Khảo Sát Khả Năng Tách Chiết Và Thu Nhận Hợp Chất Benzyl-Isothiocyanate Từ Hạt Cây Đu Đủ

Khảo sát khả năng tách chiết benzyl isothiocyanate từ hạt cây đu đủ Carica papaya, nghiên cứu hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học.

• Tác giả: Võ Hữu Minh Đức
• Người hướng dẫn: ThS. Nguyễn Minh Hoàng
• Trường học: Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Khảo Sát Tách Chiết Benzyl-Isothiocyanate Từ Hạt Đu Đủ
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. PHẦN 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan về đề tài
• 1.2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
• 1.3. Cách tiếp cận, phương pháp và phạm vi nghiên cứu
• 1.3.1. Cách tiếp cận
• 1.3.2. Phương pháp nghiên cứu
• 1.3.3. Phạm vi nghiên cứu
• 1.4. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu
• 1.4.1. Đặc điểm hình thái thực vật
• 1.4.2. Phân loại khoa học
• 1.4.3. Vị trí phân bố
• 1.4.4. Bộ phận sử dụng
• 1.4.5. Công dụng
• 2. PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
• 2.2. Dụng cụ và thiết bị
• 2.3. Đối tượng, thu thập và phạm vi thực hiện
• 2.4. Xử lý nguyên liệu thô
• 2.5. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5.1. Phương pháp chiết xuất hợp chất
• 2.5.2. Khảo sát phương pháp chiết cao tối ưu
• 2.5.3. Khảo sát sự ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi và thời gian chiết đến khối lượng cao thu được
• 2.5.4. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ khi thu cao
• 2.5.5. Phương pháp phân lập hợp chất
• 2.5.6. Khảo sát khả năng hòa tan cao thô với các đơn môi thường dùng
• 2.5.7. Khảo sát khả năng phân tách chất bằng phương pháp TLC
• 2.5.8. Xây dựng trình tự hệ dung môi dùng cho sắc ký cột (CC)
• 2.5.9. Phân tách các hợp chất bằng sắc ký cột
• 2.5.10. Định danh hợp chất tinh khiết sau phân tách
• 3. PHẦN 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Quá trình chiết xuất và thu cao thô
• 3.1.1. Khảo sát phương pháp chiết cao tối ưu
• 3.1.2. Khảo sát điều kiện tối ưu để thu cao chiết
• 3.1.3. Khảo sát giữa các tỉ lệ dung môi và thời gian chiết ly
• 3.1.4. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ trong quá trình thu cao
• 3.2. Quá trình phân lập các thành phần có trong cao thô
• 3.2.1. Khảo sát khả năng tan của cao thô với các đơn môi thông dụng
• 3.2.2. Khảo sát khả năng phân tách của cao thô bằng phương pháp TLC
• 3.3. Xây dựng hệ giải ly cho phương pháp sắc ký cột
• 3.3.1. Phân tách hợp chất bằng phương pháp sắc ký cột
• 4. PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về Khảo Sát Tách Chiết Benzyl Isothiocyanate Từ Hạt Đu Đủ

Khảo sát tách chiết Benzyl-Isothiocyanate (BITC) từ hạt đu đủ là một nghiên cứu quan trọng trong lĩnh vực công nghệ sinh học. Hạt đu đủ không chỉ là phế phẩm mà còn chứa nhiều hợp chất có giá trị. Nghiên cứu này nhằm tìm hiểu khả năng tách chiết và ứng dụng của BITC trong y học.

1.1. Ứng dụng của Benzyl Isothiocyanate trong y học

BITC có nhiều ứng dụng trong y học, đặc biệt là trong điều trị ung thư và các bệnh lý khác. Nghiên cứu cho thấy BITC có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư.

1.2. Tầm quan trọng của hạt đu đủ trong nghiên cứu

Hạt đu đủ thường bị bỏ qua, nhưng chúng chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học. Việc nghiên cứu hạt đu đủ có thể mở ra hướng đi mới trong việc phát triển dược phẩm tự nhiên.

II. Vấn đề và Thách thức trong Khảo Sát Tách Chiết

Mặc dù hạt đu đủ có tiềm năng lớn, nhưng việc tách chiết Benzyl-Isothiocyanate gặp nhiều thách thức. Các vấn đề như hiệu suất chiết xuất thấp và sự phức tạp trong quy trình tách chiết cần được giải quyết.

2.1. Hiệu suất chiết xuất thấp từ hạt đu đủ

Một trong những thách thức lớn nhất là đạt được hiệu suất chiết xuất cao. Nghiên cứu cần tìm ra các phương pháp tối ưu để cải thiện hiệu suất này.

2.2. Sự phức tạp trong quy trình tách chiết

Quy trình tách chiết BITC từ hạt đu đủ có thể phức tạp và yêu cầu nhiều bước. Việc tối ưu hóa quy trình này là cần thiết để đạt được kết quả tốt nhất.

III. Phương pháp Tách Chiết Benzyl Isothiocyanate Từ Hạt Đu Đủ

Nghiên cứu sử dụng nhiều phương pháp khác nhau để tách chiết Benzyl-Isothiocyanate từ hạt đu đủ. Các phương pháp này bao gồm ngâm chiết cổ điển và sắc ký cột.

3.1. Phương pháp ngâm chiết cổ điển

Phương pháp ngâm chiết cổ điển được sử dụng để tách chiết BITC từ hạt đu đủ. Phương pháp này đơn giản nhưng hiệu quả trong việc thu nhận hợp chất.

3.2. Phương pháp sắc ký cột

Sắc ký cột là một phương pháp hiện đại giúp phân tách và tinh chế BITC. Phương pháp này cho phép thu nhận hợp chất với độ tinh khiết cao.

IV. Kết quả Nghiên Cứu và Ứng Dụng Thực Tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy khả năng tách chiết Benzyl-Isothiocyanate từ hạt đu đủ là khả thi. Các ứng dụng thực tiễn của BITC trong y học đang được khám phá.

4.1. Kết quả tách chiết thành công

Nghiên cứu đã đạt được kết quả tách chiết thành công với hiệu suất cao. Điều này mở ra cơ hội cho việc phát triển sản phẩm từ BITC.

4.2. Ứng dụng trong điều trị bệnh

BITC có thể được ứng dụng trong điều trị nhiều loại bệnh, đặc biệt là ung thư. Nghiên cứu tiếp theo sẽ tập trung vào việc xác định hoạt tính sinh học của hợp chất này.

V. Kết luận và Tương Lai của Nghiên Cứu Tách Chiết

Khảo sát khả năng tách chiết Benzyl-Isothiocyanate từ hạt đu đủ mở ra nhiều triển vọng trong nghiên cứu và ứng dụng. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho y học.

5.1. Tương lai của nghiên cứu BITC

Nghiên cứu về BITC từ hạt đu đủ sẽ tiếp tục được mở rộng. Các nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính sinh học và ứng dụng thực tiễn sẽ được thực hiện.

5.2. Khuyến nghị cho nghiên cứu tiếp theo

Cần có thêm nhiều nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình tách chiết và xác định rõ hơn về hoạt tính sinh học của BITC. Điều này sẽ giúp phát triển các sản phẩm dược phẩm hiệu quả hơn.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong xu hướng phát triển y dược học hiện đại, việc nghiên cứu và ứng dụng các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học từ nguồn thảo dược đang đóng vai trò quan trọng. Thống kê cho thấy khoảng 70% đến 80% các loại thuốc đang lưu hành hoặc trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng trên thế giới có nguồn gốc từ thiên nhiên. Mặc dù Việt Nam sở hữu nguồn tài nguyên sinh vật phong phú, đa phần các chế phẩm dược liệu có hoạt tính cao vẫn phải phụ thuộc vào nguồn nhập khẩu do năng lực nghiên cứu chiết xuất và công nghệ hóa dược trong nước còn hạn chế.

Cây đu đủ (Carica papaya L., họ Caricaceae) là loài cây ăn quả nhiệt đới phổ biến, dễ trồng và sinh trưởng nhanh. Tại Việt Nam, cây đu đủ từ lâu đã được sử dụng trong y học dân gian, tuy nhiên các nghiên cứu khoa học chuyên sâu phần lớn mới chỉ tập trung vào bộ phận lá. Hạt đu đủ – một phụ phẩm nông nghiệp và đời sống thường bị vứt bỏ – đã được các công trình khoa học quốc tế chứng minh là nguồn tích lũy chính của tiền chất benzylglucosinolate (BG) và hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao là Benzyl isothiocyanate (BITC). Tại thời điểm thực hiện đề tài, trong nước chưa có công bố nào về việc tách chiết thành công hợp chất BITC từ hạt cây đu đủ mà chỉ mới ghi nhận trên cây chùm ngây.

Khóa luận được thực hiện nhằm giải quyết bài toán tận dụng nguồn phụ phẩm giàu tiềm năng này. Mục tiêu nghiên cứu được tác giả xác định cụ thể gồm:

1. Tìm được các phương pháp và điều kiện trích ly tối ưu trong các phương pháp trích ly cổ điển sử dụng (ngâm dầm và ngâm chiết có khuấy từ).
2. Phân lập và định danh chính xác được hợp chất Benzyl isothiocyanate (BITC) qua sắc ký cột.
3. Khảo sát hoạt tính sinh học của hợp chất sau phân lập để khẳng định kết quả nghiên cứu.

Nghiên cứu tiếp cận vấn đề từ việc tổng hợp cơ sở lý thuyết quốc tế về BITC kết hợp với thực nghiệm hóa sinh. Đối tượng nghiên cứu là hạt của cây đu đủ (Carica papaya L.) thu nhận tại khu vực thành phố Cao Lãnh, tỉnh Đồng Tháp. Về phạm vi không gian, các thí nghiệm được triển khai tại Phòng thí nghiệm Hóa – Môi trường thuộc Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh. Phạm vi thời gian thực hiện nghiên cứu kéo dài từ ngày 07/10/2019 đến ngày 07/08/2020.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết của đề tài dựa trên cấu trúc hóa học và con đường chuyển hóa sinh học của nhóm hợp chất isothiocyanate. Benzyl isothiocyanate (BITC) có tên danh pháp IUPAC là isothiocyanatomethylbenzene, thuộc nhóm hợp chất benzen chứa nhóm chức isothiocyanate (–N=C=S). Hợp chất này được hình thành từ phản ứng thủy phân tiền chất benzylglucosinolate (BG) dưới sự xúc tác của enzyme nội sinh myrosinase khi hạt bị nghiền nát. Về tính chất lý hóa, BITC có khối lượng phân tử khoảng 149,2 g/mol, nhiệt độ nóng chảy 41–42°C, nhiệt độ sôi 241–242°C, tỷ trọng 1,125 g/mL (ở 25°C), độ tan trong nước đạt 0,109 mg/mL và tan tốt trong các dung môi hữu cơ như Ethanol, Chloroform, Dimethyl sulfoxide (DMSO).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được xây dựng qua các giai đoạn kỹ thuật chuẩn hóa:

• Xử lý nguyên liệu thô: Hạt đu đủ tươi sau thu thập được loại bỏ lớp màng bọc chứa dịch nhầy, rửa sạch dưới vòi nước chảy, hong khô bằng quạt trần trong bóng râm đến độ ẩm tồn dư khoảng 10%, sau đó xay nhỏ và bảo quản trong túi zip kín.
• Phương pháp chiết xuất: Sử dụng dung môi ethanol 99,5% để trích ly. Tiến hành khảo sát so sánh hai phương pháp chiết ở nhiệt độ phòng (25–35°C): phương pháp ngâm dầm truyền thống (thời gian 24 giờ) và phương pháp ngâm chiết có khuấy từ (thời gian 2, 4 và 6 giờ) với các tỷ lệ nguyên liệu/dung môi lần lượt là 10:50, 10:75 và 10:100 (g/mL). Thí nghiệm được bố trí theo mô hình thừa số (Factorial experiment) hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại cho mỗi nghiệm thức.
• Phương pháp thu hồi dung môi: So sánh quá trình bay hơi dung môi tự nhiên ở nhiệt độ phòng và đun bay hơi trên bếp cách thủy ở nhiệt độ cài đặt 95°C; đồng thời theo dõi điểm sôi thực tế của dịch chiết và đối chứng thành phần qua sắc ký bản mỏng.
• Phương pháp phân lập:
  • Đánh giá độ tan của cao thô trong các đơn dung môi thông dụng (0,1–0,2 g cao trong 5 mL dung môi, lắc 10–20 lần).
  • Phân tích sắc ký lớp mỏng (TLC) trên bản nhôm tráng sẵn pha tĩnh Silica gel 60 F254 (Merck), khảo sát các hệ pha động gồm Dichloromethane:Petroleum ether (1:20), n-Hexane:Chloroform (1:1), n-Butanol:Chloroform (1:1), Chloroform tinh khiết và Chloroform:Ethyl acetate (9:1); phát hiện vết chất dưới đèn UV ở bước sóng 254 nm, 365 nm và tính toán hệ số lưu giữ $R_f$, hệ số phân tách $R_s$.
  • Phân tách bằng sắc ký cột hở (CC): Cột thủy tinh có đường kính 1,5 cm, chiều cao 50 cm; sử dụng 15 g pha tĩnh Silica gel 60 (tỷ lệ pha tĩnh gấp 10 lần đường kính cột), nhồi cột nén tĩnh qua đêm (chiều cao lớp hạt chiếm 2/5 cột); nạp 1,8 g cao thô trộn với silica gel theo tỷ lệ 1:1,5; giải ly bằng hệ dung môi có độ phân cực tăng dần và rửa giải cột bằng Methanol.
• Phương pháp định danh: Dựa trên kỹ thuật đối chiếu số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^{1}\text{H-NMR}$ và $^{13}\text{C-NMR}$) với các cơ sở dữ liệu phổ chuẩn quốc tế (SpectraBase và các công bố khoa học của Talab và cộng sự).

Nội dung chính theo từng chương

Phần 1: Tổng quan

Chương tổng quan tập trung hệ thống hóa các tư liệu khoa học về phân loại học thực vật, hình thái và thành phần hóa học của cây đu đủ (Carica papaya L.). Tác giả phân tích dữ liệu so sánh hàm lượng các chất dinh dưỡng (tro, chất béo, protein, chất xơ, ẩm, carbohydrate) và hàm lượng khoáng vi lượng (Photpho, Canxi, Magie, Sắt) trong hạt, lá và thịt quả của 5 kiểu hình đu đủ theo công bố của Nwofia (2012).

Về thành phần hóa thực vật, tác giả điểm luận các nhóm hợp chất chính đã được phân lập từ loài này bao gồm flavonoid, acid phenolic, alkaloid và nhóm glucosinolate - isothiocyanate. Trong đó, BITC được nhấn mạnh với các hoạt tính sinh học quan trọng: khả năng ức chế vi nấm gây bệnh (Fusarium oxysporum), hoạt tính kháng khuẩn đối với tụ cầu vàng kháng methicillin (Staphylococcus aureus - MRSA), cùng tiềm năng kìm hãm sự phát triển của các dòng tế bào ung thư tuyến tụy và tế bào ung thư đột biến thiếu hụt protein p53 ($p53\text{-deficient}$). Đồng thời, chương này cũng phân tích nguyên lý hoạt động của các phương pháp chiết xuất ngâm dầm, chiết có khuấy từ, nguyên tắc tách chất trên TLC và sắc ký cột hở.

Phần 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Nội dung chương 2 mô tả chi tiết danh mục hóa chất (Ethanol 99,5%, Methanol, Chloroform, Ethyl acetate, Acetone, n-Hexane, n-Butanol của Xilong Co.; Silica gel 60 và bản mỏng Silica gel 60 F254 của Merck) và các thiết bị chính (Cân kỹ thuật Pioneer PA4102, Cân phân tích Shimadzu ATX224, Máy khuấy từ gia nhiệt Velp ARE, Tủ sấy đối lưu Memmert UM 500, Đèn UV Viber Lourmat VL-6LC bước sóng 254/365 nm, Bếp điện Gali).

Quy trình nghiên cứu được thiết kế mạch lạc qua sơ đồ khối: từ khâu làm sạch màng hạt đu đủ, phơi bóng râm đến độ ẩm ~10%, xay mịn, đến quy trình ngâm chiết khảo sát với ethanol. Chương này quy định rõ các bước tiến hành thực nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mẫu/dung môi (10:50, 10:75, 10:100 g/mL) và thời gian trích ly (2h, 4h, 6h đối với khuấy từ; 24h đối với ngâm dầm). Các bước chuẩn bị cột sắc ký, quy trình phối trộn mẫu nạp cột (1,8 g cao thô phối trộn 2,7 g silica gel), tốc độ giải ly, cách gom các phân đoạn 15 mL trong chai bi và tiêu chuẩn đánh giá độ tinh khiết bằng TLC cũng được cụ thể hóa.

Phần 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Chương 3 trình bày các số liệu thực nghiệm thu được từ quá trình trích ly và phân lập:

• Khảo sát phương pháp chiết và tỷ lệ dung môi: Phương pháp ngâm chiết có khuấy từ trong 6 giờ mang lại hiệu suất trích ly cao hơn rõ rệt so với phương pháp ngâm dầm trong 24 giờ ở tất cả các tỷ lệ dung môi khảo sát. Phân tích phương sai mô hình thừa số cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê rất cao ($p\text{-value} = 0,00 < \alpha = 0,01$). Khi tăng tỷ lệ dung môi từ 10:50 lên 10:100 g/mL, hiệu suất chiết ở phương pháp khuấy từ tăng từ 1,14% lên 4,01%, trong khi ở phương pháp ngâm dầm chỉ tăng từ 0,90% lên 1,44%.

Phương pháp chiết	Tỷ lệ mẫu/dung môi (g/mL)	Lần lặp 1 (%)	Lần lặp 2 (%)	Lần lặp 3 (%)	Giá trị trung bình (%)
Ngâm chiết khuấy từ (6h)	10:50	1,14	1,15	1,13	1,14
	10:75	2,87	2,85	2,86	2,86
	10:100	3,95	4,05	4,03	4,01
Ngâm dầm (24h)	10:50	0,91	0,93	0,87	0,90
	10:75	1,01	1,00	0,99	1,00
	10:100	1,43	1,46	1,43	1,44

• Khảo sát quá trình thu hồi cao và độ bền nhiệt: Thực nghiệm đun cách thủy ở 95°C để loại dung môi cho thấy nhiệt độ sôi của dịch chiết ổn định và thấp hơn nhiệt độ nguồn nhiệt cài đặt. Kết quả kiểm tra đối chứng trên bản mỏng TLC giữa mẫu thu hồi bằng nhiệt và mẫu bay hơi tự nhiên ở nhiệt độ phòng cho các vết sắc ký tương đồng, chứng minh nhiệt độ cách thủy 95°C không làm phân hủy hay biến đổi hợp chất BITC (hợp chất có điểm sôi cao 241–242°C).
• Khảo sát độ tan và phân tách sắc ký: Cao thô tan tốt trong Chloroform và Ethyl acetate. Trên cơ sở kết quả sắc ký lớp mỏng, tác giả đã xây dựng hệ giải ly tăng dần độ phân cực cho sắc ký cột hở, tiến hành phân tách 1,8 g cao thô và thu nhận các phân đoạn ký hiệu từ PP 01 đến PP 07, tiếp tục giải ly các phân đoạn phụ (như PP 06, PP 07) để cô lập chất tinh khiết.

Phần 4: Kết luận và kiến nghị

Tác giả tổng kết các thông số kỹ thuật tối ưu đã đạt được trong quá trình trích ly và phân tách BITC từ hạt đu đủ Đồng Tháp. Đồng thời, chương này đề xuất các kiến nghị nhằm phát triển tiếp đề tài: tiếp tục tinh sạch các phân đoạn sắc ký chưa đạt độ sạch tuyệt đối, thực hiện đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân thực tế để khẳng định cấu trúc, và triển khai các thử nghiệm sinh học in vitro đối với các chủng vi sinh vật kháng thuốc.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã đạt được các kết quả thực nghiệm định lượng cụ thể:

• Xác lập được điều kiện trích ly cao thô tối ưu từ hạt đu đủ: phương pháp ngâm chiết có khuấy từ trong 6 giờ ở nhiệt độ phòng với tỷ lệ mẫu/dung môi ethanol là 10:100 (g/mL), đạt hiệu suất trích ly trung bình 4,01% (cao gấp 2,78 lần so với phương pháp ngâm dầm 24 giờ ở cùng tỷ lệ).
• Chứng minh tính khả thi của phương pháp thu hồi dung môi bằng đun cách thủy ở 95°C, giúp rút ngắn thời gian thu cao mà không làm phân hủy hợp chất mục tiêu.
• Thiết lập quy trình sắc ký cột hở sử dụng chất hấp phụ Silica gel 60 với mẫu nạp tỷ lệ 1:1,5 (cao/pha tĩnh) và hệ giải ly phân cực tăng dần, thu nhận thành công các phân đoạn phân tách hợp chất rõ ràng.

Về mặt đóng góp khoa học và thực tiễn, đề tài là công trình nghiên cứu thực nghiệm bước đầu tại Việt Nam về việc khảo sát tách chiết và phân lập hợp chất Benzyl isothiocyanate (BITC) trực tiếp từ nguồn phụ phẩm hạt cây đu đủ (Carica papaya L.). Nghiên cứu đã cung cấp dữ liệu thực nghiệm có giá trị về điều kiện chiết xuất thích hợp trong điều kiện phòng thí nghiệm cơ bản, mở ra hướng tận dụng nguồn phế phụ phẩm nông nghiệp tại khu vực Đồng bằng sông Cửu Long nhằm phục vụ định hướng chiết xuất hoạt chất cho y dược học.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận ghi nhận một số hạn chế do điều kiện khách quan và cơ sở vật chất:

• Gián đoạn thực nghiệm: Quá trình nghiên cứu thực địa và thí nghiệm bị gián đoạn do ảnh hưởng của đại dịch Covid-19 trong năm 2020, làm ảnh hưởng đến tiến độ triển khai một số nội dung chuyên sâu.
• Giới hạn trang thiết bị: Kích thước cột sắc ký và chủng loại pha tĩnh tại phòng thí nghiệm còn hạn chế (sử dụng cột cố định đường kính 1,5 cm và pha tĩnh Silica gel 60 thông thường), chưa triển khai được các kỹ thuật sắc ký cột hiện đại hơn.
• Định danh và thử nghiệm hoạt tính: Do điều kiện tại chỗ, việc phân tích phổ NMR và khảo sát hoạt tính sinh học chưa thể hoàn tất toàn diện trên mẫu thực nghiệm mà chủ yếu dừng ở bước xây dựng phương pháp đối chiếu dữ liệu phổ chuẩn.

Hướng nghiên cứu tiếp theo được tác giả định hướng gồm: tiếp tục tối ưu hóa quy trình sắc ký cột để nâng cao độ tinh khiết của hợp chất BITC thu nhận; gửi mẫu đo phổ NMR ($^{1}\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, HSQC, HMBC) để xác định chính xác cấu trúc; và tiến hành các thử nghiệm đánh giá hoạt tính kháng khuẩn (đặc biệt trên chủng vi khuẩn MRSA), kháng nấm và ức chế tế bào ung thư.

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận này là tài liệu tham khảo chuyên khảo hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và các nghiên cứu viên thuộc các chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Dược học, Hóa học các hợp chất tự nhiên và Công nghệ Thực phẩm.

Các nội dung có giá trị tham khảo ứng dụng cao bao gồm:

• Quy trình xử lý sơ bộ nguyên liệu hạt tươi có màng nhầy và kỹ thuật sấy/hong khô bảo quản hoạt tính enzyme myrosinase nội sinh.
• Phương pháp bố trí thí nghiệm thừa số khảo sát tương quan giữa tỷ lệ dung môi, thời gian và phương pháp chiết xuất, kèm số liệu phân tích thống kê ANOVA.
• Bảng dữ liệu tham chiếu chi tiết về độ dịch chuyển hóa học trên phổ $^{1}\text{H-NMR}$ và $^{13}\text{C-NMR}$ của hợp chất Benzyl isothiocyanate (BITC) trong các dung môi DMSO và $\text{CDCl}_3$.

Câu hỏi thường gặp

Hợp chất Benzyl isothiocyanate (BITC) được hình thành trong hạt đu đủ theo cơ chế sinh học nào?
Hợp chất BITC không tồn tại sẵn ở dạng tự do với hàm lượng lớn mà được tạo thành khi hạt đu đủ bị nghiền nát, kích hoạt phản ứng thủy phân tiền chất benzylglucosinolate (BG) dưới sự xúc tác của enzyme nội sinh myrosinase có trên bề mặt hạt.

Tại sao phương pháp ngâm chiết có khuấy từ lại cho hiệu suất trích ly cao hơn phương pháp ngâm dầm truyền thống?
Phương pháp khuấy từ tạo sự đảo trộn liên tục, làm tăng diện tích và cường độ tiếp xúc giữa dung môi ethanol và bề mặt bột hạt đu đủ, thúc đẩy nhanh quá trình hòa tan và khuếch tán chất tan vào dung môi, từ đó rút ngắn thời gian chiết xuống 6 giờ mà vẫn đạt hiệu suất 4,01% (so với 1,44% sau 24 giờ của ngâm dầm).

Phương pháp thu hồi dung môi bằng nhiệt trên bếp cách thủy 95°C có làm phân hủy BITC không?
Không. Dù BITC có nhiệt độ nóng chảy thấp (41–42°C) nhưng nhiệt độ sôi của chất này lên tới 241–242°C. Kết quả kiểm tra sắc ký bản mỏng (TLC) đối chứng giữa mẫu thu hồi cách thủy ở 95°C và mẫu bay hơi tự nhiên ở nhiệt độ phòng cho thấy vết sắc ký hoàn toàn tương đồng, khẳng định nhiệt độ thu hồi không phá hủy hợp chất.

Nghiên cứu đã sử dụng những hệ dung môi nào để khảo sát khả năng tách chất trên sắc ký bản mỏng (TLC)?
Tác giả đã tiến hành thử nghiệm trên các hệ dung môi pha động gồm: Dichloromethane:Petroleum ether (tỷ lệ 1:20), n-Hexane:Chloroform (tỷ lệ 1:1), n-Butanol:Chloroform (tỷ lệ 1:1), Chloroform tinh khiết, và Chloroform:Ethyl acetate (tỷ lệ 9:1) trên bản nhôm tráng sẵn Silica gel 60 F254.

Số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân nào được sử dụng làm chuẩn đối chiếu để định danh BITC?
Nghiên cứu sử dụng số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân $^{13}\text{C-NMR}$ và $^{1}\text{H-NMR}$ của BITC đo trong dung môi DMSO (tần số 75,5 MHz cho Carbon và 300 MHz cho Proton theo tài liệu của Talab và cộng sự, 2014) cùng dữ liệu chuẩn trong dung môi $\text{CHCl}_3$ và $\text{CDCl}_3$ từ cơ sở dữ liệu SpectraBase.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Võ Hữu Minh Đức đã khảo sát và xây dựng thành công quy trình trích ly, thu hồi cao thô và phân lập hợp chất Benzyl isothiocyanate (BITC) từ hạt đu đủ (Carica papaya L.) thu nhận tại Đồng Tháp. Nghiên cứu đã xác định phương pháp chiết ngâm khuấy từ với ethanol ở tỷ lệ 10:100 (g/mL) trong 6 giờ là điều kiện tối ưu, đạt hiệu suất trích ly 4,01%, đồng thời thiết lập được hệ thống phân tách sắc ký cột hở hiệu quả. Kết quả này cung cấp cơ sở dữ liệu thực nghiệm quan trọng cho việc nghiên cứu khai thác các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học từ phụ phẩm nông nghiệp tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Cho đến nay, y học cổ truyền và y học hiện đại đã có sự kết hợp rất tốt trong điều trị một số loại bệnh. Trong thế giới tự nhiên tiềm ẩn rất nhiều loại thảo dược tưởng chừng vô năng nhưng lại có công dụng chữa bệnh rất hữu hiệu. Hơn nữa điều trị bằng dược liệu chứa các hoạt chất tự nhiên hiện nay đang là một hướng đi tích cực được khuyến khích nghiên cứu và phát triển trong cộng đồng y học Việt Nam hiện nay cũng như trên thế giới vì khả năng chữa và điều trị bệnh ít gây tác dụng phụ cho cơ thể con người và chi phí nghiên cứu không quá lớn. Mặt khác, theo các tài liệu công bố hiện nay khoảng từ 70-80% các loại thuốc chữa bệnh đang được lưu hành trên thị trường hoặc đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng có nguồn gốc từ các hợp chất thiên nhiên.

Tuy nhiên, phần lớn các dược phẩm hiện đang được lưu hành trong nước ta đều phải nhập khẩu do khả năng nghiên cứu cũng như cung cấp dược liệu cho ngành công nghiệp hoá dược nước ta còn rất hạn chế. Trong khi đó tiềm năng về tài nguyên thiên nhiên của nước ta được đánh giá là phong phú vào loại bậc nhất thế giới. Mặc dù, chúng ta đã có những thành công nhất định trong việc nghiên cứu tạo ra các sản phẩm thuốc chữa bệnh, nhưng mới chỉ đáp ứng được chừng vài phần trăm nhu cầu. Rõ ràng những kết quả đó chưa tương xứng với tiềm năng to lớn về tài nguyên thiên nhiên của nước ta.

Điển hình trong số đó có cây đu đủ là đại diện điển hình nhất. Đu đủ được xem là một cây đa dụng, rất hữu ích tại những quốc gia nghèo nên đã được nghiên cứu khá nhiều về các hoạt tính dược tính, giá trị dinh dưỡng và khả năng công nghiệp hóa tiềm năng sử dụng. Cây rất dễ trồng vì có thể mọc từ hạt và thời gian cây cho hoa chỉ mất 4 đến 5 tháng (Đỗ Tất Lợi, 2004; Đỗ Huy Bích và cs, 2006). Dù đã được biết đến từ thời xa xưa nhưng đến nay, đu đủ chỉ đa phần được sử dụng trong điều trị dân gian Việt Nam chứ chưa có công trình nghiên cứu cụ thể trên SVTH: Võ Hữu Minh Đức GVHD: Trang 2 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVC.

Nguyễn Minh Hoàng các bộ phận khác của cây trừ lá của cây điều này khác biệt rất lớn so với các nước phát triển trên thế giới khác. Do đó, em tiến hành thực hiện đề tài “Khảo sát khả năng tách chiết hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học benzyl isothiocyanate (BITC) từ hạt của cây đu đủ Carica papaya L.” với mong muốn đóng góp một phần hiểu biết về thành phần hóa học có trong hạt của cây đu đủ cũng như có thể tìm ra phương pháp tách chiết và phân lập phù hợp để có thể thu nhận hợp chất BITC với điều kiện hạn chế về mặt khoa học kỹ thuật như các nước phát triển trên thế giới. Vì hiện nay nước ta chỉ mới có thể chiết thành công hợp chất này thông qua cây Chùm ngây cũng như chưa có nghiên cứu khoa học nào trên đối tượng là hạt đu đủ. Trong khi nó được xem là một phế phẩm bị loại bỏ trong đời sống của người dân thì theo nhiều nghiên cứu trên thế giới cho thấy tiềm năng rất lớn trong điều trị bệnh ở người (Srivastava và cs 2004; Lui, và cs, 2003; Kuroiwa và cs, 2006; Zhu và cs (2015); Rao, 2013;…) SVTH: Võ Hữu Minh Đức GVHD: Trang 3 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVC.

Nguyễn Minh Hoàng PHẦN 1 TỔNG QUAN SVTH: Võ Hữu Minh Đức GVHD: Trang 4 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVC. Nguyễn Minh Hoàng 1. Tổng quan về đề tài 1. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài Đề tài có các mục tiêu đề ra như sau: Tìm được các phương pháp và điều kiện trích ly tối ưu trong các phương pháp trích ly cổ điển sử dụng.

Phân lập và định danh chính xác được hợp chất BITC qua sắc ký cột. Khảo sát hoạt tính sinh học của hợp chất sau phân lập để khẳng định kết quả. Cách tiếp cận, phương pháp và phạm vi nghiên cứu 1. Cách tiếp cận Đề tài tiếp cận các vấn đề nghiên cứu từ các góc độ sau: Tiếp cận từ cơ sở kiến thức chuyên môn cũng như tổng quan về khả năng tách chiết hợp chất BITC từ các nghiên cứu trên thế giới.

Tiếp cận từ thực tiễn, khảo sát đánh giá khả năng thu nhận được hợp chất BITC qua các thí nhiệm được tiến hành trong quá trình thực hiện đề tài. Phương pháp nghiên cứu Đề tài được thực hiện bằng một số phương pháp nghiên cứu truyền thống như: Phương pháp chiết và thu nhận các thành phần trích ly từ mẫu vật ban đầu (Phương pháp ngâm chiết cơ bản và phương pháp ngâm chiết có khuấy trộn). Phương pháp phân lập các thành phần trong cao chiết (Phương pháp sắc ký bản mỏng, phương pháp sắc ký cột). Phương pháp định danh sản phẩm (Phương pháp phổ cộng từ hạt nhân).

Ngoài các phương pháp kể trên, đề tài có thể sử dụng thêm một số phương pháp khác nhằm phục vụ cho quá trình thực hiện đề tài. Phạm vi nghiên cứu SVTH: Võ Hữu Minh Đức GVHD: Trang 5 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVC. Nguyễn Minh Hoàng Do hạn chế về thời gian và nguồn lực tài chính, đề tài xác định được các phạm vi như sau: Phạm vi không gian: đề tài chỉ tập trung điều tra, đánh giá chất lượng mẫu chiết của đối tượng được thu nhận trên một khu vực nhất định ở đây là Cao Lãnh, Đồng Tháp. Nghiên cứu được thực hiện ở phòng thí nghiệm Hóa – Môi trường, Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh.

Phạm vi thời gian: Đề tài chỉ cho phép thực hiện theo khuôn khổ thời gian được cho phép từ phía nhà trường. Phạm vi tài chính: Đề tài chỉ thực hiện trên điều kiện được hỗ trợ tài chính từ phía nhà trường. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu Dựa theo những dữ liệu được tổng hợp từ các nguồn sách như “Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Tập 1, 2006” và “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, 2007”, tổng hợp thành các thông tin chính như sau: 1. Đặc điểm hình thái thực vật Carica papaya L.

có chiều cao vào khoảng 2-4 m và có khi cao đến gần 7m. Cây thân thẳng và hiếm khi phân nhánh, trên thân cây có nhiều vết sẹo của cuống lá rụng để lại. Lá to, mọc so le ở ngọn cây, có cuống lá rất dài, lá xẻ 5-7 thùy sâu, gốc hình tim đầu nhọn, mỗi thùy lá lại chia tiếp thành các thùy nhỏ hơn không đều, gân lá hình chân vịt, hai mặt nhẵn. Hoa có màu vàng lục nhạt, mọc ở kẻ lá; Hoa đực và cái có thể cùng gốc hoặc khác gốc, cụm hoa đực phân nhánh thành chùy xim, dài hợp có 5 răng ngắn, tràng 5 cánh hàn liền hình phễu, nhị xếp thành 2 vòng trên ống tràng, nhụy tiêu giảm, cụm hoa cái có 2 đến 3 hoa, đài và tràng gồm những bộ phận hoi dính nhau ở gốc, không có nhị lép, bầu một ô, nhiều lá noãn.

SVTH: Võ Hữu Minh Đức GVHD: Trang 6 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVC. Nguyễn Minh Hoàng Quả mọng to hình trứng ngược hoặc thuôn dài khoảng 20-30 cm, đường kính vào khoảng 15-20 cm. Thịt quả dày có màu giống vỏ khi chín thường là vàng đến cam có khi cam đến đỏ, ruột trái chứa nhiều hạt có giống không hạt (giống lai mới ngày nay) có màu đen và bọc bên ngoài là màng bọc giúp chứa sinh chất bên trong, hình thái hạt gần giống với thông trần có lớp vảy sần đen bọc bên ngoài và phần noãn có màu ngà nằm bên trong.) Hình bên trái là hình cây chụp ngoài thực tế còn bên phải là hình phác họa chi tiết SVTH: Võ Hữu Minh Đức GVHD: Trang 7 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVC. Nguyễn Minh Hoàng Hình 1.2 Cấu trúc của hoa đực (A), hoa cái (B) và hạt của đu đủ (C) 1.

Phân loại khoa học Giới (Kingdom): Thực vật – Plantae Ngành chính (Superdivision): Thực vật có hạt – Spermatophyta Ngành (Division): Thực vật có hoa – Magnoliophyta Lớp (Class): Thực vật song tử diệp – Magnoliopsida Họ (Family): Họ đu dủ - Caricaceae Chi (Genus): Đu đủ - Carica L. Loài (Species): Đu đủ - Carica papaya L. Vị trí phân bố: Loài Carica papaya L. có nguồn gốc xuất phát từ vùng nhiệt đới châu Mĩ, được tìm thấy ở độ cao từ 1500-3000 m từ Panama đến Bolivia, có giống cây đu đủ mọc tự nhiên cho quả ăn được C.

pubescens Linné & Koch. Giống cây đu đủ trồng hiện nay có thể là giống lai tự nhiên của loài C. peltata Hock & Ann. Cây được người Tây Ban Nha du nhập giống vào Đông Nam Á vào khoảng thế kỉ XVI, từ đây giống cây được du nhập tiếp và trồng ở nhiều nơi khác trên thế giới.

SVTH: Võ Hữu Minh Đức GVHD: Trang 8 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVC. Nguyễn Minh Hoàng Ở Việt Nam, giống đu đủ đã được người dân trồng từ rất lâu và vẫn chưa thể xác định được thời gian mà giống cây du nhập là khi nào. Đu đủ có rất nhiều giống, gần như việc trồng ở các vùng sinh thái khác nhau cho ra một giống loài mới. Đu đủ là loài cây trồng nhiệt đới, ưa khí hậu nóng ẩm.

Nhiệt độ thích hợp cho cây sinh trưởng và phát triển là từ 21-33oC, lượng mưa hằng năm trên 1200 mm, cây sống thích hợp trên nhiều loại đất song không thể chịu ngập úng quá 20 giờ nên cần có biện pháp thoát nước nhanh. Cây không thể trồng ở độ cao trên 1500 m tại Việt Nam. Đu đủ là loài cây sinh trưởng nhanh, cây trồng từ hạt sau 4-5 tháng là có thể ra hoa, hoa được côn trùng và gió thụ phấn nên sẽ dễ xuất hiện sự lai tạp càng về các thế hệ sau. Đu đủ không chỉ được xem là giống cây ăn quả quan trọng ở Việt Nam mà còn ở nhiều nước trên thế giới.

Ngoài ra cây đu đủ còn được trồng để lấy nhựa (mủ) cây ở một số quốc gia. Bộ phận sử dụng: Hầu hết các bộ phận trên cây đều có thể sử dụng kể đến như: quả, nhựa từ quả, lá, hoa, rễ và hạt. Công dụng Quả đu đủ thường được sử dụng làm thực phẩm bổ sung dưỡng chất cần thiết cho cơ thể con người như các dưỡng chất, các vitamin và các thành phần khhoa1ng chất. Nhưng hiện nay, cũng có nghiên cứu tìm thấy ở hạt và lá của cây cũng cho giá trị tương tự.

Kết quả được tổng hợp lại trong Bảng 1.