Nghiên cứu đánh giá hoạt tính kháng phân bào trên dòng tế bào ung thư MCF-7 và Jurkat T từ cao chiết

Luận án tiến sĩ nghiên cứu hoạt tính kháng phân bào của cao chiết trên dòng tế bào ung thư MCF-7 và Jurkat T, mở ra hướng điều trị tiềm năng.

• Tác giả: Nguyễn Chí Dũng
• Người hướng dẫn: PGS. Ngô Kế Sương
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu đánh giá hoạt tính kháng phân bào trên dòng tế bào ung thư MCF-7, Jurkat T của cao chiết và hoạt chất từ sinh khối, quả thể nhân nuôi của chủng nấm Cordyceps neovolkiana DL0004 và Isaria cicadae F0004
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ NẤM CORDYCEPS
• 1.1. Giới thiệu về nấm Cordyceps
• 1.2. Tổng quan về Cordyceps neovolkiana và Isaria cicadae
• 1.3. Giá trị kinh tế của nấm Cordyceps
• 1.4. Nghiên cứu nuôi cấy Cordyceps
• 1.5. Thành phần hoạt chất và hoạt tính sinh học của nấm Cordyceps
• 1.5.1. Thành phần hoạt chất của Cordyceps
• 1.5.2. Hoạt tính kháng phân bào của Cordyceps
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Vật liệu nghiên cứu
• 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.1.2. Dụng cụ và thiết bị
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Phương pháp thu nhận cao chiết và các hợp chất
• 2.2.2. Phương pháp khảo sát hoạt tính gây độc tế bào và cảm ứng apoptosis của cao chiết và các hợp chất
• 2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Chiết cao từ sinh khối và quả thể C. neovolkiana DL0004 và I. cicadae F0004
• 3.2. Hoạt tính gây độc tế bào của các cao chiết với dòng tế bào ung thư MCF-7 và Jurkat T
• 3.2.1. Hoạt tính gây độc của các cao chiết C. neovolkiana DL0004 đối với các dòng tế bào MCF-7 và Jurkat T
• 3.2.2. Hoạt tính gây độc của các cao chiết I. cicadae F0004 đối với các dòng tế bào MCF-7 và Jurkat T
• 3.2.3. Xác định cao chiết có khả năng gây độc tế bào cao
• 3.3. Nghiên cứu cảm ứng apoptosis tế bào MCF-7 và Jurkat T với các cao chiết tiềm năng
• 3.3.1. Nghiên cứu cao PE của sinh khối Cordyceps neovolkiana DL0004 cảm ứng apoptosis tế bào ung thư MCF-7 và Jurkat T
• 3.3.2. Kết quả đánh giá khả năng cảm ứng apoptosis của cao EA từ quả thể I. cicadae F0004
• 3.4. Phân chất, tinh sạch và định danh các hợp chất của các cao chiết có tiềm năng kháng phân bào
• 3.4.1. Phân chất cao PE của sinh khối C. neovolkiana DL0004
• 3.4.2. Phân chất cao EA của quả thể Isaria cicadae F0004
• 3.4.3. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư MCF-7 và Jurkat T của các chất
• 3.4.4. Kết quả khả năng cảm ứng apoptosis tế bào ung thư MCF-7 và Jurkat T của ergone
• 3.4.4.1. Hình thái tế bào MCF-7 và Jurkat T sau khi nhuộm với AO/EB
• 3.4.4.2. Phân tích Chu kỳ tế bào bằng phương pháp flow cytomeretry
• 3.4.4.3. Định lượng tế bào bị cảm ứng apoptosis bằng phương pháp nhuộm Annexin V/PI
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Tóm tắt

I. Giới thiệu về luận án tiến sĩ

Luận án tiến sĩ này tập trung vào việc đánh giá hoạt tính kháng phân bào của các cao chiết từ sinh khối và quả thể của hai chủng nấm Cordyceps neovolkiana DL0004 và Isaria cicadae F0004 trên hai dòng tế bào ung thư MCF-7 và Jurkat T. Nghiên cứu này nhằm tìm kiếm các hợp chất có tiềm năng kháng ung thư từ nguồn dược liệu tự nhiên, đặc biệt là từ các loài nấm ký sinh côn trùng. Luận án này không chỉ góp phần vào việc phát triển các phương pháp điều trị ung thư mới mà còn mở ra hướng nghiên cứu ứng dụng các chủng nấm bản địa tại Việt Nam.

1.1. Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chính của luận án là đánh giá hoạt tính kháng phân bào của các cao chiết và hoạt chất từ sinh khối và quả thể của hai chủng nấm Cordyceps neovolkiana DL0004 và Isaria cicadae F0004 trên dòng tế bào ung thư MCF-7 (ung thư vú) và Jurkat T (bạch cầu). Nghiên cứu cũng hướng đến việc cô lập và xác định các hợp chất có hoạt tính kháng ung thư từ các cao chiết tiềm năng.

1.2. Ý nghĩa thực tiễn

Luận án này có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển các dược liệu mới từ nguồn thực vật và nấm bản địa. Kết quả nghiên cứu có thể ứng dụng trong việc sản xuất các sản phẩm kháng ung thư, góp phần vào việc điều trị các bệnh ung thư phổ biến như ung thư vú và bạch cầu.

II. Tổng quan về nấm Cordyceps và Isaria

Cordyceps và Isaria là hai chi nấm ký sinh côn trùng được biết đến với nhiều hoạt chất sinh học có giá trị trong y học. Cordyceps neovolkiana và Isaria cicadae là hai chủng nấm được nghiên cứu trong luận án này. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng các hợp chất từ các loài nấm này có hoạt tính kháng phân bào, kháng oxy hóa, và điều hòa miễn dịch.

2.1. Đặc điểm sinh học của Cordyceps neovolkiana

Cordyceps neovolkiana là loài nấm ký sinh côn trùng, phân bố chủ yếu ở vùng núi Langbiang, Việt Nam. Quả thể của nấm có màu vàng, dài từ 3-5 cm. Nghiên cứu về hoạt tính sinh học của loài nấm này cho thấy nó chứa nhiều hợp chất có tiềm năng kháng ung thư.

2.2. Đặc điểm sinh học của Isaria cicadae

Isaria cicadae là loài nấm ký sinh côn trùng, được sử dụng trong y học cổ truyền Trung Quốc. Nó chứa nhiều hợp chất như adenosin, cordycepin, và các polysaccharid có hoạt tính kháng phân bào và kháng oxy hóa. Nghiên cứu này tập trung vào việc khai thác các hợp chất từ sinh khối và quả thể của loài nấm này.

III. Phương pháp nghiên cứu

Luận án sử dụng các phương pháp in vitro để đánh giá hoạt tính kháng phân bào của các cao chiết và hoạt chất từ sinh khối và quả thể của hai chủng nấm. Các phương pháp bao gồm chiết xuất thực vật, phân tích tế bào, và định danh hợp chất.

3.1. Chiết xuất và phân tích cao chiết

Các cao chiết được thu nhận từ sinh khối và quả thể của Cordyceps neovolkiana DL0004 và Isaria cicadae F0004 bằng các phương pháp chiết xuất thực vật truyền thống. Các cao chiết sau đó được phân tích để xác định các hợp chất có hoạt tính kháng phân bào.

3.2. Đánh giá hoạt tính kháng phân bào

Hoạt tính kháng phân bào của các cao chiết được đánh giá trên hai dòng tế bào ung thư MCF-7 và Jurkat T bằng các phương pháp như MTT assay và nhuộm Annexin V/PI. Các kết quả được phân tích để xác định khả năng gây độc tế bào và cảm ứng apoptosis của các cao chiết.

IV. Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy các cao chiết từ sinh khối và quả thể của Cordyceps neovolkiana DL0004 và Isaria cicadae F0004 có hoạt tính kháng phân bào mạnh trên cả hai dòng tế bào ung thư MCF-7 và Jurkat T. Các hợp chất được cô lập từ các cao chiết này cũng thể hiện tiềm năng kháng ung thư đáng kể.

4.1. Hoạt tính kháng phân bào của cao chiết

Các cao chiết từ sinh khối và quả thể của Cordyceps neovolkiana DL0004 và Isaria cicadae F0004 đều thể hiện hoạt tính kháng phân bào mạnh, với giá trị IC50 thấp. Điều này cho thấy tiềm năng ứng dụng của các cao chiết này trong việc phát triển các sản phẩm kháng ung thư.

4.2. Cô lập và định danh hợp chất

Các hợp chất được cô lập từ các cao chiết tiềm năng bao gồm ergone, cordycepin, và các polysaccharid. Các hợp chất này đã được định danh và đánh giá về hoạt tính kháng phân bào, cho thấy tiềm năng ứng dụng trong điều trị ung thư vú và bạch cầu.

V. Kết luận và kiến nghị

Luận án đã thành công trong việc đánh giá hoạt tính kháng phân bào của các cao chiết và hoạt chất từ sinh khối và quả thể của Cordyceps neovolkiana DL0004 và Isaria cicadae F0004. Kết quả nghiên cứu mở ra hướng ứng dụng các chủng nấm bản địa trong việc phát triển các sản phẩm kháng ung thư.

5.1. Kết luận

Các cao chiết và hoạt chất từ sinh khối và quả thể của hai chủng nấm nghiên cứu đều thể hiện hoạt tính kháng phân bào mạnh, đặc biệt là trên dòng tế bào ung thư MCF-7 và Jurkat T. Các hợp chất được cô lập cũng có tiềm năng ứng dụng trong điều trị ung thư.

5.2. Kiến nghị

Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về cơ chế kháng phân bào của các hợp chất được cô lập. Đồng thời, cần phát triển các phương pháp nuôi cấy và chiết xuất hiệu quả hơn để tối ưu hóa việc sản xuất các hoạt chất từ các chủng nấm này.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Luận án tiến sỹ chuyên ngành Công nghệ sinh học (mã số: 9420201) của nghiên cứu sinh Nguyễn Chí Dũng có tiêu đề: “Nghiên cứu đánh giá hoạt tính kháng phân bào trên dòng tế bào ung thư MCF-7, Jurkat T của cao chiết và hoạt chất từ sinh khối, quả thể nhân nuôi của chủng nấm Cordyceps neovolkiana DL0004 và Isaria cicadae F0004”. Công trình được hoàn thành tại Học viện Khoa học và Công nghệ – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. TSKH. Ngô Kế Sương và TS. Đinh Minh Hiệp.

Về tính cấp thiết, theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO, 2020), ung thư là nhóm bệnh lý có tỷ lệ tử vong hàng đầu và xu hướng mắc bệnh tiếp tục gia tăng. Việc tìm kiếm các hợp chất kháng ung thư mới từ nguồn dược liệu tự nhiên nhận được sự quan tâm lớn, trong bối cảnh ước tính giai đoạn 1981–2019 có khoảng 25% thuốc kháng ung thư được phê duyệt có nguồn gốc tự nhiên. Chi nấm Cordyceps thuộc họ Clavicipitaceae sở hữu hơn 750 loài với hơn 200 hợp chất có hoạt tính sinh học đã được định danh. Tuy nhiên, việc khai thác và ứng dụng thực tiễn trên thế giới chủ yếu tập trung vào 04 loài kinh điển (Cordyceps sinensis, Cordyceps militaris, Cordyceps sobolifera, Isaria cicadae). Tại Việt Nam, nguồn nấm ký sinh côn trùng tự nhiên rất phong phú nhưng các công trình chủ yếu dừng ở mức khảo sát cao chiết thô, còn thiếu vắng các nghiên cứu chuyên sâu về nuôi cấy nhân tạo, chiết tách phân đoạn, cô lập hoạt chất sạch và xác định cơ chế kháng phân bào ở mức độ tế bào.

Mục tiêu tổng quát của luận án là đánh giá hoạt tính kháng phân bào trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7 và tế bào ung thư bạch cầu dòng lympho T Jurkat T của các phân đoạn cao chiết và hợp chất sạch thu nhận từ sinh khối hệ sợi và quả thể nuôi cấy nhân tạo của hai chủng nấm Cordyceps neovolkiana DL0004 và Isaria cicadae F0004 thu thập tại Việt Nam.

Nội dung nghiên cứu được triển khai theo 4 bước cụ thể sau:

1. Tạo cao chiết từ sinh khối và quả thể nấm nuôi trồng nhân tạo;
2. Sàng lọc các cao chiết có độc tính tế bào tiềm năng trên 02 dòng tế bào ung thư MCF-7 và Jurkat T;
3. Xác nhận đặc tính kháng phân bào thông qua con đường cảm ứng chết theo chương trình (apoptosis) của các cao chiết tiềm năng;
4. Cô lập, định danh cấu trúc hóa học và xác định hoạt tính kháng phân bào của hợp chất tinh sạch từ cao chiết tiềm năng.

Đối tượng nghiên cứu bao gồm:

• Chủng nấm Cordyceps neovolkiana DL0004 thu nhận tại vùng núi Langbiang, tỉnh Lâm Đồng, Việt Nam (được phân lập, định danh và cung cấp bởi TS. Trương Bình Nguyên, Trường Đại học Đà Lạt).
• Chủng nấm Isaria cicadae F0004 thu nhận tại thị trấn EaKnop, huyện Ea Kar, tỉnh Đắk Lắk, Việt Nam (cung cấp bởi Trung tâm Nghiên cứu và Ứng dụng sinh học).
• Dòng tế bào ung thư thử nghiệm: Tế bào ung thư vú người MCF-7 (Michigan Cancer Foundation-7) và tế bào ung thư bạch cầu cấp dòng lympho T người Jurkat T.

Phạm vi nghiên cứu tập trung vào quy trình nuôi cấy bán rắn và nuôi cấy lỏng tĩnh ở quy mô phòng thí nghiệm tại Thành phố Hồ Chí Minh, chiết xuất phân đoạn lỏng - lỏng, khảo sát độc tính tế bào in vitro, đo đạc quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân và phân tích dòng chảy tế bào.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu của luận án hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến phân loại học, thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của nấm ký sinh côn trùng thuộc các chi Cordyceps và Isaria:

Về phân loại học, nấm Cordyceps từng được Holiday (2008) xếp vào họ Clavicipitaceae, bộ Hypocreales. Đến năm 2010, các nhà nấm học quốc tế đã sắp xếp lại hệ thống phát sinh loài dựa trên phân tích ribosome DNA, phân chia nhóm nấm này thành 3 họ: Clavicipitaceae, Cordycipitaceae và Ophiocordycipitaceae. Chi Isaria được Sung và cộng sự (2007) xác định thuộc họ Cordycipitaceae, là giai đoạn sinh sản vô tính của Cordyceps. Loài Cordyceps neovolkiana (thể vô tính là Hirsutella neovolkiana) được Kobayasi (1982) phân loại thuộc họ Clavicipitaceae, phân bố ở vùng núi Langbiang ở độ cao 1.500 m.

Về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học, các nghiên cứu quốc tế đã ghi nhận:

• Cordyceps sinensis: Chứa hàm lượng polysaccharide cao (10–20% ở mẫu tự nhiên, lên đến 50% ở mẫu lên men bán rắn), protein, sterol (ergosterol, β-sitosterol, H1-A), các acid béo (C16:1, C17:1, C18:1, C18:2), cordymin, myriocin và cordysinin A–E. Nghiên cứu của Chen và cộng sự chứng minh cao ethyl acetate ức chế 4 dòng tế bào ung thư MCF-7, B16, HL-60 và HepG2. Nhiều công bố chỉ ra cao chiết nước kéo dài thời gian sống của chuột mang khối u EAC lên 316% và Meth A lên 312% in vivo. Cơ chế kháng ung thư được làm rõ thông qua việc kích thích hệ miễn dịch (tăng IL-1, TNF-alpha, IFN-gamma, tăng hoạt tính tế bào NK và đại thực bào) và kích hoạt apoptosis phụ thuộc caspase-3, caspase-8, điều hòa p53, p21, cyclin B, ức chế bcl-2.
• Cordyceps militaris: Hoạt chất chính là cordycepin (3’-deoxyadenosine). Nghiên cứu của các tác giả quốc tế cho thấy cordycepin ức chế khối u B16-BL6 thông qua thụ thể adenosine A3 và con đường tín hiệu Wnt/GSK-3 beta; ức chế Akt, p38 và NF-kappa B; gây bắt giữ chu kỳ tế bào ở pha G1, G2/M và cảm ứng apoptosis thông qua caspase-3, 7, 9 trên tế bào MA-20, OEC-11. Cao nước C. militaris ức chế sự biểu hiện của gen MMP2 ở HT1080 và gen bFGF ở tế bào HUVEC, đồng thời làm giảm telomerase thông qua ức chế phiên mã hTERT ở tế bào ung thư phổi A549.
• Isaria cicadae: Chứa hơn 110 hợp chất gồm nucleoside, amino acid, ergosterol peroxide, beauvericin, oosporein, fumimycin. Nghiên cứu của Zhu và cộng sự (2020) cho thấy polysaccharide từ I. cicadae kích thích biểu hiện gen catalase (CAT), glutathione peroxidase (GSH-Px), SOD1 và MTH, làm giảm MDA. Nghiên cứu của Ren và cộng sự (2014) ghi nhận khả năng thu dọn gốc tự do DPPH, superoxide và hydroxyl. Một số tác giả chứng minh cao ethanol I. cicadae gây bắt giữ chu kỳ tế bào ở pha S, tăng nồng độ Ca2+ nội bào, làm mất điện thế màng ty thể và gây căng thẳng lưới nội chất.
• Cordyceps neovolkiana: Công bố của Sangeetha (2017) bước đầu ghi nhận phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của cordycepin từ sinh khối loài này với các tín hiệu anomeric đặc trưng tại 3,4 ppm.

Tại Việt Nam, các hướng nghiên cứu trước đây bao gồm: Lê Tấn Hưng và cộng sự (2010) khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng sinh tổng hợp cordycepin của 15 chủng C. militaris; Phạm Quang Thu (2009) nghiên cứu quy trình nuôi trồng nấm Cordyceps; Trương Bình Nguyên và Đinh Minh Hiệp (2015) công bố nuôi cấy thành công sinh khối hệ sợi nấm C. sinensis. Gần đây, chủng C. takaomontana DL0038A tại Lâm Đồng cũng được đưa vào thử nghiệm nuôi trồng.

Khoảng trống nghiên cứu được luận án lựa chọn giải quyết: Mặc dù nguồn tài nguyên nấm ký sinh côn trùng tại Việt Nam đa dạng, các chủng bản địa như C. neovolkiana DL0004 và I. cicadae F0004 chưa từng được khảo sát toàn diện về khả năng tạo quả thể nhân tạo, quy trình chiết xuất đa phân đoạn, sàng lọc độc tính tế bào đối chiếu giữa sinh khối và quả thể, cũng như chưa có dữ liệu thực nghiệm về việc phân lập hợp chất tinh khiết và chứng minh cơ chế gây chết tế bào theo chương trình trên hai dòng tế bào ung thư MCF-7 và Jurkat T.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên cơ sở lý thuyết về quá trình chết rụng tế bào theo chương trình (apoptosis) và lý thuyết hóa học các hợp chất tự nhiên. Apoptosis là cơ chế chọn lọc loại bỏ tế bào bất thường mà không gây viêm hoại tử, đặc trưng bởi các biến đổi hình thái (co nhân, phân mảnh DNA, tạo thể apoptosis) và sự dịch chuyển phosphatidylserine từ màng trong ra bề mặt ngoài tế bào.

Hệ thống phương pháp thực nghiệm được triển khai chi tiết:

1. Phương pháp nuôi cấy nấm nhân tạo:

• Giống cấp 1 nuôi trên môi trường thạch PGA (Potato Glucose Agar) trong đĩa petri, ủ ở 20 ± 2°C trong 15 ngày.
• Giống cấp 2 nuôi trên môi trường dịch thể PG (Potato Glucose) trong chai thủy tinh 250 mL, ủ ở 20 ± 2°C trong 7 ngày.
• Nuôi sinh khối hệ sợi: Môi trường lỏng gồm dịch nấu khoai tây (200 g/L), saccharose (50 g/L), peptone (6 g/L), cao nấm men (4 g/L), KH2PO4 (0,5 g/L), MgSO4 (0,2 g/L); thu hoạch sau 40 ngày nuôi.
• Nuôi tạo quả thể: Môi trường cơ chất bán rắn gồm gạo (28,5 g/hộp), kê (9,5 g/hộp), nhộng tằm (2 g/hộp), glucose (40 g/L), peptone (5 g/L), KH2PO4 (1,5 g/L), MgSO4 (1,5 g/L); ủ tối 15 ngày, sau đó chuyển ra ánh sáng kích thích tạo quả thể, thu hoạch sau 45 ngày.

2. Quy trình chiết xuất và phân đoạn:

• Chiết ngấm kiệt: Nguyên liệu khô xay nhỏ được ngâm chiết kiệt với ethanol 96% theo tỷ lệ 1:10 (g/mL), lặp lại nhiều lần, cô quay chân không dưới 50°C thu cao tổng ethanol (Et).
• Tủa polysaccharide: Bã nguyên liệu sau chiết ngấm kiệt được chiết với nước ở 60–70°C, cô đặc và tủa bằng ethanol 96% lạnh (tỷ lệ 1 dịch: 4 cồn) trong 24 giờ ở 4°C để thu cao polysaccharide nội bào (Poly). Dịch môi trường nuôi cấy sinh khối được cô đặc và tủa cồn lạnh tương tự để thu exopolysaccharide (EPS).
• Chiết lỏng - lỏng phân đoạn: Cao tổng ethanol được hòa tan trong nước và chiết phân bố lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: petroleum ether (PE), ethyl acetate (EA), n-butanol (Bu), dịch còn lại là phân đoạn nước (W).

3. Phương pháp phân chất, tinh sạch và định danh cấu trúc:

• Sắc ký lớp mỏng (TLC): Sử dụng bản mỏng Kieselgel Merck 60 F254 độ dày 175–225 µm; hệ dung môi pha động gồm hexane, chloroform, ethyl acetate, acetone, methanol, nước; hiện vết bằng đèn UV ở bước sóng 254 nm và phun thuốc thử vanillin/H2SO4, sấy nóng ở 105°C.
• Sắc ký cột hấp phụ (CC): Pha tĩnh sử dụng Silica gel 230–400 mesh (kích thước hạt 37–63 µm), tỷ lệ chất hấp phụ trên lượng mẫu khảo sát từ 25:1 đến 50:1 (hoặc 100:1 đến 200:1 đối với hỗn hợp khó tách), tỷ lệ chiều cao và đường kính cột là 10:1.
• Xác định cấu trúc hóa học: Đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều 1H-NMR (tần số 500 MHz) và 13C-NMR (tần số 125 MHz) trên thiết bị Bruker Avance tại Phòng Phân tích Trung tâm, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQG TP.HCM. Dữ liệu phổ được xử lý và phân tích trên phần mềm MestReNova phiên bản 11.0.

4. Phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học in vitro:

• Nuôi cấy tế bào: Dòng MCF-7 và Jurkat T được duy trì trong môi trường E’MEM bổ sung L-glutamine (2 mM), NaHCO3 (0,225%), HEPES (20 mM), penicillin G (100 UI/mL), streptomycin (100 µg/mL), amphotericin-B (0,025 µg/mL) và 10% huyết thanh thai bò (FBS).
• Thử nghiệm độc tính tế bào: Đo tỷ lệ ức chế sinh trưởng và xác định giá trị IC50 (µg/mL) bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang học trên máy đọc ELISA reader Biotek.
• Quan sát hình thái apoptotic: Nhuộm huỳnh quang kép Acridine Orange / Ethidium Bromide (AO/EB), quan sát nhân tế bào dưới kính hiển vi huỳnh quang.
• Phân tích chu kỳ tế bào: Tế bào được cố định bằng ethanol 70% lạnh, nhuộm propidium iodide (PI) và đo hàm lượng DNA qua các pha SubG1, G0/G1, S, G2/M trên hệ thống đo dòng chảy tế bào BD Accuri C6 Plus.
• Định lượng tế bào apoptosis: Sử dụng bộ kit FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit (BD Pharmingen, mã số 556570), phân tích tỷ lệ tế bào sống (Annexin V-/PI-), tế bào apoptosis sớm (Annexin V+/PI-), apoptosis trễ (Annexin V+/PI+) và hoại tử (Annexin V-/PI+).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan về nấm Cordyceps

Chương 1 trình bày chi tiết bối cảnh phân loại học, giá trị kinh tế, hiện trạng công nghệ nuôi trồng và cơ sở dược lý của chi Cordyceps. Tác giả phân tích lịch sử biến động trong hệ thống phân loại từ cách xếp đặt truyền thống của Kobayasi (1982) và Holiday (2008) đến hệ thống phân tử tái cấu trúc năm 2010 gồm 3 họ: Clavicipitaceae, Cordycipitaceae và Ophiocordycipitaceae. Hai đối tượng chính của đề tài được định vị rõ: C. neovolkiana thuộc họ Clavicipitaceae, trong khi I. cicadae là thể vô tính thuộc họ Cordycipitaceae.

Về phương diện kinh tế, nấm C. sinensis ngoài tự nhiên trên cao nguyên Tây Tạng có sản lượng chỉ khoảng 7 tấn/năm (chiếm hơn 80% sản lượng toàn cầu), đóng góp tới 225 triệu USD (hơn 40% GRDP) của vùng Tây Tạng chỉ trong mùa thu hoạch kéo dài 4–6 tuần. Giá thành loài này ở Bắc Kinh lên tới 112.500 USD/kg. Báo cáo của Data Bridge Market Research dự báo thị trường đông trùng hạ thảo toàn cầu đạt 1.167,50 triệu USD vào năm 2027 với tốc độ tăng trưởng kép hằng năm (CAGR) là 10,55%. Điều này thúc đẩy mạnh mẽ các nỗ lực nuôi trồng nhân tạo thay thế, như nuôi cấy hệ sợi lỏng Hirsutella sinensis và nuôi quả thể bán rắn C. militaris.

Chương này cũng tổng kết sâu các nhóm hoạt chất sinh học:

• Polysaccharide: Trọng lượng phân tử từ 7 đến 2.260 kDa với cấu trúc xoắn ba phức tạp, cấu thành từ mannose, galactose, glucose cùng một lượng nhỏ arabinose, rhamnose, xylose.
• Nucleoside: Cordycepin (3’-deoxyadenosine), adenosine, uridine, guanosine, inosine, thymidine; các dẫn xuất can thiệp vào quá trình kết thúc sớm chuỗi RNA.
• Sterol: Ergosterol (tiền chất vitamin D2), ergosterol peroxide, β-sitosterol, daucosterol, campesterol, H1-A.
• Protein và các dẫn xuất khác: Myriocin, cordymin, cordycedipeptide A, cordysinin A–E, D-mannitol (acid cordycepic).

Chương 1 đi sâu vào các công trình chứng minh cơ chế ức chế phân bào và cảm ứng apoptosis của C. sinensis, C. militaris, C. sphecocephala, C. ophioglossoides, C. takaomontana và I. cicadae, từ đó khẳng định việc khai thác hai chủng C. neovolkiana DL0004 và I. cicadae F0004 tại Việt Nam là hướng nghiên cứu có cơ sở học thuật rõ ràng.

Chương 2: VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP

Chương 2 mô tả hệ thống vật liệu, hóa chất, chủng giống nấm, dòng tế bào khối u và các quy trình kỹ thuật chuẩn được áp dụng trong toàn bộ nghiên cứu:

Hạng mục	Quy cách / Nguồn gốc trong luận án
Chủng nấm nghiên cứu	Cordyceps neovolkiana DL0004 (Langbiang, Lâm Đồng); Isaria cicadae F0004 (EaKnop, Đắk Lắk)
Dòng tế bào ung thư	MCF-7 (ung thư vú người), Jurkat T (ung thư bạch cầu cấp dòng lympho T)
Môi trường nuôi tế bào	E’MEM bổ sung 10% FBS, L-glutamine (2 mM), NaHCO3, HEPES và kháng sinh
Dung môi chiết tách	Ethanol 96%, Petroleum ether (PE), Ethyl acetate (EA), n-Butanol (Bu), Nước cất
Hệ thống sắc ký	TLC Kieselgel Merck 60 F254; Cột sắc ký Silica gel 230–400 mesh (Himedia)
Thiết bị quang phổ NMR	Bruker Avance 500 MHz (1H-NMR) và 125 MHz (13C-NMR)
Thiết bị đo dòng chảy	Hệ thống BD Accuri C6 Plus flow cytometer (BD Biosciences, Hoa Kỳ)
Hóa chất thử nghiệm	Bộ kit FITC Annexin V (BD Pharmingen, 556570), AO, EB, PI, Vinblastine

Quy trình chiết xuất đa phân đoạn được chuẩn hóa theo phương pháp chiết ngấm kiệt bằng ethanol 96%, chiết tủa phân đoạn polysaccharide (Poly và EPS), chiết lỏng - lỏng thu các phân đoạn PE, EA, Bu và nước. Các công thức toán học xác định hiệu suất chiết cao thô, hiệu suất chiết phân đoạn và hiệu suất tủa EPS được trình bày đầy đủ. Luận án thiết lập quy trình kiểm tra sắc ký bản mỏng (xác định giá trị Rf tối ưu từ 0,3–0,6), kỹ thuật nạp cột, xả cột và kiểm tra độc tính tế bào định hướng phân đoạn (bioassay-guided fractionation). Toàn bộ quy trình đo phổ phân tích cấu trúc trên MestReNova 11.0 và phương pháp phân tích chu kỳ tế bào, định lượng apoptosis bằng cytometer cũng được quy chuẩn hóa nghiêm ngặt.

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm thu được từ quá trình nuôi cấy, chiết xuất, sàng lọc độc tính tế bào, khảo sát cơ chế apoptosis và phân lập hợp chất:

1. Thu nhận các phân đoạn cao chiết: Luận án tiến hành chiết tách thành công các phân đoạn cao từ sinh khối hệ sợi (SK) và quả thể (QT) của 2 chủng nấm. Dữ liệu hiệu suất chiết trung bình được công bố tại Bảng 3.1 của văn bản, bao gồm cao tổng ethanol (Et), cao polysaccharide nội bào (Poly), cao exopolysaccharide (EPS) và các phân đoạn phân bố lỏng - lỏng: petroleum ether (PE), ethyl acetate (EA), n-butanol (Bu) và cao nước (W).

2. Độc tính tế bào của các cao chiết trên tế bào MCF-7 và Jurkat T: Kết quả đánh giá tỷ lệ ức chế sinh trưởng ở nồng độ sàng lọc ban đầu 100 µg/mL và giá trị IC50 (µg/mL) được trình bày tại Bảng 3.2 cùng các đồ thị thực nghiệm (từ Hình 3.2 đến Hình 3.5):

• Đối với C. neovolkiana DL0004: Các phân đoạn biểu hiện hoạt tính ức chế sinh trưởng khác nhau trên 2 dòng tế bào. Trong đó, phân đoạn cao PE từ sinh khối hệ sợi thể hiện độc tính tế bào mạnh nhất với giá trị IC50 thấp nhất trên cả hai dòng tế bào ung thư MCF-7 và Jurkat T.
• Đối với I. cicadae F0004: Phân đoạn cao EA từ quả thể thể hiện hoạt tính gây độc tế bào vượt trội so với các phân đoạn khác trên cả hai dòng MCF-7 và Jurkat T.
• Từ các dữ liệu sàng lọc này, tác giả đã chọn lọc được 02 phân đoạn cao chiết tiềm năng nhất để nghiên cứu sâu về cơ chế: Cao PE sinh khối C. neovolkiana DL0004 và cao EA quả thể I. cicadae F0004.

3. Đánh giá khả năng cảm ứng apoptosis của các cao chiết tiềm năng:

• Cao PE sinh khối C. neovolkiana DL0004: Khi xử lý trên tế bào MCF-7 và Jurkat T, kết quả nhuộm huỳnh quang AO/EB (Hình 3.6) ghi nhận các biến đổi hình thái đặc trưng của apoptosis (tế bào co cụm, màng tế bào sủi bọt, nhân cô đặc bắt màu cam/vàng). Phân tích chu kỳ tế bào bằng flow cytometry (Hình 3.7 và Hình 3.8) cho thấy sự gia tăng rõ rệt của quần thể tế bào ở pha SubG1 (pha tế bào chết) và sự thay đổi phân bố các pha G0/G1, S, G2/M. Phép nhuộm Annexin V/PI (Hình 3.9 và Hình 3.10) xác nhận tỷ lệ tế bào đi vào giai đoạn apoptosis sớm và apoptosis trễ tăng lên theo nồng độ xử lý.
• Cao EA quả thể I. cicadae F0004: Tương tự, kết quả nhuộm AO/EB (Hình 3.11), phân tích chu kỳ tế bào (Hình 3.12, Hình 3.13) và nhuộm Annexin V/PI (Hình 3.14, Hình 3.15) chứng minh phân đoạn này gây độc tế bào ung thư MCF-7 và Jurkat T thông qua kích hoạt con đường apoptosis.

4. Phân chất, tinh sạch và xác định cấu trúc hợp chất sạch: Từ cao PE sinh khối C. neovolkiana DL0004 và cao EA quả thể I. cicadae F0004, tác giả triển khai sắc ký cột silica gel kết hợp sắc ký lớp mỏng, tiến hành định hướng phân đoạn bằng hoạt tính sinh học. Cấu trúc hóa học của các chất cô lập được xác định thông qua việc giải phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz).

5. Hoạt tính kháng ung thư của các hợp chất cô lập và hợp chất ergone: Bảng 3.3 trong luận án công bố kết quả thử nghiệm độc tính tế bào của các hợp chất cô lập được tại nồng độ 100 µg/mL trên hai dòng MCF-7 và Jurkat T. Đáng chú ý, hợp chất ergone (một dẫn xuất steroid thuộc nhóm ergostane) được phân lập từ cao PE sinh khối C. neovolkiana DL0004 đã được tiến hành nghiên cứu cơ chế sâu:

• Nhuộm AO/EB (Hình 3.16) cho thấy ergone cảm ứng làm biến đổi hình thái tế bào MCF-7 và Jurkat T rõ rệt theo dạng apoptosis.
• Đo chu kỳ tế bào qua flow cytometry (Hình 3.17 và Hình 3.18) chỉ ra ergone làm thay đổi tỷ lệ tế bào ở các pha chu kỳ, gia tăng tỷ lệ tế bào ở pha SubG1.
• Nhuộm huỳnh quang Annexin V/PI (Hình 3.19 và Hình 3.20) định lượng chính xác sự dịch chuyển tỷ lệ tế bào từ trạng thái sống sang apoptosis sớm (Annexin V+/PI-) và apoptosis trễ (Annexin V+/PI+).

Kết quả và những đóng góp mới

Các đóng góp mới về mặt lý luận và thực tiễn của luận án được thể hiện qua các nội dung:

1. Đóng góp về mặt lý luận và khoa học:

• Cung cấp dữ liệu khoa học toàn diện đầu tiên về thành phần hóa học định hướng kháng ung thư của chủng nấm Cordyceps neovolkiana DL0004 phân lập tại Langbiang (Lâm Đồng) và chủng Isaria cicadae F0004 phân lập tại Đắk Lắk.
• Chứng minh bằng thực nghiệm cơ chế gây độc tế bào ung thư vú MCF-7 và tế bào ung thư bạch cầu Jurkat T của các phân đoạn tiềm năng (cao PE sinh khối C. neovolkiana và cao EA quả thể I. cicadae) là thông qua con đường cảm ứng apoptosis, làm thay đổi chu kỳ tế bào và tăng biểu hiện tín hiệu Annexin V.
• Cô lập và làm sáng tỏ cấu trúc của các hợp chất tự nhiên từ hai chủng nấm nhân nuôi, trong đó xác định ergone từ sinh khối C. neovolkiana DL0004 là một trong những hoạt chất chịu trách nhiệm cho khả năng kháng phân bào và cảm ứng apoptosis trên tế bào ung thư.

2. Đóng góp về mặt thực tiễn và ứng dụng:

• Xây dựng thành công quy trình nhân nuôi nhân tạo tạo sinh khối hệ sợi trong môi trường lỏng và tạo quả thể trên cơ chất bán rắn cho hai chủng nấm dược liệu bản địa của Việt Nam.
• Thiết lập quy trình chiết xuất phân đoạn tối ưu (ngấm kiệt ethanol, tủa cồn lạnh thu polysaccharide và exopolysaccharide, phân đoạn lỏng - lỏng bằng dãy dung môi phân cực tăng dần) hỗ trợ thu hồi các phân đoạn có hoạt tính sinh học cao.
• Đề xuất khả năng ứng dụng sinh khối C. neovolkiana DL0004 và quả thể I. cicadae F0004 làm nguồn nguyên liệu tự nhiên trong nước để nghiên cứu phát triển các chế phẩm hỗ trợ điều trị ung thư.

Kiến nghị của tác giả: Tiếp tục tối ưu hóa quy trình nuôi trồng ở quy mô lớn hơn, mở rộng khảo sát các hợp chất thứ cấp khác còn lại trong các phân đoạn sắc ký cột, và nghiên cứu sâu hơn về các cơ chế phân tử nội bào liên quan đến họ protein Bcl-2 và các enzyme caspase.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Dựa trên phạm vi và nội dung được công bố trong văn bản luận án, công trình có một số giới hạn thực nghiệm:

• Nghiên cứu chỉ dừng lại ở các thử nghiệm in vitro trên hai dòng tế bào ung thư cụ thể là MCF-7 và Jurkat T; chưa tiến hành khảo sát độc tính tế bào trên các dòng tế bào bình thường (tế bào lành) để đánh giá chỉ số chọn lọc an toàn (Selectivity Index).
• Chưa có các thử nghiệm dược lý in vivo trên động vật thực nghiệm mang khối u để kiểm chứng hiệu quả kháng phân bào, khả năng ức chế khối u và tính an toàn sinh học của cao chiết PE, cao chiết EA cũng như hợp chất ergone.
• Các khảo sát cơ chế apoptosis mới chỉ dừng ở mức độ nhuộm huỳnh quang AO/EB, đo chu kỳ tế bào SubG1 và nhuộm Annexin V/PI trên flow cytometry; chưa đi sâu kiểm tra biểu hiện các gen và protein đặc hiệu (như caspase-3, caspase-8, caspase-9, Bax, Bcl-2, PARP) bằng kỹ thuật Western Blot hay RT-PCR đối với các hợp chất sạch thu nhận từ hai chủng nấm này.

Hướng nghiên cứu tiếp theo được xác định là mở rộng phân tích các con đường truyền tín hiệu nội bào của ergone, đánh giá hiệu quả trên mô hình chuột mang khối u thực nghiệm và khảo sát độc tính bán trường diễn trước khi phát triển sản phẩm ứng dụng.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo có giá trị học thuật và thực tiễn đối với:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên các chuyên ngành Công nghệ sinh học, Hóa học các hợp chất tự nhiên, Dược học và Sinh học phân tử: Có thể tham khảo phương pháp luận chiết phân đoạn lỏng - lỏng kết hợp bioassay-guided fractionation, quy trình vận hành sắc ký cột silica gel và kỹ thuật giải phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR trên MestReNova.
• Các nhà khoa học và giảng viên nghiên cứu về nấm dược liệu: Kế thừa quy trình công nghệ nuôi cấy tạo sinh khối hệ sợi trong môi trường lỏng và nuôi cấy tạo quả thể trên cơ chất hỗn hợp nhân tạo (gạo, kê, nhộng tằm) cho các chủng nấm ký sinh côn trùng bản địa của Việt Nam (C. neovolkiana và I. cicadae).
• Các đơn vị sản xuất dược phẩm và thực phẩm chức năng: Sử dụng dữ liệu về các phân đoạn cao chiết PE và EA làm cơ sở xây dựng quy trình chuẩn hóa hoạt chất chiết xuất, định danh hợp chất chỉ thị (marker compound) phục vụ công tác kiểm soát chất lượng nguyên liệu nấm nuôi cấy.

Câu hỏi thường gặp

1. Hai chủng nấm trong luận án được thu thập từ đâu và có đặc điểm phân loại học như thế nào? Chủng Cordyceps neovolkiana DL0004 được thu thập tại vùng núi Langbiang, tỉnh Lâm Đồng ở độ cao 1.500 m, thuộc họ Clavicipitaceae, được cung cấp bởi TS. Trương Bình Nguyên (Đại học Đà Lạt). Chủng Isaria cicadae F0004 được thu thập tại thị trấn EaKnop, huyện Ea Kar, tỉnh Đắk Lắk, thuộc họ Cordycipitaceae, do Trung tâm Nghiên cứu và Ứng dụng sinh học cung cấp. Cả hai chủng sau đó đều được nuôi cấy nhân tạo thành công tại Phòng thí nghiệm Sinh hóa, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQG TP.HCM.

2. Các phân đoạn cao chiết nào thể hiện hoạt tính gây độc tế bào tiềm năng nhất trên hai dòng ung thư thử nghiệm? Dựa trên kết quả đo tỷ lệ ức chế sinh trưởng và giá trị IC50 (µg/mL) tại Bảng 3.2 của văn bản, phân đoạn cao chiết petroleum ether (PE) từ sinh khối hệ sợi của chủng Cordyceps neovolkiana DL0004 và phân đoạn cao chiết ethyl acetate (EA) từ quả thể của chủng Isaria cicadae F0004 là hai phân đoạn có hoạt tính gây độc tế bào mạnh nhất trên cả hai dòng tế bào ung thư MCF-7 và Jurkat T.

3. Cơ chế kháng phân bào của các cao chiết tiềm năng và hợp chất sạch được chứng minh bằng những kỹ thuật thực nghiệm nào? Khả năng kháng phân bào thông qua con đường cảm ứng apoptosis được luận án chứng minh bằng 3 kỹ thuật thực nghiệm độc lập: (1) Nhuộm huỳnh quang kép AO/EB để phát hiện các biến đổi hình thái apoptotic của nhân và màng tế bào; (2) Phân tích chu kỳ tế bào bằng phương pháp đo hàm lượng DNA nhuộm PI trên hệ thống BD Accuri C6 Plus flow cytometer (ghi nhận sự tích lũy tế bào ở pha SubG1); (3) Định lượng tỷ lệ tế bào apoptosis sớm và trễ bằng phương pháp nhuộm huỳnh quang Annexin V/PI.

4. Hợp chất tinh sạch nào được cô lập và khảo sát cơ chế apoptosis chi tiết trong luận án? Hợp chất ergone (một dẫn xuất thuộc nhóm steroid) được phân lập và tinh sạch từ phân đoạn cao PE của sinh khối nấm Cordyceps neovolkiana DL0004. Hợp chất này được xác định cấu trúc bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR, sau đó được chứng minh có khả năng gây độc và cảm ứng apoptosis trực tiếp trên hai dòng tế bào MCF-7 và Jurkat T thông qua kết quả nhuộm AO/EB, phân tích chu kỳ tế bào SubG1 và nhuộm Annexin V/PI.

5. Môi trường nhân nuôi sinh khối và quả thể của hai chủng nấm trong đề tài có thành phần cụ thể ra sao? Môi trường nuôi sinh khối lỏng gồm: dịch nấu khoai tây (200 g/L), saccharose (50 g/L), peptone (6 g/L), cao nấm men (4 g/L), KH2PO4 (0,5 g/L), MgSO4 (0,2 g/L) trong nước cất, nuôi trong 40 ngày. Môi trường nuôi tạo quả thể bán rắn gồm: gạo (28,5 g/hộp), kê (9,5 g/hộp), nhộng tằm (2 g/hộp), glucose (40 g/L), peptone (5 g/L), KH2PO4 (1,5 g/L), MgSO4 (1,5 g/L), trải qua 15 ngày ủ tối và 45 ngày nuôi ngoài ánh sáng.

Kết luận

Luận án tiến sỹ của Nguyễn Chí Dũng đã thực hiện thành công việc nhân nuôi sinh khối và quả thể của hai chủng nấm ký sinh côn trùng bản địa Cordyceps neovolkiana DL0004 và Isaria cicadae F0004 tại Việt Nam. Công trình đã xác định được phân đoạn cao PE từ sinh khối C. neovolkiana DL0004 và phân đoạn cao EA từ quả thể I. cicadae F0004 sở hữu hoạt tính gây độc tế bào mạnh nhất trên hai dòng ung thư MCF-7 và Jurkat T theo cơ chế cảm ứng apoptosis. Đồng thời, luận án đã cô lập, định danh cấu trúc hoạt chất ergone từ sinh khối C. neovolkiana DL0004 và chứng minh vai trò kháng phân bào của hợp chất này, cung cấp cơ sở khoa học quan trọng cho việc định hướng ứng dụng nguồn nấm dược liệu Việt Nam trong nghiên cứu y dược.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Các sản phẩm tự nhiên, với sự đa dạng về thành phần và cấu trúc hóa học đã được nghiên cứu rộng rãi về khả năng kháng ung thư trong hơn nửa thế kỷ gần đây và được xem là một nguồn cung cấp dồi dào các hợp chất có hoạt tính sinh học có tiềm năng chữa bệnh. Uớc tính từ năm 1981 đến năm 2019, khoảng 25% các loại thuốc kháng ung thư mới được phê duyệt có nguồn gốc tự nhiên [1]. Đối với Cordyceps spp., hơn 200 hợp chất có hoạt tính sinh học bao gồm nucleosid, sterol, peptid mạch vòng, flavonoid, dihydrobenzofuran, polyketid, polysaccharid, alkaloid, ergosterol và polyphenol đã được cô lập và định danh. Theo tổ chức WHO (2020), ung thư là căn bệnh gây tử vong hàng đầu trên thế giới và tỷ lệ ngày càng tăng nhanh nên việc tìm kiếm các hợp chất mới trong điều trị ung thư đã và đang được nhiều nghiên cứu trên thế giới quan tâm.

Hiện nay, các nghiên cứu đã phát hiện nhiều hợp chất kháng phân bào tiềm năng đối với các dòng tế bào ung thư từ Cordyceps spp. như cordycepin, cordypyridon, cordysinin A, isariotin, acetoxyscirpenediol, polysaccharid, beauvericin, ergosterol… và các dẫn xuất [3]. Cordyceps là chi đa dạng nhất trong họ Clavicipitaceae về số lượng loài (hơn 750 loài) và phổ ký chủ. Tuy nhiên, chỉ có 04 loài thuộc chi Cordyceps và Isaria được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi bao gồm C.

Các công trình nghiên cứu và ứng dụng nấm Cordyceps chủ yếu được thực hiện trên các chủng nấm được phân lập và có nguồn gốc từ nước ngoài nên hướng ứng dụng thực tế có nhiều hạn chế khi ứng dụng tại Việt Nam. Việc nghiên cứu và ứng dụng các chủng nấm Cordyceps của Việt Nam, được phân lập và nuôi cấy tại Việt Nam giúp chủ động hơn trong việc khai thác, bảo tồn và ứng dụng tạo các sản phẩm hữu ích. Việt Nam là Quốc gia có đa dạng các chủng nấm ký sinh côn trùng thuộc chi Cordyceps và Isaria. Các nghiên cứu tại Việt Nam chủ yếu thực hiện ở mức độ trên cao chiết của các loài nấm Cordyceps spp.

và còn rất ít các nghiên cứu về cô lập các hợp chất tự nhiên và xác định hoạt tính kháng phân bào của các hợp chất thu nhận được. Do đó, để đánh giá hoạt tính kháng phân bào trên các dòng tế bào ung thư của các cao chiết và các hoạt chất từ sinh khối hệ sợi và quả thể nấm ký sinh côn trùng phân lập và nuôi trồng tại Việt Nam làm tiền đề cho các nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng tại Viêt Nam tạo nguồn nguyên liệu cho các ứng dụng thực tế trong dược phẩm, luận án “Nghiên cứu đánh giá hoạt tính kháng phân bào trên dòng tế bào ung thư MCF-7, Jurkat T của cao chiết và hoạt chất từ sinh khối, quả thể nhân nuôi của chủng nấm Cordyceps neovolkiana DL0004 và Isaria cicadae F0004’’ với nội dung thực hiện như sau: tạo cao chiết từ sinh khối và quả thể nấm nuôi trồng; sàng lọc cao chiết có độc tính tế bào tiềm năng trên hai dòng tế bào ung thư MCF-7 và Jurkat T; xác nhận đặc tính kháng phân bào của các cao chiết tiềm năng; cô lập và xác định hợp chất có hoạt tính kháng phân bào từ cao chiết tiềm năng là khả thi và cần thiết. Tổng quan về nấm Cordyceps 1. Giới thiệu về nấm Cordyceps Theo Holiday (2008) [4], nấm Cordyceps được phân loại như sau: Giới: Fungi Ngành: Ascomycota Lớp: Ascomycetes Bộ: Hypocreales Họ: Clavicipataceae Chi: Cordyceps Cordyceps được xếp vào họ Clavicipitaceae dựa vào túi bào tử hình trụ, độ dày đỉnh nang và các nang bào tử.

Đặc biệt, Cordyceps được đặc trưng bởi quả thể hình cuống và thường ở dạng hình chuỳ trên bề mặt hay đắm mình hoàn toàn vào chất nền. Cordyceps là chi đa dạng nhất trong họ Clavicipitaceae về số lượng loài và phổ ký chủ. Phổ ký chủ của chúng rất rộng, thường thuộc nhóm côn trùng và động vật thuộc lớp chân khớp. Mỗi loài được giới hạn với một vật chủ duy nhất hay một tập hợp các ký chủ có mối liên hệ chặt chẽ với nhau (hình 1.

Theo sinh thái học, Cordyceps được xem là tác nhân gây bệnh ở động vật chân khớp và các loài nấm thuộc chi Elaphomyces [5]. Thông qua đặc điểm hình thái của quả thể và túi bào tử, Cordyceps được chia làm 3 giống: C. subg ophiocordyceps và C. Một số quả thể nấm Cordyceps tự nhiên Chú thích: A) C.

militaris (Nguồn: https://www.com) Một số nghiên cứu phát sinh loài khác dựa vào ribosome của DNA đã được tiến hành để kiểm tra và hoàn chỉnh việc phân loại Cordyceps nhưng vẫn gặp nhiều hạn chế. Năm 2010, một nhóm các nhà nấm học của Mỹ, Thái Lan và Hàn Quốc đã phối hợp nghiên cứu và sắp xếp lại hệ thống của nhóm nấm Cordyceps. Theo kết quả nghiên cứu này, toàn bộ các loài thuộc nhóm nấm Cordyceps được phân chia lại thuộc về 3 họ: họ Clavicipitaceae với các chi Metacordyceps, Hypocrella, Regiocrella và Torrubiella; họ Cordycipitaceae với chi Cordyceps; họ Ophiocordycepitaceae với 2 chi Ophiocordyceps và Elaphocordyceps [6]. Năm 2007, nghiên cứu của Sung và cộng sự đã xếp chi Isaria thuộc ngành Ascomycota, lớp Sordariomycetes, bộ Hypocreales, họ Cordycipitaceae [7].

Một số chi được quan tâm nhiều nhất hiện nay bởi tính chất dược lý hay khả năng kiểm soát sinh học bao gồm Cordyceps, Beauveria và Isaria [8]. Chi Isaria bao gồm các loài nấm ký sinh côn trùng phân bố khá rộng, dễ dàng thu thập. Isaria là giai đoạn sinh sản vô tính (giai đoạn hình thành bào tử đính) của chi Cordyceps [3]. 4 Trong các loài Cordyceps spp.

sinensis là nổi tiếng nhất về giá trị ứng dụng chữa bệnh, bồi bổ sức khỏe con người và nó phân bố chủ yếu ở Nepal, Bhutan, Ấn Độ và Cao nguyên Tây Tạng của Trung Quốc, độ cao từ 3000 m – 5000 m so với mực nước biển. sinensis nhiều loài nấm Cordyceps spp. khác cũng được phát hiện [9]: Họ Clavicipitaceae gồm có Metacordyceps liangshanensis, phân bố chủ yếu ở Trung Quốc và Nepal. Họ Cordycipitaceae gồm có Cordyceps coccinea (Được phát hiện tại: Indonesia, Srilanka, Nhật Bản, Công Gô và Nepal), C.

Họ Ophiocordycipitaceae gồm có Ophiocordyceps fornicarum (Được phát hiện tại: Nhật Bản, Nepal, Hàn Quốc và Trung Quốc), O. Tổng quan về Cordyceps neovolkiana và Isaria cicadae Theo hệ thống phân loại của Kobayasi (1982), Cordyceps neovolkiana thuộc [10]: Ngành (phylum): Ascomycota Phân ngành (subphylum): Pezizomycotina Lớp (class): Sordariomycetes Bộ (odor): Hypocreales Họ (familia): Clavicipitaceae Chi: Cordyceps Hình 1. cicadae (B) tự nhiên Nguồn: naro.jp (A) và sciencedirect.com (B) Theo Sung (2007), Isaria cicadae thuộc [3], [7]: Giới (Kingdom): Fungi Ngành (phylum): Ascomycota Phân ngành (subphylum): Pezizomycotina Lớp (class): Sordariomycetes Bộ (odor): Hypocreales 6 Họ (familia): Cordycipitaceae Chi: Isaria Cordyceps neovolkiana (thể vô tính là Hirsutella neovolkiana) đã được tìm thấy ở vùng núi Langbiang, tỉnh Lâm Đồng Việt Nam ở độ cao 1. Về đặc điểm sinh thái, quả thể C.

neovolkiana có màu vàng rộng 2-3 mm và dài 3-5 cm [11]. Phương pháp luận nghiên cứu hỗ trợ định danh nấm ký sinh côn trùng bằng phân tích phả hệ phân tử vùng ITS1-5.8S-ITS2 đã được ứng dụng vào hỗ trợ định danh được một số mẫu nấm ký sinh côn trùng thu thập từ vùng núi Langbiang, tỉnh Lâm Đồng trong đó đã xác định được loài C. Isaria cicadae (Cordyceps cicadae) đã được tìm thấy tại huyện Ea kar, tỉnh Đắk Lắk, quá trình sinh trưởng và phát triển của I. cicadae tương tự với các loài thuộc nhóm Cordyceps khác: vào mùa thu hay mùa đông bào tử nấm sẽ lây nhiễm vật chủ qua lớp da ngoài (lớp cuticun), hình thành sợi tơ khắp cơ thể côn trùng dẫn đến gây chết côn trùng, đến mùa xuân khi khí hậu ấm hơn sẽ hình thành nên quả thể nấm từ các khớp hoặc các vị trí nếp da mỏng và phát tán bào tử.

cicadae hình thành quả thể màu trắng đục đến vàng nhạt từ miệng, đầu hoặc đáy của ấu trùng I. cicadae dài từ 2,5 -5 cm. Cuống bào tử phân nhánh dày đặc, rộng 3-6 µm bao gồm các nhánh hình vòng xoắn, bào tử hình trụ, thường cong vách trơn. cicadae F0004 được nuôi cấy nhân tạo thành công sinh khối và quả thể.

cicadae là một trong những loại thuốc y học cổ truyền Trung Quốc lâu đời nhất và nổi tiếng, với những công dụng của nó được ghi nhận từ thế kỷ thứ V. Trong nhiều thế kỷ, I. cicadae đã được sử dụng làm thực phẩm, thuốc bổ và thuốc dân gian để điều trị bệnh sốt rét, ung thư, sốt, tiểu đường, các bệnh về mắt, chóng mặt và các bệnh thận mãn tính [3], [13]. Hơn 110 hợp chất được phân lập từ I.

cicadae, dựa vào cấu trúc các hợp chất thuộc các nhóm chính amino acid, acid hữu cơ, lipid, phosphoslipid, nucleosid, carbohidrate và các dẫn xuất của chúng [14]. cicadae chứa nhiều hợp chất thứ cấp cũng được phát hiện trong sinh khối và quả thể trong đó, inositol, gamma-aminobutyric acid, ornithin và 7 threonin là hợp chất chính. Trong đó nhiều hợp chất được chứng minh hoạt tính sinh học tương tự với các chủng nấm khác thuộc chi Cordyceps như kháng phân bào, kháng oxy hóa, kháng viêm, chống trầm cảm và điều hòa miễn dịch. Các nucleosid chính được tìm thấy từ I.

cicadae gồm adenosin, guanosin, uridin, inosin, thymidin… và các dẫn xuất [3]. Trong đó, adenosin và các dẫn xuất thể hiện có nhiều hoạt tính như cordycepin có khả năng kháng phân bào, kháng oxy hóa, kháng viêm và điều hòa miễn dịch. Một dẫn xuất khác của adenosin là N- (2-hydroxyethyl) adenosin cũng đã được phân lập và thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa và kháng viêm [15]. Nhiều hợp chất thứ cấp khác như phytosphingosin, cordycecin A, betain, oosporein, phytosphingosin, stipitatonic acid cũng được phát hiện trong hệ sợi và bào tử của nấm trong đó oosporein cũng biểu hiện hoạt tính kháng khuẩn, kháng oxy hóa, kháng côn trùng cùng một số nấm và gây độc tế bào.

Hercynin và ergothionein – dẫn suất của histidin - phát hiện trong hệ sơi và quả thể, có khả năng kháng oxy hóa và bảo vệ tế bào; fumimycin cũng được tìm thấy trong hệ sợi và có khả năng kháng khuẩn chống lại Staphylococcus aureus, ức chế enzyme peptid deformylase; myriocin được phân lập từ dịch nuôi cấy, sinh khối và bào tử I. cicadae thể hiện hoạt động kháng nấm, ức chế tốt Candida albicans và có độc tính cao với LD50 2–10 mg/kg trên chuột [3]. Nghiên cứu Zhu và cộng sự (2020) đã đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của polysaccharid thu nhận từ Cordyceps cicadae, kết quả cho thấy polysaccharid thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa mạnh và kéo dài tuổi thọ của Drosophila khỏi tác nhân oxy hóa thông qua tăng biểu hiện của các gen mã hóa cho các enzyme catalase (CAT) và glutathione peroxidase (GSH-Px) và ức chế sự hình thành hợp chất malondialdehyde (MDA). Đồng thời, polysaccharid cũng thay đổi mức độ biểu hiện của các gen liên quan đến quá trình chống oxy hóa CAT, SOD1 và MTH trong ruồi giấm (Drosophila melanogaster) [17].