Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp rhamnolipid từ vi khuẩn pseudomonas fluorescens hs5

Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp rhamnolipid từ vi khuẩn Pseudomonas fluorescens HS5, góp phần phát triển ứng dụng sinh học.

• Tác giả: Nguyễn Thị Thảo
• Người hướng dẫn: ThS. Nguyễn Thị Thu Huyền
• Trường học: Viện Đại học Mở Hà Nội
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố đến sinh tổng hợp rhamnolipid từ Pseudomonas fluorescens
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
• MỞ ĐẦU
• 1. PHẦN I: TỔNG QUAN
• 1.1. Vài nét về chất hoạt động bề mặt
• 1.2. Phân loại chất hoạt động bề mặt
• 1.3. Tổng quan về Rhamnolipid
• 1.4. Nguồn thu nhận
• 1.5. Cơ chế sinh tổng hợp
• 1.6. Tổng quan về vi khuẩn Pseudomonas fluorescens
• 1.6.1. Đặc điểm hình thái
• 1.6.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
• 1.7. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp rhamnolipids từ vi khuẩn Pseudomonas sp.
• 1.7.1. Chủng giống vi sinh vật
• 1.7.2. Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men đến khả năng sinh tổng hợp RL
• 1.7.3. Các thông số vật lý cho sinh tổng hợp RL
• 2. PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Môi trường
• 2.2. Thiết bị và dụng cụ
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4. Lên men sinh tổng hợp RL
• 2.5. Thu nhận RL
• 2.6. Định lượng RL
• 2.7. Ảnh hưởng của môi trường lên men đến khả năng sinh tổng hợp RL
• 2.8. Ảnh hưởng của nguồn Carbon
• 2.9. Ảnh hưởng của nguồn Nitơ
• 2.10. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến sinh tổng hợp RL
• 2.11. Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến sinh tổng hợp RL
• 2.12. Nghiên cứu tỷ lệ tiếp giống ban đầu thích hợp cho sinh tổng hợp RL
• 2.13. Nghiên cứu động học quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp RL
• 3. PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Ảnh hưởng của môi trường lên men đến khả năng sinh tổng hợp RL từ chủng P.
• 3.2. Ảnh hưởng của nguồn Carbon đến sinh tổng hợp RL
• 3.3. Ảnh hưởng của nguồn Nitơ đến sinh tổng hợp RL
• 3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến sinh tổng hợp RL
• 3.5. Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng sinh tổng hợp RL
• 3.6. Nghiên cứu tỷ lệ tiếp giống ban đầu thích hợp cho sinh tổng hợp RL
• 3.7. Nghiên cứu động học quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp RL
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu sinh tổng hợp rhamnolipid từ Pseudomonas fluorescens

Nghiên cứu về sinh tổng hợp rhamnolipid từ Pseudomonas fluorescens đang thu hút sự chú ý lớn trong lĩnh vực công nghệ sinh học. Rhamnolipid là một loại chất hoạt động bề mặt sinh học có nhiều ứng dụng trong công nghiệp và môi trường. Việc hiểu rõ về quá trình sinh tổng hợp này không chỉ giúp tối ưu hóa sản xuất mà còn mở ra nhiều cơ hội ứng dụng trong thực tiễn.

1.1. Đặc điểm của Pseudomonas fluorescens và rhamnolipid

Pseudomonas fluorescens là một vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp rhamnolipid. Rhamnolipid có cấu trúc lưỡng cực, giúp tăng cường khả năng phân hủy hydrocacbon và có tính chất sinh học cao.

1.2. Tầm quan trọng của rhamnolipid trong công nghiệp

Rhamnolipid được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực như xử lý môi trường, nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm nhờ vào tính chất sinh học và khả năng phân hủy cao.

II. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp rhamnolipid từ Pseudomonas fluorescens

Nghiên cứu cho thấy nhiều yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp rhamnolipid từ Pseudomonas fluorescens. Các yếu tố này bao gồm thành phần môi trường nuôi cấy, điều kiện vật lý và hóa học. Việc tối ưu hóa các yếu tố này là cần thiết để nâng cao hiệu suất sản xuất.

2.1. Ảnh hưởng của nguồn carbon đến sinh tổng hợp

Nguồn carbon là yếu tố quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp rhamnolipid. Các nghiên cứu cho thấy rằng việc lựa chọn nguồn carbon phù hợp có thể tăng cường đáng kể khả năng sinh sản phẩm này.

2.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến quá trình sinh tổng hợp

Nguồn nitơ cũng đóng vai trò quan trọng trong việc phát triển vi khuẩn và sinh tổng hợp rhamnolipid. Việc tối ưu hóa nồng độ nitơ có thể cải thiện hiệu suất sản xuất.

2.3. Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến sinh tổng hợp

pH và nhiệt độ là hai yếu tố vật lý có ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh tổng hợp rhamnolipid. Các điều kiện tối ưu sẽ giúp vi khuẩn phát triển tốt hơn và tăng cường sản lượng.

III. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng đến sinh tổng hợp rhamnolipid

Để nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố đến sinh tổng hợp rhamnolipid, các phương pháp thí nghiệm được áp dụng bao gồm lên men trong điều kiện kiểm soát và phân tích sản phẩm. Các phương pháp này giúp xác định được điều kiện tối ưu cho quá trình sản xuất.

3.1. Thiết lập môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy được thiết lập với các thành phần dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của Pseudomonas fluorescens, bao gồm nguồn carbon và nitơ.

3.2. Phân tích sản phẩm rhamnolipid

Sản phẩm rhamnolipid được thu nhận và phân tích bằng các phương pháp hóa lý để xác định nồng độ và tính chất của sản phẩm.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn của rhamnolipid

Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng việc tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp rhamnolipid từ Pseudomonas fluorescens có thể nâng cao hiệu suất sản xuất. Rhamnolipid có nhiều ứng dụng trong xử lý ô nhiễm và nông nghiệp, mở ra hướng đi mới cho ngành công nghiệp sinh học.

4.1. Ứng dụng trong xử lý môi trường

Rhamnolipid có khả năng phân hủy các chất ô nhiễm, giúp cải thiện chất lượng môi trường. Việc ứng dụng rhamnolipid trong xử lý ô nhiễm dầu đã cho thấy hiệu quả cao.

4.2. Ứng dụng trong nông nghiệp

Rhamnolipid có thể được sử dụng như một chất bảo vệ thực vật tự nhiên, giúp tăng cường sức đề kháng cho cây trồng và cải thiện năng suất.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu rhamnolipid

Nghiên cứu về sinh tổng hợp rhamnolipid từ Pseudomonas fluorescens mở ra nhiều cơ hội mới trong lĩnh vực công nghệ sinh học. Việc tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng sẽ giúp nâng cao hiệu suất sản xuất và ứng dụng rhamnolipid trong thực tiễn.

5.1. Tương lai của nghiên cứu rhamnolipid

Nghiên cứu sẽ tiếp tục mở rộng để tìm hiểu thêm về các yếu tố ảnh hưởng khác và phát triển các phương pháp sản xuất hiệu quả hơn.

5.2. Ứng dụng rhamnolipid trong công nghiệp

Rhamnolipid có tiềm năng lớn trong nhiều lĩnh vực công nghiệp, từ xử lý môi trường đến sản xuất thực phẩm và dược phẩm.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Chất hoạt động bề mặt (CHĐBM) là một trong những sản phẩm quan trọng của ngành công nghiệp hóa chất toàn cầu, với sản lượng sản xuất trung bình hàng năm đạt khoảng 10 triệu tấn và giá trị thương mại ước tính khoảng 9,4 tỷ USD. Tại Việt Nam, nhu cầu tiêu thụ CHĐBM hàng năm đạt khoảng 0,5 triệu tấn, chủ yếu được cung cấp bởi các doanh nghiệp như Công ty TICO, Công ty NETCO. Tuy nhiên, phần lớn các sản phẩm đang lưu hành là chất hoạt động bề mặt tổng hợp hóa học (CHĐBMHH), có đặc tính khó tự phân hủy sinh học, tiềm ẩn nguy cơ tích tụ độc hại và gây ô nhiễm môi trường sống cũng như sức khỏe con người.

Trước yêu cầu giảm thiểu tác động tiêu cực đến môi trường, chất hoạt động bề mặt sinh học (CHĐBMSH) nhận được sự chú ý nghiên cứu nhờ các ưu điểm: khả năng phân hủy sinh học tự nhiên, độc tính thấp, tính dung hợp sinh học cao và duy trì hoạt tính ổn định trong các điều kiện khắc nghiệt về nhiệt độ, pH và nồng độ muối. Trong các nhóm CHĐBMSH, Rhamnolipid (RL) là hợp chất thuộc nhóm glycolipid sở hữu hoạt tính bề mặt và khả năng nhũ hóa nổi bật, đồng thời có hoạt tính ức chế chọn lọc đối với một số loài vi sinh vật gây bệnh như Phythium, Fusarium solani, Bacillus subtilis.

Mặc dù Pseudomonas aeruginosa là loài vi khuẩn được nghiên cứu phổ biến nhất về khả năng sinh tổng hợp RL, loài này lại là vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên người và động vật, gây nhiều rào cản an toàn sinh học khi sản xuất ở quy mô lớn. Do đó, xu hướng nghiên cứu quốc tế đang chuyển dịch sang việc khảo sát các loài Pseudomonas không gây bệnh hoặc có độc tính thấp như Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas chlororaphis, Pseudomonas putida. Tại Việt Nam, vào thời điểm tác giả thực hiện khóa luận (năm 2015), nghiên cứu sản xuất RL từ vi sinh vật còn khá mới mẻ và chưa có công trình nào công bố về việc tạo RL từ chủng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens. Từ thực tiễn đó, đề tài "Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp Rhamnolipid từ vi khuẩn Pseudomonas fluorescens HS5" đã được tiến hành.

Mục tiêu tổng quát của khóa luận là: Xác định được các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men sinh tổng hợp RL từ vi khuẩn Pseudomonas fluorescens HS5.

Để đạt được mục tiêu này, tác giả đã triển khai 9 nội dung và nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:

1. Nghiên cứu ảnh hưởng của các môi trường lên men đến khả năng sinh tổng hợp RL.
2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn carbon đến khả năng sinh tổng hợp RL.
3. Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ carbon đến khả năng sinh tổng hợp RL.
4. Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp RL.
5. Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp RL.
6. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến khả năng sinh tổng hợp RL.
7. Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống đến khả năng sinh tổng hợp RL.
8. Nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng sinh tổng hợp RL.
9. Nghiên cứu động học quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp RL.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Chủng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens HS5 phân lập từ mẫu đất nhiễm xăng, có khả năng sinh tổng hợp RL ban đầu ghi nhận ở mức 8,4 g/l, do Bộ môn Nghiên cứu Công nghệ sinh học cung cấp.
• Phạm vi nghiên cứu: Thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm tại Bộ môn Nghiên cứu Công nghệ sinh học sau thu hoạch - Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch, hoàn thành vào tháng 05/2015.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết của nghiên cứu dựa trên các cấu trúc hóa học của glycolipid và sinh lý học vi sinh vật:

• Khái niệm và cấu trúc Rhamnolipid: RL có trọng lượng phân tử dao động từ 306 đến 704 g/mol, cấu tạo từ 1 hoặc 2 phân tử acid béo kỵ nước $\beta$-hydroxydecanoic liên kết với 1 hoặc 2 phân tử đường ưa nước L-rhamnose qua liên kết $\beta$-glycosidic. Hợp chất tồn tại ở 4 dạng cấu trúc chính: mono-rhamno-di-lipidic (RL1), mono-rhamno-mono-lipidic (RL2), di-rhamno-di-lipidic (RL3), và di-rhamno-mono-lipidic (RL4).
• Con đường sinh tổng hợp RL: Rhamnose được chuyển hóa từ glucose-6-phosphate qua 5 bước liên tiếp; phân tử acid béo $\beta$-hydroxy được tạo thành từ acetyl-CoA. Phản ứng sinh tổng hợp được kiểm soát bởi cụm gen chức năng: gen rhlA và rhlB mã hóa cho enzyme Rhamnosyltransferase I xúc tác tạo mono-rhamnolipid từ dimer HAA (3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoate) và dTDP-L-rhamnose; enzyme Rhamnosyltransferase II (được mã hóa bởi gen rhlC) xúc tác gắn thêm một phân tử rhamnose thứ hai để hình thành di-rhamnolipid.
• Đặc điểm vi khuẩn Pseudomonas fluorescens: Là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí, phát huỳnh quang màu xanh, kích thước 0,5 - 1 $\times$ 1,5 - 5 $\mu$m, di động bằng một hoặc nhiều roi, không sinh bào tử. Vi khuẩn sinh trưởng tối ưu ở nhiệt độ 25 - 30°C, pH 7,2, có hoạt tính amylase và protease, bị ức chế hoàn toàn ở nồng độ muối từ 5 - 6% hoặc môi trường có pH dưới 5,5.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được xây dựng đồng bộ:

• Môi trường nuôi cấy và thử nghiệm: Các môi trường dinh dưỡng được sử dụng gồm NA, NB, MSM5, MSM7ct, LB, KB, PPAS. Thành phần môi trường khoáng tối ưu MSM7ct (g/l) gồm: glycerol 20; $(NH_4)_2SO_4$ 4; $KH_2PO_4$ 0,7; $Na_2HPO_4$ 2; $CaCl_2$ vết; khử trùng ở 121°C trong 30 phút.
• Phương pháp tách chiết thu nhận RL: Áp dụng phương pháp của Miriam và cộng sự (2013) có cải tiến. Sau khi lên men, dịch nuôi cấy được ly tâm ở tốc độ 9000 vòng/phút trong 15 phút để loại bỏ sinh khối tế bào. Dịch nổi được chỉnh về pH 2 bằng dung dịch $HCl$ 1M và ủ ở 4°C qua đêm nhằm kết tủa hoàn toàn RL. Tiếp tục ly tâm 9000 vòng/phút trong 15 phút thu cặn, hòa tan cặn trong 5 ml nước khử ion và chiết lỏng - lỏng 2 lần với hỗn hợp dung môi chloroform : methanol theo tỷ lệ thể tích 2:1. Pha hữu cơ được thu nhận và cho bay hơi dung môi trên máy cất quay chân không, cặn khô hòa tan trong 5 ml methanol để định lượng.
• Phương pháp định lượng RL: Áp dụng phương pháp so màu phenol - acid sulphuric theo Aylin và cộng sự (2013). Hàm lượng rhamnose tạo phức màu vàng cam với phenol và $H_2SO_4$ đậm đặc được đo mật độ quang tại bước sóng $\lambda = 490$ nm ($OD_{490nm}$). Hàm lượng RL được tính gián tiếp thông qua phương trình: Hàm lượng RL (g/l) = Hàm lượng rhamnose $\times$ 3. Đường chuẩn rhamnose xây dựng trong dải nồng độ 10 - 50 $\mu$g/ml đạt độ tin cậy tuyến tính cao: $y = 0,028x - 0,019$ với hệ số tương quan $R^2 > 99%$.
• Phương pháp xác định mật độ tế bào: Mật độ tế bào vi khuẩn được đo quang phổ tại bước sóng 600 nm ($OD_{600nm}$).

Nội dung chính theo từng chương

Phần I: Tổng quan

Phần tổng quan hệ thống hóa các tư liệu lý thuyết và thực tiễn về chất hoạt động bề mặt sinh học trên thế giới và trong nước. Tác giả phân loại CHĐBMSH thành các nhóm cấu trúc chính: glycolipid (gồm rhamnolipid, trehalolipid, sophorolipid, mannosylerithritol lipid), lipopeptide (surfactin, iturin, fengycin, viscosin), phospholipid, acid béo, hợp chất cao phân tử (emulsan, alasan, liposan) và dạng hạt tế bào vi sinh vật.

Chương này trình bày chi tiết các đặc tính kỹ thuật của rhamnolipid:

• Khả năng làm giảm sức căng bề mặt của nước xuống mức 26 mN/m và sức căng giữa nước - hexadecane xuống dưới 1 mN/m; nồng độ mixen tối thiểu thấp hơn từ 10 đến 40 lần so với CHĐBMHH.
• Khả năng ức chế vi sinh vật gây hại: Hoạt tính kháng nấm gây bệnh thực vật đạt giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đối với Penicillium funiculosum là 16 $\mu$g/ml, Gliocadium virens là 32 $\mu$g/ml, Chaetonium globosum là 64 $\mu$g/ml, Fusarium solani là 75 $\mu$g/ml, Rhizoctonia solani là 109 $\mu$g/ml và Botrytis cinerea là 170 $\mu$g/ml.
• Các lĩnh vực ứng dụng của RL: Sử dụng trong nông nghiệp nhằm kiểm soát nấm bệnh hệ rễ cây trồng thủy canh; trong công nghiệp dầu mỏ để tăng hiệu quả thu hồi dầu mỏ từ trầm tích cát; trong xử lý môi trường nhằm phân tán sự cố tràn dầu và tạo phức tách chiết kim loại nặng từ đất ô nhiễm; trong công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm và y tế (hỗ trợ điều trị bỏng, vẩy nến, diệt khuẩn lao).

Bên cạnh đó, chương tổng quan thống kê các yếu tố kỹ thuật ảnh hưởng đến quá trình lên men từ các nghiên cứu quốc tế, bao gồm chủng giống sinh vật, các nguồn carbon hòa tan và không tan (dầu thực vật, glycerol, rỉ đường, nước thải chế biến dầu ô liu), các nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ, cùng các thông số vật lý như nhiệt độ (30 - 40°C), pH (6,5 - 7,2) và tốc độ khuấy đảo, sục khí (1 - 2 vvm).

Phần II: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Nội dung chương trình bày chi tiết xuất xứ chủng vi khuẩn, danh mục hóa chất, môi trường dinh dưỡng và thiết bị nghiên cứu. Chủng P. fluorescens HS5 có khả năng sinh tổng hợp RL ban đầu là 8,4 g/l được lưu giữ bằng 3 phương pháp: cấy truyền định kỳ trên thạch nghiêng KB ở 4°C (chu kỳ tối đa 3 tháng), bảo quản đông khô trong môi trường dịch sữa 20% ở nhiệt độ -80°C (sấy chân không độ ẩm đạt 1 - 6%), và bảo quản dịch giống trong glycerol ở -80°C.

Hệ thống thiết bị phục vụ nghiên cứu gồm có tủ nuôi lắc ổn nhiệt (Nhật Bản), máy đo pH (Hanna, Ý), tủ cấy vô trùng và tủ sấy (Labgard, Mỹ), cân điện tử (Ohaus, Thụy Sỹ), máy ly tâm (Hettich, Đức), máy cất quay chân không (Đức) và nồi hấp tiệt trùng (Sturdy, Trung Quốc).

Chương II mô tả chi tiết quy trình bố trí 7 nhóm thí nghiệm đơn yếu tố (mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần) nhằm khảo sát:

• Khả năng sinh RL trên 6 môi trường dinh dưỡng khác nhau (MSM5, MSM7, KB, LB, mNB, PPAS).
• Khả năng sử dụng 9 nguồn carbon (mannitol, fructose, maltose, lactose, glycerol, hexadecane, dầu đậu nành, dầu rán thải, rỉ đường) bổ sung ở nồng độ 2% và dải nồng độ glycerol từ 0,5% đến 3,0%.
• Ảnh hưởng của 8 nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ (ure, trypton, pepton, cao nấm men, $NaNO_3$, $(NH_4)_2SO_4$, $KNO_3$, $NH_4H_2PO_4$) ở nồng độ 0,2% và dải nồng độ $(NH_4)_2SO_4$ từ 0,1% đến 0,8%.
• Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men (10, 20, 25, 30, 35, 40°C).
• Ảnh hưởng của tốc độ lắc bình tam giác (100, 150, 200, 250 vòng/phút).
• Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống ban đầu (2, 4, 6, 8, 10% với mật độ khoảng $10^8$ CFU/ml).
• Động học sinh trưởng và sinh tổng hợp RL theo thời gian từ 0 đến 72 giờ (lấy mẫu định kỳ 6 giờ/lần để đo $OD_{600nm}$, pH và hàm lượng RL).

Phần III: Kết quả và thảo luận

Chương III phân tích các số liệu thu được qua từng bước thực nghiệm:

• Ảnh hưởng của môi trường lên men: Khả năng sinh tổng hợp RL của chủng P. fluorescens HS5 trên 6 môi trường dao động từ 1,4 g/l đến 11,5 g/l. Môi trường KB cho sản lượng thấp nhất (1,4 g/l), môi trường PPAS cho sản lượng cao nhất (11,5 g/l), tiếp đến là môi trường MSM7 đạt 11,2 g/l. Do môi trường PPAS chứa nhiều thành phần đắt tiền, tác giả đã chọn môi trường khoáng MSM7 cho các nghiên cứu tiếp theo để đảm bảo tính khả thi về kinh tế.
• Ảnh hưởng của nguồn carbon: Khảo sát 9 nguồn carbon cho thấy hàm lượng RL dao động từ 5,9 đến 14,2 g/l. Rỉ đường cho hàm lượng RL thấp nhất (5,9 g/l), trong khi glycerol cho hàm lượng cao nhất, đạt 14,2 g/l. Thí nghiệm xác định nồng độ glycerol bổ sung (từ 0,5% đến 3,0%) chỉ ra rằng ở nồng độ 0,5% và 1,0%, hàm lượng RL đạt lần lượt là 6,1 g/l và 10,7 g/l; sản lượng đạt cực đại 14,8 g/l ở nồng độ 2,0%. Khi tăng nồng độ lên 2,5% và 3,0%, hàm lượng RL không có sự khác biệt có ý nghĩa. Do đó, nồng độ glycerol 2,0% được chọn làm cơ chất thích hợp.
• Ảnh hưởng của nguồn nitơ: Hàm lượng RL tạo thành khi bổ sung các nguồn nitơ khác nhau dao động từ 8,4 đến 16,5 g/l. Nguồn nitơ hữu cơ trypton cho sản lượng thấp nhất (8,4 g/l), trong khi nguồn nitơ vô cơ $(NH_4)_2SO_4$ cho sản lượng cao nhất (16,5 g/l). Khảo sát nồng độ $(NH_4)_2SO_4$ từ 0,1% đến 0,8% cho thấy ở nồng độ 0,1% sản lượng đạt 13,7 g/l; nồng độ 0,4% cho sản lượng RL cao nhất đạt 16,8 g/l. Tác giả lựa chọn $(NH_4)_2SO_4$ 0,4% cho môi trường lên men.
• Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men: Nhiệt độ có tác động quyết định đến khả năng sinh RL của chủng HS5. Ở 10°C và 40°C, vi khuẩn không sinh tổng hợp RL. Ở 20°C, hàm lượng RL chỉ đạt 4,2 g/l. Khi tăng nhiệt độ, lượng RL tăng nhanh và đạt cực đại tại 30°C với 16,1 g/l; đến 35°C sản lượng giảm xuống còn 12,2 g/l. Nhiệt độ 30°C được chọn là nhiệt độ lên men tối ưu.
• Ảnh hưởng của tốc độ lắc: Khảo sát ở các mức 100, 150, 200 và 250 vòng/phút. Tốc độ lắc thích hợp cho chủng HS5 sinh tổng hợp RL là 150 - 200 vòng/phút, cho sản lượng RL tương ứng đạt 16,5 g/l và 16,2 g/l (ở 100 vòng/phút chỉ đạt 10,4 g/l và 250 vòng/phút đạt 13,8 g/l).
• Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống: Tỷ lệ tiếp giống dưới 8% cho sản lượng RL thấp (tỷ lệ 2% đạt 8,7 g/l; 4% đạt 10,2 g/l; 6% đạt 14,5 g/l). Tỷ lệ tiếp giống từ 8% đến 10% (mật độ $10^8$ CFU/ml) cho hàm lượng RL cao nhất và không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa hai mức này.
• Động học quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp RL: Quá trình sinh trưởng của tế bào vi khuẩn bắt đầu ngay sau 6 giờ nuôi cấy, nhưng sự tích lũy RL chỉ bắt đầu xuất hiện từ sau 12 giờ lên men. Pha sinh trưởng kéo dài từ 6 đến 36 giờ; tại thời điểm 36 giờ, mật độ tế bào đạt cực đại ($OD_{600nm} = 5,238$) và chuyển sang pha cân bằng. Trong 36 giờ đầu, RL tăng từ 0,6 g/l lên 8,5 g/l. RL tiếp tục được tích lũy mạnh trong suốt pha cân bằng và đạt giá trị cực đại 17,2 g/l ở thời điểm 66 giờ lên men. Sau 72 giờ, vi khuẩn bước vào pha suy vong với $OD_{600nm}$ giảm xuống 4,824. Trong suốt chu kỳ lên men, pH dịch nuôi cấy dao động ổn định trong khoảng từ 6,5 đến 7,2.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã xác lập bộ thông số công nghệ thích hợp cho quá trình lên men sinh tổng hợp rhamnolipid từ chủng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens HS5 trên quy mô bình tam giác:

Thông số công nghệ	Điều kiện tối ưu xác định
Môi trường lên men cơ bản	MSM7ct (khoáng tối thiểu)
Nguồn carbon bổ sung	Glycerol
Nồng độ carbon thích hợp	2,0% (v/v) (tương đương 20 g/l)
Nguồn nitơ bổ sung	$(NH_4)_2SO_4$
Nồng độ nitơ thích hợp	0,4% (w/v) (tương đương 4 g/l)
Nhiệt độ lên men	30°C
Tốc độ lắc	150 – 200 vòng/phút
Tỷ lệ tiếp giống ban đầu	8 – 10% (mật độ $10^8$ CFU/ml)
Thời gian lên men thu nhận cực đại	66 giờ

Các đóng góp chính của công trình:

• Về mặt số liệu thực nghiệm: Sau khi tối ưu các điều kiện dinh dưỡng và thông số vật lý, sản lượng rhamnolipid thu nhận từ P. fluorescens HS5 đạt mức cực đại 17,2 g/l tại thời điểm 66 giờ lên men, cao hơn 2,04 lần so với khả năng sinh tổng hợp ban đầu của chủng khi mới phân lập (8,4 g/l).
• Về mặt học thuật: Kết quả nghiên cứu chứng minh chủng Pseudomonas fluorescens HS5 có khả năng sinh tổng hợp rhamnolipid với sản lượng cao, vượt trội hơn so với nhiều chủng Pseudomonas aeruginosa tự nhiên được công bố trong các tài liệu tham khảo (như P. aeruginosa ATCC 9027 đạt 8,5 g/l; P. aeruginosa MTCC 424 đạt 5,7 g/l; P. aeruginosa LBl đạt 7,6 g/l).
• Về ý nghĩa thực tiễn: Khóa luận là công trình đầu tiên tại Việt Nam khảo sát có hệ thống các thông số công nghệ sinh tổng hợp RL trên đối tượng Pseudomonas fluorescens – một loài vi khuẩn an toàn sinh học cao hơn P. aeruginosa. Việc sử dụng cơ chất glycerol (nguồn phụ phẩm dồi dào từ quá trình sản xuất biodiesel) và muối vô cơ rẻ tiền $(NH_4)_2SO_4$ mở ra triển vọng giảm giá thành sản xuất chất hoạt động bề mặt sinh học tại Việt Nam.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận đã nêu rõ các điều kiện thực nghiệm và giới hạn nghiên cứu:

• Thí nghiệm mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm trên bình tam giác 500 ml chứa 150 ml dịch lên men, chưa tiến hành thử nghiệm mở rộng trên thiết bị lên men sinh học (fermentor/bioreactor) có hệ thống cấp khí sục liên tục và tự động điều khiển pH, pO2.
• Phương pháp khảo sát ảnh hưởng các yếu tố công nghệ là phương pháp đơn biến cổ điển (khảo sát từng yếu tố độc lập), chưa áp dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm và mô hình hóa bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology - RSM) để đánh giá các tương tác qua lại giữa các yếu tố.
• Chưa tiến hành phân tách và định lượng chi tiết tỷ lệ thành phần các dạng đồng phân mono-rhamnolipid và di-rhamnolipid thu được trong chế phẩm cuối cùng.

Hướng nghiên cứu tiếp theo bao gồm:

• Mở rộng quy mô nuôi cấy lên hệ thống bioreactor pilot nhằm đánh giá ảnh hưởng của tốc độ cấp khí (vvm) và kiểm soát oxy hòa tan.
• Nghiên cứu ứng dụng thử nghiệm dịch chiết RL thu được trong việc phòng trừ nấm bệnh nông nghiệp hoặc xử lý đất nhiễm dầu và kim loại nặng.

Giá trị tham khảo

Báo cáo khóa luận có giá trị tham khảo chuyên môn đối với sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các ngành:

• Công nghệ sinh học: Cung cấp tài liệu quy trình nuôi cấy, lên men thu nhận chất trao đổi bậc hai từ vi khuẩn chi Pseudomonas, phương pháp giữ giống vi khuẩn bằng đông khô và bảo quản lạnh sâu.
• Vi sinh vật học và Hóa sinh học: Cung cấp phương pháp chiết xuất lỏng - lỏng bằng hệ dung môi chloroform:methanol và phương pháp định lượng rhamnolipid bằng phản ứng tạo màu phenol - acid sulfuric thông qua đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng 490 nm kèm công thức dựng đường chuẩn chi tiết.
• Kỹ thuật môi trường và Nông nghiệp sinh thái: Cung cấp dẫn liệu về các đặc tính ức chế vi sinh vật gây hại, hoạt tính hoạt hóa bề mặt của rhamnolipid phục vụ định hướng nghiên cứu xử lý ô nhiễm tràn dầu và kiểm soát bệnh sinh học trên cây trồng.

Câu hỏi thường gặp

Chủng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens HS5 sử dụng trong nghiên cứu có xuất xứ từ đâu và khả năng sinh tổng hợp rhamnolipid ban đầu đạt bao nhiêu?
Chủng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens HS5 được phân lập từ mẫu đất nhiễm xăng, do Bộ môn Nghiên cứu Công nghệ sinh học thuộc Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch cung cấp. Trước khi thực hiện các thí nghiệm tối ưu thông số công nghệ, chủng này có khả năng sinh tổng hợp rhamnolipid ghi nhận ở mức 8,4 g/l.

Nguồn carbon và nguồn nitơ nào cho sản lượng rhamnolipid cao nhất và ở nồng độ bao nhiêu?
Trong số các cơ chất khảo sát, glycerol là nguồn carbon thích hợp nhất, cho hàm lượng RL đạt 14,8 g/l ở nồng độ tối ưu 2,0% (v/v). Đối với nguồn nitơ, muối vô cơ $(NH_4)_2SO_4$ cho sản lượng cao nhất, đạt 16,8 g/l ở nồng độ tối ưu 0,4% (w/v).

Các thông số vật lý (nhiệt độ, tốc độ lắc) tối ưu cho quá trình lên men chủng HS5 được xác định là bao nhiêu?
Nhiệt độ lên men tối ưu cho chủng P. fluorescens HS5 là 30°C (ở 10°C và 40°C chủng hoàn toàn không sinh RL). Tốc độ lắc thích hợp nhất trên máy lắc ổn nhiệt là 150 đến 200 vòng/phút, cho sản lượng RL đạt từ 16,2 đến 16,5 g/l.

Đặc điểm động học sinh trưởng của chủng HS5 và thời điểm thu hoạch RL cực đại diễn ra khi nào?
Vi khuẩn bắt đầu pha sinh trưởng sau 6 giờ nuôi cấy và chuyển sang pha cân bằng khi đạt mật độ tế bào cực đại ($OD_{600nm} = 5,238$) tại thời điểm 36 giờ. Rhamnolipid bắt đầu được sinh tổng hợp sau 12 giờ, tăng nhanh cùng sinh khối trong 36 giờ đầu và tiếp tục tích lũy mạnh trong suốt pha cân bằng, đạt sản lượng cực đại 17,2 g/l tại thời điểm 66 giờ lên men trước khi bước vào pha suy vong ở giờ thứ 72.

Phương pháp định lượng rhamnolipid được thực hiện theo nguyên tắc nào?
Hàm lượng rhamnolipid được xác định gián tiếp qua hàm lượng đường rhamnose bằng phương pháp so màu phenol - acid sulphuric (đo độ hấp thụ quang tại bước sóng 490 nm) theo phương trình đường chuẩn $y = 0,028x - 0,019$ ($R^2 > 99%$). Hàm lượng rhamnolipid sau đó được tính bằng công thức: lượng rhamnose xác định được nhân với hệ số 3.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Thị Thảo đã nghiên cứu có hệ thống và xác lập thành công các thông số dinh dưỡng cũng như điều kiện vật lý tối ưu cho quá trình lên men sinh tổng hợp rhamnolipid từ chủng vi khuẩn bản địa Pseudomonas fluorescens HS5 trên môi trường khoáng MSM7ct. Dưới các điều kiện công nghệ xác lập (glycerol 2%, $(NH_4)_2SO_4$ 0,4%, nhiệt độ 30°C, tốc độ lắc 150 - 200 vòng/phút, tỷ lệ tiếp giống 8 - 10%), sản lượng rhamnolipid đạt đỉnh 17,2 g/l sau 66 giờ lên men, tăng hơn 2 lần so với mức ban đầu. Công trình cung cấp cơ sở dữ liệu thực nghiệm quan trọng, khẳng định tiềm năng ứng dụng chủng vi khuẩn an toàn sinh học P. fluorescens trong nghiên cứu và sản xuất chất hoạt động bề mặt sinh học thân thiện với môi trường tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Trong vài thập niên trở lại đây, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật trong các lĩnh vực cũng như sự thay đổi về lối sống và nhu cầu của người tiêu dùng đã làm gia tăng việc sử dụng chất hoạt động bề mặt (CHĐBM). Hàng năm, trên toàn thế giới, sản xuất CHĐBM đạt trung bình 10 triệu tấn và lợi nhuận ước tính khoảng 9,4 tỷ đô la Mỹ. Hiện nay ở Việt Nam, đểđáp ứng nhu cầucủa người tiêu dùng, nhiều công ty sản xuất CHĐBM đã được thành lập như: công ty TICO, công ty NETCO… Thống kê của ngành công nghiệp cho thấy, việc sử dụng CHĐBM của nước ta hàng năm chiếm khoảng 0,5 triệu tấn mà chủ yếu là CHĐBM được tổng hợp từ hóa học. Tuy nhiên, CHĐBM được tổng hợp từ hóa học không tự phân hủy được và có thể gây ô nhiễm môi trường, làm ảnh hưởng đến sức khỏe của con người.

Do đó, cần có những nghiên cứu để tìm ra các chất có thể thay thế CHĐBMHH để giảm nguy cơ ô nhiễm môi trường, bảo vệ sức khỏe con người. Việc nghiên cứu tạo ra CHĐBM có nguồn gốc tự nhiên hay còn gọi là chất hoạt động bề mặt sinh học (CHĐBMSH) với các đặc tính ưu việt như: không độc, có khả năng phân hủy cao, có thể duy trì hoạt tính khi thay đổi nhiệt độ, pH, nồng độ NaCl, Ca2+, Mg2+ trong các điều kiện khắc nghiệt, có thể sản xuất trên các nguồn phế thải công nghiệp ở quy mô lớn…CHĐBMSH đã và đang được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới. Các CHĐBMSH có thể được thu nhận từ các loài thực vật, động vật và vi sinh vật. Tuy nhiên, các CHĐBMSH có nguồn gốc từ động, thực vật thường không ổn định dưới tác dụng của ánh sáng, nhiệt độ và các điều kiện khắc nghiệt từ môi trường.

Chất HĐBMSH từ vi sinh vật với những đặc tính ưu việt đã khắc phục được những nhược điểm này. Năm 1946, CHĐBMSH đầu tiên được Beyer tách chiết từ chủng vi khuẩn Acinetobacter calcoacetic RAG-1. Từ đó đến nay trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu và ứng dụng CHĐBMSH trong nhiều lĩnh vực sản xuất và đời sống. Một trong những CHĐBMSH được biết đến nhiều nhất là Rhamnolipid (RL).

RL có nhiều tính chất ưu việt như : hoạt tính bề mặt; khả năng nhũ hóa; khả năng chịu nhiệt độ, pH, áp suất, độ muối và lực ion biến đổi rộng; khả năng bị phân hủy sinh học; độc tính thấp; khả năng diệt một số Nguyễn Thị Thảo 1Lớp:CNSH-1103 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội loài vi sinh vật như: Phythium, Fusarium solani, Gliocadoium virens, Chaetonium globoum và Penicillium funiculosum, Klebsiella pneumoniae, Entrobacteraerogenes, Bacillus subtilis, Micrococcusluteus.(Haba et al., 2002, Luiz et al. RL thường được tổng hợp từ một số loài vi sinh vật như Pseudomonas,Burkholdera, Arthrobacter, Rhodococcus, Acinetobacter.Trong đó,Pseudomonas sp. được nghiên cứu nhiều nhất bởi khả năng tạo RL với hoạt tính bề mặt tương đối cao, dễ lên men và cho sản lượng cao hơn so với các vi sinh vật khác. Trong lên men sản xuất RL, bên cạnh chủng giống vi sinh vật thì các yếu tố về thành phần môi trường nuôi cấy (nguồn carbon, nguồn nitơ) cũng như một số yếu tố vật lý (nhiệt độ, thời gian, tốc độ lắc, tỷ lệ tiếp giống…) có ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của vi sinh vật và sinh tổng hợp RL.

Do đó, việc nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố này đến quá trình sinh tổng hợp RL là việc làm rất cần thiết. Ở Việt Nam, việc sản xuất và ứng dụng CHĐBMSH là lĩnh vực khá mới mẻ chưa có nhiều công trình nghiên cứu về vấn đề này. Đặc biệt chưa có công trình nghiên cứu về sản xuất RL từ P.