Đặt vấn đề Genetically Modified Organism (GMO) là sinh vật biến đổi gene do con người tạo ra mang một hay nhiều gene hữu ích cho con người. Thế giới hiện nay tồn tại hai trường phái đối lập nhau về việc công nhận các thành tựu GMO và lo ngại các tác động chưa biết đến môi trường, hệ sinh thái và sức khỏe con người [8]. Vì vậy, trên thế giới, đặc biệt các quốc gia Châu Âu, chính phủ các nước đã triển khai nhiều biện pháp kỹ thuật nhằm phát hiện và định lượng những biến đổi trên vật chất di truyền cây trồng, vật nuôi do tác động của các kỹ thuật công nghệ sinh học. Mục đích nhằm kiểm soát sự hiện diện của GMO, đồng thời bảo vệ quyền của người tiêu dùng trong việc lựa chon sử dụng sản phẩm nông sản truyền thống (non- GMO) hay nông sản đã được biến đổi di truyền (GMO) [4,26].
Real- time PCR là một trong số những kỹ thuật đang áp dụng phổ biến trên thế giới, giúp phát hiện GMO một cách chính xác và đáng tin cậy. Ưu điểm của nó là thao tác đơn giản, độ nhạy cao, chuyên biệt và đặc hiệu. Hiệu quả của phương pháp này phụ thuộc nhiều yếu tố từ DNA đầu vào như: tính nguyên vẹn, độ tinh sạch và nồng độ DNA sau tách chiết phù hợp cho phản ứng Real-time PCR [40]. Sử dụng phương pháp cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) để tách DNA thực vật rất phổ biến hiện nay[4].
Ưu điểm của nó là tách được hầu hết các loại DNA thực vật, quy trình đơn giản, hiệu suất tách chiết cao. Tuy nhiên, đối với các mẫu thực vật như đậu nành, đậu hà lan, tiêu,. có chứa hàm lượng cao các hợp chất thứ cấp như: protein, các hợp chất phenol và các polysaccharide, DNA sau tách chiết bằng CTAB có chứa nhiều hợp chất thứ cấp. Các hợp chất này có khả năng gây ức chế sự hoạt động của Taq polymerase, gây hiện tương âm tính giả kết quả PCR[41].
Hiện nay, trên thế giới, nhiều nghiên cứu đã công bố quy trình CTAB cải tiến từ quy trình CTAB cơ bản bằng 7 TRẦN THỊ TUYẾT NHUNG MSSV: 1253010262 Báo cáo Khóa Luận Tốt nghiệp, 5/2016 cách bổ sung các nhân tố loại tạp chất như: polyvinylpyrrolidone (PVP), β- mercaptoethanol hoặc phương pháp sử dụng cột silica [5, 19]. Promoter 35S RNA của Cauliflower mosaic virus (CaMV) và Terminator plasmid Ti nopaline synthase gene (T-NOS) của Agrobacterium tumefaciens là hai chỉ tiêu tầm soát GMO phổ biến nhất. Đặc biệt, trong các GMC có giá trị thương mại quan trọng như: bắp, đậu nành, gạo,.các thành phần này có mức độ hiện diện phổ biến [41]. Với mục tiêu thu nhận được một quy trình tách chiết DNA tối ưu trên nền mẫu hạt đậu nành, có khả năng loại bỏ các hợp chất thứ cấp, ứng dụng trong sàng lọc đậu nành biến đổi gene bằng kỹ thuật Real-time PCR, được sự đồng ý của Trung Tâm Quatest 3, khoa Công Nghệ Sinh Học, ThS.
Nguyễn Phạm Phương Thanh và ThS. Nguyễn Văn Minh, tôi quyết định chọn đề tài Khóa luận Tốt nghiệp là: “KHẢO SÁT TỐI ƯU HÓA QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT DNA TRÊN NỀN MẪU ĐẬU NÀNH, ỨNG DỤNG TRONG SÀNG LỌC ĐẬU NÀNH BIẾN ĐỔI GEN SỬ DỤNG QUY TRÌNH REAL- TIME PCR” với mong muốn được học hỏi, trải nghiệm và nâng cao kiến thức về Sinh học Phân tử nói chung và phát hiện GMO nói riêng. Mục tiêu Thu được quy trình tách chiết DNA giúp thu nhận DNA trên nền mẫu đậu nành một cách nguyên vẹn, tinh sạch, với hàm lượng phù hợp cho phản ứng Real-time PCR, ứng dụng trong sàng lọc đậu nành biến đổi gene. 8 TRẦN THỊ TUYẾT NHUNG MSSV: 1253010262 Báo cáo Khóa Luận Tốt nghiệp, 5/2016 1.PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 9 TRẦN THỊ TUYẾT NHUNG MSSV: 1253010262 Báo cáo Khóa Luận Tốt nghiệp, 5/2016 1.1 TỔNG QUAN VỀ SINH VẬT BIẾN ĐỔI GENE 1.1 Định nghĩa sinh vật biến đổi gene Sinh vật biến đổi gene (Genetically Modified Organism- GMO) là những sinh vật (thực vật, động vật hoặc vi sinh vật) bị biến đổi cấu trúc vật liệu di truyền (DNA) không theo cách tự nhiên như giao phối và/ hoặc tái tổ hợp tự nhiên.
Công nghệ này cho phép con người lựa chọn những gene mong muốn chuyển từ sinh vật này sang sinh vật khác, giữa các loài không có quan hệ họ hàng. Thực phẩm được sản xuất từ GMO được gọi là thực phẩm biến đổi gene [3]. Các cấu trúc chuyển gene bao gồm nhiều yếu tố, thường có ít nhất một gene quan tâm, một promoter hoạt động như một tín hiệu bắt đầu, và một terminator hoạt động như một tín hiệu kết thúc để điều hòa biểu hiện gen [4]. Kể từ khi sinh vật biến đổi gene đầu tiên được thương mại hóa năm 1994, hiện nay 357 sự kiện GMO trong 27 loài đã được thương mại hóa với mục đích cải thiện chất lượng nông nghiệp và phục vụ lợi ích cho con người [27].2 Các thế hệ cây trồng biến đổi gene Cây trồng biến đổi gene được chia làm 3 thế hệ dựa theo lợi ích mà chúng mang lại [33].
Thế hệ thứ nhất xuất hiện khi cà chua Flavr Savr TM có đặc tính chậm chín được thương mại hóa đầu tiên năm 1994 [53]. Hiện nay, thế hệ này phát triển bao gồm các đặc tính được tập trung ở thực vật về nông học như: khả năng kháng thuốc trừ cỏ, kháng thuốc trừ sâu, kháng virus [34]. Thế hệ tiếp theo tập trung vào các đặc tính có lợi cho con người như tạo ra giá trị dinh dưỡng cao, chất lượng cao và ít gây dị ứng. Thế hệ này tiêu biểu có đậu nành giàu acid oleic và gạo vàng giàu vitamin A[34].
Năm 1998, thế hệ thứ ba xuất hiện được ứng dụng nhiều trong việc sản xuất vaccin, kháng sinh và protein dùng trong dược phẩm[34]. 10 TRẦN THỊ TUYẾT NHUNG MSSV: 1253010262 Báo cáo Khóa Luận Tốt nghiệp, 5/2016 Sự phát triển của GMO tăng nhanh theo tốc độ phát triển của nhân loại, tính đến năm 2015, cây trồng biến đổi gene đã được trồng trên hơn 13% đất canh tác thế giới và các sản phẩm từ chúng có mặt tại hầu hết các siêu thị, cửa hàng của các quốc gia, trong đó có Việt Nam [27].3 Tình hình lưu hành GMO trên Thế giới và Việt Nam 1.1 Tình hình lưu hành GMO trên Thế giới Theo báo cáo của Tổ chức Quốc Tế về Tiếp Thu Các Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong Nông Nghiệp (ISAAA), tính đến năm 2014, cây trồng biến đổi gene đã được trồng bởi 18 triệu nông dân tại 28 quốc gia trên tổng diện tích là 181.000 ha, tương đương với 13% bề mặt canh tác của thế giới. Trong đó, 82% trên tổng diện tích được dùng để trồng đậu nành, 68% bông, 30% đối với ngô và 25% cải dầu được trồng với các giống cây trồng biến đổi gene vào năm 2014 [27]. 11 TRẦN THỊ TUYẾT NHUNG MSSV: 1253010262 Báo cáo Khóa Luận Tốt nghiệp, 5/2016 Quốc gia cho phép Quốc gia cho Quốc gia đang tiến hành trồng và nhập khẩu phép nhập khẩu khảo nghiệm đồng ruộng Hình 1.
1 Bản đồ các quốc gia trồng, nhập khẩu, và/hoặc tiến hành khảo nghiệm đồng ruộng sinh vật biến đổi gene tại 70 quốc gia trên Thế Giới năm 2014 [45] .2 Tình hình lưu hành GMO tại Việt Nam Ngày 03/02/2015, tại Hội nghị Triển vọng cây trồng về biến đổi gene, Viện trưởng viện di truyền nông nghiệp Việt Nam Lê Huy Hàm cho biết: “Từ những năm 2000, 100% đậu tương biến đổi gen đã được nhập vào Việt nam chiếm đến 93% nhu cầu, 7% còn lại là nguồn cung trong nước”[52]. Tuy nhiên, mãi cho đến năm 2005, nước ta mới bắt đầu xây dựng hành lang pháp lý cho việc ứng dụng công nghệ sinh học bao gồm các giống chuyển gene [55]. Năm 2015, ngô biến đổi gene có khả năng kháng sâu được đưa vào trồng đại trà và Việt Nam trở thành quốc gia thứ 29 trên Thế Giới trồng cây biến đổi gene[ 51]. Mục tiêu đến năm 2020, diện tích trồng trọt các cây mới tại Việt Nam tạo ra bằng các kỹ thuật 12 TRẦN THỊ TUYẾT NHUNG MSSV: 1253010262 Báo cáo Khóa Luận Tốt nghiệp, 5/2016 công nghệ sinh học chiếm trên 70%, trong đó diện tích trồng các giống cây biến đổi gene chiếm 30-50%.
Ba giống cây được quan tâm đưa vào sản xuất là ngô, bông và đậu nành [54]. Hiện nay, dù đã có một số lượng lớn sản phẩm biến đổi gen được lưu hành trong nước, nhưng hiện vẫn chưa có quy trình kiểm nghiệm và quy chế cụ thể trong việc kiểm soát các sản phẩm biến đổi gen nhập khẩu. Quy chế dán nhãn thông báo sản phẩm biến đổi gen đã nhiều lần được đưa ra thảo luận nhằm giúp người tiêu dùng nhận diện và lựa chọn, nhưng hiện vẫn là vấn đề còn nhiều tranh cãi.4 Lợi ích của sinh vật biến đổi gene Theo báo cáo của Tổ chức Quốc Tế Về Tiếp Thu Các Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong Nông Nghiệp (ISAAA), từ dữ liệu tạm thời năm 1996-2013, cây trồng biến đổi gene góp phần vào an ninh lương thực, giảm thiểu biến đổi khí hậu, và đóng góp trong chiến lược “phát triển bền vững - sustainable intensification” theo năm cách: - Góp phần vào việc tự túc và an ninh lương thực, thức ăn chăn nuôi, chất xơ, cung cấp chi phí thực phẩm hợp lý, bằng cách tăng lợi ích kinh tế và năng suất một cách bền vững ở cấp độ nông nghiệp [27]. - Bảo tồn đa dạng sinh học [27].
- Góp phần vào công cuộc xóa đói giảm nghèo [27]. - Giảm lượng khí thải trong môi trường nông nghiệp [27]. - Giúp giảm thiểu biến đổi khí hậu và giảm khí nhà kính [27]. Bên cạnh những lợi ích có thể thấy của sinh vật biến đổi gene, nhiều lo ngại về tác động có thể có của chúng đối với sức khỏe con người, vật nuôi và môi trường [32].5 Những lo ngại và dư luận xã hội về sinh vật biến đổi gene Các ảnh hưởng tiềm ẩn của sinh vật biến đổi gen đối với con người bao gồm: chất gây dị ứng, độc tố, chuyển giao marker kháng kháng sinh.
Một số nhà khoa học quan ngại rằng sự xuất hiện GMO có liên quan trực tiếp đến sự gia tăng các vấn đề sức khỏe 13 TRẦN THỊ TUYẾT NHUNG MSSV: 1253010262 Báo cáo Khóa Luận Tốt nghiệp, 5/2016 như nguy cơ gia tăng một số bệnh ung thư, các vấn đề sinh sản, bệnh tự kỉ và bệnh tim [7,32]. Một số ảnh hưởng đối với vật nuôi, cây trồng và môi trường: - Xuất hiện siêu vi khuẩn và cỏ kháng thuốc gây thiệt hại mùa màng và chi phí cho người nông dân [9]. - Ô nhiễm không khí, nước và đất. Ví dụ như Glyphosate- thuốc diệt cỏ Roundup của Mosanto có thể phá hủy chất lượng đất và làm giảm giá trị dinh dưỡng của thực vật [9].