoạt tính sinh học của fucoidan

Hoạt tính sinh học của fucoidan được nghiên cứu thông qua các thử nghiệm in vitro và in vivo. Các kết quả cho thấy fucoidan có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư, chống đông máu và điều hòa miễn dịch. Nghiên cứu này cũng khám phá mối quan hệ giữa cấu trúc fucoidan và hoạt tính sinh học của nó, nhằm tối ưu hóa ứng dụng trong y học.

3.1. Hoạt tính chống ung thư

Fucoidan được chứng minh có khả năng ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư, đặc biệt là ung thư gan và ung thư phổi. Cơ chế tác động của fucoidan bao gồm việc kích hoạt quá trình apoptosis và ức chế sự hình thành mạch máu nuôi khối u.

3.2. Hoạt tính chống đông máu

Fucoidan có khả năng chống đông máu thông qua việc ức chế quá trình đông tụ máu. Điều này làm cho fucoidan trở thành một ứng cử viên tiềm năng trong điều trị các bệnh liên quan đến huyết khối.

IV. Ứng dụng của fucoidan trong y học và sức khỏe

Fucoidan đã được ứng dụng rộng rãi trong y học và sức khỏe, từ việc hỗ trợ điều trị ung thư đến cải thiện hệ miễn dịch. Nghiên cứu này nhấn mạnh tiềm năng của fucoidan trong việc phát triển các sản phẩm dược phẩm và thực phẩm chức năng, đặc biệt là từ nguồn rong nâu Việt Nam.

4.1. Ứng dụng trong điều trị ung thư

Fucoidan được sử dụng như một liệu pháp bổ trợ trong điều trị ung thư, nhờ vào khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư và tăng cường hệ miễn dịch. Các sản phẩm từ fucoidan đang được phát triển để hỗ trợ bệnh nhân ung thư trong quá trình điều trị.

4.2. Ứng dụng trong tăng cường miễn dịch

Fucoidan có khả năng điều hòa hệ miễn dịch, giúp cơ thể chống lại các bệnh nhiễm trùng và bệnh tự miễn. Các sản phẩm từ fucoidan được sử dụng để tăng cường sức đề kháng và cải thiện sức khỏe tổng thể.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Tài nguyên rong biển Việt Nam có độ đa dạng sinh học cao với bờ biển dài hơn 3.260 km, trong đó ngành rong nâu (Phaeophyta) được ghi nhận có khoảng 143 loài sở hữu kích thước cá thể và sinh khối tự nhiên rất lớn. Rong nâu là nguồn nguyên liệu tự nhiên giàu các hợp chất có hoạt tính sinh học, đặc biệt là các polysaccharide như alginate, laminaran và fucoidan. Fucoidan là một sulfated polysaccharide dị thể có cấu trúc hóa học phức tạp, tạo thành từ fucose, nhóm sulfate cùng các gốc monosaccharide khác như galactose, mannose, xylose, glucose và acid uronic. Hợp chất này thể hiện nhiều hoạt tính sinh học quý như chống đông tụ máu, kháng huyết khối, kháng khuẩn, ức chế virus (bao gồm HIV), chống oxy hóa, điều hòa miễn dịch và kháng u.

Tuy nhiên, phần lớn các công bố khoa học trước đây chủ yếu dừng lại ở việc thử nghiệm hoạt tính trên các mẫu fucoidan thô hoặc các phân đoạn chưa được làm sạch triệt để. Mối quan hệ giữa cấu trúc hóa học tinh vi (kiểu liên kết glycoside, phân nhánh, vị trí sulfate hóa, thành phần đường đơn, hình thái không gian chuỗi phân tử) và hoạt tính sinh học của fucoidan vẫn chưa được làm sáng tỏ đầy đủ. Do đó, luận án tiến sĩ hóa học của tác giả Bùi Văn Nguyên với đề tài "Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan từ một số loài rong nâu Việt Nam" được thực hiện nhằm giải quyết khoảng trống nghiên cứu này.

Mục tiêu tổng quát của luận án là nghiên cứu phân lập, xác định các đặc điểm cấu trúc và thử nghiệm hoạt tính sinh học của các fucoidan từ một số loài rong nâu sinh trưởng ở vùng biển Việt Nam, phục vụ việc điều tra tài nguyên hợp chất thiên nhiên biển và làm rõ bản chất hóa học của đối tượng nghiên cứu. Để thực hiện mục tiêu trên, luận án tập trung vào 3 nội dung chính:

1. Nghiên cứu sàng lọc một số loài rong nâu để chọn ra các đối tượng nghiên cứu sâu về cấu trúc cũng như hoạt tính sinh học của các fucoidan.
2. Nghiên cứu sâu về cấu trúc cũng như hoạt tính sinh học của các fucoidan chiết xuất từ một số loài rong nâu chọn lọc.
3. Khảo sát mối quan hệ giữa các đặc điểm cấu trúc và hoạt tính sinh học của một số fucoidan chọn lọc.

Đối tượng nghiên cứu của luận án là các loài rong nâu thuộc hai chi phổ biến là Sargassum và Turbinaria, thu thập chủ yếu tại khu vực ven biển tỉnh Khánh Hòa (vịnh Nha Trang, vịnh Vân Phong, vịnh Cam Ranh, Đầm Nha Phu), bao gồm: Sargassum aquifolium, Turbinaria decurrens, Sargassum binderi, Sargassum duplicatum, Sargassum polycystum, Sargassum mcclurei, Sargassum oligocystum, Sargassum denticarpum, Sargassum swartzii và Turbinaria ornata. Luận án được hoàn thành và bảo vệ năm 2018 tại Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu của luận án đã hệ thống hóa lịch sử phân loại học rong nâu, thành phần hóa học thực vật biển và các công trình nghiên cứu fucoidan trên thế giới cũng như tại Việt Nam:

• Lịch sử nghiên cứu phân loại và hóa học rong biển: Hệ thống phân loại chi Sargassum do J. Agardh xây dựng từ năm 1820 (62 loài) đến năm 1889 (180 loài), được Grunow mở rộng (1915–1916) lên 230 loài và Setchell (1931–1936) bổ sung các loài tại Hồng Kông. Tại Việt Nam, các công trình của TS. Lê Như Hậu, Nguyễn Văn Tú cùng các cộng sự (2013) đã thống kê 827 loài rong biển, trong đó ngành rong nâu có 180 loài.
• Khám phá và xác định cấu trúc fucoidan: Kylin (1913) lần đầu tiên phân lập fucoidan từ loài Laminaria digitata. Percival và Ross (1950) đề xuất mô hình cấu trúc fucoidan từ Fucus vesiculosus gồm mạch chính $\alpha$-L-fucose-(1$\rightarrow$2) phân nhánh ở vị trí (1$\rightarrow$3) với sulfate tại C-4. Đến năm 1993, Patankar và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật GC-EI/MS để xác định lại mạch chính thực chất là $\alpha$-L-fucose-(1$\rightarrow$3), làm rõ ảnh hưởng của phương pháp chiết và kỹ thuật phân tích lên kết quả cấu trúc.
• Nghiên cứu hoạt tính sinh học: Nishino và cộng sự (1991) đã khảo sát hoạt tính chống đông máu (APTT, TT) của fucoidan trên 9 loài rong nâu, chỉ ra rằng phân đoạn F-4 từ Laminaria longissima có hoạt tính đạt 200 đơn vị/mg (cao hơn heparin đạt 140 đơn vị/mg) và việc tăng cường sulfate hóa (oversulfation) làm tăng hoạt tính chống đông máu. Các công trình của Qiu (2006), Duarte (2001), Silva (2005), Mourão (2004) và Pereira (1999) đã chứng minh vai trò quyết định của vị trí sulfate (C-2, C-3), chiều dài mạch polymer và thành phần monosaccharide (đặc biệt là $\alpha$-L-galactan sulfate). Bên cạnh đó, các nghiên cứu của Dohura (2004) về ức chế prion, Choi (2005) về kích hoạt đại thực bào (tăng sinh TNF-$\alpha$, IL-6, NO, $\text{H}_2\text{O}_2$), Liu (2005) về ức chế gắn kết tế bào ung thư vú MDA-MB-231 với fibronectin, và Micheline (2005) về chống oxy hóa đã cung cấp cơ sở sinh học phong phú.

Vị trí của luận án: Trong khi các công trình quốc tế chủ yếu khảo sát fucoidan từ rong nâu vùng nước lạnh, luận án của Bùi Văn Nguyên tập trung vào các loài rong nâu nhiệt đới phong phú tại Khánh Hòa, Việt Nam. Luận án đi sâu vào quy trình phân đoạn sắc ký tinh vi, giải mã cấu trúc phân tử bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều (NMR 1D/2D), phổ khối ESI-MS/MS, kết hợp ứng dụng kỹ thuật tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) để đánh giá hình thái chuỗi polymer trong dung dịch và liên hệ trực tiếp với hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro (Hep-G2, RD, LU-1) và hoạt tính chống đông máu (APTT).

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án kết hợp đồng bộ các phương pháp hóa học phân tích, hóa học cấu trúc carbohydrate, vật lý chất rắn và sinh học thực nghiệm:

Nhóm phương pháp	Kỹ thuật / Công cụ sử dụng	Mục đích phân tích
Chiết tách và phân đoạn	Chiết nước nóng/axit loãng (tham khảo Patent WO 2005/014657); kết tủa cồn; tạo phức Cetavlon; sắc ký trao đổi anion (DEAE-Cellulose, DEAE-Sephacel) với dung dịch rửa giải NaCl (từ 0,5M đến 2,0M).	Tách triệt để polysaccharide, loại bỏ tạp chất alginate/protein/polyphenol và thu các phân đoạn fucoidan đồng nhất.
Phân tích thành phần hóa học	Đo quang so màu (Carbazole/$\text{H}_2\text{SO}_4$ định lượng acid uronic; Phenol/$\text{H}_2\text{SO}_4$ định lượng carbohydrate tổng số); Phương pháp đo độ đục $\text{BaCl}_2$/gelatin xác định sulfate; Thủy phân acid kết hợp dẫn xuất hóa alditol acetate đo trên GC-FID và GC-MS.	Xác định hàm lượng tổng đường, tỷ lệ gốc sulfate và tỷ lệ các monosaccharide (Fuc, Gal, Man, Xyl, Glc, GlcA).
Nghiên cứu cấu trúc hóa học	Phổ hồng ngoại (IR); Khử sulfate hóa (Desulfation); Methyl hóa (Ciucanu-Kerek) tạo dẫn xuất PMAA phân tích bằng GC-MS; Sắc ký lọc gel (GPC) xác định phân bố trọng lượng phân tử ($M_w$); Phổ NMR 1D và 2D ($^1\text{H}$, $^{13}\text{C}$, COSY, TOCSY, NOESY, HSQC, HMBC); Phổ khối lượng phân giải cao ion hóa phun mù điện tử (ESI-MS và ESI-MS/MS).	Giải mã liên kết glycoside, trật tự liên kết các gốc đường, vị trí nhóm thế sulfate và xác định cấu trúc các đoạn nhánh oligosaccharide.
Nghiên cứu hình thái không gian	Tán xạ tia X góc nhỏ (Small-angle X-ray Scattering - SAXS); Đồ thị Kratky; Đồ thị Guinier của mặt cắt ngang ($R_{gc}$) đo trong nước và trong dung dịch $\text{NaCl 0,5M}$.	Đánh giá độ cứng, độ uốn dẻo của mạch polymer và xác định bán kính hồi chuyển mặt cắt ngang ($R_{gc}$) của chuỗi fucoidan trong dung dịch.
Đánh giá hoạt tính sinh học	Thử nghiệm gây độc tế bào in vitro (phương pháp MTT/vi đĩa trên dòng tế bào ung thư gan Hep-G2, ung thư mô liên kết RD, ung thư phổi LU-1); Thử nghiệm ức chế tạo khuẩn lạc 3 chiều trên thạch mềm; Đánh giá thời gian đông máu nội sinh APTT (Activated Partial Thromboplastin Time).	Xác định giá trị $\text{IC}_{50}$, tỷ lệ sống sót của tế bào khối u, khả năng ngăn chặn phát triển cụm u 3D và hoạt tính chống đông tụ máu.

Nguồn dữ liệu và mẫu vật: Toàn bộ mẫu rong nâu được thu thập tại bờ biển tỉnh Khánh Hòa, được TS. Lê Như Hậu (Viện Nghiên cứu Ứng dụng và Công nghệ Nha Trang) định danh khoa học; các phân tích SAXS và phổ khối được phối hợp triển khai cùng các nhóm nghiên cứu quốc tế từ Liên Bang Nga (VAST.13-14, GS. Usov) và Nhật Bản (VAST.13-15, PGS. Yoshiaki Yuguchi).

Nội dung chính theo từng chương

Nghiên cứu lựa chọn phương pháp chiết tách và thành phần polysaccharide từ 06 loài rong nâu Nha Trang

Tác giả đã tiến hành khảo sát, so sánh các quy trình chiết xuất fucoidan từ rong nâu và lựa chọn quy trình chiết tối ưu dựa trên việc xử lý nguyên liệu bằng dung môi hữu cơ để loại bỏ sắc tố, lipid và polyphenol, sau đó chiết bằng nước nóng hoặc acid loãng, loại bỏ alginate bằng muối canxi ($\text{CaCl}_2$), kết tủa phân đoạn bằng ethanol và tinh chế qua Cetavlon.

Khảo sát trên 06 loài rong nâu thu hái tại vịnh Nha Trang cho thấy hàm lượng polysaccharide tan trong nước và hiệu suất fucoidan biến động theo loài:

Loài rong nâu	Ký hiệu mẫu	Hàm lượng Polysaccharide tan (% rong khô)	Thành phần chính của Fucoidan phân lập
Sargassum polycystum	Fsp	Có sự khác biệt theo loài	Giàu Fucose, Galactose, nhóm Sulfate
Sargassum mcclurei	Fsm	Có sự khác biệt theo loài	Chứa Fucose, Galactose, Xylose, Manose, $\text{SO}_4^{2-}$
Sargassum oligocystum	Fso	Có sự khác biệt theo loài	Tỷ lệ Sulfate/đường thay đổi theo phân đoạn
Sargassum denticarpum	Fsd	Có sự khác biệt theo loài	Dị thể polysaccharide sulfat hóa
Sargassum swartzii	Fsw	Có sự khác biệt theo loài	Thành phần đường đơn phong phú
Turbinaria ornata	Fto	Có sự khác biệt theo loài	Khung galactofucan sulfate phân nhánh

Đặc điểm cấu trúc fucoidan từ hai loài rong nâu Sargassum binderi và Sargassum duplicatum

Phân tích fucoidan phân lập từ loài Sargassum binderi bằng sắc ký trao đổi anion DEAE-Cellulose cho thấy sự phân tách thành các phân đoạn có thành phần hóa học khác nhau. Phổ $^{13}\text{C}$-NMR của phân đoạn F2 từ S. binderi khẳng định sự có mặt của các gốc fucopyranose sulfate hóa với tín hiệu đặc trưng của carbon dị đầu ($C_1$) và nhóm methyl ($C_6$).

Đối với loài Sargassum duplicatum, mẫu fucoidan sạch (FSDu) được phân tích qua phổ hồng ngoại (IR) và phổ $^1\text{H}$-NMR. Phổ IR thể hiện rõ các dải hấp thụ đặc trưng cho dao động kéo dãn của nhóm hydroxyl ($\text{O-H}$), dao động bất đối xứng $\text{S=O}$ của nhóm sulfate tại vùng $\sim 1240\text{ cm}^{-1}$ và liên kết $\text{C-O-S}$ tại vùng $\sim 840\text{ cm}^{-1}$. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân $^1\text{H}$-NMR ghi nhận các tín hiệu proton vùng đường anomer ($\delta\text{ 5,0–5,6 ppm}$) và tín hiệu proton nhóm methyl của fucose ($\delta\text{ 1,1–1,4 ppm}$), chứng minh cấu trúc heteropolysaccharide phân nhánh chứa nhóm sulfate.

Cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan phân lập từ rong nâu Sargassum aquifolium

Fucoidan tổng số chiết từ rong nâu Sargassum aquifolium (FSA) được phân tách trên cột sắc ký trao đổi anion DEAE-Sephacel bằng cách rửa giải gradient dung dịch $\text{NaCl}$ (từ $1,0\text{M}$; $1,5\text{M}$ đến $2,0\text{M}$), thu được các phân đoạn tương ứng là FSA-1,0M, FSA-1,5M và FSA-2,0M:

• Phân tích chuyển hóa hóa học và phổ NMR: Mẫu FSA-1,0M được tiến hành khử sulfate hóa (desulfation), tạo sản phẩm 1,0M-deS và tiếp tục sắc ký trao đổi anion thu được 5 phân đoạn desulfat hóa tinh khiết ký hiệu từ deS-2, deS-3, deS-4, deS-5 đến deS-6. Phổ 2D-NMR ($^1\text{H}-^1\text{H}\text{ COSY}$, TOCSY, $^1\text{H}-^{13}\text{C}\text{ HSQC}$ và HMBC) đã gán đầy đủ độ dịch chuyển hóa học của từng gốc đường:
  • Phân đoạn deS-2 gồm các gốc $\alpha$-L-fucopyranose và $\beta$-D-galactopyranose liên kết qua các vị trí $(1\rightarrow 3)$ và $(1\rightarrow 4)$.
  • Phân đoạn deS-4 và deS-6 chứa chuỗi mạch fucose liên kết $(1\rightarrow 3)$ với các liên kết nhánh tại vị trí C-2 hoặc C-4.
• Phân tích methyl hóa và phổ ESI-MS/MS: Kết quả methyl hóa mẫu FSA-1,5M và mẫu 1,5M-deS kết hợp phổ ESI-MS/MS (ghi nhận các ion mảnh mang điện tích âm tại $m/z\text{ 243 } [\text{FucSO}_3]^-$, $m/z\text{ 389 } [\text{Fuc}_2\text{SO}_3]^-$ và $m/z\text{ 405 } [\text{FucGalSO}_3]^-$) đã làm sáng tỏ vị trí sulfate hóa chủ yếu nằm ở vị trí C-2 và C-4 của các gốc fucose, cũng như C-2 hoặc C-3 của các gốc galactose.

Mẫu Fucoidan thô (FSA)

• Thử nghiệm hoạt tính sinh học:
  • Hoạt tính gây độc tế bào và chống khối u: Các phân đoạn FSA thể hiện khả năng ức chế sự tăng sinh và gây độc tế bào trên dòng ung thư gan Hep-G2. Trên mô hình nuôi cấy 3 chiều trên thạch mềm, các phân đoạn làm giảm đáng kể kích thước trung bình và mật độ của các cụm khuẩn lạc tế bào Hep-G2.
  • Hoạt tính chống đông tụ máu: Thử nghiệm APTT cho thấy phân đoạn có hàm lượng sulfate cao kéo dài thời gian đông máu đáng kể so với mẫu chứng.

Cấu trúc và hoạt tính gây độc tế bào của fucoidan từ rong nâu Turbinaria decurrens

Fucoidan từ rong nâu Turbinaria decurrens (FTD) được chiết tách và làm sạch thành phân đoạn FTD-2,0N (hoặc FTD-2,0M):

• Phổ IR của FTD-2,0N thể hiện các đỉnh hấp thụ mạnh của nhóm sulfate. Phổ $^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR kết hợp phổ tương tác dị hạt nhân HSQC và HMBC chỉ ra rằng FTD-2,0N là một galactofucan sulfate với khung mạch chính là các gốc $\alpha$-L-fucopyranose liên kết $(1\rightarrow 3)$ và $(1\rightarrow 4)$, đan xen các nhánh chứa gốc D-galactopyranose.
• Phổ ESI-MS/MS ghi nhận các ion mảnh đặc trưng ở $m/z\text{ 243}$ và $m/z\text{ 405}$, cho phép thiết lập sơ đồ phân mảnh và khẳng định các nhóm sulfate gắn chọn lọc trên gốc đường.
• Thử nghiệm sinh học cho thấy FTD-2,0N có tác dụng ức chế mạnh tế bào ung thư gan Hep-G2, làm suy giảm mật độ và ức chế khả năng tạo khối tế bào trên thạch mềm.

Kích thước, hình dáng của 06 fucoidan rong nâu Việt Nam và liên hệ cấu trúc - hoạt tính

Tác giả đã ứng dụng kỹ thuật tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) để nghiên cứu cấu trúc chuỗi phân tử của 6 mẫu fucoidan (Fsp, Fsm, Fso, Fsd, Fsw, Fto) trong hai môi trường: nước nguyên chất và dung dịch $\text{NaCl 0,5M}$:

• Hình thái chuỗi polymer: Đồ thị Kratky của các mẫu trong dung dịch $\text{NaCl 0,5M}$ phản ánh dạng chuỗi polymer bán cứng (semi-rigid chain) có độ mềm dẻo nhất định khi bị che chắn điện tích bởi ion $\text{Na}^+$ và $\text{Cl}^-$. Đồ thị Guinier của mặt cắt ngang cho phép xác định chính xác bán kính hồi chuyển mặt cắt ngang ($R_{gc}$).
• Mô hình cấu trúc cho Turbinaria ornata (Fto): Tác giả so sánh đồ thị Kratky thực nghiệm của mẫu Fto với các đường cong lý thuyết tính toán từ 4 mô hình cấu trúc phân nhánh, từ đó khẳng định mô hình cấu trúc chuỗi chính với các mạch nhánh ngắn phù hợp nhất với dữ liệu tán xạ tia X.
• Tương quan cấu trúc - hoạt tính sinh học:
  • Hoạt tính gây độc tế bào ung thư gan Hep-G2 và ung thư mô liên kết RD tương quan thuận với hàm lượng sulfate và tỷ lệ sulfate/đường: mẫu có hàm lượng sulfate cao thể hiện hoạt tính độc tế bào mạnh hơn.
  • Khối lượng phân tử trung bình ($M_w$) và bán kính hồi chuyển mặt cắt ngang ($R_{gc}$) có ảnh hưởng rõ rệt đến độ linh động không gian và khả năng tiếp cận màng tế bào ung thư, định hình hoạt tính ức chế sinh trưởng tế bào khối u.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học lý luận

• Luận án đã xác định một cách hệ thống thành phần hóa học, tỷ lệ monosaccharide và hàm lượng nhóm sulfate của các fucoidan phân lập từ nhiều loài rong nâu đặc trưng của biển Việt Nam thuộc hai chi Sargassum và Turbinaria.
• Làm sáng tỏ cấu trúc chi tiết của các heteropolysaccharide sulfat hóa phức tạp từ loài Sargassum aquifolium và Turbinaria decurrens. Bằng việc kết hợp phương pháp hóa học (khử sulfate, methyl hóa) với hệ thống phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2D (COSY, TOCSY, HSQC, HMBC) và phổ khối phân giải cao ESI-MS/MS, tác giả đã xác định chính xác kiểu liên kết glycoside mạch chính, vị trí gắn nhánh và vị trí không gian của các nhóm ester sulfate.
• Là công trình đầu tiên tại Việt Nam ứng dụng kỹ thuật tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) để khảo sát kích thước, hình thái chuỗi phân tử và xác định bán kính hồi chuyển mặt cắt ngang ($R_{gc}$) của 6 mẫu fucoidan rong nâu trong dung dịch, đồng thời thiết lập mô hình cấu trúc phân nhánh không gian cho fucoidan từ Turbinaria ornata.
• Làm rõ mối quan hệ định lượng và định tính giữa đặc điểm cấu trúc hóa - lý (hàm lượng sulfate, tỷ lệ sulfate/đường, khối lượng phân tử $M_w$, bán kính $R_{gc}$) với hoạt tính gây độc tế bào ung thư (Hep-G2, RD) và hoạt tính chống đông tụ máu (APTT).

Đóng góp mới về mặt thực tiễn và giải pháp đề xuất

• Xây dựng và hoàn thiện quy trình công nghệ chiết tách, tinh chế và phân đoạn fucoidan quy mô phòng thí nghiệm từ nguồn nguyên liệu rong nâu dồi dào tại vùng biển miền Trung (Khánh Hòa), đảm bảo hiệu suất thu hồi và giữ nguyên vẹn hoạt tính sinh học của polymer.
• Cung cấp cơ sở dữ liệu khoa học về hoạt tính kháng u in vitro và chống đông máu của fucoidan rong nâu Việt Nam, định hướng tiềm năng ứng dụng các phân đoạn fucoidan tinh sạch làm nguyên liệu phát triển dược phẩm và thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị ung thư và bệnh lý tim mạch.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Văn bản luận án phản ánh một số phạm vi giới hạn thực tế:

• Mẫu rong nâu nghiên cứu chủ yếu được thu thập tại khu vực địa lý tỉnh Khánh Hòa; chưa bao quát toàn bộ các vùng sinh thái biển khác nhau dọc theo chiều dài bờ biển Việt Nam.
• Các thử nghiệm hoạt tính sinh học kháng u mới dừng lại ở quy mô in vitro trên các dòng tế bào nuôi cấy (Hep-G2, RD, LU-1) và mô hình 3 chiều trên thạch mềm; chưa thực hiện các thử nghiệm in vivo trên động vật thí nghiệm đối với các phân đoạn cấu trúc đã giải mã.

Hướng nghiên cứu tiếp được đề xuất:

• Mở rộng phạm vi thu thập mẫu rong nâu theo các mùa sinh trưởng khác nhau và tại các vùng biển phía Bắc, phía Nam nhằm đánh giá sự biến đổi hàm lượng fucoidan theo mùa và vị trí địa lý.
• Tiến hành bán tổng hợp hoặc cắt mạch có kiểm soát (thủy phân enzyme/hóa học) để tạo ra các dẫn xuất fucoidan trọng lượng phân tử thấp (LMWF) đồng nhất hơn nhằm tối ưu hóa hoạt tính sinh học.
• Triển khai các thử nghiệm dược lý in vivo trên động vật thực nghiệm để đánh giá độc tính cấp, độc tính bán trường diễn và cơ chế tác động phân tử chi tiết của fucoidan đối với hệ thống miễn dịch và quá trình ức chế khối u.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên sâu và có giá trị thực tiễn cho các nhóm đối tượng:

• Nghiên cứu sinh và học viên cao học ngành Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Hóa sinh biển, Dược liệu học: Tham khảo phương pháp luận phân lập, làm sạch polysaccharide bằng sắc ký trao đổi anion (DEAE-Sephacel) và quy trình giải mã cấu trúc phân tử đường phức tạp bằng tổ hợp 2D-NMR, methyl hóa dẫn xuất PMAA và phổ khối ESI-MS/MS.
• Nhà nghiên cứu Vật lý polyme và Hóa lý sinh vật: Tham khảo phương pháp xử lý dữ liệu tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS), cách dựng đồ thị Kratky, đồ thị Guinier xác định bán kính hồi chuyển mặt cắt ngang ($R_{gc}$) để phân tích hình thái không gian chuỗi polymer sinh học trong dung dịch.
• Doanh nghiệp dược phẩm và thực phẩm chức năng biển: Sử dụng các dữ liệu về hiệu suất chiết xuất, thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài rong nâu Khánh Hòa để xây dựng quy trình công nghệ khai thác và chế biến nguồn lợi rong biển tự nhiên thành các sản phẩm hỗ trợ sức khỏe.

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án đã nghiên cứu fucoidan từ những loài rong nâu cụ thể nào của Việt Nam?
Luận án nghiên cứu các loài rong nâu thuộc hai chi Sargassum và Turbinaria thu thập tại Khánh Hòa, bao gồm: Sargassum aquifolium, Turbinaria decurrens, Sargassum binderi, Sargassum duplicatum, cùng bộ 6 mẫu fucoidan dùng cho phân tích SAXS là Sargassum polycystum (Fsp), Sargassum mcclurei (Fsm), Sargassum oligocystum (Fso), Sargassum denticarpum (Fsd), Sargassum swartzii (Fsw) và Turbinaria ornata (Fto).

2. Phương pháp nào được sử dụng để giải mã cấu trúc fucoidan từ loài Sargassum aquifolium (FSA)?
Tác giả đã kết hợp phân đoạn sắc ký trao đổi anion DEAE-Sephacel (thu các phân đoạn 1,0M; 1,5M; 2,0M), thực hiện phản ứng khử sulfate hóa (desulfation) thu các phân đoạn deS (deS-2 đến deS-6), phân tích methyl hóa dẫn xuất PMAA bằng GC-MS, phân tích phổ khối lượng ion hóa phun mù điện tử ESI-MS/MS và đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2D bao gồm $^1\text{H}-^1\text{H}\text{ COSY}$, TOCSY, $^1\text{H}-^{13}\text{C}\text{ HSQC}$ và HMBC.

3. Kỹ thuật SAXS mang lại thông tin cấu trúc gì cho các mẫu fucoidan rong nâu?
Kỹ thuật tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) thông qua đồ thị Kratky và đồ thị Guinier của mặt cắt ngang đã xác định bản chất chuỗi polymer bán cứng (semi-rigid) của fucoidan trong dung dịch $\text{NaCl 0,5M}$, đo lường bán kính hồi chuyển mặt cắt ngang ($R_{gc}$) và xác nhận mô hình chuỗi phân nhánh không gian của mẫu fucoidan từ rong Turbinaria ornata.

4. Mối liên hệ giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan được xác định như thế nào trong luận án?
Luận án chỉ ra rằng hoạt tính gây độc tế bào ung thư (Hep-G2, RD) và hoạt tính chống đông tụ máu (APTT) tương quan thuận với hàm lượng sulfate và tỷ lệ sulfate/đường trong phân tử. Ngoài ra, khối lượng phân tử trung bình ($M_w$) và bán kính hồi chuyển mặt cắt ngang ($R_{gc}$) đóng vai trò quyết định độ linh động không gian và khả năng tương tác của fucoidan với các mục tiêu sinh học.

5. Thử nghiệm hoạt tính kháng u của fucoidan trong luận án được tiến hành trên những mô hình nào?
Hoạt tính kháng u được đánh giá qua thử nghiệm gây độc tế bào in vitro xác định giá trị $\text{IC}_{50}$ trên các dòng tế bào ung thư người gồm ung thư gan Hep-G2, ung thư mô liên kết RD, ung thư biểu mô phổi LU-1, và thử nghiệm đánh giá khả năng ức chế sự hình thành, phát triển khối tế bào 3 chiều trên môi trường thạch mềm (soft agar).

Kết luận

Luận án tiến sĩ của Bùi Văn Nguyên là công trình nghiên cứu toàn diện về thành phần hóa học, đặc điểm cấu trúc phân tử và hoạt tính sinh học của sulfated polysaccharide (fucoidan) phân lập từ các loài rong nâu phổ biến tại vùng biển Khánh Hòa, Việt Nam. Bằng việc ứng dụng đồng bộ các phương pháp hóa học hiện đại (sắc ký trao đổi anion, methyl hóa, 2D-NMR, ESI-MS/MS) kết hợp kỹ thuật tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS), luận án đã làm sáng tỏ cấu trúc chuỗi phân tử, vị trí sulfate hóa và hình thái không gian của các phân đoạn fucoidan từ Sargassum aquifolium, Turbinaria decurrens và Turbinaria ornata. Kết quả nghiên cứu đã chứng minh mối tương quan chặt chẽ giữa hàm lượng sulfate, khối lượng phân tử và bán kính hồi chuyển với hoạt tính ức chế tế bào ung thư in vitro và chống đông máu, đóng góp cơ sở khoa học quan trọng cho việc khai thác và ứng dụng nguồn tài nguyên rong biển Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Việt Nam được quốc tế công nhận là một trong những quốc gia có tính đa dạng sinh học cao nhất thế giới, với nhiều kiểu rừng, đầm lầy, sông suối, biển,… Nằm ở trung tâm Đông Nam Á, Việt Nam có tổng chiều dài bờ biển khoảng 3260 km làm ranh giới phía tây của biển Đông, với diện tích mặt nước rộng hơn 1.000 km2 là một trong những biển quan trọng nhất của thế giới, có nguồn rong biển đa dạng và phong phú. Trên thế giới có khoảng 6.000 loài rong biển đã được xác định và chia làm 03 ngành rong chính dựa trên sắc tố của chúng là rong lục (Chlorophytes), rong nâu (Pheophytes) và rong đỏ (Rhodophytes). Rong biển có vai trò quan trọng trong nguồn lợi sinh vật biển, càng ngày càng được con người khai thác, nuôi trồng và sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực thực phẩm , công nghiệp. Theo các kết quả nghiên cứu thì hiện nay Việt Nam đã phát hiện gần 1000 loài rong biển, trong đó có khoảng 143 loài rong nâu (Phaeophyta) là nhóm rong có kích thước cá thể rất lớn và dài cùng với sinh lượng lớn.

Do vậy, rong nâu được coi là nguồn nguyên liệu vô cùng quý giá của hiện tại và trong tương lai cho nông nghiệp, công nghiệp sản xuất dược liệu, thực phẩm chức năng và mỹ phẩm. Trong các ngành công nghiệp sản xuất dược liệu, rong nâu được sử dụng làm nguồn nguyên liệu chính để chiết tách các hợp chất có hoạt tính sinh học như polysaccharide bao gồm fucoidan, laminaran, alginate và hợp chất khác như phlorotannin, mannitol,… với khả năng ứng dụng hết sức rộng lớn [1,2,3,4,5,6]. Trong số các polysaccharide từ rong nâu, fucoidan là hợp chất được đặc biệt quan tâm nghiên cứu do có nhiều hoạt tính sinh học quý như chống đông tụ máu, kháng khuẩn, chống virus kể cả HIV, chống ung thư, chống nghẽn tĩnh mạch, điều biến miễn dịch, giảm lipid máu, chống oxy hóa, hạ cholesteron, các đặc tính chống bổ thể, chống lại các bệnh về gan, về đường tiết niệu, tác dụng bảo vệ dạ dày và khả năng điều trị trong phẫu thuật,… [6]. Fucoidan là sulfated polysaccharide có nguồn gốc từ rong nâu, có cấu trúc hóa học phức tạp bởi tính đa dạng của các liên kết glycoside cũng như nhiều gốc đường đơn khác nhau liên kết với nhau và khả năng phân nhánh với các vị trí nhóm sulfate cũng như các nhánh khác được sắp xếp không theo quy luật trên mạch polymer.

Thành phần cấu tạo nên fucoidan thường là 2 bao gồm chủ yếu fucose và sulfate cùng một số các gốc đường khác như galactose, glucose, manose, xylose., đôi khi còn có uronic acid [6,7]. Nhờ vào sự đa dạng cấu trúc hóa học và sở hữu nhiều hoạt tính sinh học thú vị, sulfated polysaccharide (fucoidan) đã được nghiên cứu mạnh và sâu. Việc giải thích làm sáng rõ chính xác cấu trúc hóa học của fucoidan là hết sức phức tạp, fucoidan được tách ra từ rong nâu thường là hỗn hợp của nhiều cấu trúc sulfated polysaccharide khác nhau. Fucoidan thông thường là có cấu trúc phân nhánh và chứa nhiều monosaccharide khác nhau cũng như có nhóm sulfate và axtate [7,8].

Fucoidan từ rong nâu thuộc chi Sargassum, Hormophysa và Turbinaria có cấu trúc hóa học phức tạp [9,10] nhưng lại rất hấp dẫn về hoạt tính cũng như ứng dụng của chúng và sẵn có trong tự nhiên. Mặc dù có rất nhiều công trình nghiên cứu nhằm xác định cấu trúc tinh vi của fucoidan đã được công bố, nhưng chỉ có một vài kết quả nghiên cứu phát hiện được tính quy luật trong cấu trúc của fucoidan [10,11,12] như liên kết giữa các gốc đường, sự phân nhánh, vị trí các gốc sulfate, các phân tử đường đơn khác… Cho tới nay, phần lớn các công trình nghiên cứu về hoạt tính sinh học được tiến hành trên các sản phẩm fucoidan thô. Vì vậy, mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan thực tế cho đến nay vẫn chưa được sáng tỏ [12,13,14]. Để giúp cho việc nghiên cứu cơ chế tác dụng của fucoidan lên các tế bào sinh vật và tiến tới sử dụng fucoidan để bào chế dược liệu thì việc xác định chính xác cấu trúc hóa học của fucoidan là điều quyết định đầu tiên và đang thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới.

Chính vì vậy tôi chọn tên đề tài luận án là “Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan từ một số loài rong nâu Việt Nam”. Mục tiêu nghiên cứu của luận án là: Nghiên cứu phân lập, xác định các đặc điểm cấu trúc và thử nghiệm hoạt tính sinh học của các fucoidan từ một số loài rong nâu sinh trưởng ở vùng biển Việt Nam phục vụ cho việc điều tra tài nguyên hợp chất thiên nhiên biển của Việt Nam và làm rõ bản chất hóa học của các đối tượng nghiên cứu. Để đạt được mục tiêu trên của luận án, các nội dung nghiên cứu của luận án bao gồm: 3 Nghiên cứu sàng lọc một số loài rong nâu để chọn ra các đối tượng nghiên cứu sâu về cấu trúc cũng như hoạt tính sinh học của các fucoidan Nghiên cứu sâu về cấu trúc cũng như hoạt tính sinh học của các fucoidan chiết xuất từ một số loài rong nâu chọn lọc. Khảo sát mối quan hệ giữa các đặc điểm cấu trúc và hoạt tính sinh học của một số fucoidan chọn lọc.

Tổng quan về rong nâu 1. Giới thiệu về rong biển Rong biển hay còn được gọi là tảo kích thước lớn, rong biển là thực vật bậc thấp sống tự dưỡng bằng cách quang hợp, hình thái dạng tản. Rong biển sinh trưởng phát triển nhanh, có vòng đời sinh trưởng không quá 1 năm, tốc độ tăng trọng nhanh và tạo ra sinh khối lớn [1,4]. Tổng số loài rong biển trên thế giới được báo cáo chủ yếu thuộc 3 ngành chính, có 900 loài thuộc ngành rong lục (Chlorophyta), 1500 loài thuộc ngành rong nâu (Phaeophyta) và 4000 loài thuộc ngành rong đỏ (Rhodophyta) và hiện nay đã có nhiều công trình nghiên cứu phát hiện loài mới bổ sung vào tổng số loài rong biển phân bố trên toàn thế giới.

Tổng số loài rong biển ở Việt Nam ước tính khoảng 1.000 loài, trong đó có khoảng 639 loài: 151 loài thuộc ngành rong lục (Chlorophyta), 143 loài thuộc ngành rong nâu (Phaeophyta), 269 loài thuộc ngành rong đỏ (Rhodophyta) và 76 loài thuộc ngành rong lam (Cyanophyta) [1]. Trong tất cả các loài này, 310 loài phân bố ở vùng ven biển các tỉnh phía Bắc và 484 hiện diện ở các tỉnh phía Nam, 156 loài phân bố ở cả hai vùng [15]. Đại dương cung cấp cho trái đất khoảng 200 tỷ tấn rong biển hàng năm. Các nhà khoa học cho rằng trên 90% cacbon trên trái đất được tổng hợp nhờ quang hợp, trong đó 20% có nguồn ngốc từ rong biển.

Việc sử dụng các sản phẩm từ rong biển đã trải qua thời kì lịch sử rất lâu dài. Các dấu vết khảo cổ học cho thấy, người Nhật đã dùng rong biển từ hơn 10. Trong nền văn hoá Trung Quốc cổ đại, rong biển được coi là đặc sản dùng trong các món ăn của triều đình và chỉ hoàng tộc hay khách của hoàng thân, quốc thích mới được thưởng thức. Dù rong biển được coi là món ăn đặc trưng của châu Á, nhưng trên thực tế các quốc gia có bờ biển trên thế giới như Scotland, Ireland, Newzealand, quần đảo nam Thái Bình Dương và các nước Nam Mỹ ven biển cũng đã sử dụng rong biển từ rất lâu.

Rong biển cũng được sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác, chúng là nguồn nguyên liệu tự nhiên cho công nghiệp thực phẩm (Cải biển Ulva lactuca, bột rong biển, chất tạo gel E400, E401 Alginate–Agar E406, E407, Carrageenan.), mỹ phẩm (chất tạo kết cấu và hoạt hóa), công nghiệp (Phycocolloids, hydrocolloids tạo độ sánh, gel hoặc chất ổn định), 5 thức ăn gia súc, nông nghiệp. Qua các tài liệu tham khảo trong lịch sử và trong thời gian sử dụng lâu dài, không có nguy cơ gây hại sức khỏe nào được đề cập đến. Vì vậy, ngày nay rong biển được xếp vào loại thực phẩm chức năng ngày càng được sử dụng rộng rãi trên thế giới. Hiện nay, Nhật Bản, Trung Quốc và Hàn Quốc là những nước tiêu thụ rong biển thực phẩm lớn nhất và nhu cầu của họ là cơ sở của một nghề nuôi trồng thủy sản với sản lượng hằng năm trên toàn thế giới khoảng 6 triệu tấn rong tươi, trị giá lên đến 5 tỉ USD.

Các nước và lãnh thổ cung cấp rong biển thực phẩm chính là Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc và Đài Loan. Các nước cung cấp chính rong biển cho công nghiệp là Đan Mạch, Pháp, Na Uy, Tây Ban Nha, Mỹ và Nhật [16]. Rong biển có thành phần hóa học đa dạng, các hợp chất có trong rong biển đều là những hợp chất có giá trị dinh dưỡng và dược dụng cao. Hàm lượng của các chất có trong rong biển phụ thuộc vào loài rong, điều kiện sống, sinh trưởng và phát triển của rong.

Theo kết quả phân tích ở các loài rong đã được nghiên cứu, thành phần trong rong gồm có : nước chiếm 80 – 90 %, protein chiếm khoảng 5 – 20,5% trọng lượng khô, 17 loại axít amin, trong đó có mặt tất cả các amino acid thiết yếu, hàm lượng lipid trong rong chiếm từ 0,2 – 0,6%, các loại sắc tố : sắc tố màu nâu (fucoxanhthin), các sắc tố xanthophyll khác là violaxanthin, antheraxanthin, neoxanthin, diainoxanthin và diatoxanhthin, chất khoáng, các nguyên tố đa lượng ( K, Na, Mg, S, P,…) và đặc biệt là các nguyên tố vi lượng ( Sr, Fe, Cu, Zn, Mn, Mo,…). Thành phần hóa học quan trọng của rong nâu là các glucid, chúng được chia thành 2 nhóm : monosaccharide và polysaccharide. Nhóm monosaccharide gồm các đường đơn như : mannitol, fucose, galactose, manose, xylose,….trong đó quan trọng nhất là mannitol. Mannitol thuộc nhóm đường kép của rong nâu, được phát hiện đầu tiên vào năm 1884 và nghiên cứu sâu hơn vào năm 1913.

Các nghiên cứu cho thấy hàm lượng mannitol của rong biển ở vùng biển phía Nam cao hơn phía Bắc. Hàm lượng mannitol trong rong biển thường cao vào các tháng mùa hè và có xu hướng tăng dần theo thời gian sinh trưởng của rong. Quy trình chiết tách mannitol ở quy mô phòng thí nghiệm dựa trên nguyên tắc : làm lạnh dung dịch mannitol sau khi đã được chiết bằng cồn nóng để thu được các tinh thể mannitol. Mannitol được sử dụng nhiều trong dược phẩm, trong công nghiệp để làm nguyên 6 liệu tổng hợp một số hợp chất hữu cơ, làm thuốc nổ, diêm và trong công nghiệp thực phẩm đặc biệt là trong công nghiệp bánh kẹo để sản xuất các loại bánh gato có độ ngọt cao nhưng đảm bảo độ mềm và xốp của bánh [1,2,3,4,5,6].

Nhóm polysaccharides gồm có : fucoidan, laminaran, alginate, agar và carrageenan.