So sánh khả năng phát hiện ASFV của Kit Realtime PCR trên mẫu DNA và Serum

Khóa luận: So sánh khả năng phát hiện virus ASF trên lợn bằng kit SYBR I Realtime PCR (mẫu DNA & serum). Nghiên cứu công nghệ sinh học quan trọng.

• Tác giả: Nguyễn Thanh Cảnh
• Người hướng dẫn: Ts. Đinh Xuân Phát
• Trường học: Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: So sánh khả năng phát hiện African Swine Fever Virus (ASFV) gây bệnh trên lợn của bộ kit SYBR I REALTIME PCR đối với mẫu đã tách chiết DNA và serum tiền xử lý
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2019 - 2023
• Địa điểm: Tp. Thủ Đức

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN
• TÓM TẮT
• ABSTRACT
• MỤC LỤC
• DANH SÁCH CÁC BẢNG
• DANH SÁCH CAC HÌNH
• DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ
• 2. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Lịch sử dịch tả lợn Châu Phi
• 2.2. African Swine Fever Virus (ASFV)
• 2.3. Cấu trúc của ASFV
• 2.4. Cơ chế xâm nhập và biểu hiện gen của ASFV
• 2.5. Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích
• 2.6. Bệnh tích do ASFV
• 2.7. Tổng quan về Realtime PCR
• 2.8. Realtime PCR sử dụng đoạn dò (probe)
• 2.9. Realtime PCR sử dụng chất phát huỳnh quang bám vào sợi đôi DNA
• 2.10. Biểu đồ khuếch đại Real-time PCR
• 2.11. Định lượng trong realtime PCR
• 2.12. Tình hình nghiên cứu ASFV
• 2.13. Nghiên cứu quốc tế
• 3. CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 3.2. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
• 3.3. Đối tượng nghiên cứu
• 3.4. Phương pháp nghiên cứu
• 3.5. Quy trình thu huyết thanh và tiền xử lý mẫu
• 3.6. Qui trình ly tách DNA
• 3.7. Kiểm tra độ đặc hiệu phân tích
• 3.8. Xác định giới hạn phát hiện (LOD)
• 3.9. Đánh giá khả năng phát hiện ASFV của bộ kit trên mẫu đã ly trích DNA
• 3.10. Độ đặc hiệu, độ nhạy chân đoán, giá trị dự đoán dương tính, giá trị dự đoán âm tính của bộ kit thử nghiệm đối với mẫu đã tách chiết DNA
• 3.11. Đánh giá khả năng phát hiện ASFV của bộ kit trên mẫu chưa tách chiết DNA
• 3.12. Độ đặc hiệu, độ nhạy chân đoán, giá trị dự đoán dương tính, giá trị dự đoán âm tính của bộ kit thử nghiệm đối với mẫu chưa tách chiết DNA
• 3.13. So sánh kết quả phản ứng Realtime PCR phát hiện ASFV của bộ kit thử nghiệm giữa mẫu đã tách chiết DNA và mẫu chưa tách chiết DNA
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của bộ kit thử nghiệm
• 4.2. Kết quả kiểm tra giới hạn phát hiện của bộ kit thử nghiệm
• 4.3. Đánh giá khả năng phát hiện ASFV của bộ kit trên mẫu đã ly trích DNA
• 4.4. Kiểm tra độ chính xác trong việc phát hiện ASFV
• 4.5. Đánh giá độ ổn định của bộ kit trong việc phát hiện ASFV
• 4.6. Đánh giá khả năng phát hiện ASFV của bộ kit trên mẫu Serum tiền xử lý
• 4.7. Kiểm tra độ chính xác trong việc phát hiện ASFV
• 4.8. So sánh kết quả Realtime PCR phát hiện ASFV của bộ kit thử nghiệm giữa mẫu đã tách chiết DNA va mẫu chưa tách chiết
• 5. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Vai trò Realtime PCR trong chẩn đoán Dịch tả lợn Châu Phi

Trong bối cảnh ngành chăn nuôi đối mặt với những thách thức từ Dịch tả lợn Châu Phi (ASF), việc phát hiện sớm và chính xác virus ASFV đóng vai trò tiên quyết. Phương pháp Realtime PCR (hay qPCR) đã khẳng định vị thế là 'tiêu chuẩn vàng' nhờ khả năng cung cấp kết quả nhanh chóng, có độ nhạy và độ đặc hiệu vượt trội. Kỹ thuật này cho phép phát hiện vật liệu di truyền (DNA) của virus ngay cả khi tải lượng mầm bệnh còn rất thấp, giúp các cơ quan thú y và trang trại đưa ra biện pháp khoanh vùng, dập dịch kịp thời, giảm thiểu tối đa thiệt hại kinh tế. Sự phát triển của các bộ kit xét nghiệm thương mại hóa đã giúp chuẩn hóa và đơn giản hóa quy trình xét nghiệm, mang lại công cụ chẩn đoán mạnh mẽ cho các phòng thí nghiệm trên toàn quốc. Bài viết này sẽ đi sâu phân tích hai yếu tố then chốt ảnh hưởng đến kết quả chẩn đoán: chất lượng của bộ kit và loại mẫu bệnh phẩm được sử dụng.

1.1. Tổng quan về mối đe dọa từ virus ASFV

Dịch tả lợn Châu Phi là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm do African Swine Fever Virus (ASFV) gây ra, được Tổ chức Thú y Thế giới (OIE) liệt vào danh sách các bệnh cần đặc biệt chú ý. Virus này có khả năng gây chết lên đến 100% ở mọi lứa tuổi heo, không phân biệt heo nhà hay heo rừng. Kể từ khi được phát hiện lần đầu tại Việt Nam vào tháng 2/2019, ASF đã gây ra những tổn thất nặng nề cho ngành chăn nuôi. Mặc dù vắc-xin đã được nghiên cứu và sản xuất, khả năng đáp ứng miễn dịch vẫn còn hạn chế, khiến cho việc giám sát dịch tễ và sàng lọc virus thông qua chẩn đoán vẫn là biện pháp cốt lõi. Việc phát hiện mầm bệnh nhanh chóng không chỉ giúp bảo vệ đàn heo mà còn là yếu tố quan trọng trong việc đảm bảo an ninh lương thực và ổn định kinh tế.

1.2. Nguyên lý của phản ứng chuỗi polymerase thời gian thực

Realtime PCR là một kỹ thuật sinh học phân tử cho phép khuếch đại và định lượng một đoạn DNA mục tiêu trong thời gian thực. Khác với PCR truyền thống, qPCR sử dụng các tín hiệu huỳnh quang phát ra sau mỗi chu kỳ nhiệt để theo dõi sự gia tăng của sản phẩm. Cường độ tín hiệu huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng bản sao DNA được tạo ra. Dựa vào chu kỳ mà tín hiệu vượt qua một ngưỡng nhất định (gọi là giá trị Ct), các nhà khoa học có thể xác định sự hiện diện và định lượng tải lượng virus trong mẫu bệnh phẩm. Ưu điểm của phương pháp này là tốc độ nhanh, độ nhạy cao, giảm nguy cơ ngoại nhiễm và có khả năng định lượng, cung cấp thông tin giá trị cho công tác chẩn đoán ASF.

II. Thách thức Lựa chọn Kit PCR và Mẫu bệnh phẩm tối ưu

Để có một kết quả xét nghiệm PCR đáng tin cậy, việc lựa chọn đúng bộ kit xét nghiệm và loại mẫu bệnh phẩm là vô cùng quan trọng. Một bộ kit chất lượng thấp có thể cho kết quả âm tính giả, bỏ sót heo bệnh và làm dịch lây lan. Ngược lại, một bộ kit không đủ độ đặc hiệu có thể gây ra dương tính giả, dẫn đến việc tiêu hủy đàn không cần thiết. Bên cạnh đó, loại mẫu bệnh phẩm (máu, mô, dịch miệng...) và quy trình xử lý mẫu cũng ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng DNA đầu vào cho phản ứng. Sự kết hợp không tối ưu giữa kit và mẫu có thể làm giảm hiệu suất xét nghiệm, gây tốn kém vật tư tiêu hao phòng lab và thời gian, đồng thời ảnh hưởng đến tính chính xác của công tác chẩn đoán.

2.1. Yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng bộ kit xét nghiệm ASF

Chất lượng của một bộ kit Realtime PCR phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Đầu tiên là thiết kế của mồi và đầu dò (primer & probe), chúng phải bắt cặp đặc hiệu vào vùng gen bảo tồn của virus ASFV để tránh phản ứng chéo với các mầm bệnh khác. Thứ hai là chất lượng của enzyme polymerase và các thành phần trong master mix, quyết định hiệu suất khuếch đại. Các yếu tố như độ nhạy, độ đặc hiệu, và ngưỡng phát hiện (LOD) là những thông số kỹ thuật quan trọng cần được nhà sản xuất công bố và kiểm định. Một bộ kit tốt cần có sự ổn định cao qua nhiều lần lặp lại, thể hiện qua hệ số biến động (CV%) thấp. Việc lựa chọn kit đã được các tổ chức uy tín như OIE công nhận sẽ đảm bảo độ tin cậy cao hơn trong thực tiễn.

2.2. Các loại mẫu bệnh phẩm phổ biến trong giám sát dịch tễ

Trong chẩn đoán ASF, nhiều loại mẫu bệnh phẩm có thể được sử dụng, mỗi loại có ưu và nhược điểm riêng. Mẫu máu toàn phần hoặc huyết thanh là loại phổ biến nhất vì dễ thu thập và chứa tải lượng virus cao trong giai đoạn cấp tính. Mẫu mô lách và mẫu hạch lympho từ heo chết thường cho kết quả chính xác nhất do virus tập trung nhiều ở các cơ quan này. Gần đây, dịch miệng (oral fluid) thu từ dây treo trong chuồng cũng được sử dụng để sàng lọc cả đàn, giúp giảm thiểu stress cho vật nuôi. Tuy nhiên, chất lượng mẫu phụ thuộc rất nhiều vào kỹ thuật thu thập, điều kiện bảo quản và quy trình tách chiết DNA, những yếu tố có thể ảnh hưởng lớn đến kết quả cuối cùng.

III. Hướng dẫn đánh giá Kit Realtime PCR phát hiện virus ASFV

Việc đánh giá một bộ kit Realtime PCR mới trước khi đưa vào sử dụng rộng rãi là một bước không thể thiếu để đảm bảo chất lượng chẩn đoán. Quá trình này không chỉ dựa trên thông số của nhà sản xuất mà còn cần được kiểm chứng trong điều kiện phòng thí nghiệm thực tế. Các tiêu chí cốt lõi cần được xem xét bao gồm độ đặc hiệu, độ nhạy (giới hạn phát hiện) và độ ổn định. Một nghiên cứu cụ thể được thực hiện tại Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM đã đánh giá bộ kit SYBR Green I REALTIME PCR, cung cấp những dữ liệu quý giá về hiệu năng của bộ kit này trong việc phát hiện virus ASFV từ các mẫu thực địa, làm cơ sở khoa học cho việc lựa chọn và ứng dụng trong thực tiễn.

3.1. Phương pháp xác định độ đặc hiệu và độ nhạy LOD

Độ đặc hiệu của kit được kiểm tra bằng cách cho phản ứng với DNA/RNA từ các mầm bệnh khác thường gặp trên heo (như PRRSV, PCV2, CSFV). Kết quả lý tưởng là kit chỉ cho tín hiệu dương tính với mẫu chứa DNA của ASFV và âm tính với tất cả các mẫu khác. Nghiên cứu trên bộ kit SYBR I cho thấy độ đặc hiệu phân tích đạt 100%. Về độ nhạy, ngưỡng phát hiện (LOD) được xác định bằng cách pha loãng một mẫu chuẩn đã biết nồng độ. Nghiên cứu đã xác định LOD của bộ kit là 3 copies/phản ứng, một con số rất ấn tượng, cho thấy khả năng phát hiện mầm bệnh ở nồng độ cực thấp. Đây là những chỉ số quan trọng khẳng định tiềm năng của bộ kit trong việc sàng lọc virus sớm.

3.2. Đánh giá độ ổn định thông qua hệ số biến động CV

Độ ổn định, hay độ lặp lại, là khả năng bộ kit cho ra kết quả nhất quán khi xét nghiệm cùng một mẫu nhiều lần. Chỉ số này được đo lường bằng hệ số biến động (Coefficient of Variation - CV%). CV% càng thấp, độ ổn định càng cao. Trong nghiên cứu đánh giá bộ kit SYBR I, các mẫu dương tính được chạy lặp lại 3 lần. Kết quả cho thấy khi sử dụng mẫu DNA tách chiết, CV% của giá trị Ct dao động từ 0.23% đến 9.48%. Đối với mẫu serum tiền xử lý, CV% là từ 0.61% đến 8.92%. Các con số này đều nằm trong giới hạn chấp nhận được, chứng tỏ bộ kit có độ ổn định cao, đảm bảo kết quả đáng tin cậy trong các lần xét nghiệm PCR khác nhau.

IV. So sánh hiệu quả mẫu DNA tách chiết và serum tiền xử lý

Quy trình xử lý mẫu là một bước quan trọng, quyết định chất lượng DNA đầu vào cho phản ứng chuỗi polymerase. Hiện nay có hai hướng tiếp cận chính: quy trình tách chiết DNA chuẩn bằng các bộ kit thương mại và quy trình tiền xử lý mẫu nhanh (ví dụ: sử dụng enzyme Proteinase K) để tiết kiệm thời gian và chi phí. Mỗi phương pháp có những ưu và nhược điểm riêng, ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả chẩn đoán ASF. Việc so sánh trực tiếp hiệu quả của cùng một bộ kit trên hai loại mẫu đã qua xử lý khác nhau sẽ cung cấp cái nhìn toàn diện, giúp các phòng thí nghiệm lựa chọn quy trình phù hợp với mục tiêu và điều kiện thực tế.

4.1. Quy trình tách chiết DNA Độ tinh sạch cao

Phương pháp tách chiết DNA sử dụng các bộ kit chuyên dụng được xem là quy trình tiêu chuẩn. Quy trình này bao gồm các bước ly giải tế bào, loại bỏ protein và các chất ức chế khác, sau đó thu nhận DNA tinh sạch. Ưu điểm lớn nhất của phương pháp này là cung cấp DNA có độ tinh sạch cao, không chứa các chất ức chế phản ứng PCR, từ đó đảm bảo độ nhạy và độ chính xác tối đa. Trong nghiên cứu, khi sử dụng mẫu máu đã được tách chiết DNA, bộ kit thử nghiệm cho độ chính xác tương đồng 100% so với bộ kit đối chứng thương mại. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là tốn nhiều thời gian, chi phí và đòi hỏi nhiều thao tác hơn.

4.2. Quy trình tiền xử lý serum Nhanh và tiết kiệm

Để rút ngắn thời gian chẩn đoán, một số phòng thí nghiệm áp dụng quy trình tiền xử lý nhanh cho mẫu serum. Quy trình này thường chỉ bao gồm bước xử lý với enzyme Proteinase K để phá vỡ cấu trúc protein và giải phóng DNA, sau đó sử dụng trực tiếp dịch nổi làm khuôn cho phản ứng PCR. Ưu điểm là nhanh, đơn giản và giảm chi phí vật tư tiêu hao phòng lab. Tuy nhiên, phương pháp này có rủi ro. Dịch sau xử lý có thể còn chứa các chất ức chế PCR từ mẫu bệnh phẩm. Nghiên cứu cho thấy, khi sử dụng mẫu serum tiền xử lý, độ chính xác của kit giảm còn 95,7%, với một số trường hợp âm tính giả được ghi nhận, đặc biệt ở các mẫu có chất lượng ban đầu không tốt (vỡ hồng cầu nhiều).

V. Phân tích kết quả So sánh Kit PCR trên hai loại mẫu

Kết quả nghiên cứu thực nghiệm đã chỉ ra sự khác biệt rõ rệt về hiệu quả của bộ kit xét nghiệm khi sử dụng hai quy trình xử lý mẫu khác nhau. Đối với mẫu DNA tách chiết, bộ kit SYBR I REALTIME PCR thể hiện hiệu năng xuất sắc, với các chỉ số độ nhạy chẩn đoán và độ đặc hiệu chẩn đoán đều đạt 100%. Điều này khẳng định bộ kit hoàn toàn đủ tiêu chuẩn để ứng dụng trong chẩn đoán thường quy với độ tin cậy cao nhất. Tuy nhiên, khi chuyển sang sử dụng mẫu serum tiền xử lý trực tiếp, kết quả đã xuất hiện sự suy giảm, đặt ra vấn đề về sự đánh đổi giữa tốc độ và độ chính xác.

5.1. Hiệu suất vượt trội với mẫu DNA đã tách chiết

Khi thực hiện trên 66 mẫu thực địa đã qua tách chiết DNA, bộ kit thử nghiệm cho kết quả dương/âm tính trùng khớp 100% với bộ kit đối chứng đã được thương mại hóa. Cụ thể, 47/47 mẫu dương tính và 19/19 mẫu âm tính đều được xác định chính xác. Điều này cho thấy giá trị dự đoán dương tính và giá trị dự đoán âm tính đều đạt 100%. Kết quả này khẳng định rằng, khi được cung cấp nguồn DNA đầu vào tinh sạch, các thành phần của bộ kit, bao gồm mồi và đầu dò, hoạt động một cách tối ưu, mang lại kết quả chính xác tuyệt đối. Đây là cơ sở để khuyến nghị sử dụng quy trình tách chiết chuẩn cho các mục đích chẩn đoán khẳng định hoặc nghiên cứu.

5.2. Hiện tượng âm tính giả khi dùng mẫu serum tiền xử lý

Khi cùng bộ kit được thử nghiệm trên các mẫu serum chỉ qua tiền xử lý, kết quả cho thấy 2 trong số 47 mẫu dương tính đã cho kết quả âm tính (âm tính giả). Phân tích sâu hơn cho thấy nguyên nhân có thể đến từ hai yếu tố. Thứ nhất, việc pha loãng mẫu trong quá trình xử lý có thể đã làm giảm nồng độ DNA của virus xuống dưới ngưỡng phát hiện (LOD) của kit. Thứ hai, các mẫu cho kết quả âm tính giả đều có chất lượng cảm quan kém (huyết thanh bị vỡ hồng cầu nhiều), cho thấy sự hiện diện của các chất ức chế phản ứng PCR. Mặc dù giá trị dự đoán vẫn ở mức cao (95,7%), sự xuất hiện của âm tính giả là một rủi ro cần cân nhắc, đặc biệt trong công tác giám sát dịch tễ diện rộng.

VI. Kết luận Tối ưu quy trình xét nghiệm ASF trong thực tiễn

Nghiên cứu so sánh đã cung cấp bằng chứng khoa học rõ ràng: bộ kit SYBR I REALTIME PCR là một công cụ hiệu quả để chẩn đoán ASF, nhưng hiệu suất cuối cùng phụ thuộc rất lớn vào quy trình xét nghiệm được lựa chọn. Việc lựa chọn giữa quy trình tách chiết DNA tiêu chuẩn và quy trình tiền xử lý nhanh cần dựa trên mục tiêu cụ thể. Để đạt độ chính xác cao nhất cho việc chẩn đoán khẳng định, quy trình tách chiết DNA vẫn là lựa chọn ưu tiên. Trong khi đó, quy trình tiền xử lý nhanh có thể được cân nhắc cho mục đích sàng lọc sơ bộ, giúp tiết kiệm thời gian và nguồn lực, nhưng cần nhận thức rõ về nguy cơ bỏ sót mẫu dương tính.

6.1. Đề xuất ứng dụng cho từng loại quy trình xử lý mẫu

Dựa trên kết quả, có thể đưa ra đề xuất ứng dụng như sau. Quy trình tách chiết DNA nên được áp dụng cho: các trường hợp nghi ngờ heo bệnh có triệu chứng lâm sàng rõ ràng, các mẫu cần kết quả khẳng định để công bố dịch, và các hoạt động nghiên cứu khoa học yêu cầu độ chính xác cao. Ngược lại, quy trình tiền xử lý serum nhanh có thể phù hợp cho: hoạt động sàng lọc virus định kỳ trên quy mô lớn tại các trang trại, kiểm tra nhanh đàn heo trước khi xuất chuồng. Tuy nhiên, khi sử dụng phương pháp này, cần lưu ý đến chất lượng mẫu bệnh phẩm và bất kỳ mẫu nghi ngờ nào cũng cần được kiểm tra lại bằng phương pháp tách chiết chuẩn.

6.2. Hướng nghiên cứu tiếp theo để cải tiến quy trình

Để khắc phục nhược điểm của phương pháp tiền xử lý nhanh, các nghiên cứu trong tương lai có thể tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình này. Các hướng đi có thể bao gồm việc thử nghiệm các loại enzyme khác nhau, điều chỉnh tỷ lệ pha loãng mẫu để cân bằng giữa việc giảm chất ức chế và duy trì nồng độ DNA, hoặc bổ sung một bước tinh sạch đơn giản sau khi xử lý bằng Proteinase K. Đồng thời, việc tiếp tục đánh giá bộ kit trên số lượng mẫu lớn hơn và trên nhiều loại mẫu khác nhau (như mẫu mô lách, dịch miệng) sẽ cung cấp một bức tranh toàn diện hơn về hiệu năng của nó, góp phần hoàn thiện các phương pháp chẩn đoán ASF tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC SO SÁNH KHẢ NĂNG PHÁT HIỆN AFRICAN SWINE FEVER VIRUS (ASFV) GÂY BỆNH TREN LON CUA BỘ KIT SYBR I REALTIME PCR DOI VOI MAU DA TACH CHIET DNA VA SERUM TIEN XU LY Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện : NGUYEN THANH CANH Mã số sinh viên : 19126016 Niên khóa : 2019 - 2023 TP. Thủ Đức, 09/2023 ; BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TAO TRUONG ĐẠI HỌC NÔNG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP SO SÁNH KHẢ NĂNG PHÁT HIEN AFRICAN SWINE FEVER VIRUS (ASFV) GAY BỆNH TREN LON CUA BO KIT SYBR I REALTIME PCR DOI VOI MAU DA TACH CHIET DNA VA SERUM TIEN XU LY Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện TS. ĐINH XUÂN PHÁT NGUYÊN THANH CẢNH TP. Thủ Đức, 09/2023 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên cho phép em xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu, quý thầy cô khoa Khoa học Sinh học nói riêng và toàn thể thầy cô trường Đại học Nông Lâm TP HCM nói chung đã truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý báu cho em trong suốt thời gian em học tập tại trường Thứ hai, em xin chân thành cảm ơn thầy TS.BSTY Đinh Xuân Phát, người đã luôn hướng dẫn em và cho em những lời khuyên vô cùng bồ ích giúp em hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp của mình.

Từ những lời khuyên của thầy, em đã có được định hướng nghề nghiệp và đã học hỏi được nhiều về thái độ, kỹ năng trong phòng thí nghiệm cũng như trong cuộc sống Tôi xin chân thành cảm ơn quý công ty TNHH Biomin (Chi nhánh Bình Dương) đã giúp đỡ, hỗ trợ tôi trong những bước đầu của quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin cảm ơn tập thể phòng thí nghiệm Công nghệ gene Bio 313, khoa Khoa học Sinh học, trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã cho phép tôi được thực hiện đề tài tốt nghiệp tại phòng thí nghiệm. Em xin chân thành cảm ơn chị Nguyễn Thi Mi Mi, anh Lê Thanh Bình, anh Hoàng Gia Lâm cùng tập thể bạn bè phòng thí nghiệm Công nghệ gene Bio 313 đã hỗ trợ em trong suốt thời gian làm đề tài tốt nghiệp.

Con xin chân thành cảm ơn gia đình vì đã luôn ủng hộ, tiếp thêm sức mạnh và động viên cho con trên mỗi bước đường trong suốt 4 năm đại học. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến tất cả những người bạn - những người đã luôn đồng hành, giúp đỡ và chia sẻ những khó khăn cùng tôi trong suốt thời gian qua. XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN Tôi tên Nguyễn Thanh Cảnh, MSSV: 19126016, Lớp: DH19SHD thuộc ngành Công nghệ Sinh học Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, xin cam đoan: Đây là Khóa luận tốt nghiệp do bản thân tôi trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoan toản trung thực và khách quan.

Tôi xin hoàn toan chịu trách nhiệm trước Hội đồng về những cam kết này. Thủ Đức, ngày 7 tháng 9 năm 2023 Người việt cam đoan (Ký và ghi rõ họ tên) ll TÓM TẮT Đề tài “ So sánh khả năng phát hiện African Swine Fever Virus (ASFV) gây bệnh trên lợn của bộ kit SYBR I REALTIME PCR đối với mẫu đã ly trích DNA và mẫu serum tiền xử lý” được tién hành nhằm kiểm tra hiệu quả của bộ kit thử nghiệm SYBR I REALTIME PCR trong việc phát hiện African Swine Fever Virus (ASFV) thông qua đánh giá độ đặc hiệu và độ nhạy của bộ kit thử nghiệm trên những mẫu thực dia. Đồng thời qua đề tài cũng so sánh được sự khác nhau về hiệu quả của bộ kit thử nghiệm khi sử dụng bộ kit với mẫu DNA tách chiết và mẫu serum tiền xử lý. Trong nghiên cứu này giới han phát hiện (LOD) của bộ kit được xác định là 3 copies/phan ứng, bộ kit thử nghiệm xảy ra phản ứng khuếch đại đặc hiệu đối với.

Nghiên cứu cho thấy bộ kit thử nghiệm có khả năng phát hiện sự tồn tại của ASFV trong mẫu thực địa với độ chính xác và độ đặc hiệu chân đoán đạt đến 100%, giá trị dự đoán dương tính và âm tính cũng đạt 100%. Đồng thời bộ kit thử nghiệm cũng cho thay sự ôn định trong việc phát hiện ASFV khi có hệ số biến động (CV%) giữa 3 lần lặp lại của các mẫu dương tinh từ 0,23 đến 9,48% khi thực hiện bộ kit thử nghiệm với mẫu là DNA tách chiết. Đối với mẫu là serum tiền xử lý, nghiên cứu cho thấy bộ kit thử nghiệm cho giá trị dự đoán âm tính và đương tính ở mức 95,7% với hệ số biến động (CV%) giữa 3 lần lặp lại của các mẫu dương tinh từ 0,6 1% đến 8,92%. Tóm lại, nghiên cứu cho thay bộ kit thử nghiệm có thé sử dụng dé chan đoán ASFV ngoài ra bộ kit còn có thé được sử dụng với mau serum không it bị vỡ hồng cau, giúp rút ngắn thời gian phát hiện ASFV trong thực địa.

Từ khóa: African Swine Fever Virus, ASFV, kit thử nghiệm, realtime PCR il ABSTRACT The thesis "Comparison of the ability to detect African swine fever virus (ASFV) causing disease in pigs of the SYBR I REALTIME PCR kit in extracted and DNA and pre-treatment serum sample" was conducted to check the effectiveness of SYBR I REALTIME PCR. For detection of African Swine Fever Virus (ASFV) through evaluation of the specificity and sensitivity of the this kit in clinical samples and the difference in the effectiveness of the trial kit would be compared when being used with the extracted DNA sample and the pretreated serum sample. In this study, the limit of detection (LOD) of the kit was 3 copies/reaction, the test kit had specific amplification results for ASFV and non-amplification with others unrelated DNA/RNA. The results showed that the test kit was capable of detecting the existence of ASFV in field samples with diagnostic sensitity and specificity reaching 100%, positive and negative predictive values also reaching 100%.

Furthermore, the stability for detection of ASFV of trial kit when there was a coefficient of variation (CV%) between 3 replicates of positive samples rangging from 0.48% when performing the test kit with the extracted DNA sample. For the Pretreated Serum sample, the study showed that the test kit gave a negative and positive predictive value of 95.7% with a coefficient of variation (CV%) from 0. In summary, the study showed that the test kit could be used to diagnose ASFV in swine. In addition, the kit can also be used with pre-treated serum samples, which helps skip the DNA extraction step and shorten the ASFV diagnosis process.

Keywords: African Swine Fever Virus, ASFV, trial kits, realttme PCR 1V MỤC LỤC ; ; Trang IE6109.89)029 00 Số ốốốốốẽố ốc 1 XÁC NHẬN VA CAM ĐOAN.----2-©22S22E2EE2122121212121121121121111111 1116 ii 7z; pe, er iii va. 1V NV TE GaoztssrssisddiepssdirggrsnbdViegarosieetocniöiimueqsdidimtorgdefistggisöBigmsospijNessrosiiMusseosiZbi0MiGpsšZgsizs8Esixranste:sassömi V HANH SBÁOH QHỦ VIỆT TẤT.-e--—-seer~2xsekc-xersrtz.rztrmcrsrcocczerrctrreere vi DANH SÁCH CÁC BẢNG. ix DANH SÁCH CAC HÌNH. rex Se (Ce TỔ NV no ro Tin co | 1.

Me tiêu đỗ HÀ csácccnn Hán ni ng H2 HE ca 12 G1101100016180160800216161140101010/15 80g | 1. NO1i dung thurc W161 oo. TÚÌNNG GQUUAN TT TIẾT csesuensdenneobegieosiosgxesodlggsgtg600000012409003503G00)8340v0 3 2-1».L/IGH'SỬ địch l. PIN saassaseesstiiiinhdiadidiititbEGIRLI4SS1SGGRSGIG38iI048340353A0885G82 0200388083080 3 2.

African Swine Fever Virus (ASTFV). Cầu trúc của ASFV. Cơ chế xâm nhập và biểu hiện gen của ASFV. [eu Ching lati Sane Va, DỆHH “RGHsssssssssssssssossssebiSESEEESD0CS0938843855/04890NE588380.00638L 5 2/1: LTIỂU:GHỨNG: (Ai SAN svessassskbretiGPBieisiidtnss tháesSzSiElipGpiBtoplosataD4cbi2pi30ixSioxpssasadssei 5 2.

Bénh tich do ASFV 0:. Thương phần chân: đoần ASE V scscssicressssizecsnsssscannstiercussssan tnsesastauonssanssnena teasmnansinuins 8 2. dey AE Pealtiie (lo nnstonnesnstdktSiOSGBLBSSRBISSESETHBEBHSIENHHEISE00LS00SSESG0-S03. Realtime PCR sử dụng đoạn dò (prob©).

Realtime PCR sử dụng chất phát huỳnh quang bám vào sợi đôi DNA. Biểu đồ khuếch đại Real-time PCR. Định lượng trong realtime PCT.-- --- - + 5+ 2+ 2x22 2 HH HH ưêt 11 2. Tình hình nghiên cứu ASF V .- Ác TH TT TH TH TH TH nu TH ngàng 12 2.

Nghiên cứu quốc tẾ. VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP. Thời gian và địa điểm nghiên cứu. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu.

Đối tượng nghiên cứu.P hương pháp TghiŠfi:€ỨU::zssssessesesiies3804810131054558010104630850x00340603U00588509/09030/60% 14 3. Quy trình thu huyết thanh và tiền xử lý mẫu. Qui trình, ly tach DNA can soisnskeoieDEEAGGSEESEĐB430S8145888gkEuG1SnHLSA34085g33121L03316842 16 EEbsi8ui0ii8(S) 0ì 00. Kiểm tra độ đặc hiệu phân tích.-- 2 2 +s+2®+S+E£SE+EE2E2EE2EE2E221221212222222 2x22, 17 3.5, Sach 6161, Han phat bien (LOD) eeeeseseeedsdndisiothiotbdbigtiGtiD84000601400308383/501800//88.

Đánh giá khả năng phát hiện ASFV của bộ kit trên mẫu đã ly trích DNA. Độ đặc hiệu, độ nhạy chân đoán, giá tri dự đoán dương tinh, giá tri dự đoán âm tinh của bộ kit thử nghiệm đối với mẫu đã tách chiết DNA. Đánh giá khả năng phát hiện ASFV của bộ kit trên mẫu chưa tách chiết DNA. Độ đặc hiệu, độ nhạy chân đoán, giá trị dự đoán dương tính, giá trị dự đoán âm tinh của bộ kit thử nghiệm đối với mẫu chưa tách chiết DNA.

So sánh kết qua phản ứng Realtime PCR phát hiện ASFV của bộ kit thử nghiệm giữa mau đã tách chiết DNA và mẫu chưa tách chiết DNA.--- 19 521 Sai lý số LGW sásneuniebxoiesoaBisEEltittit4i0S003908101035010040346012359043600. KET QUA VÀ THẢO LUẬN .---2-52252222E22E22ECEECEEEErErrrerree 20 Š TT LH sneessetderrtorttirintGirtrgtspingtg900YaSdI0nN00SG02N06U0I0002Nf0900008GE01-R0C005723000GG009/220. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của bộ kit thử nghiệm. Kết quả kiểm tra giới hạn phát hiện của bộ kit thử nghiệm.

Đánh giá khả năng phát hiện ASFV của bộ kit trên mẫu đã ly trích DNA. Kiểm tra độ chính xác trong việc phát hiện ASFV. Đánh giá độ ồn định của bộ kit trong việc phát hiện ASFV. Đánh giá khả năng phát hiện ASFV của bộ kit trên mau Serum tiền xử lý.

Kiểm tra độ chính xác trong việc phát hiện ASEYV. So sánh kết quả Realtime PCR phát hiện ASFV của bộ kit thử nghiệm giữa mẫu đã tách chiết DNA va mẫu chưa tách chiết.---2- 2 2222E+2E+2EE2EE222222EcZEzzzxzree 24 ee 25 CHUONG 5. KET LUẬN VA DE NGHI.ccccsscssessessesssesesseesessssecsessecsesseeseesseeee 37 0 OO (Os 37 5. - 25-22 2< 1E212112122121121121211211211112111121111111211211011121111211210121 21 re oe CHUNG: TÃILIỆTT THAI ACY, cic teaanescirnavinicinensissneaintinicrithisiasindveainnesiteesvnasnts 28 Ta N60 TONS DUOC ccccusscimenisarmarmanemasnnman eae 28 Tat LGU nO NQOAL 011 .--2-©22+22222222E2222112211271122112711211121121121121121121121111121121221 ca 32 Vii DANH SACH CHU VIET TAT PCR : Polymerase Chain Reaction ASF : African Swine Fever ASFV : African Swine Fever Virus OIE : Office International des Epizooties LOD : Limited of Detection TCVN : Tiéu Chuan Viét Nam Ctv : Cộng tác viên CV : Coefficient of Variation TNHH : Trách Nhiệm Hữu Han : Specificity : Sensivity : Positive Predictive Value : Negative Predictive Value : base pair : Kilobasepair : Acid Deoxyribonucleoic Vill DANH SÁCH CAC BANG Trang Bang 3.

Đánh giá kết qua của kit thử nghiệm dựa theo kết quả kit đối chứng. Kết quả tín hiệu huỳnh quang khuếch đại các nồng độ Plasmid DNA ASFV pha loãng của 3 lần lặp lại. Kết quả phát hiện ASFV cua kit đối chứng va kit thử nghiệm trên mẫu thực 1X DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 2. Lịch sử phát hiện dich tả lợn Châu PH1.

M6 hinh cẩu trữ của ASP Y secceskvenh kg 20g 050018100100100160/2015600701966160001 40g00) 4 Hình 2. Quá trình xâm nhập vào tế bao vật chủ của ASFV.-¿--¿+5z+sz2xcce2 5 Hình 2.