MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, chất hoạt hóa bề mặt (CHHBM) là một trong số các sản phẩm quan trọng của ngành công nghiệp hóa học. Hàng năm, trên toàn thế giới, sản xuất trung bình khoảng 10 triệu tấn và lợi nhuận thương mại của chúng ước tính đạt 9,4 tỉđô la Mỹ. Chất hoạt hóa bề mặt hóa học (CHHBMHH) đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của sản xuất và cuộc sống. Tuy nhiên, CHHBMHH lại không tự phân hủy được và có thể là nguy cơ gây ô nhiễm môi trường.
Do đó, cần có những nghiên cứu để tìm ra các chất có thể thay thế CHHBMHH (Lại Thúy Hiền, 2010). Năm 1946, chất hoạt hóa bề mặt sinh học (CHHBMSH) đầu tiên được Beyer tách chiết từ chủng vi khuẩn Acinetobacter calcoacetic RAG – 1. Từ đó đến nay, CHHBMSH được tập trung nghiên cứu nhiều do chúng có ưu điểm không gây độc và khả năng tự phân hủy cao vì thế không gây ô nhiễm môi trường. Rhamnolipids (RL) là CHHBMSH được biết đến nhiều nhất.
RL có nhiều tính chất ưu việt như 1/ hoạt tính bề mặt 2/ khả năng nhũ hóa 3/ khả năng chịu nhiệt độ, pH, áp suất, độ muối và lực ion biến đổi rộng 4/ khả năng bị phân hủy sinh học 5/ độc tính thấp 6/ khả năng diệt vi sinh vật như Phythium, Fusarium solani, Gliocadoium virens, Chaetonium globoum và Penicillium funiculosum, Klebsiella pneumoniae, Entrobacteraerogenes, Bacillus subtilis, Micrococcusluteus.(Haba et al., 2002, Luiz et al. Các vi sinh vật có khả năng tổng hợp RL như Pseudomonas, Burkholdera, Arthrobacter, Rhodococcus, Acinetobacter.Trong số các vi sinh vật sinh tổng hợp RL thì Pseudomonas sp. được nghiên cứu nhiều nhất bởi khả năng tạo RL với hoạt tính bề mặt tương đối cao, dễ lên men và cho sản lượng cao hơn so với các vi sinh vật sinh khác. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân lập và tuyển chọn chủng Pseudomonas sp.
có khả năng sinh tổng hợp rhamnolipid.” Vũ Hương Linh1Lớp: CNSH-1103 MỤC TIÊU: - Tuyển chọn 1-2 chủng Pseudomonas sp. có khả năng sinh RL với sản lượng > 8g/l. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Thu thập các mẫu đất và nước nhiễm hydratcacbon cho phân lập các chủng Pseudomonas sp. - Phân lập chủng Pseudomonas sp.
từ các mẫu thu thập - Bảo quản các chủng Pseudomonas sp. phân lập - Xác định phương pháp định tính chủng Pseudomonas sp. sinh RL - Tuyển chọn các chủng Pseudomonas sp. có khả năng sinh tổng hợp RL - Xây dựng đường chuẩn rhamnose - Định lượng RL từ các chủng Pseudomonas sp.
tuyển chọn - Phân loại sơ bộ chủng Pseudomonas sp. tuyển chọn bằng quan sát đặc điểm hình thái và phân tích phản ứng sinh hóa bằng kit API 20N PHẦN I. TỔNG QUAN Vũ Hương Linh2Lớp: CNSH-1103 1.VÀI NÉT VỀ CHẤT HOẠT HÓA BỀ MẶT Trong những năm gần đây, chất hoạt hóa bề mặt (CHHBM) là một trong số các sản phẩm quan trọng của ngành công nghiệp hóa học. Hàng năm, trên toàn thế giới, sản xuất trung bình khoảng 10 triệu tấn và lợi nhuận thương mại ước tính đạt 9,4 tỉ đô la Mỹ.
Chất hoạt hóa bề mặt hóa học (CHHBMHH) đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của sản xuất và cuộc sống. Người ta ước tính, trong thời gian hơn 1 thập kỷ qua, nhu cầu về CHHBM đã tăng 300% trong ngành công nghiệp hóa chất Hoa Kỳ. Tuy nhiên, CHHBM được tổng hợp từ hóa học lại không tự phân hủy được và có thể là nguy cơ gây ô nhiễm môi trường. Do đó, cần có những nghiên cứu để tìm ra các chất có thể thay thế CHHBMHH (Lại Thúy Hiền, 2010).
Năm 1946, chất hoạt hóa bề mặt sinh học (CHHBMSH) đầu tiên được Beyer tách chiết từ chủng vi khuẩn Acinetobacter calcoacetic RAG-1. CHHBMSH là những hợp chất có cấu trúc đa dạng về hoạt tính bề mặt được tổng hợp bởi vi sinh vật. Tất cả CHHBMSH là hợp chất lưỡng cực, có cấu tạo gồm một nhóm ưa nước (thường là phân tử đường hoặc amino acid) và một nhóm kị nước (thường là acid béo). Do cấu tạo phân cực, CHHBMSH có xu hướng co cụm tại bề mặt và mặt phân cách giữa 2 chất (có thể là chất lỏng-chất lỏng, chất lỏng-chất rắn), kết quả là làm giảm sức căng bề mặt (giữa chất lỏng và không khí) và giảm sức căng giữa 2 chất (chất lỏng-chất lỏng và chất lỏng-chất rắn).
So với CHHBMHH thì CHHBMSH có nhiều ưu điểm hơn: 1/ có khả năng phân hủy sinh học; 2/ hầu như không có độc tính hoặc có độ độc thấp; 3/ có tính dung hợp sinh học và tiêu hóa được nên thường được dùng trong mỹ phẩm, dược phẩm hay thậm chí làm phụ gia thực phẩm; 4/ sản xuất có hiệu quả kinh tế (có thể được sản xuất từ phụ phẩm công, nông nghiệp); 5/ có tính đặc hiệu (các CHHBMSH ở dạng phức hợp chất hữu cơ với các nhóm chức đặc trưng nên thường có hoạt tính chuyên biệt); tính hiệu quả ở các điều kiện cực đoan về nhiệt độ, pH và muối. CHHBMSH thường được ứng dụng trong xử lý môi trường (diệt vi sinh vật gây bệnh và độc tố, phân hủy sinh học, giải độc, dùng trong xử lý ô nhiễm dầu. PHÂN LOẠI CHẤT HOẠT HÓA BỀ MẶT SINH HỌC Không giống như CHHBMHH thường phân loại theo bản chất các nhóm phân cực, CHHBMSH được phân loại dựa vào thành phần hóa học và nguồn gốc vi sinh Vũ Hương Linh3Lớp: CNSH-1103 vật tạo ra. Nhìn chung, CHHBMSH được chia thành hai loại: CHHBMSH có khối lượng phân tử thấp gồm các glycolipids (RL, SLs, MELs.
CHHBMSH khối lượng phân tử cao gồm các chất cao phân tử và các CHHBM dạng hạt (thực phẩm nhũ tương và biodispersan). Phần lớn CHHBMSH tích điện âm hoặc không tích điện, phần kỵ nước là các axit béo chuỗi dài hoặc các dẫn xuất của chúng và phần ưa nước có thể là cacbohydrate, amino axit, phosphate hoặc peptide dạng vòng. Phân loại CHHBMSH CHHBMSH VI SINH VẬT TẠO RA Glycolipids Rhamnolipids Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas fluorescens Pseudomonas putida Pseudomonas chlororaphis Trehalolipids Rhodococcus erthropolis Arthobacter sp. Sophorolipids Candida bombicola Candida apicola Manosylerithritol lipids Candida antartica Lipopeptid Surfactin/Iturin/Fengycin Bacillus subtilis Viscosin Pseudomonas viscosa Lichenysin Bacillus licheniformis Serrawettin Serratia marcescens Phospholipid Actinobacter sp.
Corynebacterium lepus CHHBMSH có hoạt tính kháng sinh Brevibacterium brevis Gramicidin Bacillus polymyxa Polymixin Myxococcus xanthus Vũ Hương Linh4Lớp: CNSH-1103 Antibiotic TA Axit béo Corynomicolic axit Corynebacterium insidibaseosum CHHBMSH trùng hợp Emulsan Acinetobacter calcoaceticus Alasan Acinetobacter radioreistens Liposan Candida lipolytica Lipomanan Candida tropicalis CHHBMSH dạng hạt Vesicles Acinetobacter calcoaceeticus Whole microbial cells Cyanobacteria 1. TỔNG QUAN VỀ RHAMNOLIPID (RL) 1. Cấu tạo RL Rhamnolipids (RL) là loại chất hoạt hóa bề mặt sinh học được biết đến nhiều nhất. RL có cấu trúc lưỡng cực với cực ưa nước và cực kỵ nước, nhờ đó làm tăng khả năng tiếp xúc và phân hủy hydrocacbon.
Trọng lượng phân tử của RL nằm trong khoảng 306-704 g/mol. RL thuộc nhóm glycolipids và có cấu tạo từ 1 hoặc 2 đơn vị axit béo kỵ nước β-hydoxydecanoic liên kết với 1 hoặc 2 đơn vị L-rhamnose bằng liên kết β-glycosidic hình thành các nhóm ưa nước. RL được cấu tạo bởi ba nguyên tố cacbon, nitơ, oxy. RL có hai loại chính là mono-rhamno-di-lipidic và di- rhamno-di-lipidic.
Cả hai loại này có chứa một hoặc hai đơn vị đường L-rhamnose và hai đơn vị axit β-hydroxydecanoic (RL1 và RL3). Mono-rhamno-di-lipidic và di- rhamno-di-lipidic có chứa một hoặc hai đơn vị đường L-rhamnose và một đơn vị axit β-hydroxydecanoic (RL2 và RL4) chỉ được tạo ra trong điều kiện nuôi cấy xác định (Milena et al. Vũ Hương Linh5Lớp: CNSH-1103 Hình 1. Cấu trúc của RL Ghi chú: RL1 mono-rhamno-di-lipid RL2 mono-rhamno-mono-lipid RL3 di-rhamno-di-lipid RL4 di-rhamno-mono-lipid 1.
Tính chất của RL RL có mùi xà phòng nhẹ. RL dạng bột có màu trắng, ở dạng dung dịch thì trong suốt, có màu ngà vàng và ổn định ở 100oC. Vì RL đa dạng về cấu trúc hóa học nên có nhiều tính chất như khả năng tạo nhũ hóa, giữ ẩm, tạo bọt, hoạt hóa bề mặt…(http://www. - Hoạt tính bề mặt: RL có thể làm giảm sức căng bề mặt của nước và sức căng bề mặt giữa nước và hexadecane.aeruginosa làm giảm sức căng bề mặt của nước xuống 26 mN/m và sức căng bề mặt của nước với hexadecane xuống dưới Vũ Hương Linh6Lớp: CNSH-1103 1mN/m.
RL có nồng độ mixen tối thiểu thấp hơn từ 10 đến 40 lần so với CHHBMHH (Lại Thúy Hiền, 2010). - Khả năng nhũ hóa: RL có thể làm ổn định hoặc làm mất ổn định dạng nhũ hóa. RL cao phân tử có khả năng nhũ hóa tốt hơn RL có khối lượng phân tử thấp. RL cao phân tử có nhiều lợi thế hơn bởi chúng bao phủ các giọt dầu, do đó hình thành dạng nhũ hóa ổn định.
Tính chất này đặc biệt hữu hiệu trong việc tạo dạng nhũ hóa giữa dầu và nước trong các ngành mỹ phẩm, thực phẩm và nông nghiệp. - Khả năng chịu nhiệt độ, pH, áp suất, độ muối và lực ion biến đổi rộng: hoạt tính bề mặt của RL không bị ảnh hưởng bởi các điều kiện môi trường như nhiệt độ và pH. Đây cũng là tính chất quan trọng để ứng dụng RL trong sản xuất nông nghiệp, khi ở các điều kiện môi trường và khí hậu có nhiều thay đổi mà không làm thay đổi hoạt tính của RL. - Khả năng bị phân hủy sinh học: không giống với CHĐBMHH, RL có thể phân hủy dễ dàng trong môi trường đất, nước và đặc biệt thích hợp với các ứng dụng liên quan đến môi trường như phục hồi sinh học.
- Độc tính thấp: các CHHBMSH nói chung và RL nói riêng hầu như không độc. Vì vậy rất nhiều công ty trên thế giới đã ứng dụng CHHBMSH trong công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm, nông nghiệp (thuốc kháng sinh, thuốc diệt nấm. - Ngoài các đặc tính nêu trên, RL còn có khả năng diệt vi sinh vật. Chúng ức chế tác nhân gây bệnh sinh bào tử động như Phythium và các loài Phytophthora.
RL cũng có hoạt tính ức chế sự phát triển của một số loài nấm khác như Fussarium solani, Gliocadoium virens, Chaetonium globoum và Penicillium funiculosum. Bên cạnh đó, khả năng kháng một số loài vi khuẩn gram âm và gram dương của RL cũng đã được ghi nhận, trong đó Klebsiella pneumoniae, Entrobacteraerogenes, Bacillus subtilis và Micrococcusluteus được xem là những chủng nhạy cảm nhất với RL (Haba et al., 2002, Luiz et al.Nguồn thu nhận RL RL là sản phẩm thứ cấp chủ yếu được sinh ra từ quá trình phân hủy carbobhydrate của một số loài thuộc chi Pseudomonas sp. (Benincasa et al., 2002; Amhad et al., 2011; Andreas et al., 2011; Mohammed et al., 2012; Seema et al., Vũ Hương Linh7Lớp: CNSH-1103 2012). Các chủng này được phân lập từ nước thải dầu mỏ, các mẫu nước và trầm tích biển, đất rừng ngập mặn, mẫu đất nhiễm xăng.Các loài vi sinh vật khác nhau sản xuất lượng RL khác nhau.