CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU download by : skknchat@gmail. TÌNH HÌNH BỆNH CÚM A/H5N1 [3], [6] Cúm gà hay cúm gia cầm do virus cúm typ A gây nên. Chúng thường gây bệnh trên các loài gia cầm và có thể lây nhiễm sang một số loài động vật có vú. Cúm gia cầm lây lan rất nhanh và khó kiểm soát.
Chúng thường lây nhiễm nhanh ở các loài lông vũ và gây chết trên diện rộng. Năm 1996, virus cúm A/H5N1 lần đầu tiên được phân lập ở ngỗng tại tỉnh Giang Đông, Trung Quốc. Sau đó tiếp tục lan rộng ra nhiều nước châu Á và một số nước châu Âu. Từ năm 2003, dịch cúm gia cầm H5N1 bùng phát mạnh tại Thái Lan, Việt Nam, Hàn Quốc, Nhật Bản sau đó lan khắp châu Á.
Thái Lan và Việt Nam là hai quốc gia bị ảnh hưởng nặng nề nhất. Không chỉ gây bệnh trên gia cầm, virus cúm A/H5N1 còn là mối đe dọa cho sức khỏe con người. Theo thống kê của TCYTTG, tính đến ngày 04/07/2006 đã có 229 người bị nhiễm cúm A/H5N1 ở 10 quốc gia trong đó có 131 người tử vong chiếm tỷ lệ 58% [6]. Việt Nam vẫn là nước có số người nhiễm cúm A/H5N1 rất cao.
Tính đến tháng 6/2007, tại 32 tỉnh thành trong cả nước có 98 người bị mắc bệnh, trong đó có 42 người bị chết [3]. Từ năm 2003 đến nay, tình hình lây nhiễm virus cúm A/H5N1 diễn biến rất phức tạp. Không chỉ gây bệnh trên gia cầm, nó còn gây nhiễm sang một số động vật khác như hổ (Thái Lan), mèo (Thái Lan, Indonesia, Iraq, Đức), lợn (Indonesia, Việt Nam), chồn (biển Baltic, Đức). Số người nhiễm do H5N1 cũng gia tăng không ngừng cả về số lượng lẫn phạm vi ảnh hưởng.
Mặc dù các trường hợp nhiễm virus cúm A/H5N1 trên người trong suốt những mùa dịch vừa qua cho thấy, sự nhiễm virus chỉ xảy ra khi có sự tiếp xúc khá chặt chẽ giữa người với các loài gia cầm bệnh. Tuy nhiên, viễn cảnh xuất hiện những chủng virus cúm có khả năng lây từ người sang người là một điều có thể tiên liệu được. TCYTTG đã đưa ra cảnh báo rằng đại dịch cúm đang đến gần và nhiều khả năng là do một biến chủng của virus cúm gia cầm H5N1. Vì vậy, công tác phòng chống dịch đang diễn ra ở nhiều nước trên thế giới.
Hiện nay, giải pháp được nhiều nước trên thế giới đang thực hiện là sản xuất vacxin phòng cúm cho người. download by : skknchat@gmail. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VACXIN CÚM A/H5N1 HIỆN NAY [1], [3], [6] Trước nguy cơ đại dịch cúm đang đến gần, công tác phòng chống dịch đang diễn ra rất khẩn trương ở nhiều nước trên thế giới. Để phòng chống đại dịch thì việc sử dụng vacxin là phương thức hữu hiệu nhất để bảo vệ cộng đồng, làm giảm tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ chết.
Tình hình thế giới: TCYTTG và tổ chức Nông lương thế giới khuyến cáo tất cả các nước, đặc biệt là các nước đang phát triển phải tự nghiên cứu và sản xuất vacxin cúm A/H5N1 để chủ động nguồn vacxin phục vụ cho nhu cầu bảo vệ sức khỏe cộng đồng khi đại dịch xảy ra. TCYTTG đã đưa ra ba loại vacxin cúm sau cho các nước lựa chọn sản xuất: Vacxin bất hoạt trên trứng gà có phôi và nuôi cấy tế bào; vacxin sống trên trứng gà có phôi và nuôi cấy tế bào; vacxin sống dạng phun mù, hít qua mũi [3]. Hiện nay, trên thế giới mặc dù đã có rất nhiều nước nghiên cứu và sản xuất vacxin cúm A/H5N1 nhưng chưa có nước nào được cấp giấy phép lưu hành. Nhiều hãng sản xuất vacxin lớn như hãng Sanofi Pasteur (Mỹ, Pháp), hai hãng Nobilon, Sovay Pharmaceutials của Hà Lan vv.đang nghiên cứu sản xuất vacxin cúm A/H5N1 bằng phương pháp nuôi cấy trên trứng gà có phôi hoặc nuôi cấy trên các dòng tế bào (như tế bào Vero, MDCK.
Tình hình Việt Nam: Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa nên rất dễ cho dịch cúm bùng phát và lây lan ra diện rộng. Ngoài ra, đàn gia cầm với số lượng lớn cũng là một yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến việc bùng nổ dịch cúm. Trước nguy cơ đại dịch cúm đang đến gần, vấn đề cân nhắc và lựa chọn một dây chuyền sản xuất vacxin cúm sao cho phù hợp với tình hình thực tế đất nước mà vẫn đảm bảo chất lượng đang là mối quan tâm hàng đầu của nước ta hiện nay. Vấn đề càng trở nên gấp rút hơn khi dịch cúm mỗi ngày một tiến gần hơn.
Trước tình hình đó, căn cứ vào ưu nhược download by : skknchat@gmail.com -6- điểm của từng phương pháp mà hiện nay ở Việt Nam đã có nhiều đơn vị sản xuất vacxin cúm H5N1 như: Năm 2004, viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương nghiên cứu sản xuất vacxin cúm A/H5N1 dùng cho người bằng phương pháp nuôi cấy trên tế bào thận khỉ. Ngày 18/03/2006, viện Pasteur Tp.HCM phối hợp với viện Vắc xin và sinh phẩm y tế Nha Trang và viện Công nghệ sinh học Hà Nội đã bảo vệ thành công đề tài cấp nhà nước mang tên “Nghiên cứu quy trình sản xuất vacxin cúm A/H5N1 dùng cho người bằng kỹ thuật nuôi cấy trên trứng gà có phôi và trên tế bào Vero” tại Hội đồng Khoa học, Bộ khoa học công nghệ [6]. Tiếp theo đó, năm 2007, Viện Vắc xin và sinh phẩm y tế Nha Trang đã xây dựng quy trình sản xuất vacxin cúm đạt tiêu chuẩn GMP với sự hỗ trợ của TCYTTG, quy mô sản xuất là 1 triệu liều/năm. GIỚI THIỆU VACXIN CÚM A/H5N1 SẢN XUẤT TRÊN TRỨNG GÀ CÓ PHÔI [3], [4] 1.
Nguyên liệu sản xuất Nguyên liệu sản xuất vacxin cúm theo phương pháp này là trứng gà sạch có phôi 10 đến 11 ngày tuổi. Trứng được cung cấp từ những cơ sở sản xuất trứng sạch đạt tiêu chuẩn ở trong và ngoài nước. Chủng sản xuất Hiện nay, Viện Vắc xin và sinh phẩm y tế Nha Trang đang sử dụng chủng sản xuất NIBRG-14 (Viện NIBSC-Anh), được tái tổ hợp từ hai chủng virus cúm A/VietNam/1194/2004 (H5N1) và A/PR/8/34 (H1N1), trong đó gen mã hóa H5 và N1 lấy từ chủng A/VietNam/1194/2004. Vùng quyết định tính độc trên gen H5 gồm 4 axit amin mang tính kiềm bị cắt bỏ, 6 gen còn lại lấy từ chủng A/PR/8/34.
Chủng NIBRG-14 có kháng nguyên bề mặt (H5 và N1) gần gũi với chủng virus cúm A/H5N1 đã phân lập được ở Việt Nam và được TCYTTG cho phép sử dụng làm vacxin [3]. download by : skknchat@gmail. Quy trình sản xuất và kiểm định vacxin cúm A/H5N1 trên trứng gà có phôi Trứng gà sạch có phôi 10÷11 ngày tuổi được cấy chủng virus cúm. Sau khi vào trong trứng, virus cúm sẽ nhân lên với số lượng lớn.
Đến khi đủ số lượng, tiến hành tiến hành thu gặt dịch niệu nang. Dịch niệu nang được tinh chế sau đó được hoàn nguyên và bất hoạt bằng formandehyde. Sản phẩm được đem đi hấp phụ tá chất và pha bán thành phẩm. Sau đó, sản phẩm được đóng lọ tạo thành vacxin thành phẩm.
Song song với quy trình sản xuất, quy trình kiểm định cũng diễn ra theo sơ đồ (phụ lục 1). Tiêu chuẩn chất lượng của vacxin cúm A/H5N1 [10] Mỗi lô vacxin cúm A/H5N1 trong quá trình sản xuất cũng như khi thành phẩm, trước khi đưa vào sử dụng đều phải trải qua quá trình kiểm định rất chặt chẽ. Các tiêu chí kiểm tra đều dựa trên các tiêu chuẩn hiện hành của Bộ Y tế Việt Nam và các quy định của TCYTTG cho vacxin cúm uống cho người. Đối với vacxin cúm sản xuất trên trứng gà có phôi, có một chỉ tiêu kiểm tra đặc trưng mà đối với các vacxin sản xuất trên tế bào không có đó là kiểm tra hàm lượng ovalbumin.
Đây là một chỉ tiêu rất quan trọng trong số hàng loạt các chỉ tiêu kiểm định vacxin cúm sản xuất trên trứng gà có phôi. Ovalbumin là protein có trong lòng trắng trứng, trong quá trình sản xuất vacxin cúm trên trứng gà, thành phần này có thể còn tồn tại trong vacxin cúm thành phẩm. Ovalbumin là chất gây dị ứng cho cơ thể người và động vật nên việc kiểm tra hàm lượng ovalbumin của các lô vacxin cúm thành phẩm là một yêu cầu bắt buộc. download by : skknchat@gmail.
Trong điện di ovalbumin có điểm đẳng điện (pHi) tại pH= 4,6 [19]. Hiện nay đã có một số nghiên cứu về ovalbumin trong một số lĩnh vực khác nhau như: − Những nghiên cứu chung về cấu trúc và đặc tính − Những nghiên cứu về cấu trúc serpin và chức năng − Proteomic − Những nghiên cứu trong lĩnh vực miễn dịch học Tuy nhiên, đây mới chỉ là những nghiên cứu ban đầu, chức năng của ovalbumin vẫn chưa được biết đến mặc dù nó được dự đoán là một protein có nhiều tiềm năng. Một trong những ứng dụng của ovalbumin hiện nay là dùng trong điện di trên gel, nó được dùng như một phân tử chuẩn làm mốc đánh dấu. Bên cạnh đó, ovalbumin cũng được dùng trong chữa bệnh.
Trong trường hợp bị nghi ngờ ngộ độc kim loại nặng (ví dụ như sắt) ovalbumin có thể chữa trị được vì ovalbumin có khả năng bẫy các ion này trong liên kết sulfuhydrin của nó. Điều này đã ngăn cản sự thu hút kim loại xâm nhập vào trong hệ tiêu hóa (dạ dày và ruột) và ngăn cản sự nhiễm độc [17]. Tuy nhiên, trong lĩnh vực miễn dịch học thì ovalbumin là chất gây dị ứng đối với người và động vật. Do đó, đây là thành phần bắt buộc phải kiểm tra đối với các sản phẩm bị nghi ngờ là có chứa ovalbumin như các dược phẩm: thuốc, vacxin…, các sản phẩm thực phẩm có nguồn gốc từ: trứng, sữa… Ovabumin có thể ổn định trong thời gian 1 năm khi bảo quản ở nhiệt độ từ 2÷8OC [19].
download by : skknchat@gmail. Cấu tạo [17], [18], [19] Ovalbumin trong lòng trắng trứng được cấu tạo bởi 385 amino acid. Nó là một glycoprotein với 4 vị trí gắn glucoza. Là một protein tiết ra từ tế bào mặc dù nó thiếu 1 đầu nitơ (-N) trong trình tự của nó.
Cấu trúc của ovalbumin thuộc về dạng cấu trúc serpin của protein, mặc dù không giống phần lớn các serpin khác - ovalbumin không có khả năng ức chế bất kì một enzym thủy phân protein nào. Điều này được làm rõ khi so sánh cấu trúc của nó với các serpin. Tính sinh miễn dịch [2], [5], [8] Ovalbumin là một chất sinh miễn dịch mạnh vì nó có đủ các yếu tố của một chất sinh miễn dịch. Đó là: Tính lạ: Thông thường một chất được gọi là kháng nguyên trước hết phải là một chất lạ đối với cơ thể vì bình thường cơ thể không đáp ứng bảo vệ với một chất của bản thân.
Ovalbumin là một protein có trong lòng trắng trứng, do đó đối với các cơ thể động vật nó là một protein lạ (chất lạ).