Luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học khảo sát mức độ mang một số gen mã hóa carbapenemase trên acinetobacter baumannii tại bệnh viện đa khoa thống nhất đồng nai

Luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học khảo sát mức độ mang gen mã hóa carbapenemase trên Acinetobacter baumannii tại Bệnh viện Đa khoa Thống Nhất Đồng Nai.

• Tác giả: Trần Viết Lãm
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Thúy Hương
• Trường học: Đại học Bách Khoa - Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Khảo sát mức độ mang một số gen mã hóa carbapenemase trên Acinetobacter baumannii tại Bệnh viện Đa khoa Thống Nhất Đồng Nai
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: TP. Hồ Chí Minh

Tóm tắt

I. Giới thiệu và bối cảnh nghiên cứu

Nghiên cứu Khảo sát gen mã hóa carbapenemase trên Acinetobacter baumannii tại Bệnh viện Đa khoa Thống Nhất Đồng Nai tập trung vào việc xác định tỷ lệ mang các gen mã hóa enzyme carbapenemase trên vi khuẩn Acinetobacter baumannii. Đây là một vấn đề nghiêm trọng trong bối cảnh nhiễm trùng bệnh viện và kháng kháng sinh đang gia tăng trên toàn cầu. Acinetobacter baumannii là một trong những tác nhân chính gây nhiễm trùng bệnh viện, đặc biệt là ở các bệnh nhân nặng. Vi khuẩn này có khả năng kháng lại nhiều loại kháng sinh, bao gồm cả carbapenem, nhóm kháng sinh mạnh thường được sử dụng cuối cùng trong điều trị. Nghiên cứu này nhằm mục đích xây dựng quy trình PCR để phát hiện các gen NDM-1 và BlaOXA, từ đó đánh giá tỷ lệ mang các gen này trong các chủng Acinetobacter baumannii tại bệnh viện.

1.1. Vấn đề nhiễm trùng bệnh viện

Nhiễm trùng bệnh viện là một thách thức lớn đối với hệ thống y tế toàn cầu. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tỷ lệ nhiễm trùng bệnh viện dao động từ 5% đến 12% ở các quốc gia có thu nhập cao. Tại Việt Nam, các nghiên cứu cho thấy tỷ lệ này khoảng 5,7% đến 11,5%. Acinetobacter baumannii là một trong những tác nhân chính gây nhiễm trùng bệnh viện, đặc biệt là ở các khoa hồi sức tích cực. Vi khuẩn này có khả năng kháng lại nhiều loại kháng sinh, làm tăng nguy cơ tử vong và kéo dài thời gian điều trị.

1.2. Kháng kháng sinh và carbapenemase

Kháng kháng sinh là một vấn đề nghiêm trọng trong điều trị nhiễm trùng bệnh viện. Carbapenem là nhóm kháng sinh mạnh thường được sử dụng cuối cùng trong điều trị các nhiễm trùng nặng. Tuy nhiên, vi khuẩn Acinetobacter baumannii có khả năng sản xuất enzyme carbapenemase, làm vô hiệu hóa tác dụng của carbapenem. Các gen mã hóa carbapenemase như NDM-1, OXA-23, OXA-51, và OXA-58 đã được phát hiện ở nhiều quốc gia, bao gồm cả Việt Nam.

II. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng phương pháp PCR và multiplex PCR để phát hiện các gen mã hóa carbapenemase trên Acinetobacter baumannii. Quy trình PCR được xây dựng để phát hiện gen NDM-1, trong khi multiplex PCR được sử dụng để phát hiện đồng thời các gen OXA-23, OXA-51, và OXA-58. Các mẫu vi khuẩn được thu thập từ Bệnh viện Đa khoa Thống Nhất Đồng Nai và được phân tích để xác định tỷ lệ mang các gen này.

2.1. Quy trình PCR phát hiện gen NDM 1

Quy trình PCR được tối ưu hóa để phát hiện gen NDM-1. Các bước bao gồm thiết kế mồi, tối ưu hóa nhiệt độ lai, và xác định giới hạn phát hiện gen. Kết quả PCR được kiểm chứng bằng giải trình tự gen để đảm bảo độ chính xác. Quy trình này cho phép phát hiện gen NDM-1 với độ nhạy cao và độ đặc hiệu tốt.

2.2. Quy trình multiplex PCR phát hiện gen BlaOXA

Quy trình multiplex PCR được phát triển để phát hiện đồng thời các gen OXA-23, OXA-51, và OXA-58. Các thông số như nồng độ mồi, nhiệt độ lai, và nồng độ enzyme Taq DNA polymerase được tối ưu hóa để đảm bảo hiệu quả của phản ứng. Kết quả multiplex PCR được kiểm chứng bằng phương pháp điện di trên gel agarose và giải trình tự gen.

III. Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ mang các gen mã hóa carbapenemase trên Acinetobacter baumannii tại Bệnh viện Đa khoa Thống Nhất Đồng Nai là đáng kể. Cụ thể, 74,19% chủng mang gen OXA-23, 95,57% mang gen OXA-51, 8,87% mang gen OXA-58, và 5,64% mang gen NDM-1. Đặc biệt, hai chủng A205 và A207 mang đồng thời cả ba gen OXA, trong khi chủng A002 mang cả gen NDM-1 và OXA-58. Đây là những phát hiện mới chưa từng được báo cáo trước đây tại Việt Nam.

3.1. Tỷ lệ mang gen BlaOXA

Kết quả cho thấy tỷ lệ mang gen OXA-51 là cao nhất (95,57%), tiếp theo là OXA-23 (74,19%) và OXA-58 (8,87%). Điều này phản ánh sự phổ biến của các gen này trong quần thể Acinetobacter baumannii tại bệnh viện. Việc phát hiện các chủng mang đồng thời nhiều gen OXA cho thấy sự đa dạng trong cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn.

3.2. Tỷ lệ mang gen NDM 1

Tỷ lệ mang gen NDM-1 là 5,64%, thấp hơn so với các gen OXA. Tuy nhiên, việc phát hiện chủng A002 mang cả gen NDM-1 và OXA-58 là một phát hiện quan trọng, cho thấy sự phức tạp trong cơ chế kháng kháng sinh của Acinetobacter baumannii. Điều này đặt ra thách thức lớn trong việc điều trị các nhiễm trùng do vi khuẩn này gây ra.

IV. Kết luận và kiến nghị

Nghiên cứu đã thành công trong việc xây dựng quy trình PCR và multiplex PCR để phát hiện các gen mã hóa carbapenemase trên Acinetobacter baumannii. Kết quả cho thấy tỷ lệ mang các gen này là đáng kể, đặc biệt là các gen OXA-23, OXA-51, và OXA-58. Việc phát hiện các chủng mang đồng thời nhiều gen kháng kháng sinh cho thấy sự phức tạp trong cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn. Nghiên cứu này cung cấp dữ liệu quan trọng để hỗ trợ việc điều trị và kiểm soát nhiễm trùng bệnh viện tại Bệnh viện Đa khoa Thống Nhất Đồng Nai.

4.1. Ý nghĩa thực tiễn

Nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc cung cấp thông tin về tỷ lệ mang các gen kháng kháng sinh trên Acinetobacter baumannii. Điều này giúp các bác sĩ lâm sàng có cơ sở để lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp, giảm thiểu nguy cơ thất bại trong điều trị. Ngoài ra, nghiên cứu cũng góp phần nâng cao nhận thức về vấn đề kháng kháng sinh trong bệnh viện.

4.2. Hướng nghiên cứu tương lai

Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về cơ chế kháng kháng sinh của Acinetobacter baumannii, đặc biệt là các gen mới như NDM-1. Ngoài ra, việc phát triển các phương pháp điều trị mới, bao gồm cả liệu pháp kháng sinh kết hợp và liệu pháp sinh học, là cần thiết để đối phó với tình trạng kháng kháng sinh ngày càng gia tăng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Nhiễm khuẩn bệnh viện là những nhiễm khuẩn mắc phải trong thời gian bệnh nhân điều trị trong bệnh viện, đây là một trong những nguyên nhân gây kéo dài thời gian điều trị, tăng tỷ lệ tử vong cho bệnh nhân tại các bệnh viện trên thế giới. Tác nhân chính gây nhiễm khuẩn bệnh viện là các vi khuẩn có khả năng kháng thuôc kháng sinh cao do đó gây khá nhiều trở ngại cho công tác điều trị của bác sĩ [1]. Vi khuẩn Gram âm Acinetobacter baumannii là một trong những tác nhân hàng đầu gây nhiễm khuẩn bệnh viện trên toàn thế giới, thời gian gần đây bên cạnh sự gia tăng tỷ lệ nhiễm khuẩn thì khả năng kháng lại các loại kháng sinh bởi Acinetobacter baumannii cũng được phát hiện có sự gia tăng rất lớn. Theo công bố của tổ chức y tế thế giới năm 2011, ở Mỹ tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện xác định bởi Acinetobacter baumannii chiếm 65-75%, tình hình đa kháng thuốc và không nhạy cảm với carbapenem tăng từ 9% ( 1995) lên 57% ( 2011).

Ở Anh từ năm 2000 đã xuất hiện sự nhiễm khuẩn bệnh viện do Acinetobacter baumannii, đến năm 2011 thì tỉ lệ không nhạy cảm của Acinetobacter baumannii với các lớp kháng sinh khác được bao cáo sau: aminoglysides khoảng 20%, ciprofloxacin 30%; ceftazidine 70%; cefotaxime 89%; piperacillin/tazobactam 50% [2]. Ở khu vực châu Á, tình hình nhiễm khuẩn bệnh viện do tác nhân Acinetobacter baumannii được báo cáo ở một số nước như Ấn Độ, Thái Lan, Trung Quốc, Hàn Quốc, Singapore chiếm tỷ lệ trên 30%, trong đó tỷ lệ kháng kháng sinh nằm ở mức khoảng 70% [3]. Carbapenem là nhóm kháng sinh mạnh thường được lựa chọn cuối cùng để điều trị cho các trường hợp nhiễm khuẩn bệnh viện nặng gây bởi các vi khuẩn Gram âm có khả năng sản sinh enzyme phân phủy kháng sinh phổ rộng. Tuy nhiên với việc sử dụng rộng rãi nhóm kháng sinh này đã tạo điều kiện cho các vi khuẩn kháng lại carbapenem [4].

Nghiên cứu của Wisplinghoff và Seifert năm 2008, cho thấy Acinetobacter baumannii mang các gen mã hóa enzyme kháng kháng sinh nhóm carbapenem như OXA51, OXA23 và OXA58 được phát hiện ở nhiều quốc gia trên thế giới, trong đó 2 gen OXA51 là gen kháng thuốc nội tại nằm trong nhiễm sắc thể của Acinetobacter baumannii. Gen OXA23 và gen OXA58 là các gen kháng kháng sinh mạnh được mã hóa cả trên nhiễm sắc thể và trên plasmid do đó khiến khả năng lây truyền và phát tán gen kháng kháng sinh của Acinetobacter baumannii trở nên nguy hiểm hơn [5, 6]. Cũng trong năm 2008, các nhà khoa học trên thế giới đã công bố phát hiện một gen mới có khả năng kháng carbapenem rất mạnh chính là gen New Delhi metallo-beta- lactamase-1(NDM-1). Vi khuẩn mang gen NDM-1 có khả năng kháng lại rất nhiều loại kháng sinh và có khả năng lây lan cao dẫn đến việc điều trị trở nên rất khó khăn, hiện nay tình hình Acinetobacter baumannii mang gen NDM-1 đã được công bố và phát hiện ở nhiều nơi trên thế giới [7].

Điều này cho thấy sự biến đổi không ngừng để kháng lại kháng sinh của vi khuẩn, đặt ra vấn đề lớn cho các nhà khoa học trên toàn thế giới nhằm tìm ra cách thức để điều trị các vi khuẩn có khả năng kháng kháng sinh. Ở Việt Nam, đã có nhiều báo cáo được công bố cho thấy mức độ nhiễm khuẩn bệnh viện bởi tác nhân Acinetobacter baumannii có tỷ lệ kháng kháng sinh đang ở mức cao và đáng báo động, nghiên cứu của Nguyễn Thị Nam Liên và cộng sự năm 2010 phát hiện tỷ lệ Acinetobacter baumannii kháng impenem là 48,4% [8]. Một nghiên cứu khác tại bệnh viện Nhiệt Đới Trung Ương năm 2009 cho thấy tỷ lệ kháng kháng sinh của Acinetobacter baumannii rất cao, khoảng 90% kháng với cephalosporin và carbapenem [9]. Tại bệnh viện Đa Khoa Thống Nhất Đồng Nai, nơi nhóm đang tiến hành nghiên cứu, cũng đã có một số nghiên cứu về tình trạng nhiễm khuẩn bệnh viện do tác nhân Acinetobacter bamannii và sự đề kháng kháng sinh của chúng đã chỉ ra các kết quả như sau: đối với nhiễm khuẩn bệnh viện do tác nhân Acinetobacter baumannii chiếm tỷ lệ cao nhất với 36,2% và tỷ lệ đề kháng với kháng sinh nhóm carbapenem lần lượt là kháng imipenem là 90,2% và meropenem là 92,7% [10, 11].

Tuy nhiên các nghiên cứu hầu hết chỉ dừng lại ở mức độ khảo sát tình hình nhiễm khuẩn bệnh viện và mức độ kháng kháng sinh của bởi tác nhân Acinetobacter baumannii. Có khá ít các nghiên cứu đi sâu vào các cơ chế đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Acinetobacter baumannii, vấn 3 đề vi khuẩn mang gen mã hóa enzyme kháng kháng sinh còn khá mới ở Việt Nam. Việc nắm rõ tỷ lệ mang các gen mã hóa enzyme kháng carbapenem trên Acinetobacter baumannii kết hợp với các kiến thức lâm sàng và sự phối hợp kháng sinh sẽ giúp cho tỷ lệ điều trị thành công các ca nhiễm khuẩn bệnh viện trở nên cao hơn. Trước sự cấp thiết và ý nghĩa thực tiễn đã nêu nhóm chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Khảo sát mức độ mang một số gen mã hóa carbapenemase trên Acinetobacter baumannii tại bệnh viện Đa Khoa Thống Nhất Đồng Nai” Với mục tiêu của đề tài là xác định tỷ lệ mang một số gen mã hóa carbapenemase trên Acinetobacter baumannii tại bệnh viện Đa Khoa Thống Nhất Đồng Nai.

Để thực hiện được mục tiêu nêu trên của đề tài nhóm chúng tôi thức hiện các nội dung chính như sau: - Xây dựng quy trình PCR phát hiện gen NDM-1. - Xây dựng quy trình multiplex PCR phát hiện gen BlaOXA. - Sử dụng hai quy trình PCR phát hiện gen NDM-1 và multiplex PCR phát hiện gen BlaOXA nhằm xác định tỷ lệ mang một số gen mã hóa carbapenem trên mẫu Acinetobacter baumannii lưu tại bệnh viện Đa Khoa Thống Nhất Đồng Nai. 4 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm dịch tễ học nhiễm khuẩn bệnh viện 1.1 Dịch tễ học Nhiễm Khuẩn Bệnh Viện (Hospital Acquired Infections – HAI) (NKBV) là những nhiễm khuẩn mắc phải trong thời gian bệnh nhân điều trị tại bệnh viện, các tác nhân nhiễm khuẩn không hiện diện cũng như không nằm trong giai đoạn ủ bệnh tại thời điểm nhập viện.

NKBV thường xuất hiện sau 48 giờ kể từ khi người bệnh nhập viện, là một trong những nguyên nhân gây kéo dài thời gian điều trị của bệnh nhân và tăng tỷ lệ tử vong cho các bệnh nhân trong bệnh viện ở khắp thế giới [1]. Hiện nay nhiễm khuẩn bệnh viện là một vấn đề nghiêm trọng tác động đến sức khoẻ toàn cầu, theo báo cáo của tổ chức Y tế thế giới về nhiễm khuẩn bệnh viện từ năm 1995 đến 2010 cho thấy: Tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện tính chung cho các quốc gia có thu nhập cao nằm trong khoảng từ 5% đến 12% và tỷ lệ chung cho tất cả các quốc gia này vào khoảng 7,6% [2]. Theo ước tính của trung tâm phòng chống và kiểm soát bệnh châu Âu, hàng năm có khoảng 4100000 bệnh nhân bị nhiễm khuẩn bệnh viện và khoảng 37000 trường hợp tử vong [12]. Tại Việt Nam hiện nay tình hình NKBV chưa được xác định một cách đầy đủ, có khá ít tài liệu và giám sát về NKBV được công bố, đến nay đã có ba cuộc điều tra cắt ngang (point prevalence) mang tính khu vực do Vụ Điều Trị Bộ Y tế (nay là Cục Quản lý khám, chữa bệnh) đã được thực hiện.

Điều tra năm 1998 trên 901 bệnh nhân trong 12 bệnh viện toàn quốc cho thấy tỉ lệ NKBV là 11,5%; trong đó nhiễm khuẩn vết mổ chiếm 51% trong tổng số các NKBV. Điều tra năm 2001 xác định tỉ lệ NKBV là 6,8% trong 11 bệnh viện và viêm phổi bệnh viện là nguyên nhân thường gặp nhất (41,8%). Điều tra năm 2005 tỉ lệ NKBV trong 19 bệnh viện toàn quốc cho thấy là 5,7% và viêm phổi bệnh viện cũng là nguyên nhân thường gặp nhất (55,4%) [13].2 Các tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện Có rất nhiều tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện và sự tác động của các tác nhân này cũng rất khác nhau giữa các nhóm bệnh nhân, các bệnh viện, khoa điều trị và giữa các quốc gia [1].1 Tác nhân vi khuẩn Vi khuẩn gây NKBV có thể từ hai nguồn gốc khác nhau: Vi khuẩn nội sinh, thường cư trú ở lông, tuyến mồ hôi, tuyến chất nhờn. Bình thường trên da có khoảng 13 loài vi khuẩn ái khí được phân bố khắp cơ thể và có vai trò ngăn cản sự xâm nhập của vi sinh vật (VSV) gây bệnh.

Một số vi khuẩn nội sinh có thể trở thành căn nguyên nhiễm trùng khi khả năng bảo vệ tự nhiên của vật chủ bị tổn thưởng. Vi khuẩn ngoại sinh, là vi khuẩn có nguồn gốc ngoại lai, có thể từ dụng cụ y tế, nhân viên y tế, không khí, nước hoặc lây nhiễm chéo giữa các bệnh nhân [1, 13]. Vi khuẩn Gram dương, cầu khuẩn, tụ cầu vàng (Staphylococcuc aureus) đóng vai trò quan trọng đối với NKBV từ cả hai nguồn nội sinh và ngoại sinh. Tụ cầu vàng có thể gây nên nhiễm trùng đa dạng ở phổi, xương, tim, nhiễm khuẩn huyết và đóng vai trò quan trọng trong NKBV có liên quan đến truyền dịch, ống thở, nhiễm khuẩn vết bỏng và nhiễm khuẩn vết mổ [13].

Các nghiên cứu trong nước cho thấy, nhiễm khuẩn do chấn thương, nhiễm khuẩn ngoại khoa hay nhiễm khuẩn vết bỏng tỷ lệ vi khuẩn Gram (+), đặc biệt là S.aureus thường gặp nhiều hơn các nhiễm khuẩn phổi và nhiễm khuẩn đường tiết niệu. Nhiễm khuẩn vết bỏng có tỷ lệ vi khuẩn Gram (+) là 31,3%, cao hơn nhiều so với nhiễm khuẩn phổi (6,2%), nhiễm khuẩn vết mổ (12,1%) và tỷ lệ phối hợp cao nhất là P. Vi khuẩn Gram âm, trong đó các trực khuẩn Gram (-) thường có liên quan nhiều đến NKBV và phổ biến trên bệnh nhân nhiễm trùng phổi tại khoa điều trị tích 6 cực. Họ vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae) thường cư trú trên đường tiêu hoá của người và động vật, đang là mối quan tâm lớn trong NKBV do có khả năng kháng cao với các nhóm kháng sinh amiglycoside, β-lactam và có khả năng truyền tính kháng qua plasmid.

Chủng Acinetobacter spp, trong đó đáng quan tâm nhất là chủng Acinetobacter baumannii thường gặp trong không khí bệnh viện, nước máy, ống thông niệu đạo, máy trợ hô hấp, ngoài ra còn thấy trong đờm, nước tiểu, phân, dịch nhầy âm đạo. Ngày nay NKBV do Acinetobacter spp đang có chiều hướng gia tăng rõ rệt. Vi khuẩn thuộc giống Klebsiella spp cũng thường xuyên là nguyên nhân NKBV và vi khuẩn này có khả năng lan nhanh tạo thành các vụ dịch tại bệnh viện. Nhiều nghiên cứu trong nước và quốc tế về tác nhân gây NKBV đã khẳng định loài Klebsiella pneumoniae thường có vai trò quan trọng trong nhiễm trùng tiết niệu, phổi, nhiễm trùng huyết và mô mềm.