Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính kháng nấm của cao chiết nấm linh chi ganoderma lucidum

Khảo sát thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính kháng nấm của cao chiết nấm linh chi Ganoderma lucidum, mang lại tiềm năng trong y học.

• Tác giả: Trần Kiến Tường
• Người hướng dẫn: TS. Lao Đức Thuận
• Trường học: Trường Đại Học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Khảo Sát Sơ Bộ Thành Phần Hóa Học và Đánh Giá Hoạt Tính Kháng Nấm của Nấm Linh Chi (Ganoderma Lucidum)
• Loại tài liệu: Khóa Luận Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. PHẦN I: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan về nấm Linh chi (Ganoderma lucidum)
• 1.2. Tổng quan về một số vi khuẩn gây bệnh thử nghiệm
• 1.3. Tổng quan về vi nấm gây bệnh
• 1.4. Khái quát phương pháp thử hoạt tính kháng nấm
• 1.4.1. Phương pháp khuyết tán
• 1.4.2. Phương pháp pha loãng liên tiếp
• 1.5. Tình hình nghiên cứu
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Bộ mẫu nấm
• 2.2. Dụng cụ, thiết bị, môi trường và hóa chất
• 2.3. Bố trí thí nghiệm
• 2.4. Quy trình nghiên cứu
• 2.5. Thu thập mẫu nấm
• 2.6. Thu cao chiết mẫu nấm
• 2.7. Xác định tổng hàm lượng polysachride, polyphenol và định lượng adenosine
• 2.8. Định tính sơ bộ một số nhóm chất có trong cao chiết toàn phần
• 2.9. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn
• 2.10. Khảo sát hoạt tính kháng nấm
• 2.11. Khảo sát hoạt tính chống oxi hóa tế bào
• 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả thu cao chiết mẫu nấm
• 3.2. Kết quả tổng hàm lượng polysachride, polyphenol và định lượng adenosine
• 3.2.1. Tổng hàm lượng polysachride
• 3.2.2. Tổng hàm lượng polyphenol
• 3.2.3. Định lượng adenosine
• 3.3. Định tính sơ bộ một số nhóm chất có trong cao chiết toàn phần
• 3.3.1. Định tính alkaloid
• 3.3.2. Định tính flavonoid
• 3.3.3. Định tính acid hữu cơ
• 3.3.4. Định tính saponin
• 3.3.5. Định tính phenolic và tanine
• 3.3.6. Định tính đường khử
• 3.3.7. Định tính acid uronic
• 3.4. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nấm Linh chi
• 3.5. Hoạt tính kháng nấm của cao chiết nấm Linh chi
• 3.6. Hoạt tính chống oxi hóa tế bào của cao chiết nấm Linh chi
• 4. PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• 4.1.
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nấm Linh Chi và thành phần hóa học của nó

Nấm Linh Chi, hay còn gọi là Ganoderma lucidum, là một loại nấm quý hiếm được sử dụng trong y học cổ truyền. Nấm này chứa nhiều hợp chất hóa học có lợi cho sức khỏe, bao gồm polysaccharides, triterpenoids và các hợp chất phenolic. Những thành phần này không chỉ giúp tăng cường hệ miễn dịch mà còn có tác dụng kháng viêm và chống ung thư. Theo nghiên cứu của Liu và cộng sự (2016), nấm Linh Chi đã được sử dụng để điều trị nhiều bệnh lý khác nhau.

1.1. Đặc điểm sinh học của nấm Linh Chi

Nấm Linh Chi thường mọc trên các cây gỗ mục và có hình dạng quả thể đặc trưng. Chúng có thể phát triển trong nhiều điều kiện môi trường khác nhau, từ nhiệt độ thấp đến cao. Đặc điểm này giúp nấm Linh Chi có khả năng thích nghi tốt với môi trường sống.

1.2. Thành phần hóa học chính trong nấm Linh Chi

Nấm Linh Chi chứa nhiều thành phần hóa học quan trọng như polysaccharides, triterpenoids và adenosine. Các hợp chất này có tác dụng chống oxi hóa, kháng viêm và hỗ trợ điều trị nhiều bệnh lý, đặc biệt là ung thư.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu nấm Linh Chi

Mặc dù nấm Linh Chi có nhiều lợi ích sức khỏe, nhưng việc nghiên cứu và ứng dụng của nó vẫn gặp nhiều thách thức. Một trong những vấn đề chính là việc chiết xuất và phân tích các hợp chất sinh học từ nấm. Nhiều nghiên cứu hiện tại vẫn chưa xác định được đầy đủ các hoạt chất có trong nấm Linh Chi, dẫn đến việc chưa khai thác hết tiềm năng của nó.

2.1. Khó khăn trong việc chiết xuất hợp chất từ nấm

Quá trình chiết xuất các hợp chất từ nấm Linh Chi thường phức tạp và tốn thời gian. Các phương pháp chiết xuất hiện tại chưa tối ưu hóa được hiệu suất thu hồi các hoạt chất có lợi.

2.2. Thiếu thông tin về hoạt tính sinh học của nấm

Nhiều nghiên cứu về hoạt tính sinh học của nấm Linh Chi vẫn còn hạn chế. Việc thiếu thông tin này gây khó khăn trong việc áp dụng nấm Linh Chi vào thực tiễn y học.

III. Phương pháp nghiên cứu hoạt tính kháng nấm của nấm Linh Chi

Để đánh giá hoạt tính kháng nấm của nấm Linh Chi, các phương pháp nghiên cứu như phương pháp khuyết tán và phương pháp pha loãng liên tiếp thường được sử dụng. Những phương pháp này giúp xác định nồng độ tối thiểu cần thiết để ức chế sự phát triển của nấm gây bệnh.

3.1. Phương pháp khuyết tán

Phương pháp khuyết tán là một trong những kỹ thuật phổ biến để đánh giá hoạt tính kháng nấm. Kỹ thuật này cho phép xác định nồng độ tối thiểu của chiết xuất nấm Linh Chi có khả năng ức chế sự phát triển của nấm.

3.2. Phương pháp pha loãng liên tiếp

Phương pháp pha loãng liên tiếp giúp xác định nồng độ tối thiểu ức chế (MIC) của chiết xuất nấm Linh Chi đối với các chủng nấm khác nhau. Kết quả từ phương pháp này cung cấp thông tin quan trọng về khả năng kháng nấm của nấm Linh Chi.

IV. Kết quả nghiên cứu về hoạt tính kháng nấm của nấm Linh Chi

Nghiên cứu cho thấy nấm Linh Chi có hoạt tính kháng nấm mạnh đối với nhiều chủng nấm gây bệnh. Các kết quả thử nghiệm cho thấy chiết xuất nấm Linh Chi có thể ức chế sự phát triển của nấm Candida albicans và Trichophyton rubrum, hai loại nấm thường gặp trong y học.

4.1. Hoạt tính kháng nấm đối với Candida albicans

Chiết xuất nấm Linh Chi cho thấy khả năng ức chế sự phát triển của Candida albicans, một trong những tác nhân gây nhiễm trùng phổ biến. Kết quả này mở ra hướng đi mới trong việc điều trị nhiễm nấm.

4.2. Hoạt tính kháng nấm đối với Trichophyton rubrum

Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng nấm Linh Chi có khả năng ức chế Trichophyton rubrum, loại nấm gây bệnh nấm da. Điều này cho thấy tiềm năng ứng dụng của nấm Linh Chi trong điều trị các bệnh nấm da.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nấm Linh Chi

Nấm Linh Chi không chỉ là một loại dược liệu quý mà còn có tiềm năng lớn trong nghiên cứu và ứng dụng y học. Các nghiên cứu hiện tại đã chỉ ra rằng nấm Linh Chi có nhiều hoạt tính sinh học có lợi, đặc biệt là hoạt tính kháng nấm. Tuy nhiên, cần tiếp tục nghiên cứu để khai thác hết tiềm năng của nấm Linh Chi trong y học.

5.1. Tương lai của nghiên cứu nấm Linh Chi

Nghiên cứu về nấm Linh Chi sẽ tiếp tục được mở rộng, đặc biệt là trong việc xác định các hợp chất sinh học và hoạt tính của chúng. Điều này sẽ giúp nâng cao giá trị của nấm Linh Chi trong y học.

5.2. Ứng dụng thực tiễn của nấm Linh Chi

Nấm Linh Chi có thể được ứng dụng rộng rãi trong các sản phẩm chăm sóc sức khỏe và thực phẩm chức năng. Việc phát triển các sản phẩm từ nấm Linh Chi sẽ mang lại lợi ích cho sức khỏe cộng đồng.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Nấm Linh chi (Ganoderma lucidum (Curtis) P. Karst) là loại dược liệu quý thuộc họ Nấm lim (Ganodermataceae), bộ Nấm đa tầng (Polyporales). Trong lịch sử y học cổ truyền phương Đông tại các quốc gia như Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc và Việt Nam, quả thể nấm Linh chi đã được ghi nhận trong sách Thần nông bản thảo và được sử dụng rộng rãi nhằm bồi bổ sức khỏe, hỗ trợ điều trị thấp khớp, viêm phế quản, các bệnh lý về gan, thận, tim mạch, cũng như nâng cao thể trạng cho bệnh nhân ung thư đang thực hiện hóa trị liệu và xạ trị. Nhiều công trình nghiên cứu hiện đại đã chỉ ra rằng các hợp chất có hoạt tính sinh học trong nấm Linh chi như polysaccharide, triterpenoid, adenosine, alkaloid và saponin mang lại khả năng chống khối u, điều hòa miễn dịch, kháng virus (bao gồm cả virus HIV) và đào thải độc tố do phóng xạ.

Mặc dù tiềm năng dược lý của Ganoderma lucidum đã được ghi nhận qua nhiều tài liệu, phần lớn các nghiên cứu chuyên sâu về chiết xuất hoạt chất trước đây thường tập trung chủ yếu vào phần bào tử nấm hoặc phân bố loài ở khu vực phía Bắc và miền Trung Việt Nam. Việc khai thác quả thể nấm hóa gỗ bằng phương pháp chiết xuất cao toàn phần để đánh giá đồng thời thành phần hóa học và phổ hoạt tính sinh học—đặc biệt là hoạt tính kháng các chủng vi khuẩn đường ruột, vi nấm gây bệnh ngoài da ở người và khả năng dọn dẹp gốc tự do—đối với nguồn nấm Linh chi nuôi trồng tại vùng đất Lâm Đồng vẫn cần bổ sung các dẫn liệu thực nghiệm có tính hệ thống. Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn đó, đề tài khóa luận "Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính kháng nấm của cao chiết nấm Linh chi (Ganoderma lucidum)" được thực hiện.

Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể của đề tài bao gồm:

1. Thu nhận cao chiết thô từ quả thể nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) bằng phương pháp chiết xuất nước nóng ở nhiệt độ 100°C.
2. Định tính sơ bộ 07 nhóm hợp chất tự nhiên có trong cao chiết toàn phần thông qua các phản ứng hóa học chỉ thị.
3. Định lượng hàm lượng polysaccharide tổng (phương pháp acid phenol-sulfuric), polyphenol tổng (phương pháp Folin-Ciocalteu) và xác định hàm lượng adenosine bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
4. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nấm Linh chi trên 04 chủng vi khuẩn kiểm định (Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, Escherichia coli) bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch.
5. Đánh giá hoạt tính kháng nấm của cao chiết trên 04 chủng vi nấm gây bệnh (Candida albicans, Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes, Microsporum canis) bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch.
6. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa tế bào của cao chiết thông qua khả năng trung hòa gốc tự do DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) so sánh với chất đối chứng acid ascorbic (Vitamin C).

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Mẫu quả thể nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) sấy khô.
• Phạm vi không gian: Mẫu nấm được thu thập tại thành phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng. Toàn bộ các quy trình chiết xuất, phân tích hóa học, thử nghiệm vi sinh và đo quang phổ được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử và Phòng thí nghiệm Vi sinh 1, 2 thuộc Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh.
• Phạm vi thời gian: Đề tài khóa luận tốt nghiệp đại học ngành Công nghệ Sinh học được hoàn thành và bảo vệ vào tháng 8 năm 2022.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Cơ sở lý thuyết và các nhóm hoạt chất mục tiêu

Về mặt phân loại sinh học, nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) được xếp theo hệ thống phân loại của Donk (1948) thuộc Giới Fungi, Ngành Basidiomycota, Lớp Agaricomycetes, Bộ Polyporales, Họ Ganodermataceae, Chi Ganoderma. Về mặt cấu tạo, quả thể nấm hóa gỗ gồm phần mũ nấm và cuống nấm, thịt nấm gồm nhiều lớp sợi phân nhánh đan xen chặt chẽ tạo thành lớp vỏ nhẵn bóng không thấm nước. Quá trình sinh trưởng trải qua các giai đoạn từ bào tử đơn nhân nảy mầm hình thành hệ sợi sơ cấp, kết hợp thành sợi thứ cấp song nhân, phát triển thành nút nấm, quả thể con và quả thể trưởng thành phóng thích bào tử.

Cơ sở lý thuyết về thành phần hóa sinh và dược lý của Ganoderma lucidum tập trung vào các nhóm chất chính:

• Polysaccharide nấm Linh chi (GLPs): Chủ yếu là các mạch polymer liên kết beta-D glucan với cấu trúc xoắn ba chiều tương tự acid nucleic, khối lượng phân tử dao động từ $3{,}13 \times 10^6$ đến $1{,}55 \times 10^7$ Da, có khả năng tan trong nước nóng, mang hoạt tính tăng cường miễn dịch, kháng u và bảo vệ mô tế bào.
• Adenosine: Dẫn xuất purine nucleoside có vai trò quan trọng trong việc điều hòa độ nhớt máu, ức chế kết tập tiểu cầu, ngăn ngừa hình thành huyết khối và hỗ trợ tuần hoàn oxy lên não.
• Triterpenoid và Ganoderic acid (Ganoderic acid A, B, S, R, T.O...): Hợp chất có bộ khung carbon từ 27 đến 30 đơn vị isopren, tạo nên vị đắng đặc trưng của nấm Linh chi, có tính kháng viêm, bảo vệ tế bào gan, điều hòa huyết áp và ức chế sinh tổng hợp cholesterol.
• Alkaloid, Saponin, Polyphenol và Tanin: Các nhóm chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học đa dạng trong điều hòa thần kinh, chống oxy hóa và ức chế vi sinh vật gây hại.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Khóa luận áp dụng phương pháp nghiên cứu thực nghiệm trong phòng thí nghiệm thông qua chuỗi quy trình chuẩn hóa:

Nhóm nội dung	Phương pháp thực nghiệm áp dụng	Tài liệu/Quy chuẩn tham chiếu
Thu nhận cao chiết	Chiết xuất hồi lưu bằng nước nóng ở 100°C trong 8 giờ (tỷ lệ 5 g bột quả thể khô trong 200 mL nước cất, tức tỷ lệ 5:200 w/v). Lọc thô qua vải mỏng, lọc chân không qua giấy lọc và cô cạn thu cao thô.	Cheng và cộng sự (2013)
Định tính hóa thực vật	Thử nghiệm tạo màu và tạo kết tủa trong ống nghiệm đối với 07 nhóm chất: Alkaloid (thuốc thử Mayer), Flavonoid (phản ứng Cyanidin với bột Mg và HCl đặc), Acid hữu cơ (phản ứng với $\text{Na}_2\text{CO}_3$), Saponin (độ bền cột bọt), Phenolic/Tanin (phản ứng với $\text{FeCl}_3$ 5%), Đường khử (thuốc thử Fehling A + B), Acid uronic (kết tủa với ethanol 96°).	Sofowora (1996), Tiwari (2013)
Định lượng Polysaccharide	Phương pháp đo quang phổ acid phenol-sulfuric tạo phức màu, đo mật độ quang (OD) tại bước sóng $\lambda = 483\text{ nm}$ trên máy quang phổ Shimadzu UV/Vis series 1601, dựng đường chuẩn dựa trên D-glucose.	Nielsen và cộng sự (2017)
Định lượng Polyphenol	Phương pháp Folin-Ciocalteu, phản ứng tạo màu với thuốc thử Folin 10% và $\text{Na}_2\text{CO}_3$ 10%, ủ 2 giờ ở nhiệt độ phòng, đo OD tại bước sóng $\lambda = 765\text{ nm}$, tính toán dựa trên đường chuẩn Acid Gallic (GAE).	Đường chuẩn Acid Gallic
Định lượng Adenosine	Chiết hồi lưu mẫu với methanol 90% trong 60 phút, lọc qua màng 0,45 µm. Chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC Perkin Elmer), pha tĩnh hạt silica gel, pha động Methanol : Đệm Kali Photphat 10 mM (tỷ lệ 15:85, pH 5,0), tốc độ dòng 1,5 mL/phút, đối chiếu chất chuẩn thương mại Sigma.	Yang và cộng sự (2006)
Thử hoạt tính kháng khuẩn	Phương pháp khuếch tán giếng thạch (đường kính giếng 6 mm, thể tích nạp $70\ \mu\text{L}$ cao chiết). Môi trường nuôi cấy MHA, huyền dịch vi khuẩn pha nồng độ chuẩn 0,5 McFarland ($1{,}5 \times 10^8\text{ CFU/mL}$). Đo đường kính vòng ức chế sau 16–18 giờ ủ ở 37°C.	Bauer và cộng sự (1966)
Thử hoạt tính kháng nấm	Phương pháp khuếch tán giếng thạch (đường kính giếng 6 mm, nạp $70\ \mu\text{L}$ cao chiết). Môi trường thử nghiệm PDA và SDA, huyền dịch nấm pha đạt mật độ $1 - 2 \times 10^6\text{ tế bào/mL}$. Đo đường kính vòng ức chế sau 5–7 ngày ủ ở 37°C.	Nxumalo và cộng sự (2020)
Thử hoạt tính chống oxy hóa	Phương pháp dọn dẹp gốc tự do DPPH 2%, ủ mẫu thử và DPPH (tỷ lệ 1:1) ở nhiệt độ phòng trong bóng tối 60 phút. Đo độ hấp thụ quang tại bước sóng $\lambda = 517\text{ nm}$. Tính toán chỉ số % SA theo công thức: $%\text{SA} = [(\text{OD}{\text{đối chứng}} - \text{OD}{\text{mẫu}})/\text{OD}_{\text{đối chứng}}] \times 100$. Đối chứng dương là Acid ascorbic (Vitamin C).	Yuvaraj và cộng sự (2013)

Nguồn vật liệu và chủng vi sinh vật

1. Bộ mẫu nấm: Quả thể nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) thu nhận từ Đà Lạt, Lâm Đồng, xay thành bột mịn trước khi chiết xuất.
2. Chủng vi khuẩn kiểm định: Gồm 01 chủng vi khuẩn Gram dương là Staphylococcus aureus (ATCC 25923) và 03 chủng vi khuẩn Gram âm gồm Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Salmonella typhimurium (ATCC 14028), Escherichia coli (ATCC 25922).
3. Chủng vi nấm kiểm định: Gồm 01 chủng nấm men gây bệnh cơ hội Candida albicans và 03 chủng vi nấm sợi gây bệnh da liễu (Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes, Microsporum canis).

---

Nội dung chính theo từng chương

Đặt vấn đề

Chương mở đầu phân tích vị trí dược liệu của nấm Linh chi trong y học cổ truyền và y học hiện đại, chỉ ra giá trị của các nhóm hoạt chất sinh học tự nhiên trong quả thể nấm. Tác giả lập luận về tính cấp thiết của việc xây dựng quy trình chiết xuất cao toàn phần từ quả thể nấm Linh chi trồng tại Lâm Đồng nhằm xác lập các dữ liệu định tính, định lượng và kiểm chứng hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm và chống oxy hóa phục vụ định hướng ứng dụng thực tiễn.

Phần I: Tổng quan

Chương tổng quan hệ thống hóa tài liệu khoa học về nấm Linh chi và các đối tượng vi sinh vật thử nghiệm, chia thành các nội dung chính:

• Sinh học và thành phần hóa học của nấm Linh chi: Trình bày vị trí phân loại theo Donk (1948), đặc điểm giải phẫu mũ nấm, cuống nấm, cấu trúc hai lớp vỏ của bào tử, chu trình phát triển cá thể và điều kiện nuôi trồng thích hợp (nhiệt độ nuôi sợi 20–30°C, nhiệt độ tạo quả thể 22–28°C, độ ẩm mùn cưa 40–70%, độ ẩm môi trường 70–90%, pH 4–6). Mô tả chi tiết cấu trúc hóa học và dược tính của Polysaccharide (beta-D glucan), Adenosine, Alkaloid, Saponin và các dẫn xuất Triterpenoid/Ganoderic acid.
• Tổng quan về vi sinh vật thử nghiệm: Phân loại và đặc tính gây bệnh của các chủng vi khuẩn (E. coli gây tiêu chảy và nhiễm trùng huyết; P. aeruginosa gây nhiễm trùng cơ hội, viêm phổi, tiết sắc tố pyocyanin; S. typhimurium gây bệnh thương hàn; S. aureus gây nhiễm trùng da và ngộ độc) và các vi nấm (C. albicans gây nấm niêm mạc/nội tạng; T. rubrum, T. mentagrophytes, M. canis gây nấm da đầu, nấm móng, nấm da biểu bì).
• Nguyên lý phương pháp thử nghiệm vi sinh: Trình bày cơ chế của phương pháp khuếch tán đĩa thạch/giếng thạch và phương pháp pha loãng liên tiếp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) theo tiêu chuẩn của Viện Tiêu chuẩn Lâm sàng và Phòng xét nghiệm Hoa Kỳ (CLSI M27-A3 cho nấm men, CLSI M38-A2 cho nấm sợi, CLSI M7-A8 cho vi khuẩn).
• Tình hình nghiên cứu: Tổng kết các công trình phân loại và thành phần loài nấm Ganodermataceae tại Việt Nam của Trịnh Tam Kiệt, Phan Huy Dục, Ngô Anh, Lê Bá Dũng, Lê Xuân Thám; cùng các nghiên cứu quốc tế về hoạt tính sinh học của nấm Linh chi từ các tác giả Patouillard, Steyaert, Moncalvo, Tsivileva.

Phần II: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết toàn bộ điều kiện vật chất và quy trình thực nghiệm:

• Liệt kê danh mục thiết bị (tủ cấy vô trùng, nồi hấp tiệt trùng $121^\circ\text{C}$, tủ sấy, tủ ấm, máy quang phổ UV/Vis Shimadzu 1601, hệ thống HPLC Perkin Elmer), dụng cụ và các hóa chất tinh khiết, môi trường nuôi cấy (NA, MHA, PDA, SDA, thuốc thử Mayer, Fehling A/B, Trim Hill, Folin-Ciocalteu, DPPH).
• Thiết lập sơ đồ bố trí thí nghiệm toàn diện từ 50 g mẫu nấm khô ban đầu qua các bước chiết nước nóng 8 giờ ở 100°C (tỷ lệ 5:200 w/v), lọc vải mỏng, lọc chân không và cô đặc thành cao thô.
• Quy trình cụ thể cho các phản ứng định tính 07 nhóm hợp chất tự nhiên theo Sofowora và Tiwari.
• Quy trình định lượng quang phổ xác định Polysaccharide tổng (bước sóng 483 nm), Polyphenol tổng (bước sóng 765 nm) và sắc ký HPLC xác định hàm lượng Adenosine.
• Thiết kế thử nghiệm kháng khuẩn (4 chủng) và kháng nấm (4 chủng) trên đĩa thạch với dải nồng độ cao chiết pha loãng bậc hai: 400; 200; 100; 50; 25; 12,5 mg/mL (dung môi nước cất vô trùng, nạp $70\ \mu\text{L}$/giếng đường kính 6 mm).
• Thiết kế thử nghiệm bắt gốc tự do DPPH với dải nồng độ thử nghiệm trong phản ứng: 100; 50; 25; 12,5; 6,25 µg/mL (đo mật độ quang OD tại bước sóng 517 nm sau 60 phút ủ).

Phần III: Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Chương trình bày toàn bộ số liệu thu được từ các thí nghiệm, bao gồm:

• Hiệu suất thu hồi cao chiết: Đánh giá khối lượng cao thô thu được từ 50 g bột quả thể khô ban đầu sau quy trình chiết xuất nước nóng và cô cạn.
• Kết quả phân tích hóa thực vật:
  • Xác định hàm lượng Polysaccharide tổng số từ phương trình hồi quy đường chuẩn D-glucose đo ở 483 nm.
  • Xác định hàm lượng Polyphenol tổng số từ phương trình hồi quy đường chuẩn Acid Gallic đo ở 765 nm.
  • Kết quả định lượng Adenosine trên sắc ký đồ HPLC qua diện tích đỉnh pic và thời gian lưu so với chất chuẩn Adenosine thương mại.
  • Kết quả định tính 07 nhóm hoạt chất thể hiện sự hiện diện của Alkaloid, Flavonoid, Acid hữu cơ, Saponin, Phenolic/Tanin, Đường khử và Acid uronic.
• Kết quả hoạt tính kháng khuẩn: Ghi nhận và so sánh đường kính vòng vô khuẩn sinh ra bởi cao chiết ở các nồng độ từ 12,5 mg/mL đến 400 mg/mL trên các đĩa thạch cấy P. aeruginosa, E. coli, S. typhimurium và S. aureus.
• Kết quả hoạt tính kháng nấm: Đo lường đường kính vòng ức chế của cao chiết nấm Linh chi tại các nồng độ thử nghiệm trên các chủng nấm sợi da liễu (T. mentagrophytes, M. canis, T. rubrum) và nấm men C. albicans.
• Kết quả hoạt tính chống oxy hóa: Đồ thị biểu diễn phần trăm dọn dẹp gốc tự do DPPH (% SA) của cao chiết nấm Linh chi tương ứng với dải nồng độ từ 6,25 đến 100 µg/mL, đặt trong tương quan so sánh với chất chuẩn chống oxy hóa Acid ascorbic (Vitamin C).

Phần IV: Kết luận và kiến nghị

Tổng hợp các chỉ số thực nghiệm chính về thành phần hoạt chất và phổ ức chế vi sinh vật của mẫu cao chiết nấm Linh chi Lâm Đồng, đồng thời nêu các đề xuất chuyên môn nhằm phát triển các phân đoạn chiết tinh sạch và thử nghiệm dược lý chuyên sâu.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả định tính hóa thực vật

Thực nghiệm định tính hóa học trên cao chiết toàn phần nấm Linh chi bằng các phản ứng màu chỉ thị trong ống nghiệm ghi nhận các hiện tượng đặc trưng:

Nhóm hợp chất	Phương pháp / Thuốc thử sử dụng	Hiện tượng quan sát thực nghiệm	Kết luận
Alkaloid	Thuốc thử Mayer	Xuất hiện kết tủa trắng đục	Dương tính (+)
Flavonoid	Phản ứng Cyanidin (HCl đậm đặc + bột Mg)	Dung dịch chuyển sang màu vàng	Dương tính (+)
Acid hữu cơ	Phản ứng với tinh thể $\text{Na}_2\text{CO}_3$	Xuất hiện bọt khí sủi lên bề mặt dung dịch	Dương tính (+)
Saponin	Lắc cơ học mạnh trong 30 giây	Tạo lớp bọt bền trên bề mặt từ 3 đến 60 phút	Dương tính (+)
Phenolic + Tanin	Dung dịch $\text{FeCl}_3$ 5%	Dung dịch phản ứng chuyển sang màu đen	Dương tính (+)
Đường khử	Thuốc thử Fehling A + Fehling B (đun nóng)	Xuất hiện kết tủa màu đỏ gạch ($\text{Cu}_2\text{O}$)	Dương tính (+)
Acid uronic	Kết tủa phân đoạn bằng Ethanol 96°	Xuất hiện kết tủa trong ống nghiệm	Dương tính (+)

Kết quả định lượng các nhóm hoạt chất chính

• Polysaccharide tổng: Được xác định thông qua phương pháp so màu acid phenol-sulfuric tại bước sóng 483 nm trên đường chuẩn D-glucose. Kết quả khẳng định hàm lượng polysaccharide dồi dào trong dịch chiết nước nóng từ quả thể.
• Polyphenol tổng: Được xác định qua phản ứng với thuốc thử Folin-Ciocalteu tại bước sóng 765 nm trên đường chuẩn Acid Gallic, chứng minh sự hiện diện của nhóm chất có khả năng khử và dọn dẹp gốc tự do.
• Adenosine: Sắc ký đồ HPLC phân tích ở tốc độ dòng 1,5 mL/phút với hệ dung môi Methanol : Đệm Kali Photphat (15:85, pH 5,0) cho pic sắc ký của adenosine phân tách rõ nét, trùng khớp với thời gian lưu của chất chuẩn thương mại.

Kết quả hoạt tính sinh học

• Hoạt tính kháng khuẩn: Cao chiết nấm Linh chi ở các nồng độ thử nghiệm (đặc biệt tại 200 mg/mL và 400 mg/mL) thể hiện khả năng ức chế sinh trưởng đối với cả 04 chủng vi khuẩn kiểm định gồm Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Salmonella typhimurium và Staphylococcus aureus. Đường kính vòng vô khuẩn mở rộng tương ứng với sự gia tăng nồng độ cao chiết.
• Hoạt tính kháng nấm: Thử nghiệm khuếch tán giếng thạch ghi nhận sự xuất hiện vòng ức chế sinh trưởng rõ rệt trên các chủng nấm sợi gây bệnh da liễu Trichophyton mentagrophytes, Microsporum canis, Trichophyton rubrum và nấm men Candida albicans, trong đó hiệu lực kháng nấm thể hiện mạnh nhất ở nồng độ cao chiết 400 mg/mL.
• Hoạt tính chống oxy hóa: Cao chiết nấm Linh chi có khả năng dọn dẹp gốc tự do DPPH phụ thuộc theo nồng độ trong dải từ 6,25 µg/mL đến 100 µg/mL. Đồ thị % SA cho thấy hoạt tính chống oxy hóa tăng tuyến tính theo nồng độ, thể hiện tiềm năng trung hòa gốc tự do so với chất chuẩn đối chứng Acid ascorbic (Vitamin C).

Đóng góp của khóa luận

1. Cung cấp bộ dẫn liệu thực nghiệm hoàn chỉnh về quy trình công nghệ chiết xuất nước nóng quả thể nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) có xuất xứ tại thành phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng.
2. Thiết lập hồ sơ hóa thực vật sơ bộ chuẩn xác cho nguồn nấm Linh chi nội địa, định tính thành công 07 nhóm hợp chất tự nhiên và định lượng các chỉ tiêu hóa sinh trọng yếu (Polysaccharide, Polyphenol, Adenosine).
3. Chứng minh bằng thực nghiệm phổ kháng khuẩn và kháng nấm rộng của cao chiết nấm Linh chi đối với các chủng vi sinh vật gây nhiễm trùng tiêu hóa, nhiễm trùng cơ hội và bệnh lý nấm da thường gặp trên người, đồng thời xác lập hoạt tính chống oxy hóa dọn dẹp gốc tự do DPPH.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

• Phương pháp chiết xuất: Nghiên cứu chỉ thực hiện chiết xuất đơn công đoạn bằng dung môi nước nóng (cao toàn phần), chưa tiến hành chiết phân đoạn với các hệ dung môi có độ phân cực khác nhau (như n-hexane, ethyl acetate, ethanol, methanol) để cô lập và làm giàu từng nhóm hoạt chất riêng biệt.
• Phạm vi khảo sát vi sinh vật: Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm mới dừng lại ở phương pháp khuếch tán giếng thạch nhằm xác định sự hiện diện của vòng vô khuẩn (định tính và bán định lượng), chưa xác định giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn/diệt nấm tối thiểu (MBC/MFC) bằng phương pháp pha loãng liên tiếp trong môi trường lỏng theo chuẩn CLSI.
• Phạm vi thử nghiệm sinh học: Khảo sát chống oxy hóa mới thực hiện trên mô hình in vitro với gốc tự do DPPH, chưa đánh giá hoạt tính chống oxy hóa trên dòng tế bào sống hoặc các mô hình động vật thực nghiệm (in vivo).
• Nguồn mẫu: Nghiên cứu chỉ khảo sát trên một bộ mẫu nấm Linh chi thu nhận tại khu vực Lâm Đồng, chưa tiến hành so sánh đối chứng song song với các chủng nấm Linh chi thu thập từ các vùng sinh thái khác nhau tại Việt Nam.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Thực hiện chiết xuất phân đoạn cao chiết nấm Linh chi bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần nhằm tinh sạch các phân đoạn giàu triterpenoid, polysaccharide và adenosine.
• Ứng dụng các kỹ thuật phân tích hiện đại (như sắc ký cột, LC-MS/MS, phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR) để phân lập và xác định cấu trúc phân tử chính xác của các hợp chất tinh khiết.
• Xác định giá trị MIC, MBC, MFC đối với các chủng vi khuẩn và vi nấm gây bệnh theo đúng tiêu chuẩn CLSI quốc tế.
• Mở rộng nghiên cứu cơ chế phân tử tác động lên tính toàn vẹn màng tế bào vi khuẩn/vi nấm, đồng thời đánh giá độc tính tế bào và hoạt tính sinh học trên các mô hình thử nghiệm in vivo.

---

Giá trị tham khảo

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Trần Kiến Tường mang giá trị học thuật và tài liệu thực hành hữu ích cho nhiều đối tượng:

• Sinh viên và học viên ngành Công nghệ Sinh học, Hóa Dược và Dược học: Có thể sử dụng khóa luận như tài liệu tham khảo chi tiết về quy trình chiết xuất dược liệu hóa gỗ, phương pháp vận hành phản ứng định tính hóa thực vật chuẩn hóa, và kỹ thuật định lượng quang phổ UV/Vis kết hợp HPLC.
• Nghiên cứu viên lĩnh vực Vi sinh ứng dụng và Dược liệu học: Cung cấp phương pháp luận và các thông số thực nghiệm chuẩn xác để bố trí thí nghiệm khuếch tán giếng thạch khảo sát hoạt tính kháng nấm sợi da liễu (Trichophyton, Microsporum)—một nhóm đối tượng vi sinh vật đòi hỏi thời gian nuôi cấy dài ngày và điều kiện kỹ thuật nghiêm ngặt.
• Các đơn vị nghiên cứu và sản xuất chế phẩm sinh học: Cung cấp cơ sở khoa học và số liệu thực nghiệm làm tiền đề phát triển các sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe, cao chiết dược liệu hoặc dung dịch bôi ngoài da hỗ trợ điều trị nấm từ nguồn nấm Linh chi nuôi trồng tại Việt Nam.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Quy trình chiết xuất cao thô từ quả thể nấm Linh chi trong khóa luận được tiến hành với những thông số kỹ thuật nào?
Nghiên cứu sử dụng 50 g bột quả thể nấm Linh chi khô xay mịn, tiến hành chiết xuất bằng phương pháp nước nóng ở nhiệt độ 100°C trong thời gian 8 giờ với tỷ lệ mẫu/dung môi là 5:200 (w/v). Dịch chiết sau đó được lọc thô qua vải mỏng, lọc sạch bằng giấy lọc trên hệ thống máy hút chân không và tiến hành cô cạn để thu nhận sản phẩm cao thô toàn phần.

2. Khóa luận sử dụng các phương pháp hóa lý nào để định lượng các nhóm hoạt chất chính trong cao chiết?
Nghiên cứu áp dụng 03 phương pháp phân tích: (1) Phương pháp so màu acid phenol-sulfuric đo độ hấp thụ quang tại bước sóng 483 nm trên máy quang phổ UV/Vis để định lượng Polysaccharide tổng số theo đường chuẩn D-glucose; (2) Phương pháp Folin-Ciocalteu đo tại bước sóng 765 nm để định lượng Polyphenol tổng số theo đường chuẩn Acid Gallic; (3) Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC Perkin Elmer) sử dụng pha tĩnh silica gel, pha động Methanol : Đệm Kali Photphat 10 mM (tỷ lệ 15:85, pH 5,0) ở tốc độ dòng 1,5 mL/phút để định lượng hàm lượng Adenosine.

3. Những nhóm hợp chất tự nhiên nào được phát hiện qua thử nghiệm định tính hóa học trong cao chiết toàn phần?
Thông qua các phản ứng chỉ thị trong ống nghiệm, nghiên cứu đã định tính và xác nhận sự hiện diện của 07 nhóm hoạt chất tự nhiên trong cao chiết nấm Linh chi gồm: Alkaloid (tạo tủa với thuốc thử Mayer), Flavonoid (chuyển vàng với HCl đđ và Mg), Acid hữu cơ (sủi bọt khí với $\text{Na}_2\text{CO}_3$), Saponin (tạo bọt bền >3 phút), Phenolic và Tanin (chuyển đen với $\text{FeCl}_3$ 5%), Đường khử (tạo tủa đỏ gạch với Fehling A/B) và Acid uronic (tạo tủa với ethanol 96°).

4. Hoạt tính kháng vi sinh vật của cao chiết nấm Linh chi được đánh giá trên những chủng vi khuẩn và vi nấm cụ thể nào?
Nghiên cứu thực hiện thử nghiệm khuếch tán giếng thạch trên 04 chủng vi khuẩn kiểm định gồm Staphylococcus aureus (Gram dương), Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, Escherichia coli (Gram âm) và 04 chủng vi nấm gây bệnh gồm nấm men Candida albicans cùng 03 chủng nấm sợi da liễu Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes và Microsporum canis.

5. Hoạt tính chống oxy hóa của cao chiết nấm Linh chi được xác định theo phương pháp nào và đối chứng với chất gì?
Hoạt tính chống oxy hóa được đánh giá thông qua phương pháp dọn dẹp gốc tự do DPPH (nồng độ 2%), tiến hành ủ mẫu thử và dung dịch DPPH theo tỷ lệ 1:1 trong 60 phút ở nhiệt độ phòng trong bóng tối, sau đó đo mật độ quang tại bước sóng 517 nm với dải nồng độ thử nghiệm từ 6,25 µg/mL đến 100 µg/mL. Chất đối chứng dương được sử dụng trong thí nghiệm là Acid ascorbic (Vitamin C).

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Trần Kiến Tường đã giải quyết trọn vẹn các mục tiêu nghiên cứu đề ra trong việc khảo sát thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính sinh học của cao chiết nước nóng từ quả thể nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) thu nhận tại Lâm Đồng. Đề tài đã xây dựng thành công quy trình chiết xuất cao thô, xác định sự hiện diện của 07 nhóm hoạt chất tự nhiên và định lượng chính xác các chỉ tiêu quan trọng gồm Polysaccharide tổng, Polyphenol tổng và Adenosine bằng phương pháp quang phổ và sắc ký HPLC. Các thử nghiệm vi sinh và hóa sinh in vitro đã chứng minh cao chiết nấm Linh chi có hoạt tính ức chế rõ rệt đối với 04 chủng vi khuẩn, 04 chủng vi nấm gây bệnh ngoài da và thể hiện khả năng trung hòa gốc tự do DPPH mạnh mẽ, tạo lập cơ sở dữ liệu thực nghiệm phục vụ việc nghiên cứu phát triển các chế phẩm dược liệu từ nguồn nấm Linh chi nuôi trồng tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Nấm Linh chi là một họ ăn được quan trọng trong môi trường tự nhiên, nấm này được phát hiện ở hầu như khắp nơi trên thế giới, chúng phân bố ở hầu hết các khu rừng cận nhiết đới và nhiệt đới và ở Châu Phi, Châu Mỹ và Châu Á, được biết đến và sử dụng lâu đời nhất ở Ấn Độ, Trung quốc và Việt Nam. Linh chi từ lâu đã được xem là một loại dược liệu mang nhiều hợp chất quý. Những loài thuộc họ Ganodermataceae thường được sử dụng hiệu quả trong điều trị thấp khớp, viêm phế quản, hỗ trợ điều trị cho bệnh nhân đang thực hiện hóa trị liệu cũng như một số bệnh khác (Liu và cộng sự, 2016). Quả thể của nấm Linh chi đã được dùng rộng rãi trong y học cổ truyền Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc và Việt Nam để điều trị nhiều loại bệnh từ thời cổ đại (Kleinwachter và cộng sự, 2001).

Các sản phẩm từ nấm Linh chi (Ganoderma) được dùng để hỗ trợ điều trị nhiều bệnh như bệnh tiết niệu, gan, ung thư, tim mạch, AIDS. Trong quả thể của Ganoderma lucidum có tác dụng kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của virus HIV do chứa các hoạt chất khác nhau có hoạt tính kháng virus (Weng và cộng sự, 2010). Các hoạt chất từ Ganoderma lucidum có tác dụng chống khối u cao, chúng được sử dụng trong điều trị ung thư: phổi, vú, dạ dày. Ngoài ra, các hợp chất từ Linh chi có khả năng hạn chế và loại trừ những tổn thương do phóng xạ ở mô và tế bào và đào thải phóng xạ.

Các bài báo trước đây cho thấy khả năng sinh ra các hợp chất sinh học có tính chất y học quý của nấm Linh chi là khả quan (Lê Xuân Thám và Trịnh Tam Kiệt, 1995). Trong nhiều năm trở lại đây, các phương pháp phân tích định tính, định lượng mới đã cho phép xác định hàm lượng lớn các chất hóa học có trong quả thể, tơ nấm và bào tử nấm Linh chi như: saponin, triterpenoids, steroid, polysacharide, amino acid, chất khoáng, … trong đó polysacharide và triterpenoid được xem là thành phần chính mang nhiều hoạt tính sinh học của nấm. Tuy các hợp chất sinh học đã được tìm ra nhưng việc phân tích, chiết xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học này chủ yếu thực hiện trên bào tử nấm. Ngoài ra việc chiết xuất cao tổng để thực hiện một số hoạt tính sinh học của nấm 1 2 Linh chi như: kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxi hóa tế bào, chống ung thư,… cũng là một đề tài đáng được quan tâm.

Vì vậy, với mục đích đóng góp một phần nhỏ của mình vào việc nghiên cứu xác định các hoạt chất có trong quả thể nấm Linh chi và khảo sát một số hoạt tính sinh học của cao chiết từ quả thể nấm, chúng tôi đã có những nghiên cứu sơ bộ được thực hiện trong khóa luận tốt nghiệp với tên đề tài: “Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính kháng nấm của nấm Linh chi (Ganoderma lucidum)”. Đề tài này nhằm nghiên cứu về các vấn đề như: Những thành phần hóa học có trong cao chiết của quả thể nấm, khảo sát hoạt tính kháng nấm trên các nồng độ khác nhau. Thông qua các kết quả của đề tài, bước đầu có thể giúp chúng ta có thể xác định thành phần loài nhằm bảo tồn được sự đa dạng sinh học, đánh giá và bổ sung thêm một số tính chất dược liệu quý của nấm Linh chi được nuôi trồng ở Việt Nam. PHẦN I: TỔNG QUAN 3 1.

Tổng quan về nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) Chi Ganoderma hiện nay có khoảng 250 loài trên thế giới. Trong đó, Ganoderma lucidum là loài được sử dụng nhiều nhất để chăm sóc sức khỏe cho đến thời điểm hiện tại (Theo Bộ Y tế, 2013). Nấm Ganoderma lucidum gọi là Lingzhi theo tiếng Trung Quốc, Reishi theo tiếng Nhật Bản, gọi là nấm Lim, nấm Tiên Thảo hay nấm Trường Thọ ở Việt Nam. Ngoài ra còn một số tên gọi khác như của nấm Linh chi như: Bất lão, Chi linh, Nấm lim,… phân bố rộng ở các vùng trên thế giới.

Tên Linh chi đã được chính thức sử dụng theo sách “Thần nông bản thảo” trong số rất nhiều tên gọi. Vị trí phân loại Theo hệ thống phân loại thực vật học Donk. (1948), nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) có vị trí phân loại như sau: Giới: Fungi (nấm) Ngành: Basidiomycota (Nấm đảm) Lớp: Agaricoycetes (Nấm đảm) Bộ: Polyporales (Nấm đa tầng) Họ: Ganodermataceae (Nấm lim) Chi: Ganoderma (Linh chi) Loài: Ganoderma lucidum 1. Đặc điểm cấu tạo Nấm Linh chi thường gặp ở dạng quả thể, tai nấm hóa gỗ gồm 2 phần: mũ nấm và cuống nấm (Trịnh Tam Kiệt, 2011).

4 Thân nấm dài hoặc ngắn, thường đính lệch hoặc đính tâm với mũ nấm. Thân nấm có đường kính khoảng 0,3 – 0,8 cm phần lớn có hình trụ mảnh hoặc to chắc có đường kính tới 1,5 – 4 cm, không phân nhánh đôi lúc có uốn lượn có hình vòng cung (do biến dạng trong quá trình nuôi trồng). Lớp vỏ thân màu nâu đỏ, đỏ, nâu đen bóng, không có lông trên mặt nấm. Mũ nấm khi còn non có hình tròn dẹp và sau trở thành hình rẻ quạt.

Mũ nấm thuôn dài, ít khi có hình vảy, bị biến dạng. Trên bề mặt mũ nấm có màu sắc là vàng nghệ, vàng chanh, vàng cam, vàng nâu, nâu tím, đỏ nâu, nâu đen và nhẵn những vân sóng đồng tâm và rãnh phóng xạ,. Thường sẫm dần theo tuổi, lớp vỏ bao phủ phía trước mũ, đôi lúc có ánh xanh tía. Kích thước tán rất khác nhau, từ 3 – 35 cm đến dày 1 - 4 cm.

Mặt dưới mũ màu vàng hoặc trắng, phẳng, có nhiều lỗ nhỏ là nơi sinh trưởng và giải phóng bào tử nấm. Bào tử nấm bị cắt cụt bởi 2 lớp vỏ có nhiều đoạn nối từ trong ra ngoài. Phần đính kèm thân được nâng lên hoặc lõm xuống. Thịt nấm dày 0,5 - 2,3 cm, màu trắng sữa - nâu nhạt – vàng sữa, chia thành lớp dưới và lớp trên.

Có thể nhìn thấy các sợi nấm hướng lên trên ở các lớp trên. Dưới kính hiển vi chỉ thấy những sợi phồng có đầu giống hình que, màng dày đan xen chặt chẽ hình thành lớp vỏ nhẵn (dày khoảng 0,3 - 0,6 mm). Nấm chống được mưa và nắng nhờ lớp bóng không thấm nước. Hệ sợi đi xuống đều đặn ở lớp dưới, bên cạnh lớp bào tử.

Lớp mầm (lớp tế bào-lớp thụ thể-lớp dưới màng) là một lớp hình ống, dày 0, - 1,9 cm có màu nâu, gồm các ống nhỏ thẳng, miệng gần tròn, màu chanh nhạt, khoảng 2 - 5 ống / mm. Holobasidies có dạng bầu dục, dạng que, không màu, dài 15 - 21 µm, với bốn bào tử cơ bản. Đôi khi các tác giả mô tả chúng giống như hình bầu dục với các đầu tròn. Nó thực sự là do phồng lên của nắp trên hoặc một vết lõm ở thành trong.

Bào tử có cấu tạo hai mảnh vỏ, màu vàng chanh tươi, có một giọt hình cầu ở giữa các lớp nội chất, giống như giọt nước, bào tử có kích thước rất nhỏ, kích thước thay đổi từ 8 đến 11,5. 6- 7,7 µm, phải soi dưới kính hiển vi (Trịnh Tam Kiệt, 2011).1 Hình thái giải phẩu quả thể nấm Linh chi (Trần Minh Hoàng, 2016) 1. Đặc điểm sinh trưởng Vì nấm Linh chi thuộc nhóm nấm, nên sỡ hữu những đặc tính sau: Sợi nấm có hình ống với vách ngăn. Tế bào chất có thể di chuyển dễ dàng từ tế bào này sang tế bào khác do có một vách ngăn không hoàn toàn.

Sợi nấm phát triển và phân chia thành nhiều nhánh cái và nhánh con (Đỗ Tất Lợi, 1994). Có hai loại sợi nấm. Sợi nấm sơ cấp được tạo thành từ các bào tử và các tế bào có một nhân. Sợi thứ cấp là sự kết hợp của hai sợi sơ cấp và tế bào có hai nhân.

Vòng đời của nấm Linh chi, giống như hầu hết các loại nấm khác, bắt đầu bằng một bào tử. Bào tử nảy mầm và hình thành ống mầm. Đường sinh dục phát triển thành hệ sợi sơ cấp. Hai sợi sơ cấp kết hợp với nhau tạo thành sợi thứ cấp.

Sợi sơ cấp và sợi phụ kết hợp với nhau tạo thành hệ sợi nấm, hệ sợi nấm này phát triển thành sợi nấm. Trong điều kiện thuận lợi (nhiệt độ thấp, độ ẩm tăng), bện của các sợi chỉ tạo thành nút nấm. Với nhiệt độ và độ ẩm thích hợp, sợi nấm hình thành chồi 6 nấm, từ đó phát triển thành chồi, tán và thân nấm trưởng thành, mặt dưới mũ sinh bào tử, phóng thích bào tử và chu kỳ (Đỗ Tất Lợi, 2005). Điều kiện và chu trình sống của nấm Linh chi 1.

Điều kiện nuôi trồng • Nhiệt độ - Giai đoạn nuôi sợi: Từ 200C đến 300C - Giai đoạn quả thể: Từ 220C đến 280C • Độ ẩm - Độ ẩm trong mùn cưa đảm bảo nấm có thể mọc được nằm trong khoảng 40% đến 70%. - Độ ẩm môi trường nằm trong khoảng 70% đến 90%. • Ánh sáng - Giai đoạn hệ sợi: Nuôi trong tối - Giai đoạn quả thể: Cần ánh sáng với cường độ thấp • pH - Nấm có thể thích nghi và sinh trưởng tốt ở môi trường acid yếu đến trung tính nằm trong khoảng 4 đến 6. Qúa trình sống 7 Hình 1.2 Chu trình phát triển của nấm Linh chi (Nguyễn Như Quýnh, 2015) Chu trình sinh trưởng của nấm Linh chi gồm các giai đoạn như: Qủa thể phóng thích các bào tử ra ngoài môi trường, các bào tử sau khi nảy mầm và phát triển sẽ hình thành các sợi nấm, các sợi nấm này sẽ phân hóa thành các sợi nấm đơn và song nhân, gặp các điều kiện thuẩn lợi các sợi nấm này sẽ hình thành quả thể con và mọc thành quả thể lớn.

Chu trình này lặp lại nhiều lần (Đỗ Tấn Lợi, 1991). Phân bố Nấm linh chi là loài phân bố rộng khắp trên thế giới, nấm Linh chi mọc ở các tán rừng, sống hoại sinh trên các cây thân gỗ, các cây thuộc họ đậu được đặc biệt chú ý như vành xanh, vành vàng. Trong nước, nấm linh chi có ở hầu như tất cả các vùng miền núi từ Lâm Đồng đến Lào Cai (Đỗ Tất Lợi, 1994). Ganoderma lucidum duy trì chủ yếu thông qua bào tử.

Ở nhiều nước, nấm linh chi được dùng cho nhiều lĩnh vực ngoài có ứng dụng trong y học còn được sử dụng để nghiên cứu khoa học. Nấm hiện nay đã có thể nuôi trồng trên giá thể do con người tạo ra và cho năng suất tốt. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học 8 1. Ganoderma polysaccharide (GLPs) Hiện có hơn 200 loại polysaccharid chiết xuất và thu được từ Ganoderma lucidum.