Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong phân tích y sinh hiện đại, việc định lượng các chất chỉ điểm sinh học (biomarker) giữ vai trò then chốt trong sàng lọc, chẩn đoán sớm và theo dõi tiến triển bệnh lý. Tuy nhiên, ở giai đoạn khởi phát của nhiều bệnh lý, các phân tử sinh học có hoạt tính—đặc biệt là các chuỗi peptide ngắn—thường tồn tại trong dịch sinh học với nồng độ cực vết. Điển hình như Angiotensin II, một peptide mạch thẳng gồm 8 acid amin với khối lượng phân tử khoảng 1.046,2 Da (thành phần: Sar-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Ile), đóng vai trò quan trọng trong hệ thống renin-angiotensin-aldosterone (RAAS) điều hòa thể tích máu và co mạch huyết áp. Nồng độ của Angiotensin II trong huyết tương người bình thường rất thấp, đồng thời bị bao phủ bởi nền mẫu sinh học phức tạp chứa các protein kích thước lớn có nồng độ cao gấp hàng nghìn lần (như albumin huyết thanh). Do đó, sự hiện diện của các protein nền làm suy giảm đáng kể độ nhạy và độ chính xác của các kỹ thuật phân tích quang phổ hay khối phổ.

Để giải quyết rào cản này, tiền xử lý mẫu thông qua kỹ thuật làm giàu và phân tách phân tử sinh học chọn lọc kích thước là yêu cầu cấp thiết. Vật liệu silic hữu cơ siêu xốp cấu trúc tuần hoàn (Periodic Mesoporous Organosilicas - PMO) nổi lên như một giá mang tiềm năng nhờ cấu trúc mao quản có trật tự cao, kích thước lỗ rỗng đồng đều trong dải 2–50 nm, diện tích bề mặt riêng lớn và khả năng gắn các nhóm chức hữu cơ (amin, carboxyl) trực tiếp vào thành khung hoặc bề mặt mao quản. Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ của sinh viên Lương Thu Lan (Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, 2023) được thực hiện trong khuôn khổ đề tài nghiên cứu KHCN theo Nghị định thư mã số NĐT.CHN/19 ("Hợp tác nghiên cứu kỹ thuật định lượng một số biomarker ở bệnh nhân bị bệnh võng mạc đái tháo đường") nhằm phát triển các hệ vật liệu xốp PMO phục vụ làm giàu phân tử Angiotensin II.

Tác giả xác định hai mục tiêu nghiên cứu cụ thể được đánh số trong văn bản:

  1. Tổng hợp các vật liệu có kích thước nanomet và micromet trên nền silic hữu cơ.
  2. Khảo sát khả năng hấp phụ, làm giàu và phân tách Angiotensin II của các vật liệu đã tổng hợp.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Các hệ vật liệu PMO kích thước hạt nanomet (NPT, NPA, NPC) và micromet (MPT, MPA, MPC) với các bề mặt trung tính, chức năng hóa nhóm amin (-NH2) và nhóm carboxyl (-COOH); phân tử sinh học mô hình gồm Angiotensin II human và albumin huyết thanh bò (BSA).
  • Phạm vi nghiên cứu: Thực nghiệm tổng hợp hóa học, đặc trưng hóa cấu trúc vật liệu và khảo sát hấp phụ - thôi hấp phụ in vitro trong hệ dung dịch đệm giả lập tại các phòng thí nghiệm thuộc Trường Đại học Y Dược, Trường Đại học Công nghệ (ĐHQGHN), Viện Khoa học Vật liệu (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) và Khoa Hóa học (Trường Đại học Sư phạm Hà Nội).

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng lý thuyết về vật liệu nano lai vô cơ - hữu cơ PMO, được phát triển độc lập lần đầu tiên vào năm 1999 bởi ba nhóm nghiên cứu của Inagaki, Ozin và Stein. Cấu trúc tổng quát của khung polysilsesquioxan bắc cầu được biểu diễn qua công thức $O_{1,5}Si-R-SiO_{1,5}$, trong đó $R$ là cầu nối hữu cơ liên kết cộng hóa trị với các nguyên tử silic. Cơ chế tạo hình vật liệu dựa trên phương pháp hóa ướt sol-gel từ dưới lên (bottom-up), kết hợp cơ chế tự lắp ráp của chất hoạt động bề mặt cation Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) đóng vai trò chất định hướng cấu trúc (khuôn mẫu micelle). Quá trình chức năng hóa bề mặt sử dụng tác nhân ghép nối 3-(Aminopropyl)triethoxysilane (APTES) để đưa nhóm amin và anhydride succinic (SAA) để chuyển hóa nhóm amin thành nhóm carboxyl.

Cơ chế phân tách và làm giàu phân tử sinh học dựa trên nguyên lý loại trừ kích thước (size-exclusion) và hấp phụ vật lý thuận nghịch. Các lỗ xốp trung mô (mesopore) của PMO đóng vai trò như các bẫy phân tử cho phép các chuỗi peptide kích thước nhỏ (như Angiotensin II, ~1 kDa) dễ dàng khuếch tán vào bên trong lòng lỗ xốp, trong khi các protein cồng kềnh (như BSA, ~66 kDa, kích thước phân tử khoảng $4 \times 4 \times 14$ nm) bị loại trừ về mặt không gian và chỉ có thể hấp phụ không đặc hiệu trên bề mặt ngoài của hạt vật liệu.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm và hệ thống thiết bị phân tích bao gồm:

  • Phương pháp tổng hợp hóa học: Tổng hợp sol-gel thủy phân và ngưng tụ tiền chất 1,2-Bis(triethoxysilyl)ethane (BTEE) trong môi trường kiềm $NH_3$ 20% để thu nhận hạt nanoPMO; sử dụng 1,2-Bis(trimethoxysilyl)ethane (BTME) trong môi trường $NaOH$ để thu nhận hạt microPMO; loại bỏ chất hoạt động bề mặt CTAB bằng kỹ thuật chiết hồi lưu trong hỗn hợp ethanol 96% và $HCl$ 37%.
  • Phương pháp kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường (FESEM): Thực hiện trên thiết bị Hitachi S4800 nhằm quan sát hình thái học, bề mặt và kích thước hạt.
  • Phương pháp quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR): Ghi phổ trên máy IR Prestige-21 (Shimadzu) trong dải số sóng $4000 - 400\text{ cm}^{-1}$ để phân tích các liên kết đặc trưng của khung silica ($Si-O-Si$, $Si-CH_2$, $Si-OH$) và các nhóm chức bề mặt ($-NH_2$, $-CONH-$).
  • Phương pháp hấp phụ - khử hấp phụ đẳng nhiệt Nitơ ở 77,4 K: Sử dụng thiết bị đo tự động Micromeritics 3Flex phiên bản 3.02, áp dụng mô hình Brunauer-Emmett-Teller (BET) và Barrett-Joyner-Halenda (BJH) để xác định diện tích bề mặt riêng, thể tích mao quản và đường kính lỗ xốp trung bình.
  • Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử tử ngoại - khả kiến (UV-Vis micro-volume): Định lượng nồng độ protein tại bước sóng 280 nm thông qua thiết bị Nanodrop ND 8000 với thể tích mẫu đo $1 - 3\ \mu\text{l}$, tính toán tải lượng hấp phụ ($q_t$) dựa trên phương trình bảo toàn khối lượng pha lỏng.

Nội dung chính theo từng chương

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN

Chương tổng quan hệ thống hóa cơ sở lý thuyết về vật liệu nano, lịch sử phát triển và cấu trúc phân tử của PMO từ năm 1999 đến nay. Tác giả phân tích sâu bốn con đường tổng hợp PMO, vai trò của chất hoạt động bề mặt và ảnh hưởng của các loại muối hữu cơ (như natri salicylat, natri succinat, natri benzoat) lên sự chuyển dịch đối xứng cấu trúc mao quản từ lập phương ($Pm3n$) sang lục giác ($P6mm$). Chương này tổng thuật các ứng dụng chính của PMO trong y sinh gồm: hệ dẫn truyền thuốc có kiểm soát, cố định enzyme/protein (như cytochrome c, lysozyme, lipase, horseradish peroxidase), xúc tác sinh học và làm giàu phân tử sinh học.

Điểm nhấn của chương là phần điểm luận tình hình nghiên cứu: trên thế giới, tác giả phân tích các công trình của Qian (2011) về vi cầu PMOMs làm giàu peptide miễn dịch E7 và Ling (2012) về PMO chức năng hóa amin/carboxyl để tinh chế chọn lọc BSA, hemoglobin và lysozyme; tại Việt Nam, nêu bật nghiên cứu của Mai Ngọc Xuân Đạt (2021) về PMO phân hủy sinh học mang liên kết tetrasulfide tải hoạt chất cordycepin và nghiên cứu của Phan Thị Hồng Thảo (2012) dùng PMO-SBA16 cố định enzyme DAAO. Cuối cùng, chương 1 cung cấp dữ liệu sinh lý học về Angiotensin II, vai trò thụ thể $AT_1$, $AT_2$ và sự cần thiết của việc làm giàu biomarker này trước khi phân tích.

CHƯƠNG 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương này mô tả chi tiết danh mục hóa chất tinh khiết, vật tư tiêu hao và các hệ thống máy móc phân tích. Quy trình thực nghiệm được chuẩn hóa thành 6 quy trình tổng hợp:

  1. NanoPMO trung tính (NPT): Hòa tan 1,2 g CTAB trong 300 ml dung dịch $NH_3$ 20% ở 40°C, nhỏ từ từ 2 ml BTEE, khuấy 3 giờ; tinh sạch hồi lưu với 120 ml ethanol 96% và 6,75 ml $HCl$ 37% trong 8 giờ (cải tiến rút ngắn thời gian so với quy trình gốc của Qian là 16 giờ); sấy ở 45°C.
  2. NanoPMO amin (NPA): Tương tự NPT nhưng bổ sung đồng thời 2 ml BTEE và 2 ml APTES, phản ứng 3 giờ ở 40°C, tinh sạch 8 giờ.
  3. NanoPMO carboxyl (NPC): Phản ứng giữa 50 mg NPA với 2,5 ml dung dịch SAA ở các nồng độ 1 mg/ml (NPC1), 10 mg/ml (NPC10) và 50 mg/ml (NPC50) tại pH = 6 trong 2 giờ.
  4. MicroPMO trung tính (MPT): Hòa tan 1,29 g CTAB và 0,6 g $NaOH$ trong 300 ml nước, nhỏ 1,5 ml BTME, khuấy từ 8 giờ ở 25°C, sau đó ủ thủy nhiệt ở 95°C trong 24 giờ; tinh sạch bằng ethanol/$HCl$ trong 8 giờ.
  5. MicroPMO amin (MPA): Phản ứng giữa 0,1 g MPT với 0,125 ml APTES trong 125 ml dung dịch $NH_3$ 20% ở 40°C trong 3 giờ (MPA3) hoặc 5 giờ (MPA5).
  6. MicroPMO carboxyl (MPC): Biến tính 1,038 g MPA3 với 52 ml dung dịch SAA 10 mg/ml (pH = 6) trong 2 giờ.

Bên cạnh đó, chương 2 thiết lập quy trình khảo sát hấp phụ: xác định động học hấp phụ của MPT với dung dịch Angiotensin II 0,5 mg/ml ở các mốc thời gian 2, 5, 10, 30 phút; khảo sát thôi hấp phụ bằng dung dịch eluent (0,1% TFA trong hỗn hợp acetonitrile/nước khử ion tỉ lệ 50:50, v/v) tại 30, 60, 120 phút; khảo sát hiệu suất làm giàu đơn chất (từ nồng độ ban đầu 0,01 mg/ml) và phân tách trong hỗn hợp chứa BSA nồng độ 10 mg/ml (gấp 1.000 lần Angiotensin II) trên cả 6 hệ vật liệu.

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ

Chương kết quả trình bày số liệu thực nghiệm toàn diện thông qua bảng biểu và đồ thị:

  • Hiệu suất tổng hợp: Bột vật liệu sau khi sấy khô có màu trắng, xốp, mịn. Khối lượng thu hồi và hiệu suất tổng hợp: NPT đạt 0,84 g (70%); NPA đạt 0,96 g (80%); NPC1 đạt 0,042 g (84%); NPC10 đạt 0,0428 g (86%); NPC50 đạt 0,041 g (82%); MPT đạt 0,80 g (62%); MPA3 đạt 0,086 g (86%); MPA5 đạt 0,0889 g (89%); MPC đạt 0,86 g (83%).
  • Đặc trưng nhóm chức (FTIR): Toàn bộ các mẫu đều sạch hoàn toàn chất hoạt động bề mặt CTAB, thể hiện qua sự biến mất của các đỉnh dao động tại 1470, 1402, 1626, 2850 và $2918\text{ cm}^{-1}$. Các dao động liên kết khung xuất hiện rõ tại $1412\text{ cm}^{-1}$ và $1270\text{ cm}^{-1}$ ($Si-CH_2$), $910\text{ cm}^{-1}$ ($Si-OH$), $444\text{ cm}^{-1}$, $1033 - 1044\text{ cm}^{-1}$ và $1095\text{ cm}^{-1}$ ($Si-O-Si$). Nhóm amin được xác nhận qua đỉnh $1516\text{ cm}^{-1}$ (nanoPMO) và $1512\text{ cm}^{-1}$ (microPMO). Nhóm carboxyl được xác nhận qua đỉnh dao động liên kết amide $CO-NH$ tại $1554\text{ cm}^{-1}$ (nanoPMO) và $1555\text{ cm}^{-1}$ (microPMO), trong đó nồng độ SAA 10 mg/ml cho cường độ đỉnh tối ưu nhất.
  • Hình thái học (FESEM): Mẫu NPT có dạng hình lục giác với kích thước trung bình 500 nm – 2 $\mu\text{m}$; NPA có dạng hình cầu đồng đều kích thước 1 – 2 $\mu\text{m}$; NPC10 dạng hình cầu đồng đều nhưng bề mặt sần sùi. Ngược lại, MPT dạng hình cầu không đồng đều với kích thước trải rộng 2 – 10 $\mu\text{m}$; các mẫu MPA3 và MPC chỉ xuất hiện một lượng nhỏ hạt hình cầu kích thước 1 – 5 $\mu\text{m}$, cho thấy quá trình biến tính bề mặt hạt micro chưa đạt độ đồng nhất cao.
  • Đặc trưng cấu trúc mao quản: Mẫu NPT có diện tích bề mặt riêng BET là $1.423\text{ m}^2/\text{g}$, thể tích lỗ $1,5\text{ cm}^3/\text{g}$, kích thước mao quản 3,0 nm. Nhìn chung, hệ nanoPMO có diện tích bề mặt $200 - 1.500\text{ m}^2/\text{g}$, kích thước lỗ 2–3 nm; hệ microPMO có diện tích bề mặt $600 - 900\text{ m}^2/\text{g}$, kích thước lỗ lớn hơn, đạt 3–5 nm.
  • Khảo sát làm giàu và phân tách:
    • Đường chuẩn nồng độ protein được xây dựng tuyến tính: Angiotensin II trong khoảng $31,25 - 500\ \mu\text{g/ml}$ ($R^2$ cao) và BSA trong khoảng $0,5 - 10\text{ mg/ml}$ ($R^2 = 0,9999$).
    • Động học hấp phụ trên MPT cho thấy lượng Angiotensin II bị hấp phụ đạt 50% chỉ sau 2 phút và chạm ngưỡng bão hòa tại 5 phút. Quá trình giải hấp (thôi) bằng dung dịch eluent đạt cực đại sau 30 phút.
    • Với dung dịch đơn chất nồng độ 0,01 mg/ml (1000 $\mu\text{l}$), sau khi thôi bằng 10 $\mu\text{l}$ dung dịch eluent, nồng độ Angiotensin II trong dịch thôi tăng từ 7 đến 12 lần (cao nhất ở MPT đạt 0,121 mg/ml - gấp 12,1 lần; thấp nhất ở NPC10 đạt 0,076 mg/ml - gấp 7,6 lần).
    • Trong hỗn hợp chứa protein kích thước lớn BSA (10 mg/ml), nồng độ Angiotensin II trong dịch thôi tăng gấp 5 đến 41 lần so với ban đầu, trong khi nồng độ BSA giảm đi hơn một nửa.

CHƯƠNG 4 - BÀN LUẬN

Chương bàn luận tập trung phân tích sâu cơ chế hóa lý và so sánh kết quả thực nghiệm với các công bố quốc tế:

  • Tối ưu hóa quy trình: Việc giảm thời gian hồi lưu loại CTAB từ 16 giờ xuống 8 giờ vẫn đảm bảo độ sạch hoàn toàn của sản phẩm mà không làm suy giảm cấu trúc xốp. Phản ứng gắn nhóm carboxyl bằng SAA đạt cân bằng chỉ sau 2 giờ ở nồng độ 10 mg/ml, rút ngắn đáng kể so với thời gian 24 giờ trong công bố của Yue (2020). Thời gian gắn APTES trên microPMO được tối ưu hóa ở mốc 3 giờ thay vì 5 giờ do phổ FTIR cho cường độ đỉnh $1512\text{ cm}^{-1}$ tương đương.
  • So sánh thông số vật liệu: Tác giả lập bảng đối sánh cấu trúc với các nghiên cứu của Qian (2011), Zhu (2012) và Yue (2020). Sự khác biệt về hình thái và kích thước lỗ xốp giữa nghiên cứu này với Zhu được giải thích do chất làm khuôn: Zhu sử dụng chất hoạt động bề mặt không ion Pluronic P123 tạo dạng que kích thước lỗ 5,5–5,7 nm, trong khi đề tài dùng chất diện hoạt cation CTAB tạo cấu trúc hạt cầu/lục giác. Sai khác với Yue bắt nguồn từ việc Yue sử dụng tiền chất mang liên kết tetrasulfide Bis[3-(triethoxysilyl)propyl]tetrasulfide (BTES) thay vì các alkyl bắc cầu ngắn như BTEE và BTME.
  • Cơ chế hấp phụ và các yếu tố ảnh hưởng: Angiotensin II có điểm đẳng điện pI = 6,7. Trong dung dịch đệm PBS pH = 6,8, phân tử này không mang điện tích tổng thể, do đó lực hút tĩnh điện bị triệt tiêu; quá trình hấp phụ lúc này được dẫn dắt bởi liên kết hydro, tương tác kỵ nước và lực Van der Waals. Do đó, các vật liệu trung tính (MPT, NPT) thể hiện khả năng hấp phụ và làm giàu vượt trội so với các vật liệu biến tính mang nhóm tích điện dương ($-NH_3^+$ trên NPA, MPA) hay tích điện âm ($-COO^-$ trên NPC, MPC). Hơn nữa, vật liệu microPMO có kích thước mao quản lớn hơn (3–5 nm) tạo điều kiện khuếch tán thuận lợi hơn cho phân tử Angiotensin II so với hệ nanoPMO (2–3 nm). Quá trình hấp phụ là tương tác vật lý thuận nghịch, bảo tồn nguyên vẹn cấu trúc và hoạt tính của phân tử sinh học, đồng thời cho phép tái sử dụng giá mang.

Kết quả và đóng góp

Các kết quả định lượng cụ thể thu được từ quá trình thực nghiệm tổng hợp và thử nghiệm làm giàu phân tử sinh học được tổng hợp trong các bảng sau:

Bảng 1: Thông số tổng hợp và hiệu suất thu hồi các hệ vật liệu PMO

Ký hiệu mẫu Loại vật liệu và điều kiện chức năng hóa Lượng nguyên liệu ban đầu Khối lượng thu được (g) Hiệu suất tổng hợp (%)
NPT NanoPMO trung tính 1,2 g CTAB + 2 ml BTEE 0,8400 70%
NPA NanoPMO amin 1,2 g CTAB + 1 ml BTEE + 1 ml APTES 0,9600 80%
NPC1 NanoPMO carboxyl (SAA 1 mg/ml) 0,05 g NPA + 2,5 ml SAA 1 mg/ml 0,0420 84%
NPC10 NanoPMO carboxyl (SAA 10 mg/ml) 0,05 g NPA + 2,5 ml SAA 10 mg/ml 0,0428 86%
NPC50 NanoPMO carboxyl (SAA 50 mg/ml) 0,05 g NPA + 2,5 ml SAA 50 mg/ml 0,0410 82%
MPT MicroPMO trung tính 1,29 g CTAB + 1,5 ml BTME 0,8000 62%
MPA3 MicroPMO amin (thủy phân APTES 3 giờ) 0,1 g MPT + 0,125 ml APTES 0,0860 86%
MPA5 MicroPMO amin (thủy phân APTES 5 giờ) 0,1 g MPT + 0,125 ml APTES 0,0889 89%
MPC MicroPMO carboxyl 1,038 g MPA3 + 52 ml SAA 10 mg/ml 0,8600 83%

Bảng 2: So sánh đặc trưng hình thái và cấu trúc mao quản của các vật liệu

Nghiên cứu Ký hiệu mẫu Hình thái học Kích thước hạt (nm) Diện tích bề mặt BET ($m^2/g$) Kích thước lỗ xốp (nm)
Khóa luận này NPT Lục giác 500 – 2.000 1.423 3,0
Khóa luận này NPC10 Cầu (bề mặt thô ráp) 200 – 400 235 2 – 3
Khóa luận này MPT Cầu 200 – 1.000 (2.000 – 10.000) 844 3 – 5
Qian et al. [36] microPMO trung tính Cầu 200 – 750 976 3,1
Qian et al. [36] nanoPMO trung tính Cầu 2.000 – 5.000 612 2,5
Zhu et al. [40] PMO amin Que $1.500 \times (100 - 200)$ 677 5,5 – 5,7
Yue et al. [46] PMO carboxyl Cầu 200 – 400 917 —

Bảng 3: Hiệu quả làm giàu và phân tách Angiotensin II

Chỉ số khảo sát Điều kiện thực nghiệm Kết quả định lượng
Thời gian hấp phụ bão hòa Khảo sát trên MPT với Angiotensin II 0,5 mg/ml Đạt 50% sau 2 phút; bão hòa hoàn toàn ở 5 phút
Thời gian thôi tối đa Sử dụng dung dịch 0,1% TFA trong ACN/$H_2O$ (50:50) Đạt nồng độ bão hòa sau 30 phút
Hệ số làm giàu đơn chất 10 mg PMO + 1.000 $\mu\text{l}$ Angiotensin II 0,01 mg/ml; thôi bằng 10 $\mu\text{l}$ eluent Nồng độ tăng gấp 7 đến 12 lần (MPT cao nhất đạt 0,121 mg/ml; NPC10 đạt 0,076 mg/ml)
Hệ số làm giàu trong hỗn hợp Hỗn hợp Angiotensin II 0,01 mg/ml + BSA 10 mg/ml (tỉ lệ 1:1.000); thôi bằng 20 $\mu\text{l}$ eluent Nồng độ Angiotensin II tăng gấp 5 đến 41 lần; nồng độ BSA giảm hơn 50%

Đóng góp học thuật và thực tiễn của đề tài:

  • Cải tiến quy trình tổng hợp: Đã tối ưu hóa thời gian tinh sạch chất hoạt động bề mặt CTAB bằng cách đun hồi lưu axit-dung môi xuống còn 8 giờ (so với 16 giờ trong các quy trình cổ điển). Rút ngắn thời gian chức năng hóa bề mặt bằng SAA từ 24 giờ xuống còn 2 giờ mà vẫn bảo đảm mật độ nhóm carboxylate cao trên phổ FTIR.
  • Chứng minh thực nghiệm cơ chế size-exclusion: Khẳng định tính khả thi của việc sử dụng mạng lưới mao quản trung mô PMO để phân tách chọn lọc các phân tử peptide nhỏ (Angiotensin II) ra khỏi hỗn hợp chứa nồng độ rất cao các protein cồng kềnh (BSA), đóng góp dữ liệu thực nghiệm cho việc phát triển các bộ kit chuẩn bị mẫu trong chẩn đoán y sinh.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận tự chỉ ra các điểm giới hạn nội tại và đề xuất định hướng phát triển:

  • Tính đồng nhất về hình thái của vi cầu: Quy trình tổng hợp các mẫu microPMO chức năng hóa (MPA3 và MPC) chưa đạt độ tối ưu hoàn toàn; hình ảnh FESEM cho thấy số lượng hạt hình cầu hoàn chỉnh còn ít, hạt phân tán kích thước rộng (1–5 $\mu\text{m}$) và hệ vật liệu vẫn đang trong giai đoạn khởi tạo cấu trúc.
  • Độ phân giải của phương pháp phân tích: Nghiên cứu sử dụng phương pháp đo quang phổ UV-Vis micro-volume (Nanodrop) tại bước sóng 280 nm và tính toán nồng độ Angiotensin II trong hỗn hợp qua phương pháp chênh lệch gián tiếp đối chứng với mẫu BSA đơn lẻ. Tác giả thẳng thắn thừa nhận chưa thể khẳng định phần nồng độ chênh lệch là hoàn toàn tinh khiết của Angiotensin II do BSA vẫn có thể hấp phụ không đặc hiệu một phần lên bề mặt ngoài.
  • Hướng mở rộng nghiên cứu:
    1. Tiếp tục tối ưu hóa quy trình thôi giải hấp để rút ngắn thời gian dưới 30 phút nhằm bảo toàn tối đa cấu trúc phân tử và hoạt tính sinh học của peptide.
    2. Ứng dụng các phương pháp phân tích có độ chọn lọc và độ nhạy cao hơn như sắc ký lỏng ghép khối phổ phân giải cao (LC-MS/MS) để định lượng chính xác trình tự peptide sau làm giàu.
    3. Tiến hành thử nghiệm làm giàu Angiotensin II và các peptide dấu chỉ sinh học khác trên nền mẫu huyết thanh hoặc dịch sinh học thực tế thu nhận từ bệnh nhân (đặc biệt là bệnh nhân đái tháo đường theo mục tiêu của đề tài NĐT.CHN/19).

Giá trị tham khảo

Bản khóa luận tốt nghiệp này là tài liệu tham khảo chuyên khảo hữu ích cho:

  • Sinh viên và học viên cao học ngành Dược học, Hóa dược và Hóa học vật liệu: Cung cấp quy trình thực nghiệm chi tiết về phản ứng sol-gel, phương pháp gắn nhóm chức hữu cơ lên giá mang vô cơ và các bước tinh sạch loại bỏ chất định hướng cấu trúc.
  • Các nhà nghiên cứu trong lĩnh vực Hóa phân tích y sinh và Công nghệ sinh học: Cung cấp thông số vận hành thực tế về động học hấp phụ, dung môi giải hấp (eluent) và cơ chế làm giàu peptide dựa trên loại trừ kích thước mao quản, có thể ứng dụng trực tiếp vào việc chế tạo pha tĩnh sắc ký hoặc các cột chiết pha rắn (SPE) tiền xử lý mẫu sinh học.
  • Phần nội dung đáng tham khảo nhất: Quy trình chi tiết tại mục 2.2 (Chương 2) và phần phân tích ảnh hưởng của điểm đẳng điện pI/pH dung dịch đệm đến cơ chế hấp phụ phân tử tại mục 4.2 (Chương 4).

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao vật liệu microPMO trung tính (MPT) lại cho khả năng làm giàu Angiotensin II cao hơn vật liệu nanoPMO (NPT)?
Khả năng làm giàu của MPT cao hơn NPT chủ yếu do kích thước lỗ xốp trung mô của hệ microPMO (đạt từ 3–5 nm) lớn hơn so với kích thước lỗ xốp của hệ nanoPMO (chỉ từ 2–3 nm). Kích thước mao quản 3–5 nm tạo không gian khuếch tán thuận lợi hơn cho phân tử Angiotensin II (kích thước chuỗi 8 acid amin, khối lượng 1.046,2 Da) xâm nhập và định vị sâu vào lòng mao quản.

2. Tại sao vật liệu PMO trung tính lại hấp phụ Angiotensin II tốt hơn các vật liệu mang nhóm chức amin (NPA, MPA) hoặc carboxyl (NPC, MPC)?
Trong dung dịch đệm phosphat PBS sử dụng trong nghiên cứu có pH = 6,8, giá trị này gần như trùng khớp với điểm đẳng điện của Angiotensin II ($pI = 6,7$). Do đó, phân tử Angiotensin II ở trạng thái trung hòa điện tích (không mang điện), làm triệt tiêu lực hút tĩnh điện với các nhóm chức tích điện âm ($-COO^-$) hoặc dương ($-NH_3^+$). Lúc này, tương tác hấp phụ bị chi phối bởi liên kết hydro, lực Van der Waals và tương tác kỵ nước, vốn diễn ra mạnh mẽ và thuận lợi nhất trên khung silic hữu cơ trung tính của MPT và NPT.

3. Tác giả đã thực hiện những cải tiến cụ thể nào đối với các quy trình tổng hợp so với các nghiên cứu công bố trước đây?
Tác giả đã cải tiến hai khâu quan trọng:

  • Giảm thời gian đun hồi lưu chiết tách chất hoạt động bề mặt CTAB bằng hỗn hợp ethanol/HCl từ 16 giờ (theo quy trình gốc của Qian, 2011) xuống còn 8 giờ mà vẫn loại bỏ hoàn toàn các pic dao động của CTAB trên phổ FTIR.
  • Rút ngắn thời gian phản ứng gắn nhóm carboxyl của anhydride succinic (SAA) lên hạt PMO mang nhóm amin từ 24 giờ (theo quy trình của Yue, 2020) xuống chỉ còn 2 giờ ở nồng độ tối ưu 10 mg/ml.

4. Thành phần của dung dịch giải hấp (eluent) được sử dụng để thu hồi Angiotensin II là gì và thời gian giải hấp tối ưu là bao lâu?
Dung dịch eluent được sử dụng là hỗn hợp chứa 0,1% axit trifluoroacetic (TFA) pha trong hệ dung môi acetonitrile / nước cất khử ion theo tỉ lệ thể tích 50:50 ($v/v$). Thời gian giải hấp đạt trạng thái cân bằng bão hòa và thu hồi tối đa Angiotensin II ra khỏi vật liệu là 30 phút.

Kết luận

Khóa luận của tác giả Lương Thu Lan đã tổng hợp thành công các hệ vật liệu silic hữu cơ siêu xốp tuần hoàn (PMO) dạng nano và micro với các biến tính bề mặt trung tính, amin và carboxyl. Bằng việc tối ưu hóa quy trình chiết hồi lưu và chức năng hóa, nghiên cứu đã xác định vật liệu microPMO trung tính (MPT) sở hữu cấu trúc xốp và kích thước mao quản tối ưu nhất cho việc cố định Angiotensin II. Kết quả thực nghiệm in vitro chứng minh vật liệu có khả năng làm giàu nồng độ Angiotensin II lên 7–12 lần đối với mẫu đơn chất và từ 5–41 lần khi phân tách khỏi hỗn hợp chứa lượng dư protein cồng kềnh BSA. Đây là tiền đề thực nghiệm quan trọng, mở ra hướng ứng dụng PMO làm pha mang tiền xử lý mẫu cho các phân tích biomarker nồng độ siêu vết trong dịch sinh học.