Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Hạt Thân Rễ Lá Hình 1. Cây lúa Nàng Thơm Chợ Đào 3 Cây lúa thuộc họ Poaceae (Graminea hay họ Hòa Thảo), phụ họ Pryzoideae, tộc Oryzae, dòng Oryza, loài Oryza sativa và Oryza glaberrima. Loài Oryza sativa là lúa trồng ở châu Á và Oryza glaberrima lúa trồng ở châu Phi. Cây lúa (Oryza sativa L.) là cây lương thực chính cho 1/2 dân số trên thế giới và là cây mô hình tiêu biểu cho loài đơn tử diệp.
Trong đó, Việt Nam là một trong những nước có tài nguyên di truyền lúa phong phú và đa dạng trên thế giới. Dựa trên nghiên cứu về tiến hóa và sự đa dạng di truyền của các loài thuộc dòng lúa Oryza, các nhà khoa học cho rằng Việt Nam nằm trong khu vực xuất xứ và đa dạng di truyền của loài lúa trồng châu Á (Oryza sativa) [5]. Tuy nhiên, để đáp ứng nhu cầu an ninh lương thực cho cả nước nên hầu hết các chương trình chọn tạo giống hướng theo mục tiêu phát triển các giống lúa cho năng suất cao nên nguồn tài nguyên di truyền lúa Việt Nam ngày bị mai một. Nguyên nhân là do các giống lúa đặc sản địa phương thường có năng suất thấp, chất lượng cao được thay thế bằng các giống cao sản ngắn ngày, kháng sâu bệnh và không thơm [6].
Đó là nguyên nhân dẫn đến nhiều giống lúa địa phương không được lưu giữ và sản xuất, thậm chí còn mất đi những nguồn gen quý [1, 7, 8, 9]. Ngày nay, khi đời sống ngày được nâng cao, thị hiếu của người tiêu dùng cũng thay đổi, nhu cầu về gạo chất lượng cao ngày càng được người tiêu dùng quan tâm. Do đó, việc duy trì và phát triển nguồn gen lúa bản địa chất lượng cao đã và đang được các quốc gia trồng lúa quan tâm. Trong đó, Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam đã được nhà nước đầu tư để thực hiện dự án “Giải mã bộ gen (Genomes) một số giống lúa bản địa của Việt Nam”, đặc biệt các giống lúa có những gen quý đặc trưng cho từng đặc tính như (1) nhóm chất lượng (Tám Xoan Hải Hậu, Tám Xoan Bắc Ninh, NTCĐ); (2) nhóm chịu mặn (Một Bụi Đỏ, Chiêm Đỏ, Nếp Mặn); (3) Nhóm chịu hạn (Nàng Quớt Biển, Bồ Hóng Hải Dương, Tan Ngần); (4) nhóm kháng đạo ôn (Nếp Lùn, Khẩu Mặc Buột); (5) nhóm kháng rầy nâu (Xương Gà, Khẩu Giáng, Coi Ba Đất) và (6) nhóm kháng bạc lá (Tép Thái Bình, Tóc Lùn, Hom Râu).
Trong đó lúa NTCĐ được xếp vào nhóm lúa chất lượng, điểm đặc biệt của giống lúa này là chỉ khi được canh tác tại xã Mỹ Lệ, huyện Cần Đước, tỉnh Long An mới cho được sản phẩm gạo nổi tiếng thơm ngon, được người tiêu dùng biết đến bởi những ưu điểm nổi bật mà không có loại gạo nào sánh được như mùi thơm mạnh và mềm cơm. Đặc điểm của lúa NTCĐ là giống lúa cảm quang, thời vụ bắt gieo trồng từ 15/7 đến 30/7 cho năng suất và chất lượng tốt nhất [2]. Thời gian sinh trưởng của lúa NTCĐ từ 4 150 đến 185 ngày, chiều cao cây từ 155 đến 183 cm, cây yếu, sau trổ thường bị đổ ngã, có khả năng chống chịu với rầy nâu, nhưng bị nhiễm sâu đục thân [3]. Lúa NTCĐ được canh tác chủ yếu dựa vào nước mặt, tính thơm giảm mạnh trong các năm có mùa mưa kéo dài và ở các vùng đất thấp.
Dựa vào hình dạng hạt lúa, có thể phân lúa NTCĐ thành 03 nhóm chính: nhóm có dạng đuôi cong, dạng hạt thẳng và dạng trung gian. Các dòng lúa NTCĐ khác nhau về tính thơm và năng suất [2]. Tuy nhiên, các nghiên cứu về lúa NTCĐ còn rất hạn chế, chỉ tập trung ở việc bảo tồn, lưu giữ các nguồn gen quý và khai thác sử dụng làm vật liệu lai tạo. Với chất lượng gạo như hiện nay, tại Hợp tác xã Nàng Thơm Chợ Đào, gạo NTCĐ có giá bán cao hơn các loại gạo thông thường khoảng 10.
Trong khi thị trường xuất khẩu con số này cao hơn rất nhiều lần. Nhiều doanh nghiệp đã liên hệ bao tiêu sản phẩm để xuất khẩu, nhưng do chất lượng gạo thấp, không ổn định vì vậy gạo NTCĐ vẫn chỉ lưu chuyển ở thị trường trong nước, chưa thể đem về ngoại tệ. Đến nay, việc nghiên cứu chọn tạo phục tráng giống lúa NTCĐ được thực hiện rất ít. Năm 2000-2002, nghiên cứu về chọn tạo giống lúa được thực hiện bởi Viện nghiên cứu lúa Đồng bằng Sông Cửu Long, do Bùi Chí Bửu làm chủ nhiệm đề tài đã xác định được các đặc tính nông học của lúa NTCĐ như thời gian sinh trưởng, chiều cao cây, khả năng kháng đạo ôn, rầy nâu, phẩm chất hạt, năng suất và thành phần năng suất.
Năm 2005-2009, nghiên cứu về xây dựng quy trình canh tác lúa NTCĐ tại khu vực xã Mỹ Lệ, huyện Cần Đước, tỉnh Long An được Viện Khoa học Kỹ thuật Miền Nam thực hiện do Ths. Huỳnh Trấn Quốc làm chủ nhiệm đề tài đã chọn lọc được 01 dòng lúa NTCĐ cho năng suất ổn định, khá đồng đều về hình dạng hạt, xác định được các công thức phân bón ảnh hưởng đến năng suất, chất lượng gạo [2]. Năm 2016 - 2020, nghiên cứu “Khai thác và phát triển nguồn gen giống lúa NTCĐ tại xã Mỹ Lệ, huyện Cần Đước, tỉnh Long An” được Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng Đại học Cần Thơ thực hiện, do Võ Công Thành làm chủ nhiệm đề tài. Đề tài đi sâu vào chọn lọc giống NTCĐ đạt phẩm chất như giống NTCĐ trước đây, đồng thời thiết lập dấu phân tử nhận diện giống NTCĐ, xây dựng chỉ dẫn địa lý, xây dựng cánh đồng mẫu NTCĐ gắn với doanh nghiệp bao tiêu sản phẩm, thị trường chủ lực là xuất khẩu [4].
Hội thảo trong khuôn khổ đề tài “Khai thác và phát triển nguồn gen giống lúa NTCĐ tại xã Mỹ Lệ, huyện Cần Đước, tỉnh Long An” a. Quang cảnh hội thảo; b. Gạo NTCĐ xay xát tại hội thảo 1.2 KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN 1.1 Các phương pháp giải trình tự gen truyền thống 1.1 Phương pháp hóa học Phương pháp này đã được Maxam và Gilbert phát minh vào năm 1977 để giải trình tự một đoạn DNA. Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên phản ứng hóa học thủy giải đặc hiệu, các DNA không tự xoắn lại với nhau, tạo thành tập hợp gồm nhiều phân đoạn có kích thước khác nhau.
Đầu tiên, đánh dấu một đầu của đoạn DNA cần giải trình tự bằng đồng vị phóng xạ của phosphor (P32); Xử lý các đoạn DNA đã đánh dấu với chất hóa học có thể làm biến đổi đặc hiệu một hoặc hai loại base nitrogen của nucleotide trên đoạn DNA Thực hiện điện di mẫu DNA đã xử lý. Áp gel đã điện di này trên một phim nhạy tia X, các vị trí dừng lại của các mạch đơn trên gel điện di sẽ tạo thành các vạch trên phim vì các vị trí này đều bị đánh dấu phóng xạ do các mạch đơn đều có một đầu được đánh dấu bằng P32. Tổng hợp các vạch trên phim xạ ký tự ghi này, có thể biết được trình tự sắp xếp các nucleotide của đoạn DNA Phương pháp hóa học xác định trình tự DNA của Maxam và Gilbert trên thực tế không phải dễ thực hiện vì cần phải xác định khá nhiều thông số tối ưu cho thí nghiệm, 6 trong đó khó nhất là phải xác định được nồng độ giới hạn nhất của các chất hóa học sao cho khi xử lý mẫu DNA thì trên mỗi đoạn DNA chỉ có một base bị biến đổi để ứng với mỗi vị trí của base bị biến đổi thì sẽ có một mạch đơn có đầu đánh dấu P32 được tách ra. Chính vì sự phức tạp này, phương pháp Maxam Gilbert ít được sử dụng, mà thay vào đó các nhà khoa học dùng phương pháp enzyme với nhiều ưu điểm vượt trội hơn.2 Phương pháp enzyme sử dụng các dideoxynucleotide (ddNTP) Phương pháp này được F.
Sanger và cộng sự phát minh vào năm 1977. Nguyên tắc của phương pháp ddNTP là dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ hoạt động của enzyme DNA-polymerase. Với việc sử dụng thêm các dideoxynucleotide (ddNTP) với các deoxynucleotide (dNTP) thông thường, kết quả tổng hợp cũng là sự hình thành một tập hợp nhiều đoạn DNA có kích thước khác nhau. Trong phản ứng sử dụng đoạn DNA mồi mạch đơn khoảng 20 nucleotide, bốn loại ddNTP (trong đó có một loại đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ) và bổ sung thêm 1% ddNTP (hoặc ddCTP, ddGTP, ddTTP) cho mỗi loại phản ứng.
Các ddNTP mất hai nguyên tử oxy ở C3 và C2 khi mạch đơn DNA đang tổng hợp được gắn 1 ddNTP phản ứng ngừng tổng hợp. Mỗi loại phản ứng được thực hiện riêng rẽ, có DNA khuôn, DNA mồi, đầy đủ các loại dNTP, enzyme Taq DNA- polymerase, dung dịch đệm và có thêm khoảng 1% một loại ddNTP. Kết quả phản ứng tổng hợp nên các đoạn oligonucleotide dài ngắn khác nhau một nucleotide và được nhận biết nhờ phương pháp điện di. Tổng hợp kêt quả phản ứng ở 4 ống, thu được trình tự các nucleotide của mạch đơn, có thể biết được trình tự sắp xếp các nucleotide trong gen.3 Phương pháp xác định trình tự nucleotide bằng máy tự động Trong kĩ thuật này, người ta không đánh dấu bằng các đồng vị phóng xạ mà bằng hóa chất (các fluochrome).
Mỗi loại ddNTP được đánh dấu bằng một fluochrome có màu khác nhau. Như vậy, tất cả các oligonucleotide cùng chấm dứt tại một loại ddNTP sẽ có cùng một màu. Sau khi điện di trên gel Polyacrylamide, các vạch điện di sẽ phát sáng khi đi qua chùm tia sáng laser và được mắt cảm quan phát hiện, lưu lại thành đỉnh cường độ sáng trong biểu đồ. Kết quả sẽ được xử lí qua một hệ thống vi tính, các đỉnh ghi nhận được so sánh với đỉnh tương ứng của các màu để phân tích thành trình tự đoạn DNA.
Đây là các thế hệ máy tự động đầu tiên dùng trong giải trình tự DNA.2 Công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới NGS (Next-Genration DNA Sequencing) Công nghệ NGS được thương mại hóa năm 2004. Hiện nay, 05 hệ thống được sử dụng rộng rãi cho việc giải trình tự là các thiết bị của Roche (454FLX), Illumina (Solexa Genome Analyzer), Applied Biosystems SOLiDTM System, Helicos HeliscopeTM và Pacific Biosciences SMRT. Các thiết bị này cho phép người sử dụng chủ động trong việc sắp xếp mẫu ở các bước chuẩn bị trước khi giải trình tự DNA, dẫn đến sự tiết kiệm về thời gian. Tuy công nghệ của các hãng là khác nhau, nhưng đều thực hiện theo nguyên tắc là khuếch đại sợi đơn của một fragment library và thực hiện phản ứng giải trình tự trên các sợi đã được khuếch đại.