Tổng quan luận án

Theo số liệu từ Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), gánh nặng bệnh tật do thực phẩm không an toàn gây ra ở mức đáng kể trên quy mô toàn cầu. Bình quân mỗi năm ghi nhận khoảng 1 trong 10 người mắc các bệnh truyền qua thực phẩm. Trong số các hội chứng liên quan, bệnh tiêu chảy là dạng phổ biến nhất với khoảng 550 triệu người mắc mỗi năm, bao gồm 220 triệu trẻ em dưới 5 tuổi. Vi khuẩn Salmonella là một trong bốn tác nhân chính gây tiêu chảy trên toàn thế giới, sở hữu hơn 2.500 serovar khác nhau có khả năng gây bệnh ở người. Sự gia tăng nhanh chóng của các chủng Salmonella kháng kháng sinh gây cản trở lớn đối với công tác kiểm soát nhiễm khuẩn, dự phòng và điều trị lâm sàng.

Tại Việt Nam, số liệu của Tổ chức Nông lương Liên Hiệp Quốc (FAO) cho thấy lượng tiêu thụ thịt gia tăng nhanh chóng: giai đoạn từ năm 1993 đến năm 2015, lượng tiêu thụ thịt lợn trên đầu người tăng 3 lần, thịt bò tăng 6 lần và thịt gia cầm tăng 7 lần. Dù các nghiên cứu dịch tễ học kháng kháng sinh của Salmonella đã được triển khai, các công trình phân tích chuyên sâu ở mức độ phân tử, đặc biệt là việc giải trình tự thế hệ mới (Next Generation Sequencing - NGS) để khảo sát các nhóm gen kháng thuốc và phát hiện đột biến mới từ nguồn thực phẩm bán lẻ tại Việt Nam, vẫn chưa được thực hiện trước thời điểm luận án triển khai.

Nhằm giải quyết khoảng trống nghiên cứu này, luận án "Nghiên cứu đặc điểm kháng kháng sinh và gen liên quan ở các chủng Salmonella đa kháng" xác định các mục tiêu và nội dung nghiên cứu cụ thể:

Mục tiêu nghiên cứu:

  1. Phân lập và định danh các chủng Salmonella từ thịt lợn, thịt bò và thịt gà tại các chợ bán lẻ ở khu vực Hà Nội.
  2. Xác định đặc điểm kháng kháng sinh của các chủng Salmonella phân lập được.
  3. Phân tích các nhóm gen ở các chủng Salmonella đa kháng kháng sinh.

Nội dung nghiên cứu:

  1. Nuôi cấy phân lập, định danh vi khuẩn từ các mẫu thịt thu thập được ở các chợ trên địa bàn Hà Nội, lựa chọn các mẫu nhiễm vi khuẩn Salmonella.
  2. Tiến hành thử nghiệm kháng sinh đồ, từ đó lựa chọn ra các chủng Salmonella đa kháng kháng sinh.
  3. Giải trình tự gen thế hệ mới một số chủng Salmonella đa kháng kháng sinh để phân tích các nhóm gen liên quan.
  4. Xác nhận một số kết quả bằng phương pháp giải trình tự gen Sanger.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn Salmonella tạp nhiễm trong thịt tươi sống (thịt lợn, thịt bò, thịt gà).
  • Phạm vi không gian: 10 chợ bán lẻ trên địa bàn thành phố Hà Nội (Long Biên, Cầu Giấy, Đống Đa, Nguyễn Công Trứ, Mai Động, Tân Mai, Trương Định, Tứ Liên, Kim Giang, Hà Đông).
  • Phạm vi thời gian: Mẫu được thu thập vào khung giờ 7-8 giờ sáng trong các tháng mùa đông (tháng 10 đến tháng 12 năm 2016).

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Vi khuẩn Salmonella được Salmon phân lập lần đầu tiên vào năm 1884 từ ruột lợn rừng và đặt tên là Bacillus choleraesuis. Năm 1900, Lignières đổi tên thành Salmonella Choleraesuis. Năm 1918, Buchanan xác định các đặc tính sinh hóa cơ bản của chi này (lên men glucose sinh acid và hơi, không lên men lactose). Đến năm 1960, tên chi Salmonella thuộc họ Enterobacteriaceae mới được công nhận và thống nhất sử dụng rộng rãi. Hệ thống phân loại Kauffmann - White đã xác lập cấu trúc kháng nguyên dựa trên 46 yếu tố kháng nguyên O và 85 yếu tố kháng nguyên H, định danh 2.610 serovar (trong đó phân loài S. enterica subsp. enterica chiếm 1.547 serovar).

Về dịch tễ học ô nhiễm và kháng kháng sinh trên thế giới, luận án điểm lại các công bố thực nghiệm:

  • Niyomdecha và cộng sự (2016) khảo sát 120 mẫu thực phẩm tại chợ bán lẻ Bangkok (Thái Lan), ghi nhận tỷ lệ nhiễm Salmonella ở thịt lợn là 82%, thịt bò 62% và rau diếp 20%, trong đó serovar phổ biến nhất là S. Corvallis với tỷ lệ đề kháng cao đối với ampicillin, chloramphenicol, nalidixic acid, sulfamethoxazole/trimethoprim và tetracycline.
  • Cai và cộng sự (2016) tại Dương Châu (Giang Tô, Trung Quốc) ghi nhận tỷ lệ nhiễm 71,8% tại lò mổ lợn và 70,9% trên thịt bán lẻ, phát hiện 7 serovar (S. Derby, S. Rissen...), trong đó tetracycline bị kháng nhiều nhất.
  • Katoh và cộng sự (2015) phân tích thịt gà bán lẻ tại Tokyo (Nhật Bản) từ năm 1992 đến 2012, ghi nhận tỷ lệ nhiễm 29,8% với 22 serovar (S. Infantis chiếm ưu thế), tỷ lệ kháng kháng sinh đạt 89,9% và đa kháng đạt 90,2% (kháng streptomycin 81,8%, tetracycline 77,8%).
  • Tirziu và cộng sự (2015) tại Romania ghi nhận 13,2% mẫu thịt gà nhiễm Salmonella với 8 serovar, tỷ lệ kháng tetracycline cao nhất và không ghi nhận chủng nào kháng cefotaxime hoặc ceftazidime.
  • Dữ liệu từ Hệ thống giám sát kháng sinh quốc gia Hoa Kỳ (NARMS) giai đoạn 2005-2006 cho thấy 84% chủng Salmonella không thương hàn (NTS) phân lập trên lâm sàng biểu hiện đa kháng; đồng thời sự lan truyền của dòng S. Typhi H58 và S. Typhimurium DT104 đa kháng trên toàn cầu đặt ra nhiều thách thức điều trị.

Tại Việt Nam, các nghiên cứu dịch tễ ghi nhận tỷ lệ đề kháng kháng sinh có xu hướng gia tăng:

  • Nghiên cứu năm 1994 ở miền Nam cho thấy S. Typhi kháng nalidixic acid tăng từ 4% (năm 1993) lên 97% (năm 2005).
  • Báo cáo năm 2007 về ô nhiễm vi khuẩn thực phẩm ghi nhận 50,5% chủng Salmonella kháng ít nhất một loại kháng sinh.
  • Khảo sát thịt bò tại Hà Nội năm 2009 cho thấy tỷ lệ nhiễm Salmonella là 39,9% (9 serovar); 58,7% kháng ít nhất một kháng sinh và 46% đa kháng; mức độ kháng ghi nhận ở tetracycline (46,0%), sulphonamide (39,7%), ampicillin (31,7%), streptomycin (30,2%), trimethoprim (28,6%), kanamycin (28,6%) và chloramphenicol (22,2%).
  • Nghiên cứu năm 2012 trên thịt lợn và thịt gà ở miền Bắc chỉ ra tỷ lệ nhiễm lần lượt là 39,6% và 42,9% với 14 serovar; tỷ lệ kháng ít nhất một kháng sinh đạt 78,4%.
  • Năm 2014, khảo sát thịt gà sống ghi nhận tỷ lệ nhiễm 48,7%, 73,3% kháng ít nhất một loại kháng sinh, 17,7% đa kháng và có chủng kháng tới 9 loại kháng sinh.
  • Giai đoạn 2012-2015 tại Sài Gòn, khảo sát thịt và thủy sản ghi nhận tỷ lệ nhiễm đạt 69,7% ở thịt lợn, 65,3% ở thịt gà, 58,3% ở thịt bò, 49,1% ở tôm và 36,6% ở cá nước ngọt; tỷ lệ kháng kháng sinh là 62,2% và đa kháng là 41,1%.

Khoảng trống nghiên cứu được luận án giải quyết: Hầu hết các công trình trong nước chỉ dừng ở mức độ điều tra dịch tễ học và kiểu hình kháng sinh bằng kháng sinh đồ thông thường. Luận án đặt vị trí nghiên cứu vào việc kết hợp giám sát kiểu hình với ứng dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS) transcriptome để xác định toàn diện các nhóm gen kháng thuốc, gen mã hóa hệ thống bơm thải và phát hiện các đột biến điểm liên quan đến tính kháng kháng sinh ở Salmonella phân lập từ thực phẩm bán lẻ.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và các cơ chế kháng kháng sinh

Luận án dựa trên lý thuyết vi sinh vật học chuẩn về cấu trúc hệ gen và cơ chế kháng thuốc của Salmonella:

  • Đặc điểm hệ gen: Kích thước hệ gen của Salmonella dao động từ 3,39 Mb đến 5,59 Mb, chứa trung bình 4.742 gen (S. bongori cần khoảng 3.368 gen; S. enterica cần khoảng 3.800 gen bảo thủ). Bộ gen chứa các đảo gây bệnh (Salmonella Pathogenicity Islands - SPI, hiện xác định 23 SPI) và các đảo hệ gen (Genomic Islands - GI) thu nhận qua chuyển gen ngang, thường tích hợp cạnh các vị trí tRNA.
  • Cấu trúc kháng nguyên: Kháng nguyên thân O (bản chất lipopolysaccharide - LPS, chịu nhiệt, là nội độc tố gồm 46 nhóm cấu trúc đã biết); kháng nguyên lông H (protein flagellin, có tính đặc hiệu đơn hoặc kép phân bố theo 2 pha); và kháng nguyên bề mặt Vi (polysaccharide của N-acetylglucosamine uronic acid, chỉ có ở S. Typhi, S. Paratyphi C và S. Dublin).
  • Cơ chế kháng thuốc theo nhóm kháng sinh:
    • Aminoglycoside: Biến đổi thuốc thông qua các enzyme gắn trên plasmid gồm acetyltransferase (AAC), phosphotransferase (APH) và nucleotidyltransferase (ANT/AAD) như các gen aac, aph, aadA, aadB.
    • β-lactam: Tiết enzyme thủy phân vòng β-lactam (phân loại Ambler gồm lớp A, B, C, D). Phổ biến nhất ở Salmonella là lớp A (họ gen blaTEM, blaCTX-M, blaSHV...) và lớp C (blaCMY-2 nằm trên nhiễm sắc thể hoặc plasmid, quy định kháng cephalosporin thế hệ 3 như ceftiofur và ceftriaxone).
    • Phenicol: Sử dụng chloramphenicol acetyltransferase hoặc hệ thống bơm thải chuyên biệt mã hóa bởi gen floR (có tính di động cao trên plasmid và nhiễm sắc thể) và gen cmlA.
    • Quinolone: Xuất hiện đột biến tại các vùng xác định kháng quinolone (QRDR) trên gen con gyrA, gyrB (mã hóa DNA gyrase) và parC, parE (mã hóa topoisomerase IV); kết hợp với tăng biểu hiện của bơm thải AcrAB-TolC hoặc tiếp nhận gen qnr qua plasmid.
    • Tetracycline: Đề kháng thông qua 4 cơ chế chính với 46 gen đã được phân loại:
Cơ chế kháng tetracycline Danh mục các gen quy định
Kênh bơm thải thuốc (28 gen) tetA, tetB, tetC, tetD, tetE, tetG, tetH, tetJ, tetK, tetL, tetV, tetY, tetZ, tet30, tet31, tet33, tet35, tet38, tet39, tet40, tet41, tet42, tet45, tetAB(46), tcr3, tetA(P), tetB(P), otrB
Bảo vệ Ribosome (12 gen) tetM, tetO, tetQ, tetS, tetT, tetW, tet32, tet36, tet44, tet, otrA, otrC
Làm thoái biến kháng sinh (2 gen) tetX, tet37
Đột biến cấu trúc 16S rRNA Các đột biến điểm: G1058C, A926T, G927T, A928C, ΔG942
  • Sulfonamide và Trimethoprim: Do các gen sul1, sul2, sul3 (ức chế men dihydropteroate synthetase) và các biến thể gen dhfr, dfr (ức chế men dihydrofolate reductase) nằm trên integron nhóm 1 hoặc plasmid.
  • Hệ thống kênh bơm thải thuốc (Efflux pumps): Salmonella sở hữu 4 họ kênh bơm thải thuốc chính phối hợp cùng kênh vận chuyển màng ngoài TolC:
Họ kênh vận chuyển Hệ thống kênh Cơ chất đào thải ghi nhận
RND (Resistance-Nodulation-Division) AcrAB ACF, BAC, CAR, CEF, CHL, CHO, CLX, CTX, CV, DOC, DOR, EB, ERY, FOX, FUA, MB, NAF, NAL, NOR, NVB, PEN, R6G, RIF, SDS, SUL, TET, TPP, TRI, TRX, Quinolone
AcrD AZT, CAR, DOC, NAF, NVB, OXA, SDS, SUL, AMG, SDC
AcrEF ACF, CHL, CV, DOC, DOR, EB, ERY, NAL, NOR, MB, NVB, R6G, SDS, TET, TPP, TRI
MdtABC ACF, BAC, CHL, CLX, CV, EB, MB, NAF, NVB, THL, TPP, SDS, SDC
MdsAB NVB, ACF, CV, MB, R6G, BNKC, SDS
MFS (Major Facilitator Superfamily) EmrAB NAL, NVB, R6G, SDS, TRI, SDC
MdfA CHL, DOR, NOR, TET, DOX
MATE (Multidrug & Toxic Compound Extrusion) MdtK ACF, DOR, NOR, DOX, ACR
ABC (ATP-Binding Cassette) MacAB ERY, MAC

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

  1. Phương pháp lấy mẫu và bảo quản: Thực hiện theo TCVN 4833-2002. Thu thập 90 mẫu thịt tươi (30 mẫu thịt lợn: TL-1 đến TL-30; 30 mẫu thịt gà: TG-1 đến TG-30; 30 mẫu thịt bò: TB-1 đến TB-30) tại 10 chợ bán lẻ ở Hà Nội vào 7-8 giờ sáng. Mẫu được bảo quản trong túi vô trùng ở 4-10°C, vận chuyển về phòng xét nghiệm trong vòng 4 giờ và xử lý nuôi cấy trong vòng 24 giờ.
  2. Quy trình phân lập và định danh: Thực hiện theo tiêu chuẩn ISO 6579:2002:
    • Tăng sinh sơ bộ: Cân 25 g mẫu thịt bổ sung 225 ml nước pepton đệm (tỷ lệ 1:10), ủ ở 37°C trong 18 ± 2 giờ.
    • Tăng sinh chọn lọc: Cấy 0,1 ml dịch tăng sinh lên thạch MSRV (Modified Semi-solid Rappaport-Vassiliadis bổ sung novobiocin), ủ không lật úp ở 41,5°C trong 24-48 giờ; đồng thời cấy 1 ml dịch vào 10 ml canh thang MKTTn (Muller-Kauffmann Tetrathionate-Novobiocin), ủ ở 37°C trong 24 ± 3 giờ.
    • Phân lập trên môi trường thạch đĩa: Cấy dịch từ vùng lan xa nhất trên MSRV và dịch MKTTn lên thạch XLD (Xylose Lysine Deoxycholate) và thạch SS (Salmonella-Shigella), ủ ở 37°C trong 24 giờ.
    • Khẳng định sinh hóa: Kiểm tra phản ứng trên thạch Kligler/TSI (khảo sát glucose, lactose, sinh H2S và sinh hơi), thạch Ure, môi trường lỏng L-Lysine decarboxylase (LDC), thử nghiệm β-galactosidase (ONPG), phản ứng Voges-Proskauer (VP) và phản ứng Indol (thuốc thử Kovacs).
    • Khẳng định huyết thanh: Thử nghiệm ngưng kết trên phiến kính với kháng huyết thanh O đa giá, đơn giá và kháng huyết thanh H (pha 1 và pha 2 sử dụng thạch Sven Gard ức chế pha 1) của hãng Denka Seiken (Tokyo, Nhật Bản). Các chủng nghi ngờ được gửi khẳng định tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương.
  3. Thử nghiệm kháng sinh đồ: Sử dụng phương pháp khuếch tán khoanh giấy của Kirby-Bauer trên môi trường thạch Mueller-Hinton (Biolife), đo độ đục dịch vi khuẩn đạt chuẩn 0,5 McFarland bằng máy DensiCHEK Plus (BioMérieux). Sử dụng 8 loại khoanh giấy kháng sinh (BD Diagnostics) theo khuyến cáo CLSI-2015: Ampicillin (10 µg), Ceftazidime (30 µg), Gentamicin (10 µg), Streptomycin (10 µg), Ciprofloxacin (5 µg), Chloramphenicol (30 µg), Tetracycline (30 µg), Trimethoprim/sulfamethoxazole (1,25/23,75 µg).
  4. Kỹ thuật sinh học phân tử và giải trình tự gen:
    • Tách chiết RNA: Sử dụng TRIzol Reagent (Invitrogen) từ $10^8$ tế bào vi khuẩn nuôi trong môi trường BHI không chứa kháng sinh; xử lý loại bỏ DNA bằng bộ kit RNase-free DNase Set (QIAGEN). Đánh giá nồng độ bằng máy NanoDrop ND-1000 (bước sóng 260 nm) và điện di agarose 0,8%.
    • Tạo thư viện cDNA: Sử dụng TruSeq RNA Sample Preparation v2 Kit và TruSeq Stranded mRNA Sample Preparation Kit (Illumina). Kiểm tra chất lượng thư viện bằng Bioanalyzer 2100 (Agilent High Sensitivity DNA Kit) và định lượng qPCR (KAPA LQ Kit for Illumina-ABI Prism).
    • Giải trình tự NGS: Thực hiện trên hệ thống Illumina HiSeq4000 tại MACROGEN (Seoul, Hàn Quốc) với các mẫu cDNA đạt nồng độ > 4 ng/µl và OD 260/280 từ 1,8 đến 2,0.
    • Kiểm chứng Sanger: Giải trình tự Sanger trực tiếp các đoạn cDNA để xác nhận các đột biến mới trên gen đích kháng quinolone.
  5. Phương pháp tin sinh học và xử lý số liệu:
    • Đánh giá chất lượng dữ liệu thô bằng FastQC v0.11.5 (theo thang điểm Phred Q20, Q30); lọc cắt adapter và đọc kém chất lượng bằng Trimmomatic 0.36.
    • Lắp ráp de novo transcriptome bằng phần mềm Geneious R11 (thuật toán Tadpole).
    • Chú giải hệ gen bằng RAST, PATRIC 3.4.11 và căn gióng với hệ gen tham chiếu (S. Indiana ATCC, S. Derby 2012CEB117SAL, S. Give, S. Typhimurium S181).
    • Nhận diện gen kháng thuốc và đột biến điểm (gyrA, gyrB, parC, parE) qua các cơ sở dữ liệu ResFinder, ARG-ANNOT, CARD và PATRIC 3.4.11.
    • Xử lý thống kê: Phân tích số liệu sinh học bằng phần mềm SPSS 16.0 (sử dụng kiểm định Chi bình phương $\chi^2$, Fisher's exact test, ngưỡng ý nghĩa $p < 0,05$).

Nội dung chính theo từng chương

TỔNG QUAN

Chương Tổng quan hệ thống hóa lịch sử định danh vi khuẩn Salmonella từ công trình của Salmon (1884) đến các sửa đổi của Lignières (1900), Buchanan (1918) và sự đồng thuận quốc tế năm 1960. Văn bản mô tả chi tiết các đặc điểm hình thái học (trực khuẩn Gram âm, kích thước 2-3 x 0,5-1,0 µm, di động nhờ lông quanh thân), tính chất nuôi cấy (nhiệt độ tối ưu 37°C, pH 6,5-7,5, khuẩn lạc đen tâm trên XLD do sinh $H_2S$) và hóa sinh đặc trưng.

Chương này trình bày cơ sở di truyền với cấu trúc bộ gen có kích thước từ 3,39 đến 5,59 Mb, chứa 23 đảo bệnh học SPI và các đảo hệ gen GI. Nội dung tổng quan phân tích sâu 5 cơ chế kháng kháng sinh chính đối với các nhóm aminoglycoside, β-lactam, phenicol, quinolone, tetracycline, sulfonamide/trimethoprim, đồng thời lập danh mục 4 họ kênh bơm thải thuốc RND, MFS, MATE, ABC với cơ chất đào thải đa dạng. Bên cạnh đó, chương tổng kết toàn diện dữ liệu dịch tễ học ô nhiễm thực phẩm tại nhiều quốc gia (Thái Lan, Trung Quốc, Nhật Bản, Romania, Hoa Kỳ) và các nghiên cứu tại miền Bắc, miền Nam Việt Nam từ năm 1993 đến 2015. Cuối cùng, chương so sánh các kỹ thuật phân tích biểu hiện gen, chỉ ra hạn chế của RT-PCR, qPCR, Microarray và nêu bật nguyên lý vận hành của công nghệ giải trình tự thế hệ mới Illumina.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương trình bày chi tiết danh mục 90 mẫu thịt thu thập ngẫu nhiên tại 10 chợ thuộc Hà Nội (mã hóa cụ thể TL-1 đến TL-30 cho thịt lợn, TG-1 đến TG-30 cho thịt gà, TB-1 đến TB-30 cho thịt bò). Toàn bộ thành phần hóa chất, môi trường dinh dưỡng và môi trường chọn lọc (nước Peptone, thạch MSRV, canh thang MKTTn, thạch SS, thạch XLD, Kligler, Ure, LDC, ONPG, VP, Indol, Kovacs, BHI, Mueller-Hinton) được chuẩn hóa theo quy định ISO 6579:2002 và CLSI-2015.

Chương này mô tả hệ thống trang thiết bị nghiên cứu phân bố tại Viện Nghiên cứu Hệ gen và Học viện Quân y (bao gồm máy giải trình tự HiSeq4000, máy Bioanalyzer 2100, máy đo NanoDrop ND-1000, máy PCR Mastercycler pro, máy đo độ đục DensiCHEK Plus...). Toàn bộ quy trình phân lập 4 bước chuẩn ISO, thử nghiệm kháng sinh đồ 8 loại kháng sinh, quy trình chiết tách RNA bằng TRIzol, xử lý DNase, tạo thư viện cDNA TruSeq và chuỗi công cụ tin sinh học (FastQC, Trimmomatic, Geneious R11, ResFinder, ARG-ANNOT, CARD, PATRIC, SPSS 16.0) được chuẩn hóa từng bước.

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Chương Kết quả và bàn luận công bố các phát hiện thực nghiệm ban đầu về khả năng nhiễm và đặc tính sinh học của Salmonella trong 90 mẫu thịt tươi khảo sát:

Kết quả nuôi cấy tăng sinh và phân lập: 100% mẫu thịt (90/90 mẫu) cho kết quả đục đều trong môi trường tăng sinh sơ bộ nước pepton. Khi chuyển sang các môi trường tăng sinh chọn lọc và phân lập, có 25/90 mẫu (chiếm tỷ lệ 27,8%) dương tính với các biểu hiện khuẩn lạc điển hình:

STT Môi trường nuôi cấy Số mẫu dương tính (+) Tỷ lệ (%) Đặc điểm nhận dạng khuẩn lạc
1 Nước Pepton 90 100,0 Môi trường đục đều
2 Thạch bán lỏng MSRV 25 27,8 Vùng vi khuẩn màu xám trắng mọc lan ra xa các giọt cấy, có cạnh rõ ràng ở 41,5°C
3 Canh thang MKTTn 25 27,8 Môi trường chuyển đục
4 Thạch chọn lọc XLD 25 27,8 Khuẩn lạc dạng S, viền đỏ nhạt, trung tâm màu đen
5 Thạch chọn lọc SS 25 27,8 Khuẩn lạc dạng S, không màu, trung tâm có màu đen

Trên môi trường MSRV ở nhiệt độ 41,5°C, các chủng Salmonella thể hiện khả năng di động tối ưu vượt trội so với các vi khuẩn đường ruột khác (Enterobacter cloacae, Citrobacter diversus), tạo quầng lan xám trắng đặc trưng. Trên môi trường thạch XLD, các mẫu thịt lợn TL-1 và TL-2 cho khuẩn lạc dạng S màu đen tuyền bao trùm; riêng mẫu thịt gà TG-1 xuất hiện 3 dạng khuẩn lạc khác nhau (khuẩn lạc dạng S tâm đen, khuẩn lạc dạng S màu vàng do lên men lactose/sucrose làm acid hóa môi trường, và khuẩn lạc dạng S màu hồng), phản ánh tình trạng nhiễm đồng thời nhiều chủng vi sinh vật trên mẫu thịt gà khảo sát.

Kết quả giám định đặc tính sinh hóa: 25 chủng vi khuẩn phân lập được kiểm tra trên hệ thống các chỉ thị sinh hóa theo tiêu chuẩn ISO 6579:2002. Kết quả phân tích khẳng định 100% các chủng phù hợp hoàn toàn với hồ sơ sinh hóa của Salmonella:

STT Phép thử đặc tính sinh hóa Số mẫu dương tính (+) Tỷ lệ (%) Chuẩn quy định theo ISO 6579:2002
1 Lên men Glucose 25 100,0 +
2 Lên men Lactose 0 0,0 -
3 Sinh khí $H_2S$ 25 100,0 +
4 Khả năng sinh hơi 25 100,0 +
5 Phân giải Ure (Urease) 0 0,0 -
6 Phản ứng decarboxylase Lysine (LDC) 25 100,0 +
7 Phản ứng $\beta$-galactosidase (ONPG) 0 0,0 -
8 Phản ứng Voges-Proskauer (VP) 0 0,0 -
9 Khả năng sinh Indol 0 0,0 -

Trên thạch Kligler (các mẫu TB-1, TL-1), vi khuẩn sử dụng glucose làm acid hóa phần đáy ống nghiệm khiến chỉ thị phenol red chuyển sang màu vàng, đồng thời sinh $H_2S$ làm đen đáy môi trường, không làm thay đổi màu đỏ ở phần thạch nghiêng (không lên men lactose).

Kết quả và những đóng góp mới

Dựa trên nội dung văn bản luận án, các kết quả và đóng góp mới bao gồm:

  • Đóng góp về thực tiễn:
    • Cung cấp số liệu thực nghiệm về tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella trong thịt tươi sống bán lẻ tại 10 chợ trên địa bàn Hà Nội trong mùa đông năm 2016, xác định tỷ lệ nhiễm đạt 27,8% (25/90 mẫu).
    • Phản ánh thực trạng ô nhiễm vi sinh vật trên chuỗi cung ứng thực phẩm tại chợ truyền thống, ghi nhận trường hợp mẫu thịt gà (TG-1) đồng nhiễm nhiều loại vi khuẩn đường ruột khác nhau.
  • Đóng góp về khoa học và phương pháp:
    • Ứng dụng quy trình định danh chuẩn hóa kết hợp nuôi cấy tăng sinh chọn lọc trên thạch MSRV ở nhiệt độ 41,5°C và định danh sinh hóa 9 chỉ tiêu theo ISO 6579:2002, đảm bảo độ chính xác trong phân lập vi khuẩn từ nền mẫu thực phẩm phức tạp.
    • Luận án là một trong những nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam thiết lập quy trình giải trình tự transcriptome thế hệ mới (RNA-Seq trên hệ thống Illumina HiSeq4000) kết hợp với kiểm chứng giải trình tự Sanger để khảo sát sâu các cụm gen kháng thuốc, hệ thống gen bơm thải và phát hiện các đột biến điểm kháng kháng sinh nhóm quinolone (gyrA, gyrB, parC, parE) ở các chủng Salmonella đa kháng phân lập từ thịt bán lẻ.
  • Kiến nghị và giải pháp đề xuất:
    • Cần duy trì các chương trình giám sát định kỳ đối với tình trạng tạp nhiễm Salmonella và mức độ đa kháng kháng sinh trong chuỗi thực phẩm tươi sống tại các chợ bán lẻ.
    • Tăng cường kiểm soát vệ sinh an toàn thực phẩm trong khâu giết mổ, vận chuyển và bảo quản thịt nhằm giảm thiểu nguy cơ nhiễm chéo vi khuẩn sang người tiêu dùng.
    • Hoàn thiện các quy định quản lý việc sử dụng kháng sinh trong điều trị lâm sàng và chăn nuôi thú y nhằm hạn chế áp lực chọn lọc làm lan truyền các chủng vi khuẩn đa kháng.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Từ phạm vi và dữ liệu thực tế được trình bày trong văn bản:

  • Hạn chế:
    • Cỡ mẫu nghiên cứu còn ở mức giới hạn (90 mẫu thịt) và chỉ tập trung thu thập tại 10 chợ bán lẻ trên địa bàn thành phố Hà Nội trong một khoảng thời gian nhất định (các tháng mùa đông từ tháng 10 đến tháng 12 năm 2016), chưa bao quát được sự biến thiên dịch tễ theo mùa và các vùng địa lý khác.
    • Phân tích giải trình tự thế hệ mới tập trung chủ yếu vào các chủng đại diện biểu hiện kiểu hình đa kháng kháng sinh và tập trung sâu vào nhóm gen kháng quinolone được kiểm chứng Sanger.
  • Hướng nghiên cứu tiếp:
    • Mở rộng quy mô điều tra dịch tễ học và giám sát kháng thuốc trên nhiều nguồn thực phẩm khác nhau (thủy sản, rau quả) và mở rộng phạm vi địa lý tại các tỉnh thành khác.
    • Tiếp tục phân tích sâu cơ chế điều hòa biểu hiện của hệ thống các kênh bơm thải thuốc (như kênh AcrAB-TolC) và tương tác giữa các đột biến kháng thuốc mới phát hiện trong điều kiện có và không có áp lực kháng sinh.

Giá trị tham khảo

Luận án có giá trị tham khảo chuyên môn cho các nhóm đối tượng:

  • Nghiên cứu sinh và học viên chuyên ngành Vi sinh vật học, Sinh học phân tử, Dịch tễ học: Cung cấp tài liệu tham khảo chi tiết về quy trình phân lập vi sinh theo chuẩn ISO 6579:2002; phương pháp làm kháng sinh đồ Kirby-Bauer theo chuẩn CLSI-2015; và quy trình xử lý tin sinh học dữ liệu NGS transcriptome (FastQC, Trimmomatic, lắp ráp de novo bằng Geneious R11, tra cứu ResFinder, CARD, PATRIC).
  • Cán bộ kiểm nghiệm an toàn thực phẩm và kiểm soát dịch bệnh: Tham khảo các quy chuẩn nuôi cấy tăng sinh trên MSRV, MKTTn và bảng 9 chỉ tiêu sinh hóa để phân biệt chính xác Salmonella với các vi khuẩn đường ruột khác (Shigella, Citrobacter, coliform).
  • Cơ quan quản lý nông nghiệp, y tế và người làm chính sách: Cung cấp dữ liệu thực chứng về tỷ lệ tạp nhiễm vi khuẩn và thực trạng kháng kháng sinh trong thịt tươi sống, phục vụ việc xây dựng kế hoạch kiểm soát sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi và ban hành hướng dẫn đánh giá nguy cơ ô nhiễm thực phẩm.

Câu hỏi thường gặp

1. Tỷ lệ phân lập vi khuẩn Salmonella trong 90 mẫu thịt tươi tại các chợ Hà Nội là bao nhiêu và đặc tính sinh hóa ra sao?
Trong 90 mẫu thịt khảo sát (30 thịt lợn, 30 thịt bò, 30 thịt gà), có 25 mẫu dương tính với Salmonella trên các môi trường chọn lọc, đạt tỷ lệ 27,8%. 100% chủng phân lập (25/25) biểu hiện đặc tính sinh hóa điển hình: lên men glucose (+), sinh $H_2S$ (+), sinh hơi (+), LDC (+); đồng thời âm tính hoàn toàn với lactose (-), urease (-), $\beta$-galactosidase (-), VP (-) và indol (-).

2. Vi khuẩn Salmonella có những họ kênh bơm thải thuốc (efflux pumps) chính nào và cơ chất đào thải của chúng gồm những gì?
Salmonella sở hữu 4 họ kênh bơm thải thuốc chính liên kết với kênh màng ngoài TolC: họ RND (gồm AcrAB, AcrD, AcrEF, MdtABC, MdsAB); họ MFS (gồm EmrAB, MdfA); họ MATE (gồm MdtK); và họ ABC (gồm MacAB). Các hệ thống này có khả năng đào thải nhiều loại kháng sinh (quinolone, aminoglycoside, tetracycline, chloramphenicol, erythromycin, β-lactam...) cùng các chất tẩy rửa và thuốc nhuộm độc hại (SDS, deoxycholate, ethidium bromide, acriflavine, novobiocin...).

3. Quy trình giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) và các công cụ tin sinh học được luận án sử dụng như thế nào?
Nghiên cứu tách chiết RNA tổng số từ $10^8$ vi khuẩn bằng TRIzol Reagent, tinh sạch bằng RNase-free DNase Set (QIAGEN), tạo thư viện bằng TruSeq RNA Sample Prep Kit (Illumina) và giải trình tự trên máy Illumina HiSeq4000 tại MACROGEN (Hàn Quốc). Dữ liệu được kiểm tra chất lượng bằng FastQC v0.11.5, lọc bằng Trimmomatic 0.36, lắp ráp de novo bằng Geneious R11 (thuật toán Tadpole), chú giải chức năng qua RAST, PATRIC 3.4.11 và tìm gen/đột biến kháng thuốc qua ResFinder, ARG-ANNOT, CARD.

4. Vì sao quy trình phân lập lại sử dụng thạch bán lỏng MSRV ở nhiệt độ 41,5°C?
Môi trường thạch bán lỏng MSRV chứa kháng sinh novobiocin, nồng độ $MgCl_2$ cao, pH thấp và xanh malachite giúp ức chế mạnh vi khuẩn Gram dương. Theo nghiên cứu của De Smedt và cộng sự, nhiệt độ 41,5°C là điều kiện tối ưu để vi khuẩn Salmonella di động xa nhất ra khỏi điểm cấy (tạo quầng lan xám trắng), vượt trội so với các vi khuẩn có thể phát triển khác như Enterobacter cloacae hay Citrobacter diversus, giúp que cấy lấy đúng khuẩn lạc thuần khiết để cấy chuyển sang thạch XLD.

5. Luận án ghi nhận thực trạng nhiễm Salmonella trong thịt gia súc, gia cầm tại Việt Nam qua các nghiên cứu trước đây như thế nào?
Các công bố được luận án tổng kết cho thấy: năm 2009 tại Hà Nội, thịt bò bán lẻ nhiễm 39,9% (46% đa kháng); năm 2012 tại miền Bắc, thịt lợn nhiễm 39,6% và thịt gà nhiễm 42,9% (78,4% kháng ít nhất một kháng sinh); năm 2014, thịt gà sống nhiễm 48,7% (17,7% đa kháng, có chủng kháng tới 9 kháng sinh); và giai đoạn 2012-2015 tại Sài Gòn, tỷ lệ nhiễm là 69,7% trên thịt lợn, 65,3% trên thịt gà và 58,3% trên thịt bò.

Kết luận

Luận án "Nghiên cứu đặc điểm kháng kháng sinh và gen liên quan ở các chủng Salmonella đa kháng" đã thực hiện khảo sát thực nghiệm trên 90 mẫu thịt tươi tại 10 chợ bán lẻ ở Hà Nội, xác định tỷ lệ nhiễm Salmonella đạt 27,8% với các đặc tính sinh hóa thuần nhất theo chuẩn ISO 6579:2002. Công trình hệ thống hóa chi tiết các cơ chế kháng thuốc đối với 6 nhóm kháng sinh chính và 4 họ kênh bơm thải thuốc ở Salmonella. Đồng thời, nghiên cứu đã thiết lập quy trình tích hợp giữa thử nghiệm kiểu hình kháng sinh đồ chuẩn CLSI-2015 với công nghệ giải trình tự transcriptome thế hệ mới Illumina HiSeq4000 và phân tích tin sinh học để khảo sát các nhóm gen kháng thuốc và đột biến kháng quinolone ở mức độ phân tử. Các kết quả cung cấp cơ sở dữ liệu thực nghiệm phục vụ công tác giám sát dịch tễ học vi sinh và quản lý an toàn thực phẩm trong chuỗi cung ứng thịt tại Việt Nam.