Phân lập và xác định cấu trúc hợp chất Lanostan Triterpen từ nấm Cổ Cò

Tổng hợp kết quả nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất lanostan triterpen từ nấm Cổ Cò (Ganoderma flexipes) ở Tây Nguyên.

• Tác giả: Đặng Thị Quỳnh
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Duyên
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội, Khoa Y Dược
• Chuyên ngành: Dược Học
• Đề tài: Phân Lập Và Xác Định Cấu Trúc Một Số Hợp Chất Lanostan Triterpen Từ Phân Đoạn Dicloromethan Của Nấm Cổ Cò - Ganoderma Flexipes Pat., Họ Ganodermataceae Thu Hái Tại Tây Nguyên
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp đại học
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Giới thiệu về Nấm Cổ Cò và Hợp chất Lanostan Triterpen

Nấm cổ cò (Ganoderma flexipes Pat.) thuộc họ Ganodermataceae là một loài nấm quý hiếm được thu hái tại Tây Nguyên. Loài nấm này chứa nhiều hợp chất hoạt tính sinh học có giá trị cao trong lĩnh vực dược học. Trong đó, lanostan triterpen là một nhóm hợp chất quan trọng với cấu trúc phức tạp và đa dạng. Các hợp chất triterpen này được phân lập từ phân đoạn dichloromethan của nấm cổ cò và cho thấy những tiềm năng lớn trong ứng dụng y dược. Nghiên cứu về xác định cấu trúc hợp chất lanostan giúp hiểu rõ hơn về đặc tính hóa học và hoạt tính sinh học của chúng.

1.1. Định nghĩa và Đặc điểm của Lanostan Triterpen

Lanostan triterpen là một nhóm hợp chất hữu cơ phức tạp có nguồn gốc từ các vi sinh vật và thực vật, đặc biệt là từ các loài nấm. Các triterpen này có cấu trúc đặc biệt với hệ thống vòng khôngbão hòa, góp phần tạo ra những hoạt tính sinh học đa dạng như chống viêm, chống oxy hóa và tăng cường miễn dịch.

1.2. Tầm quan trọng của Nấm Cổ Cò trong Dược học

Nấm cổ cò được sử dụng trong y học cổ truyền Việt Nam và các nước châu Á hàng ngàn năm. Các hợp chất hoạt tính từ loài nấm này có khả năng chống lão hóa, hỗ trợ điều trị bệnh Alzheimer, và tăng cường hệ miễn dịch. Việc phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất này là bước đột phá trong nghiên cứu khoa học.

II. Phương Pháp Phân Lập Hợp Chất Lanostan Triterpen

Quá trình phân lập hợp chất lanostan từ nấm cổ cò thực hiện tại Viện Dược liệu sử dụng nhiều phương pháp sắc ký hiện đại. Phân đoạn dichloromethan (DNCC) của nấm cổ cò được chiết xuất và tinh chế qua các bước xử lý hóa học. Sắc ký cột thường (CC) được áp dụng để tách các hợp chất theo độ phân cực khác nhau. Tiếp đó, sắc ký bản mỏng (TLC) được dùng để kiểm tra độ tinh khiết của các mẫu. Cuối cùng, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) đảm bảo chất lượng cao nhất cho các hợp chất được phân lập.

2.1. Kỹ Thuật Sắc Ký Cột trong Phân Lập Hợp chất

Sắc ký cột (CC) là phương pháp cơ bản để tách các hợp chất lanostan dựa trên sự khác biệt về độ phân cực. Dung môi chứa ethyl acetat và methanol được sử dụng với các tỷ lệ khác nhau. Phương pháp này giúp tách từng hợp chất riêng biệt với độ tinh khiết cao, tạo điều kiện thuận lợi cho các bước xác định cấu trúc tiếp theo.

2.2. Ứng Dụng Phổ Phân Tích trong Xác Định Cấu Trúc

Phổ NMR (Proton và Carbon-13) cung cấp thông tin chi tiết về cấu trúc phân tử của hợp chất lanostan. Phổ HMBC và HSQC xác định các mối liên kết giữa các nguyên tử. Phổ ESI-MS giúp xác định khối lượng phân tử chính xác. Kết hợp các phương pháp này cho phép nhà khoa học dự đoán cấu trúc hóa học hoàn chỉnh của mỗi hợp chất triterpen phân lập được.

III. Các Nhóm Hợp Chất Lanostan Triterpen Phân Lập Được

Từ phân đoạn dichloromethan của nấm cổ cò, các nhà nghiên cứu đã phân lập được nhiều hợp chất lanostan triterpen khác nhau, được chia thành ba nhóm chính theo cấu trúc hóa học. Nhóm I triterpen có cấu trúc cơ bản với các vòng khôngbão hòa. Nhóm II chứa các dẫn xuất có các nhóm thay thế phức tạp. Nhóm III gồm những hợp chất triterpen có cấu trúc đặc biệt với hoạt tính sinh học cao. Ngoài các lanostan triterpen, các nhà nghiên cứu cũng phát hiện các hợp chất sterol quan trọng khác với các tính chất sinh học khác biệt.

3.1. Nhóm Triterpen I và Đặc Điểm Cấu Trúc

Nhóm triterpen I là những lanostan với cấu trúc cơ bản nhất, chứa hệ thống bốn vòng carbohydrate điển hình. Các hợp chất này có khối lượng phân tử từ 426-432 Da. Chúng được tìm thấy trong nhiều loài Ganoderma khác nhau, cho thấy tầm quan trọng tiến hóa của nhóm này trong thế giới nấm.

3.2. Nhóm Triterpen II và III Dẫn Xuất Phức Tạp

Nhóm triterpen II và III chứa các dẫn xuất lanostan với các nhóm thay thế như hydroxyl, keton, hoặc carboxyl. Những hợp chất phức tạp này có khối lượng phân tử cao hơn (440-480 Da) và thường biểu hiện hoạt tính sinh học mạnh hơn. Hợp chất NCC03 và NCC06 phân lập được là những ví dụ điển hình của những triterpen có giá trị dược học cao.

IV. Ứng Dụng và Triển Vọng Nghiên Cứu Hợp Chất Lanostan

Hợp chất lanostan triterpen từ nấm cổ cò có nhiều ứng dụng tiềm năng trong y dược hiện đại. Các triterpen này thể hiện hoạt tính chống viêm, chống oxy hóa mạnh mẽ, giúp bảo vệ tế bào khỏi tổn thương do gốc tự do oxy hóa (ROS). Nghiên cứu cho thấy một số hợp chất này có khả năng ức chế acetylcholinesterase (AChE), hỗ trợ trong điều trị bệnh Alzheimer. Ngoài ra, các lanostan triterpen còn có khả năng kích hoạt các enzyme SOD và catalase, tăng cường hệ miễn dịch tự nhiên. Các khám phá này mở ra hướng nghiên cứu mới cho phát triển các dược phẩm từ lâm sàng lên thị trường.

4.1. Hoạt Tính Sinh Học của Lanostan Triterpen

Lanostan triterpen từ nấm cổ cò biểu hiện nhiều hoạt tính sinh học quan trọng. Chúng có khả năng ức chế ERK kinase và các đường tín hiệu liên quan đến sự phát triển của tế bào ung thư. Hoạt tính kháng virus của các hợp chất này cũng được chứng minh, đặc biệt là chống lại HIV và HBV. Ngoài ra, các triterpen này còn có tác dụng bảo vệ tế bào tiền thân thần kinh (NPC) và thúc đẩy sự tái tạo tế bào.

4.2. Triển Vọng Phát Triển Dược Phẩm Mới

Việc phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất lanostan là nền tảng cho phát triển các dược phẩm mới. Các công ty dược phẩm đang quan tâm đến tiềm năng của những triterpen này trong điều trị các bệnh thoái hóa thần kinh. Các thử nghiệm lâm sàng tiếp theo sẽ xác định liều dùng hiệu quả và độc tính của các hợp chất này, góp phần tạo ra những thuốc mới từ tài nguyên tự nhiên.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Cùng với sự tiến bộ của khoa học – kỹ thuật, xu hướng quay về với thiên nhiên, tìm về những phương thuốc truyền thống dân gian ngày càng được quan tâm, phát triển. Dược thảo thiên nhiên ngày càng đóng vai trò quan trọng trong phòng, chữa bệnh và nâng cao sức khoẻ. Trong đó, việc tìm ra loại dược liệu có nguồn gốc thiên nhiên để chữa các bệnh hiểm nghèo trên cơ sở khoa học có ý nghĩa vô cùng to lớn [10]. Nấm Linh chi là một loại dược liệu quý trong y học cổ truyền.

Với thành phần hóa học có chứa polysaccharit (giàu β-glucan), triterpenoid, steroid, saponin…, nấm Linh chi được ghi nhận có tác dụng phòng chống ung thư, tăng cường hệ miễn dịch, giải độc gan, hỗ trợ điều trị tiểu đường, giảm cholesterol trong máu… Chính vì thế, nhu cầu sử dụng nấm Linh chi trong phòng ngừa và điều trị bệnh là rất lớn, không chỉ ở Việt Nam, mà còn ở nhiều nơi trên thế giới như Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc, Đài Loan, Malaysia, Thái Lan,…[9]. Theo cuốn Nấm linh chi - Tài nguyên dược liệu quý ở Việt Nam của Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, nước ta có khoảng trên 80 loài nấm Linh chi, chiếm khoảng 1/3 số loài trên thế giới với không ít loài mới, đặc hữu [7]. Riêng ở Vườn Quốc gia Kon Ka Kinh thuộc khu vực Tây Nguyên, chi Ganoderma có ít nhất là 25 loài, trong đó 10 loài có tác dụng dược liệu như Ganoderma tornatum, Ganoderma amboinense, Ganoderma gibbosum, Ganoderma capense, Ganoderma lobatum, Ganoderma applanatum, Ganoderma lucidum, Ganoderma flexipes, Ganoderma tropicum, Ganoderma cochlear, các loài còn lại chưa biết rõ ý nghĩa [6]. Do đó, nghiên cứu tài nguyên nấm Linh chi ở Việt Nam sẽ là một công trình có ý nghĩa và mang lại hiệu quả to lớn cho người trồng nấm.

Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu (cả trong và ngoài nước) về chi Ganoderma mới chỉ dừng lại trên đối tượng Ganoderma lucidum. Trong khi cũng được công bố là một trong số 10 loài có tác dụng dược liệu tại Vườn Quốc gia Kon Ka Kinh, nấm Cổ cò - Ganoderma flexipes lại chưa được nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như giá trị sử dụng. Vì vậy, để góp phần làm sáng tỏ thành phần hóa học của Ganoderma flexipes, em thực hiện đề tài “Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất lanostan triterpen từ phân đoạn dicloromethan của nấm Cổ cò - 1 Ganoderma flexipes Pat., họ Ganodermataceae thu hái tại Tây Nguyên” với 2 mục tiêu cần đạt được: 1. Chiết xuất và phân lập một số hợp chất từ phân đoạn dicloromethan.

Xác định và nhận dạng cấu trúc của các chất phân lập được trong phân đoạn. Tổng quan về chi Ganoderma 1. Vài nét về thực vật của chi Ganoderma. Chi Ganoderma thuộc họ Ganodermataceae Donk, trong tất cả, có 219 loài trong họ đã được gán cho chi này [13], phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Á, châu Đại Dương và châu Mỹ [5].

Ở Việt Nam, theo GS.TSKH Trịnh Tam Kiệt, có khoảng 80 loài, phân bố rộng, đặc biệt vùng nhiệt đới [3]. Riêng trong hệ sinh thái của vườn Quốc gia Kon Ka Kinh ở Tây Nguyên nước ta đã định danh được 25 loài nấm thuộc chi này [6]. Các loài nấm thuộc chi Ganoderma đa số sinh trưởng và phát triển dưới tán rừng ở sinh cảnh rừng lá rộng thường xanh là chủ yếu, tiếp theo là một số sinh cảnh khác như rừng lá rộng bán thường xanh, rừng hỗn giao lá rộng lá kim, rừng hỗ giao tre nứa. Đa số các loài xuất hiện từ tháng 5 đến tháng 12 trong năm [6].

Vị trí phân loại của chi Ganoderma Karst. Theo hệ thống phân loại của P. Karsten (1881) chi Garnoderma Karst. thuộc: Giới nấm (Fungi).

Ngành nấm đảm (Basidiomycota). Lớp nấm đảm (Agaricomycetes). Bộ nấm đa tầng (Polyporales). Họ nấm Lim (Ganodermataceae).

Chi Ganoderma Karst. [3] Đặc điểm của chi Ganoderma Karst: Quả thể có cuống hoặc không cuống, mọc trên gỗ. Mũ nấm bóng láng thường dạng thận hay quạt có khi tròn. Thịt nấm màu nâu chất gỗ đến chất bì dai.

Ống nấm đa số một tầng, một số ít hai tầng. Bào tử có dạng hình trứng nhụt một đầu, vỏ bào tử gồm hai lớp, lớp ngoài nhẵn lớp trong có gai nhẹ có màu vàng gỉ sắt [6]. Tuy nhiên, các đặc điểm hình thái có thể thay đổi do, ví dụ, sự khác biệt trong canh tác ở các vị trí địa lý khác nhau trong các điều kiện khí hậu khác nhau và sự phát triển di truyền tự nhiên (đột biến, tái tổ hợp) của từng loài [13]. Thành phần hóa học Ngoài gần 90% là nước trong đặc trưng của tất cả các loại nấm, 10% khối lượng còn lại của chi Ganoderma chủ yếu bao gồm: protein (10 - 40%), carbohydrate (3 - 28%), chất béo (2 - 28%), chất xơ (3 - 32%), vitamin và khoáng chất.

Người ta đã xác nhận rằng protein có nguồn gốc từ nấm có chứa tất cả các axit amin thiết yếu và chúng đặc biệt giàu lysine và leucine. Tuy nhiên, nhóm chất có hoạt tính sinh học chính trong các loại nấm khác nhau của chi Ganoderma là triterpen và polysaccharit (Boh và cộng sự, 2007) [35]. Triterpen/ Triterpenoid Terpen là một nhóm các hợp chất xuất hiện trong tự nhiên, có bộ xương carbon bao gồm một hoặc nhiều đơn vị isopren. Terpen bao gồm bốn nhóm: (a) mono- và sesquiterpen dễ bay hơi (tinh dầu) (C10 và C15), (b) diterpen ít bay hơi (C20), (c) triterpen và sterol (C30) và (d) ) các sắc tố caroten (C40).

Hầu hết các nghiên cứu về nấm Linh chi liên quan đến các dạng triterpene và sterol ít bay hơi hơn [13]. Triterpen là những hợp chất được tổng hợp từ 6 đơn vị isopren [13]. Hàng trăm hợp chất triterpen đã được phân lập từ chiết xuất methanol, ethanol, acetone và chloroform của bào tử, sợi nấm và cơ thể đậu quả của các loại nấm Linh chi, đặc biệt là loài G. Kubota lần đầu tiên phân lập được axit ganoderic A và axit ganoderic B từ Ganoderma lucidum (FR.

Kể từ đó, hơn 316 triterpen đã được phân lập từ cơ thể đậu quả, bào tử, và sợi nấm của nhiều loại nấm Linh chi trong chi Ganoderma [46]. Cấu trúc hóa học của triterpen dựa trên lanostane, là một chất chuyển hóa của lanosterol, thông thường chúng có hai nhóm cụ thể được xác định là ganoderic (C30) và axit lucidenic (C27). Theo nghiên cứu của Cole R. đã có hơn 130 hợp chất là dẫn xuất của lannosterol (acid ganoderic, ganoderiol, ganolucidic, các lucidon, acid lucidenic,.) được phân lập từ phân đoạn không phân cực chiết xuất từ nấm Linh chi.

Các triterpen tồn tại dưới dạng tự do (không có phần đường), có cấu trúc vòng, mang một số nhóm chức như: -OH; -OAc; -O- (eter); C=O; nối đôi C=C. Cấu trúc hóa học của nó rất phức tạp và bị oxy hóa cao. Đặc tính chung là có tính thân dầu (tan 4 tốt trong eter dầu hỏa, n-hexan, diethyl ether, cloroform), ít tan trong nước ngoại trừ khi chúng kết hợp với đường để tạo thành glycosid [2]. Các triterpen phân lập từ chi Ganoderma được phân thành từng nhóm khác nhau theo 3 cấu trúc chính dưới đây.

Cấu trúc của Triterpen nhóm I [1] 6 Bảng 1. Một số triterpen nhóm I phân lập được từ chi Ganoderma STT Triterpen R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 Nguồn gốc TLTK 1 Ganoderal A O H H H Δ 24-25 Me CHO G. lucidum [40] 2 Acid Ganoderic S α- α- H H Δ 24-25 Me COOH G. lucidum [21] OAc OAc 3 Acid lanosta- 7,9(11),24-trien- β- α- β- H Δ 24-25 Me COOH G.

lucidum [1] 3β,15α,22β- OAc OAc OAc triacetoxy-26-oic 4 Ganorbiformin G O H OAc H Me COOH G. Cấu trúc của Triterpen nhóm II [1] Bảng 1. Một số triterpen nhóm II phân lập được từ chi Ganoderma STT Triterpen R1 R2 R3 R4 R5 Nguồn gốc TLTK 1 Acid lucidenic A O β-OH H Me 2 Acid lucidenic C β-OH β-OH β-OH Me COOH G. lucidum [1] 3 Acid 20-hydroxylucidenic N β-OH β-OH H OH COOH G.

lucidum 4 Methyl lucidenat F O O H H COOMe G. lucidum 5 20-hydroxylucidenic acid A O OH β-OH COOH G. Cấu trúc của Triterpen nhóm III [1] Bảng 1. Một số triterpen nhóm III phân lập được từ chi Ganoderma STT Triterpen R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 R10 Nguồn TLTK gốc 1 β- Acid ganoderic α β-OH O O β-OH α-Me O H COOH Me OAc 2 β- G.

[17] Acid ganoderic H β-OH O O O α-Me O H COOH Me OAc lucidum 3 Acid ganoderic V O α-OH H H α-OAc α-Me H Δ24-25 Me COOH [1] 4 Acid ganoderic W α-OAc α-OH H H α-OAc α-Me H Δ24-25 Me COOH 1. Sterol Gần đây, Fa – Huan Ge và cộng sự (2017) lần đầu tiên phân lập được từ dầu bào tử nấm Linh chi thu được bằng chiết xuất CO2 siêu tới hạn một sterol, Ganoderin A, được chứng minh là cấu trúc trước đây chưa từng có [19]. Dưới đây là một số sterol đã được phân lập và xác định từ chi Ganoderma. Một số sterol phân lập dược từ chi Ganoderma STT Sterol Nguồn gốc TLTK 1 Ergosterol G.lucidum [18] 3 5α-ergost-7-en-3β-ol, 5α- G.annulare [43] ergosta-7,22-dien-3β-ol 4 5,8-epidioxy-5α,8α- G.annulare [43] ergosta-6,22-dien-3β-ol 5 Stellasterol G.

Polysaccharit Polysacchrit của linh chi là các polymer thiên nhiên, có cấu trúc đa dạng và phức tạp [10]. Cho đến nay, hơn 200 polysaccharit đã được phân lập từ bào tử, sợi nấm và cơ thể đậu quả của chi Ganoderma (Huie và Di, 2004). Nhưng polysaccharit chỉ gồm 2 loại chính và tỉ lệ các thành phần có trong mỗi loại như sau: GL – A có thành phần chính là Gal, nên gọi là Glactan, còn GL – B có thành phần chính là Glu, nên gọi là Glucan [35]. Theo các báo cáo trước đây, các polysacharit của chi Ganoderma chủ yếu bao gồm glucan, galactan và/hoặc các heteropolysaccharit khác bao gồm một số monosaccharit như glucose, galactose, mannose và fucose [50].

Hầu hết các GPs hình thành từ 3 chuỗi monosaccharit, có cấu trúc xoắn ốc 3 chiều, giống cấu trúc của ADN và ARN. Cấu trúc xoắn này tựa trên khung sườn cacbon, lượng khung sườn từ 100.000, đa số chúng tồn tại phía trong vách tế bào (CWM). Một phần 9 polysaccharit phân tử nhỏ không tan trong cồn cao độ, nhưng tan trong nước nóng [2]. Tác dụng sinh học Từ thời xa xưa, trong các tài liệu y học cổ đã ghi nhận nhiều tác dụng bảo vệ sức khỏe của nấm Linh chi đối với cơ thể.

Ngày nay, khi nền khoa học hiện đại ngày càng phát triển, đặc biệt là lĩnh vực phân tử học và dược lý dược lâm sàng, hàng trăm những công trình nghiên cứu đã công bố, một lần nữa khẳng định tính năng, công dụng của loài thảo dược quý này. Kết quả của các nghiên cứu khoa học này cho rằng tác dụng sinh học của chi Ganoderma chủ yếu do triterpen và polysaccharit đem lại.