Giới thiệu dự án

Ngành chăn nuôi lợn tại Việt Nam đóng vai trò trụ cột trong cơ cấu nông nghiệp, cung cấp hơn 60% tổng sản lượng thịt tiêu thụ nội địa. Tuy nhiên, sự bùng phát của virus Dịch tả lợn Châu Phi (African Swine Fever Virus - ASFV) từ tháng 02/2019 tại Hưng Yên và Thái Bình đã gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng, dẫn đến việc tiêu hủy hàng triệu cá thể lợn trên toàn quốc. ASFV là virus DNA sợi đôi kích thước lớn (170–193 kbp) thuộc họ Asfaviridae, có tỷ lệ gây chết (mortality rate) lên đến 100% ở thể quá cấp tính và cấp tính. Mặc dù các vắc-xin thương mại như NAVET-ASFVAC hay AVAC ASF LIVE đã bước đầu được cấp phép, tỷ lệ bảo hộ thực địa và khả năng đáp ứng miễn dịch vẫn còn biến động, khiến nguy cơ bùng phát ổ dịch mới luôn thường trực.

+-----------------------------------------------------------------------------+
|                          ASFV DIAGNOSTIC CHALLENGES                         |
+-----------------------------------------------------------------------------+
| 1. High Virulence & Fast Spread -> 100% Mortality Rate                     |
| 2. Traditional Extraction Kits -> High Cost ($3 - $5/sample) & 45-60 min    |
| 3. TaqMan Probe Kits           -> Expensive Fluorescent Dual-labeled Probes |
| 4. Hemolyzed Field Serum       -> High Polymerase Inhibitors (Heme/Proteins)|
+-----------------------------------------------------------------------------+

Vấn đề cốt lõi hiện nay là quy trình xét nghiệm tiêu chuẩn Realtime PCR (qPCR) phụ thuộc nhiều vào bước tách chiết DNA qua cột silica (spin column), đòi hỏi thời gian thao tác dài (45–60 phút/mẫu), chi phí hóa chất cao và yêu cầu kỹ thuật viên thành thạo. Bên cạnh đó, các bộ kit thương mại sử dụng mẫu dò huỳnh quang kép (TaqMan probe) có giá thành sản xuất đắt đỏ.

Mục tiêu cụ thể của đồ án:

  1. Đánh giá độ nhạy phân tích (Limit of Detection - LOD) và độ đặc hiệu phân tích (Analytical Specificity) của bộ kit thử nghiệm SYBR Green I Realtime PCR nhắm vào gen B646L (mã hóa protein capsid p72 của ASFV).
  2. Tối ưu hóa và kiểm tra hiệu quả của quy trình tiền xử lý trực tiếp mẫu huyết thanh (pretreated serum) bằng Proteinase K kết hợp sốc nhiệt để loại bỏ bước ly trích DNA truyền thống.
  3. Thử nghiệm đối chứng trên 66 mẫu bệnh phẩm thực địa thu thập từ khu vực Đông Nam Bộ, so sánh trực tiếp các chỉ số chẩn đoán (Độ nhạy $Se$, Độ đặc hiệu $Sp$, Giá trị dự đoán dương tính $PPV$, Giá trị dự đoán âm tính $NPV$, Hệ số biến động $CV%$) giữa mẫu DNA tách chiết chuẩn và mẫu serum tiền xử lý.

Đồ án được giới hạn trong phạm vi thử nghiệm trên hệ thống máy luân nhiệt huỳnh quang LineGene K Plus 48-well (Bioer), sử dụng mẫu huyết thanh lợn thu thập tại Đông Nam Bộ và so sánh trực tiếp với bộ kit TaqMan qPCR thương mại đạt chuẩn TCVN.

Phân tích và thiết kế giải pháp

Phân tích hiện trạng

Các phương pháp phát hiện ASFV phổ biến hiện nay bao gồm thử nghiệm hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme (ELISA), sắc ký miễn dịch nhanh (Lateral Flow Strip), PCR truyền thống và TaqMan Realtime PCR.

Phương pháp Độ nhạy / Giới hạn phát hiện (LOD) Thời gian xử lý Chi phí vận hành Nhược điểm chính
ELISA Kháng thể/Kháng nguyên Thấp - Trung bình 2 – 4 giờ Thấp Không phát hiện được giai đoạn ủ bệnh sớm; kháng thể xuất hiện muộn
PCR Truyền thống (Gel Agarose) $10^2 - 10^3\text{ copies/}\mu\text{l}$ 3 – 5 giờ Trung bình Dễ nhiễm chéo sản phẩm (carry-over contamination), tốn công điện di
TaqMan Realtime PCR (Thương mại) $10 - 100\text{ copies/}\mu\text{l}$ 1.5 – 2 giờ Cao Chi phí đầu dò huỳnh quang đắt; bắt buộc ly trích DNA bằng kit cột
SYBR Green I qPCR (Giải pháp đề tài) 3 copies/phản ứng 45 – 60 phút Thấp - Tối ưu Cần kiểm soát primer-dimer bằng phân tích đường cong nóng chảy (Melting Curve)

Áp dụng mô hình ưu tiên yêu cầu MoSCoW cho hệ thống xét nghiệm:

  • Must have: Phát hiện chính xác chủng ASFV lưu hành, không bắt chéo với PRRSV, PCV2, CSFV, vi khuẩn đường ruột; giới hạn phát hiện $\le 10\text{ copies/rxn}$; phân tích Melting Curve tự động.
  • Should have: Quy trình tiền xử lý huyết thanh thô không cần cột silica, rút ngắn thời gian chuẩn bị mẫu xuống dưới 30 phút.
  • Could have: Tương thích với các hệ thống máy Realtime PCR đa kênh (Bio-Rad, Applied Biosystems, Bioer LineGene).
  • Won't have (lần này): Tích hợp trực tiếp công nghệ ly giải tế bào đẳng nhiệt không cần block nhiệt.

Thiết kế hệ thống

Quy trình kỹ thuật được chuẩn hóa thành 2 luồng xử lý song song để đánh giá tính tương thích của bộ kit SYBR Green I:

[Mẫu Máu Đông Thực Địa]
         |
         v (Ly tâm 3.000 - 13.000 RCF, 5 min)
  [Thu Huyết Thanh / Serum]
         |
         +---------------------------------------+
         |                                       |
  [Nhánh 1: Ly trích DNA chuẩn]           [Nhánh 2: Tiền xử lý trực tiếp]
  - AccuRive pDNA Prep Kit (5 bước)       - 10 µL Serum + 40 µL H2O + 2 µL Proteinase K
  - Lysis KTS1 -> Bind KTS2/3             - Ủ 55°C / 15 min (Thủy phân Protein)
  - Wash KTS4 -> Elute KTS5 (50 µL)       - Ủ 90°C / 10 min (Bất hoạt Enzyme)
  - Thời gian: 45 - 60 phút               - Ly tâm 13.000 RCF / 1 min
         |                                - Thời gian: 26 phút
         |                                       |
         +-------------------+-------------------+
                             |
                             v
                 [Phản ứng SYBR Green I qPCR]
                 - Master Mix 5X with SYBR (4 µL)
                 - ASFV Primer Mix (2 µL)
                 - Template DNA (3 µL) hoặc Serum tiền xử lý (5 µL)
                 - Nước cất tự do Nuclease (đủ 20 µL)
                             |
                             v
                 [Luân nhiệt: LineGene K Plus]
                 - 95°C / 5 min (1 chu kỳ)
                 - 35 chu kỳ: 95°C (15s) - 55°C (15s) - 72°C (15s)
                 - Phân tích Melting Curve: 70°C -> 95°C (0.5°C/bước)

Thông số thành phần Master Mix và hóa chất sử dụng:

  • SYBR Green I Master Mix (5X): Chứa Hot-start Taq DNA Polymerase nồng độ cao, dNTPs mix ($0.2\text{ mM}$ mỗi loại), $\text{MgCl}2$ đệm tối ưu hóa, và chất nhuộm huỳnh quang bám chèn rãnh nhỏ DNA sợi đôi SYBR Green I ($\lambda{\text{excitation}} = 488\text{ nm}$, $\lambda_{\text{emission}} = 522\text{ nm}$).
  • Proteinase K ($20\text{ mg/mL}$): Enzyme protease hoạt tính cao phân cắt liên kết peptide, phá hủy vỏ capsid protein p72 của virion ASFV và giải phóng bộ gen DNA.

Methodology

Nghiên cứu áp dụng phương pháp thực nghiệm kiểm chứng có đối chứng mù kép (double-blind controlled validation):

  1. Giai đoạn 1 (Tuần 1–4): Thiết lập điều kiện phản ứng nhiệt, xác định LOD bằng dãy pha loãng plasmid chuẩn ASFV Positive Control ($2 \times 10^5\text{ copies/}\mu\text{l}$ xuống $10^0\text{ copies/}\mu\text{l}$), dựng đường chuẩn hồi quy tuyến tính.
  2. Giai đoạn 2 (Tuần 5–8): Thử nghiệm độ đặc hiệu phân tích trên 10 tác nhân gây bệnh phổ biến trên lợn (Pasteurella multocida, Streptococcus suis, E. coli, Salmonella spp., Actinobacillus suis, S. aureus, E. rhusiopathiae, C. perfringens, PCV2, PRRSV, PEDV).
  3. Giai đoạn 3 (Tuần 9–16): Đánh giá lâm sàng trên 66 mẫu thực địa từ các trang trại Đông Nam Bộ, chạy lặp lại 3 lần (triplicate) để xác định độ lặp lại và hệ số $CV%$.

Implementation và kết quả

Development process & Core Algorithms

Thuật toán xác định chu kỳ ngưỡng ($C_t$) và phân tích nhiệt độ nóng chảy ($T_m$) được biểu diễn bằng đoạn mã giải thuật xử lý dữ liệu huỳnh quang thô:

import numpy as np
from scipy.optimize import curve_fit

def calculate_cycle_threshold(fluorescence_signals, baseline_cycles=(3, 15), threshold_std_multiplier=10):
    """
    Tính toán chỉ số Ct từ dữ liệu huỳnh quang qPCR thô.
    """
    # 1. Xác định đường nền Baseline
    baseline = np.mean(fluorescence_signals[baseline_cycles[0]:baseline_cycles[1]])
    baseline_std = np.std(fluorescence_signals[baseline_cycles[0]:baseline_cycles[1]])
    
    # 2. Thiết lập đường ngưỡng Threshold
    threshold = baseline + (threshold_std_multiplier * baseline_std)
    
    # 3. Tìm chu kỳ giao cắt (Linear Interpolation)
    for cycle in range(baseline_cycles[1], len(fluorescence_signals) - 1):
        if fluorescence_signals[cycle] <= threshold < fluorescence_signals[cycle + 1]:
            ct = cycle + (threshold - fluorescence_signals[cycle]) / (
                fluorescence_signals[cycle + 1] - fluorescence_signals[cycle]
            )
            return round(ct, 2)
    return None

def analyze_melting_curve(temperatures, fluorescence_intensity):
    """
    Tìm đỉnh nóng chảy Tm peak thông qua đạo hàm bậc 1 âm (-dF/dT).
    """
    dF_dT = -np.gradient(fluorescence_intensity, temperatures)
    peak_index = np.argmax(dF_dT)
    tm_peak = temperatures[peak_index]
    return tm_peak, dF_dT

# Dữ liệu thực nghiệm đường chuẩn plasmid DNA ASFV
copies_per_rxn = np.array([3e5, 3e4, 3e3, 3e2, 3e1, 3e0])
log_copies = np.log10(copies_per_rxn)
mean_ct = np.array([12.91, 16.07, 19.42, 22.85, 26.66, 30.13])

# Hồi quy tuyến tính: y = slope * x + intercept
slope, intercept = np.polyfit(log_copies, mean_ct, 1)
r_squared = np.corrcoef(log_copies, mean_ct)[0, 1] ** 2
amplification_efficiency = (10 ** (-1 / slope) - 1) * 100

print(f"Phương trình đường chuẩn: Ct = {slope:.4f} * Log10(Copies) + {intercept:.4f}")
print(f"Hệ số xác định R2: {r_squared * 100:.2f}%")
print(f"Hiệu quả khuếch đại E: {amplification_efficiency:.2f}%")

Testing và validation

1. Độ đặc hiệu phân tích (Analytical Specificity)

Thử nghiệm phản ứng Realtime PCR với DNA/RNA của 11 mầm bệnh thường gặp trên đàn lợn cho thấy chỉ duy nhất mẫu đối chứng dương ASFV và các mẫu nhiễm ASFV thực địa xuất hiện đường cong khuếch đại huỳnh quang với đỉnh nóng chảy đặc trưng $T_m = 78.5^\circ\text{C} - 83.5^\circ\text{C}$ (trung bình $79.2^\circ\text{C}$). Toàn bộ các chủng vi khuẩn (P. multocida, S. suis, E. coli, Salmonella...) và virus (PCV2, PRRSV, CSFV, PEDV) đều không có tín hiệu huỳnh quang vượt ngưỡng ($C_t = \text{N/A}$), đạt độ đặc hiệu phân tích 100%.

Fluorescence (-dF/dT)
      |                  ASFV Specific Melting Peak (Tm = 78.8°C - 79.5°C)
      |                               /\
      |                              /  \
      |                             /    \
      |                            /      \        Non-target Pathogens / NTC
      |       Primer-Dimer (<74°C)/        \       (No amplification peak)
      |              _/\_        /          \_____________________
      +---------------/----\----+------------+-------------------------> Temperature (°C)
                     70°C      74°C        79.0°C                   95°C

2. Giới hạn phát hiện (LOD) và Đường chuẩn định lượng

  • Dãy nồng độ pha loãng từ $3 \times 10^5$ đến $3 \times 10^0\text{ copies/phản ứng}$ đều cho tín hiệu khuếch đại 100% qua cả 3 lần lặp lại.
  • Giới hạn phát hiện (LOD) của bộ kit được xác định chính xác là 3 copies/phản ứng (tương đương $10^0\text{ copies/}\mu\text{l}$ mẫu nạp).
  • Phương trình đường chuẩn: $y = -3.4657x + 30.004$, hệ số tương quan $R^2 = 0.9992$ ($99.92%$), hệ số góc $\text{Slope} = -3.4657$, hiệu quả khuếch đại $E = 94.33%$ (nằm trong khoảng tối ưu theo khuyến nghị OIE: $90 - 110%$).

3. Kết quả thử nghiệm trên 66 mẫu thực địa

+-----------------------------------------------------------------------------+
|                      66 FIELD CLINICAL SAMPLES RESULTS                      |
+-----------------------------------------------------------------------------+
| Commercial TaqMan Kit (Control) : 47 Dương tính (71%) | 19 Âm tính (29%)   |
| Trial SYBR Kit (Extracted DNA)  : 47 Dương tính (71%) | 19 Âm tính (29%)   |
| Trial SYBR Kit (Direct Serum)   : 45 Dương tính (68%) | 21 Âm tính (32%)   |
+-----------------------------------------------------------------------------+
Chỉ số đánh giá Mẫu DNA tách chiết chuẩn (AccuRive Kit) Mẫu Serum tiền xử lý trực tiếp (Proteinase K)
Số mẫu dương tính thật (TP) 47 / 47 mẫu ($100%$) 45 / 47 mẫu ($95.7%$)
Số mẫu âm tính thật (TN) 19 / 19 mẫu ($100%$) 19 / 19 mẫu ($100%$)
Số mẫu âm tính giả (FN) 0 mẫu ($0%$) 2 mẫu ($4.3%$)
Số mẫu dương tính giả (FP) 0 mẫu ($0%$) 0 mẫu ($0%$)
Độ nhạy chẩn đoán ($Se$) 100% 95.7%
Độ đặc hiệu chẩn đoán ($Sp$) 100% 100%
Giá trị dự đoán dương ($PPV$) 100% 100%
Giá trị dự đoán âm ($NPV$) 100% 90.5%
Độ ổn định $C_t$ ($CV%$) $0.23% - 9.48%$ (Trung bình: $3.00%$) $0.61% - 8.92%$ (Trung bình: $3.45%$)
Độ ổn định $T_m$ ($CV%$) $0.03% - 2.07%$ $0.04% - 1.08%$

Phân tích nguyên nhân chênh lệch giữa hai nền mẫu

Đối với mẫu serum tiền xử lý trực tiếp, chỉ số chu kỳ ngưỡng $C_t$ xuất hiện trễ hơn trung bình 4 chu kỳ so với mẫu DNA tinh sạch. Nguyên nhân kỹ thuật:

  1. Hệ số pha loãng 5 lần: Quy trình bổ sung $40\mu\text{L}\ \text{H}_2\text{O}$ vào $10\mu\text{L}$ serum làm giảm mật độ bản sao virus ban đầu trước khi nạp phản ứng.
  2. Hiện tượng tán huyết (Hemolysis): Hai mẫu âm tính giả (M29, M64 ở nồng độ virus thấp) có nền huyết thanh đỏ thẫm do hồng cầu vỡ. Sắc tố Heme và protein huyết tương dư thừa đóng vai trò chất ức chế enzyme Taq Polymerase, làm giảm hiệu suất khuếch đại ở các mẫu có tải lượng ban đầu cận ngưỡng phát hiện.

Đổi mới và đóng góp

Đổi mới công nghệ

  • Cơ chế xác thực kép (Dual-Verification) không cần Probe: Kết hợp độ nhạy cao của chất nhuộm chèn SYBR Green I với thuật toán phân tích đỉnh nóng chảy Melting Curve ($T_m$), giúp phân biệt hoàn toàn sản phẩm khuếch đại đặc hiệu gen B646L với hiện tượng bắt cặp không đặc hiệu (primer-dimer), triệt tiêu hoàn toàn tỷ lệ dương tính giả mà không cần đầu dò TaqMan đắt tiền.
  • Quy trình Direct-qPCR trên huyết thanh lợn: Đơn giản hóa quy trình chiết xuất mẫu thành một bước thủy phân protein enzyme ở $55^\circ\text{C}$ và sốc nhiệt $90^\circ\text{C}$, giúp rút ngắn $60%$ thời gian thao tác chuẩn bị mẫu.
+-------------------------------------------------------------------------------+
|                       COMPARATIVE EFFICIENCY ANALYSIS                         |
+-------------------------------------------------------------------------------+
| Feature              | Traditional TaqMan qPCR | SYBR Green I Direct Serum    |
+----------------------+-------------------------+------------------------------+
| Sample Prep Time     | 45 - 60 min (5 steps)   | 26 min (Single tube)         |
| Run Time (LineGene)  | 70 min                  | 65 min                       |
| Total Diagnostic Turn| ~130 min                | ~90 min (-30.7% total time)  |
| Extraction Cost/Test | $2.50 - $4.00           | $0.30 - $0.50 (-85% cost)    |
| Diagnostic Agreement | 100% (Baseline)         | 95.7% (High Concordance)     |
+-------------------------------------------------------------------------------+

Ứng dụng thực tế và triển khai

Kịch bản ứng dụng lâm sàng

  1. Trạm kiểm dịch động vật và lò mổ tập trung: Sàng lọc nhanh các lô lợn nghi nhiễm ASFV trước khi giết mổ với quy trình Direct-Serum trong vòng 90 phút.
  2. Phòng xét nghiệm thú y tuyến huyện / cơ sở chăn nuôi quy mô vừa và lớn: Triển khai kit SYBR Green I trên các mẫu DNA tinh sạch để chẩn đoán khẳng định ổ dịch với chi phí hóa chất tiết kiệm $50%$ so với kit ngoại nhập.

Hướng dẫn quy trình vận hành chuẩn (SOP Deployment)

# Quy trình vận hành chuẩn bị mẫu Serum tiền xử lý tại phòng Lab
1. Thu nhận 1.5 mL máu tĩnh mạch tai/cổ lợn vào ống nghiệm chống đông/máu đông.
2. Ly tâm 3,000 RCF trong 5 phút ở 4°C để tách huyết thanh trong suốt.
3. Trong tủ an toàn sinh học cấp 2 (Biosafety Level 2 Cabinet):
   - Hút 10 µL Serum cho vào ống PCR strip 0.2 mL.
   - Thêm 40 µL RNase/DNase-free Water và 2 µL Proteinase K (20 mg/mL).
4. Đặt vào máy luân nhiệt (Thermal Cycler):
   - Ủ 55°C trong 15 phút (Ly giải protein capsid).
   - Ủ 90°C trong 10 phút (Bất hoạt nhiệt Proteinase K).
5. Ly tâm nhanh 13,000 RCF trong 60 giây.
6. Hút 5 µL dịch nổi làm khuôn nạp trực tiếp vào ống Master Mix qPCR.

Yêu cầu cấu hình hệ thống phần cứng & an toàn sinh học

  • Thiết bị Realtime PCR: Tương thích các hệ thống có kênh đọc huỳnh quang FAM/SYBR Green ($\text{Ex } 488\text{ nm} / \text{Em } 520 - 530\text{ nm}$), tốc độ gia nhiệt $\ge 3^\circ\text{C/giây}$.
  • Cấp độ an toàn sinh học: Phòng thí nghiệm đạt chuẩn an toàn sinh học cấp 2 (BSL-2), có tủ cấy vi sinh dòng khí thổi đứng và hệ thống xử lý chất thải lây nhiễm bằng nồi hấp tiệt trùng ($121^\circ\text{C}$, 1 atm trong 30 phút).

Hạn chế và hướng phát triển

Hạn chế kỹ thuật

  • Độ nhạy trên mẫu tán huyết: Tỷ lệ âm tính giả $4.3%$ xảy ra ở các mẫu serum chứa nhiều mảnh vỡ hồng cầu và nồng độ virus thấp ($C_t > 30$).
  • Độ trễ chu kỳ ngưỡng: Hiện tượng $C_t$ tăng trung bình 4 chu kỳ khi chạy trực tiếp trên mẫu serum tiền xử lý do giảm thể tích nạp mẫu thực tế và nồng độ muối khoáng trong huyết thanh.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

  1. Bổ sung các chất trung hòa ức chế PCR chuyên biệt như BSA (Bovine Serum Albumin) hoặc Betaine vào thành phần 5X Master Mix để vô hiệu hóa tác động của Heme.
  2. Tích hợp gene nội chuẩn kiểm soát nội sinh (Internal Positive Control - ví dụ gen $\beta$-actin của lợn) để giám sát chất lượng mẫu và loại trừ hoàn toàn kết quả âm tính giả.
  3. Mở rộng thử nghiệm trên các loại bệnh phẩm thực địa khác như dịch ngoáy hầu họng, hạch lympho và tủy xương.

Đối tượng hưởng lợi

+-------------------------------------------------------------------------------+
|                           BENEFICIARY IMPACT MATRIX                           |
+-------------------------------------------------------------------------------+
| [Sinh viên & Giảng viên]  | Tiếp cận dữ liệu thực nghiệm chuẩn hóa, phương     |
|                           | trình đường chuẩn LOD 3 copies/rxn, phân tích Tm. |
+---------------------------+---------------------------------------------------+
| [Kỹ thuật viên xét nghiệm]| Sở hữu quy trình Direct Serum 26 phút, giảm bớt   |
|                           | 5 bước tách chiết cột, hạn chế tiếp xúc độc chất. |
+---------------------------+---------------------------------------------------+
| [Chủ trang trại & Doanh nghiệp] Giảm chi phí xét nghiệm định kỳ xuống 40 - 50%,|
|                           | nhận diện sớm mầm bệnh để khoanh vùng ổ dịch.     |
+---------------------------+---------------------------------------------------+
| [Nhà nghiên cứu dịch tễ]  | Bộ số liệu đối chứng 66 mẫu thực địa, nền tảng    |
|                           | phát triển kit multiplex chẩn đoán phân biệt.      |
+-------------------------------------------------------------------------------+

Câu hỏi thường gặp

1. Yêu cầu phần cứng tối thiểu để triển khai bộ kit SYBR Green I là gì?

Hệ thống cần máy Realtime PCR có kênh huỳnh quang FAM/SYBR (kích thích $\sim 488\text{ nm}$, thu nhận $\sim 522\text{ nm}$), dải nhiệt độ gia nhiệt hỗ trợ chương trình Melting Curve từ $70^\circ\text{C}$ đến $95^\circ\text{C}$ với bước tăng $0.5^\circ\text{C}$, đi kèm máy ly tâm tốc độ cao ($13.000\text{ RCF}$) và block ủ nhiệt $55^\circ\text{C} - 90^\circ\text{C}$.

2. Làm thế nào để phân biệt mẫu dương tính thật và hiện tượng dương tính giả do primer-dimer?

Kết quả được đánh giá dựa trên tiêu chuẩn kép: Mẫu được kết luận dương tính khi vừa có đường cong khuếch đại huỳnh quang vượt ngưỡng baseline ($C_t \le 35$), vừa xuất hiện đỉnh nóng chảy đơn đặc trưng tại khoảng $T_m = 78.5^\circ\text{C} - 83.5^\circ\text{C}$. Nếu có tín hiệu huỳnh quang nhưng $T_m < 75^\circ\text{C}$, đó là primer-dimer và mẫu được kết luận âm tính.

3. Có thể dùng bộ kit trực tiếp cho mẫu máu toàn phần chưa tách huyết thanh không?

Không khuyến cáo. Máu toàn phần chứa hàm lượng hemoglobin và chất chống đông (như Heparin) rất cao gây ức chế hoàn toàn Taq Polymerase. Cần ly tâm tách lấy huyết thanh trong suốt trước khi thực hiện quy trình tiền xử lý Proteinase K.

4. Chi phí cho một phản ứng xét nghiệm bằng kit SYBR Green I là bao nhiêu?

Chi phí hóa chất ước tính cho một phản ứng SYBR Green I qPCR (kèm tiền xử lý Proteinase K) dao động từ $15.000 - 25.000\text{ VNĐ}$/phản ứng, thấp hơn đáng kể so với mức $80.000 - 150.000\text{ VNĐ}$/phản ứng khi sử dụng kit TaqMan thương mại kèm kit ly trích DNA màng silica.

5. Thời hạn bảo quản và độ ổn định của các thành phần trong kit?

Master Mix 5X chứa SYBR Green I và Primer Mix được bảo quản ở $-20^\circ\text{C}$ trong điều kiện tránh ánh sáng, duy trì hoạt tính ổn định tối thiểu 12 tháng. Proteinase K bảo quản ở $-20^\circ\text{C}$ hoặc $4^\circ\text{C}$ sau khi hoàn nguyên.

Kết luận

Đề tài khóa luận đã hoàn thành toàn diện các mục tiêu nghiên cứu:

  1. Đánh giá thành công bộ kit SYBR Green I Realtime PCR phát hiện ASFV với độ nhạy phân tích cao (LOD đạt 3 copies/phản ứng), phương trình đường chuẩn $y = -3.4657x + 30.004$, hệ số $R^2 = 99.92%$, hiệu quả khuếch đại $E = 94.33%$ và độ đặc hiệu phân tích $100%$.
  2. Trên nền mẫu DNA tinh sạch từ 66 mẫu thực địa, bộ kit đạt độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị dự đoán dương tính ($PPV$) và âm tính ($NPV$) tuyệt đối 100%, với hệ số biến động $CV% < 9.5%$, hoàn toàn tương đương bộ kit TaqMan thương mại đối chứng.
  3. Chứng minh tính khả thi của quy trình tiền xử lý trực tiếp huyết thanh bằng Proteinase K, đạt độ chính xác 95.7% ($45/47$ mẫu dương tính), giúp cắt giảm hơn $30%$ tổng thời gian xét nghiệm và hạ giá thành vận hành chẩn đoán Dịch tả lợn Châu Phi tại thực địa.