MỞ ĐẦU Trong vài thập niên trở lại đây, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật trong các lĩnh vực cũng như sự thay đổi về lối sống và nhu cầu của người tiêu dùng đã làm gia tăng việc sử dụng chất hoạt động bề mặt (CHĐBM). Hàng năm, trên toàn thế giới, sản xuất CHĐBM đạt trung bình 10 triệu tấn và lợi nhuận ước tính khoảng 9,4 tỷ đô la Mỹ. Hiện nay ở Việt Nam, đểđáp ứng nhu cầucủa người tiêu dùng, nhiều công ty sản xuất CHĐBM đã được thành lập như: công ty TICO, công ty NETCO… Thống kê của ngành công nghiệp cho thấy, việc sử dụng CHĐBM của nước ta hàng năm chiếm khoảng 0,5 triệu tấn mà chủ yếu là CHĐBM được tổng hợp từ hóa học. Tuy nhiên, CHĐBM được tổng hợp từ hóa học không tự phân hủy được và có thể gây ô nhiễm môi trường, làm ảnh hưởng đến sức khỏe của con người.
Do đó, cần có những nghiên cứu để tìm ra các chất có thể thay thế CHĐBMHH để giảm nguy cơ ô nhiễm môi trường, bảo vệ sức khỏe con người. Việc nghiên cứu tạo ra CHĐBM có nguồn gốc tự nhiên hay còn gọi là chất hoạt động bề mặt sinh học (CHĐBMSH) với các đặc tính ưu việt như: không độc, có khả năng phân hủy cao, có thể duy trì hoạt tính khi thay đổi nhiệt độ, pH, nồng độ NaCl, Ca2+, Mg2+ trong các điều kiện khắc nghiệt, có thể sản xuất trên các nguồn phế thải công nghiệp ở quy mô lớn…CHĐBMSH đã và đang được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới. Các CHĐBMSH có thể được thu nhận từ các loài thực vật, động vật và vi sinh vật. Tuy nhiên, các CHĐBMSH có nguồn gốc từ động, thực vật thường không ổn định dưới tác dụng của ánh sáng, nhiệt độ và các điều kiện khắc nghiệt từ môi trường.
Chất HĐBMSH từ vi sinh vật với những đặc tính ưu việt đã khắc phục được những nhược điểm này. Năm 1946, CHĐBMSH đầu tiên được Beyer tách chiết từ chủng vi khuẩn Acinetobacter calcoacetic RAG-1. Từ đó đến nay trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu và ứng dụng CHĐBMSH trong nhiều lĩnh vực sản xuất và đời sống. Một trong những CHĐBMSH được biết đến nhiều nhất là Rhamnolipid (RL).
RL có nhiều tính chất ưu việt như : hoạt tính bề mặt; khả năng nhũ hóa; khả năng chịu nhiệt độ, pH, áp suất, độ muối và lực ion biến đổi rộng; khả năng bị phân hủy sinh học; độc tính thấp; khả năng diệt một số Nguyễn Thị Thảo 1Lớp:CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội loài vi sinh vật như: Phythium, Fusarium solani, Gliocadoium virens, Chaetonium globoum và Penicillium funiculosum, Klebsiella pneumoniae, Entrobacteraerogenes, Bacillus subtilis, Micrococcusluteus.(Haba et al., 2002, Luiz et al. RL thường được tổng hợp từ một số loài vi sinh vật như Pseudomonas,Burkholdera, Arthrobacter, Rhodococcus, Acinetobacter.Trong đó,Pseudomonas sp. được nghiên cứu nhiều nhất bởi khả năng tạo RL với hoạt tính bề mặt tương đối cao, dễ lên men và cho sản lượng cao hơn so với các vi sinh vật khác. Trong lên men sản xuất RL, bên cạnh chủng giống vi sinh vật thì các yếu tố về thành phần môi trường nuôi cấy (nguồn carbon, nguồn nitơ) cũng như một số yếu tố vật lý (nhiệt độ, thời gian, tốc độ lắc, tỷ lệ tiếp giống…) có ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của vi sinh vật và sinh tổng hợp RL.
Do đó, việc nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố này đến quá trình sinh tổng hợp RL là việc làm rất cần thiết. Ở Việt Nam, việc sản xuất và ứng dụng CHĐBMSH là lĩnh vực khá mới mẻ chưa có nhiều công trình nghiên cứu về vấn đề này. Đặc biệt chưa có công trình nghiên cứu về sản xuất RL từ P. Nắm bắt được tình hình đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp Rhamnolipid từ vi khuẩn Pseudomonas fluorescens HS5.” Nguyễn Thị Thảo 2Lớp:CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội MỤC TIÊU Xác định được các yếu tố ảnh hưởng đếnquá trình lên men sinh tổng hợp RL từ vi khuẩn P.
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Nghiên cứu ảnh hưởng của các môi trường lên men đến khả năng sinh tổng hợp RL. - Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn carbon đến khả năng sinh tổng hợp RL. - Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ carbon đến khả năng sinh tổng hợp RL. - Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp RL.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp RL. - Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến khả năng sinh tổng hợp RL. - Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống đến khả năng sinh tổng hợp RL. - Nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng sinh tổng hợp RL.
- Nghiên cứu động học quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp RL. Nguyễn Thị Thảo 3Lớp:CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội PHẦN I: TỔNG QUAN 1. Vài nét về chất hoạt động bề mặt. Trong những năm gần đây, chất hoạt động bề mặt (CHĐBM) là một trong số các sản phẩm quan trọng của ngành công nghiệp hóa học.
Hàng năm, trên toàn thế giới sản xuất CHĐBM trung bình khoảng 10 triệu tấn và lợi nhuận thương mại ước tính đạt 9,4 tỉ đô la Mỹ. Chất hoạt động bề mặt hóa học (CHĐBMHH) đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của sản xuất và trong cuộc sống. Người ta ước tính, trong thời gian hơn 1 thập kỷ qua, nhu cầu về CHĐBM đã tăng 300% trong ngành công nghiệp hóa chất Hoa Kỳ. Tuy nhiên, CHĐBM được tổng hợp từ hóa học lại không tự phân hủy được và có thể là nguy cơ gây ô nhiễm môi trường.
Do đó, cần có những nghiên cứu để tìm ra các chất có thể thay thế CHĐBMHH (Lại Thúy Hiền, 2010). Năm 1946, chất hoạt động bề mặt sinh học (CHĐBMSH) đầu tiên được Beyer tách chiết từ chủng vi khuẩn Acinetobacter calcoacetic RAG-1. CHĐBMSH là những hợp chất có cấu trúc đa dạng về hoạt tính bề mặt được tổng hợp bởi vi sinh vật. Tất cả CHĐBMSH là hợp chất lưỡng cực, có cấu tạo gồm một nhóm ưa nước (thường là phân tử đường hoặc amino acid) và một nhóm kị nước (thường là acid béo).
Do cấu tạo phân cực, CHĐBMSH có xu hướng co cụm tại bề mặt và mặt phân cách giữa 2 chất (có thể là chất lỏng-chất lỏng, chất lỏng-chất rắn), kết quả là làm giảm sức căng bề mặt (giữa chất lỏng và không khí) và giảm sức căng giữa 2 chất (chất lỏng-chất lỏng và chất lỏng-chất rắn). So với CHĐBMHH thì CHĐBMSH có nhiều ưu điểm hơn: - Có khả năng phân hủy sinh học. - Hầu như không có độc tính hoặc có độ độc tính thấp. - Có tính dung hợp sinh học và tiêu hóa được nên thường được dùng trong mỹ phẩm, dược phẩm hay thậm chí làm phụ gia thực phẩm.
- Sản xuất có hiệu quả kinh tế (có thể được sản xuất từ phụ phẩm công, nông nghiệp). - Có tính đặc hiệu (các CHĐBMSH ở dạng phức hợp chất hữu cơ với các nhóm chức đặc trưng nên thường có hoạt tính chuyên biệt). - Tính hiệu quả ở các điều kiện cực đoan về nhiệt độ, pH và muối. Nguyễn Thị Thảo 4Lớp:CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội CHĐBMSH thường được ứng dụng trong xử lý môi trường (diệt vi sinh vật gây bệnh và độc tố, phân hủy sinh học, giải độc, dùng trong xử lý ô nhiễm dầu…) ( Lại Thúy Hiền, 2010).
Phân loại chất hoạt động bề mặt. Không giống như CHĐBMHH thường phân loại theo bản chất các nhóm phân cực, CHĐBMSH được phân loại dựa vào thành phần hóa học và nguồn gốc vi sinh vật tạo ra. Nhìn chung, CHĐBMSH được chia thành 2 loại: CHĐBMSH có khối lượng phân tử thấp gồm các glycolipids (RL, SLs, MELs…), lipopeptid, photpholipid. CHĐBMSH khối lượng phân tử cao gồm các chất cao phân tử và CHĐBM dạng hạt (thực phẩm nhũ tương và biodispersan).
Phần lớn CHĐBMSH tích điện âm hoặc không tích điện, phần kị nước là các acid béo chuỗi dài hoặc các dẫn xuất của chúng và phần ưa nước có thể là cacbohydrate, amino acid, photphate hoặc peptide dạng vòng. Nguyễn Thị Thảo 5Lớp:CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Bảng 1. Phân loại CHĐBMSH CHĐBMSH VI SINH VẬT TẠO RA Glycolipids Rhamnolipids Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas fluorescens Pseudomonas putida Pseudomonas chlororaphis Trehalolipids Rhodococus erthropolis Arthobacter sp. Sophorolipids Candida bombicola Candida apicola Manosylerithritol lipids Candida antartica Lipopeptide Surfactin/Iturin/Fengycin Bacillus subtilis Viscosin Pseudomonas viscosa Lichennysin Bacillus licheniformis Serrawettin Serratia marcescens Phospholipid Actinobacter sp.
Corynebacterium lepus CHĐBMSH có hoạt tính kháng sinh Gramicidin Bervibacterium brevis Polymixin Bacillus polymixa Antibiotic TA Myxococcus xanthus Acid béo Corynomicolic acid Corynebacterium insidibasseosum CHĐBMSH trùng hợp Emulsan Acinetobacter calcoaceticus Alasan Acinetobacter radioresistens Liposan Candida lipolytica Lipomanan Candida tropicalis CHĐBMSH dạng hạt Vesicles Acinetobacter calcoaceticus Whole microbial cells Cyanobacteria Nguyễn Thị Thảo 6Lớp:CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 1. Tổng quan về Rhamnolipid. Rhamnolipid (RL) là chất hoạt động bề mặt sinh học được biết đến nhiều nhất. RL có cấu trúc lưỡng cực với cực ưa nước và cực kị nước, nhờ đó làm tăng khả năng tiếp xúc và phân hủy hydrocacbon.
Trọng lượng phân tử của RL nằm trong khoảng 306-704 g/mol. RL thuộc nhóm glycolipids và có cấu tạo từ 1 hoặc 2 đơn vị acid béo kị nước β-hydroxydecanoic liên kết với 1 hoặc 2 đơn vị L-rhamnose bằng liên kết β-glycosidic hình thành các nhóm ưa nước. RL được cấu tạo bởi 3 nguyên tố carbon, nitơ và oxy. RL có 2 loại chính là mono-rhamno-di-lipidic và di-rhamno- di-lipidic.
Cả hai loại này có chứa một hoặc hai đơn vị đường L-rhamnose và hai đơn vị acid β-hydroxydecanoic (RL1 và RL3). Mono-rhamno-di-lipidic và di- rhamno-di-lipidic có chứa một hoặc hai đơn vị đường L-rhamnose và một đơn vị acid β-hydroxydecanoic (RL2 và RL4) chỉ được tạo ra trong điều kiện nuôi cấy xác định (Milena et al., 2012) Nguyễn Thị Thảo 7Lớp:CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Hình 1. Cấu trúc của RL Ghi chú: RL1 mono-rhamno-di-lipid RL2 mono-rhamno-mono-lipid RL3 di-rhamno-di-lipid RL4 di-rhamno-mono-lipid Nguyễn Thị Thảo 8Lớp:CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 1. RL có mùi xà phòng nhẹ.
RL dạng bột có màu trắng, ở dạng dung dịch thì trong suốt, có màu ngà vàng và ổn định ở 100oC. Vì RL đa dạng về cấu trúc hóa học nên có nhiều tính chất như khả năng tạo nhũ hóa, giữ ẩm, tạo bọt, hoạt hóa bề mặt…. - Hoạt tính bề mặt: RL có thể làm giảm sức căng bề mặt của nước và sức căng bề mặt giữa nước và hexadecane.aeruginose làm giảm sức căng bề mặt của nước xuống 26mN/m và sức căng bề mặt của nước với hexadecane xuống dưới 1mN/m. RL có nồng độ mixen tối thiểu thấp hơn từ 10 đến 40 lần so với CHĐBMHH (Lại Thúy Hiền, 2010).