Khảo Sát Đột Biến Gen STXBP2 trong Hội Chứng Thực Bào Máu (HLH)

Đột biến gen STXBP2 và hội chứng thực bào máu: Nguyên nhân, triệu chứng, chẩn đoán và phương pháp điều trị hiện nay. Tìm hiểu chi tiết về bệnh lý di truyền này.

• Tác giả: Nguyễn Thị Lan Vi
• Người hướng dẫn: Pgs. Hoàng Anh Vũ
• Trường học: Trường Đại Học Mở Tp.hcm
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học – Y Dược
• Đề tài: Khảo Sát Đột Biến Gen STXBP2 Trong Hội Chứng Thực Bào Máu Bằng Kỹ Thuật Giải Trình Tự DNA
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Tp. Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1. PHẦN I: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan về HLH
• 1.1.1. HLH nguyên phát
• 1.1.2. HLH thứ phát
• 1.1.3. Dịch tễ học
• 1.1.4. Cơ chế bệnh sinh
• 1.1.5. Biểu hiện lâm sàng
• 1.1.6. Cận lâm sàng
• 1.1.7. Tiêu chuẩn chẩn đoán xác định
• 1.1.8. Tiêu chuẩn chẩn đoán phân biệt
• 1.2. Tổng quan về gen STXBP2
• 1.2.1. Vị trí, tên gọi và cấu trúc gen STXBP2
• 1.2.2. Chức năng của gen STXBP2
• 1.2.3. Đột biến gen STXBP2
• 1.2.4. Tính đa hình đơn nucleotide (SNP)
• 1.3. Kỹ thuật di truyền phân tử xác định đột biến gen STXBP2 trong hội chứng thực bào máu
• 1.3.1. Giải trình tự gen
• 1.3.1.1. Phương pháp Maxam – Gilbert
• 1.3.1.2. Phương pháp Sanger
• 1.3.1.3. Máy giải trình tự tự động dựa trên phương pháp Sanger cải tiến
• 1.3.2. Cơ sở dữ liệu và phần mềm phân tích trình tự Nucleotide
• 1.3.2.1. Cơ sở dữ liệu
• 1.3.2.2. Phần mềm phân tích trình tự Nucleotide
• 2. PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Mẫu nghiên cứu
• 2.2. Công cụ trực tuyến
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Khảo sát dữ liệu
• 2.3.1.1. Khảo sát in silico
• 2.3.1.2. Thu nhận trình tự gen, xác định cấu trúc
• 2.3.1.3. Thiết kế - đánh giá mồi cho phản ứng PCR kết hợp giải trình tự
• 2.3.2. Khảo sát thực nghiệm
• 2.3.2.1. Sơ đồ tổng quát quy trình xác định đột biến trên gen STXBP2 ở bệnh nhân mắc HLH
• 2.3.2.2. Tách chiết DNA bộ gen (gDNA) từ mẫu máu
• 2.3.2.3. Kiểm tra chất lượng DNA thu nhận
• 2.3.2.4. Phản ứng PCR
• 2.3.2.5. Tinh sạch sản phẩm PCR
• 2.3.2.6. Phản ứng giải trình tự (Cycle Sequencing)
• 2.3.2.7. Tủa sản phẩm Cycle Sequencing
• 2.3.2.8. Phân tích dữ liệu giải trình tự đồng thời so sánh với các công trình nghiên cứu trước
• 2.4. Thời gian thực hiện và địa điểm
• 3. PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Khai thác dữ liệu
• 3.1.1. Khảo sát in silico
• 3.1.2. Thu nhận trình tự gen, xác định cấu trúc
• 3.1.3. Thiết kế - đánh giá mồi cho phản ứng PCR kếp hợp giải trình tự
• 3.2. Khảo sát thực nghiệm
• 3.2.1. Tách chiết gDNA từ mẫu máu
• 3.2.2. Phản ứng PCR
• 3.2.3. Tinh sạch sản phẩm PCR
• 3.2.4. Phản ứng Cycle Sequencing và đọc kết quả giải trình tự
• 3.2.5. Phân tích kết quả giải trình tự đồng thời so sánh với các công trình nghiên cứu trước
• 4. PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• Trang Web trực tuyến
• PHỤ LỤC 1: KẾT QUẢ PRIMER – BLAST
• PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ SO SÁNH GIỮA TRÌNH TỰ DNA CHUẨN VỚI KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ CỦA MẪU BỆNH
• PHỤ LỤC 3: DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ SỬ DỤNG

Tóm tắt

I. Đột Biến Gen STXBP2 Nguyên Nhân Gây Hội Chứng Thực Bào Máu

Hội chứng thực bào máu (Hemophagocytic Lymphohistiocytosis - HLH) là một rối loạn miễn dịch hiếm gặp nhưng có khả năng đe dọa tính mạng, đặc trưng bởi phản ứng viêm hệ thống không kiểm soát. Tình trạng này xuất phát từ sự kích hoạt và tăng sinh quá mức của tế bào lympho và đại thực bào, dẫn đến "cơn bão cytokine" gây tổn thương đa cơ quan. Trong các thể bệnh di truyền, đột biến gen STXBP2 được xác định là nguyên nhân chính gây ra Hội chứng thực bào máu gia đình loại 5 (FHL5), một dạng suy giảm miễn dịch bẩm sinh. Gen STXBP2, tọa lạc trên nhiễm sắc thể 19, mã hóa cho protein Munc18-2. Protein này đóng vai trò thiết yếu trong việc điều hòa quá trình giải phóng các hạt độc tế bào từ tế bào giết tự nhiên (NK) và tế bào T gây độc (CTL). Khi có đột biến gen STXBP2, chức năng của protein Munc18-2 bị suy giảm hoặc mất hoàn toàn, làm gián đoạn khả năng tiêu diệt các tế bào bị nhiễm bệnh của hệ miễn dịch. Sự thất bại trong việc loại bỏ các tác nhân kích thích miễn dịch này dẫn đến việc kích hoạt liên tục và kéo dài các tế bào miễn dịch, gây ra các triệu chứng lâm sàng nặng nề của hội chứng thực bào máu. Nghiên cứu "Khảo sát đột biến gen STXBP2 trong hội chứng thực bào máu bằng kỹ thuật giải trình tự DNA" nhấn mạnh tầm quan trọng của việc xác định các biến thể di truyền này. Việc chẩn đoán sớm và chính xác FHL5 thông qua xét nghiệm di truyền STXBP2 không chỉ giúp phân biệt với các thể HLH thứ phát mà còn là cơ sở để đưa ra các quyết định điều trị kịp thời, đặc biệt là liệu pháp ghép tế bào gốc tạo máu, phương pháp duy nhất có khả năng chữa khỏi bệnh.

1.1. Tổng quan về Hội chứng thực bào máu HLH và các thể bệnh

Hội chứng thực bào máu (HLH), hay Hemophagocytic Lymphohistiocytosis, được mô tả lần đầu vào năm 1939, là một rối loạn đặc trưng bởi sự tăng sinh bất thường của các tế bào lympho và đại thực bào hoạt hóa. Điều này dẫn đến tình trạng viêm hệ thống nghiêm trọng và suy đa cơ quan. HLH được phân thành hai thể chính: nguyên phát và thứ phát. HLH nguyên phát, còn gọi là HLH gia đình (FHL), là một nhóm các bệnh suy giảm miễn dịch bẩm sinh do di truyền lặn nhiễm sắc thể thường. Các đột biến trên các gen như PRF1, UNC13D, STX11, và STXBP2 gây ra các subtype tương ứng từ FHL2 đến FHL5. Ngược lại, HLH thứ phát thường khởi phát sau các yếu tố kích hoạt như nhiễm trùng (đặc biệt là virus Epstein-Barr), bệnh tự miễn hoặc các bệnh lý ác tính. Việc phân biệt hai thể này là cực kỳ quan trọng vì phương pháp điều trị và tiên lượng bệnh hoàn toàn khác nhau.

1.2. Vai trò sinh học của protein STXBP2 Munc18 2 trong miễn dịch

Gen STXBP2 mã hóa cho protein Munc18-2, một thành viên của họ protein SEC/MUNC. Protein này có vai trò trung tâm trong quá trình vận chuyển và dung hợp các túi nội bào. Cụ thể, trong hệ miễn dịch, Munc18-2 điều khiển sự lắp ráp của phức hợp SNARE, một cơ chế phân tử thiết yếu cho việc hòa màng và giải phóng các hạt ly giải từ tế bào NK và CTL. Các hạt này chứa perforin và granzyme, những vũ khí phân tử dùng để tiêu diệt tế bào đích (tế bào bị nhiễm virus hoặc tế bào ung thư). Theo tài liệu nghiên cứu, sự tương tác giữa Munc18-2 và Syntaxin 11 (protein liên quan đến FHL4) là bắt buộc để giải phóng hiệu quả các hạt độc tế bào. Do đó, bất kỳ đột biến gen STXBP2 nào làm thay đổi cấu trúc hoặc làm giảm biểu hiện của Munc18-2 đều sẽ làm suy yếu nghiêm trọng chức năng gây độc tế bào, dẫn đến cơ chế bệnh sinh của hội chứng HLH.

II. Hướng Dẫn Nhận Biết Sớm Triệu Chứng Của Hội Chứng HLH

Việc chẩn đoán hội chứng thực bào máu là một thách thức lớn do các biểu hiện lâm sàng đa dạng và không đặc hiệu, thường bị nhầm lẫn với nhiễm trùng huyết nặng hoặc các bệnh lý ác tính. Các triệu chứng HLH điển hình bao gồm sốt kéo dài không rõ nguyên nhân (thường ≥ 38,5°C), một dấu hiệu xuất hiện sớm và phổ biến nhất. Khám thực thể thường phát hiện gan lách to, chiếm hơn 90% các trường hợp. Các bất thường về huyết học cũng là dấu hiệu quan trọng, với tình trạng giảm các dòng tế bào máu (ảnh hưởng ít nhất hai trong ba dòng: hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu). Bệnh nhân có thể biểu hiện vàng da, phát ban, và các triệu chứng thần kinh trung ương như co giật hoặc thay đổi ý thức. Các xét nghiệm cận lâm sàng đóng vai trò then chốt trong chẩn đoán HLH. Nồng độ ferritin trong máu tăng cao (>500 ng/ml, và đặc biệt có giá trị khi >10.000 ng/ml), tăng triglyceride máu và giảm fibrinogen máu là các dấu hiệu sinh hóa gợi ý mạnh mẽ. Tiêu chuẩn chẩn đoán HLH-2004 của Henter và cộng sự [23] yêu cầu có ít nhất 5 trong 8 tiêu chí lâm sàng và xét nghiệm, hoặc xác định được đột biến gen gây bệnh như đột biến gen STXBP2. Việc nhận biết sớm các dấu hiệu này là cực kỳ quan trọng để bắt đầu điều trị kịp thời, ngăn ngừa tổn thương đa cơ quan không hồi phục và cải thiện tiên lượng cho bệnh nhân.

2.1. Các biểu hiện lâm sàng Sốt kéo dài và gan lách to

Sốt kéo dài không rõ nguyên nhân là triệu chứng khởi phát ở hầu hết bệnh nhân mắc hội chứng HLH, thường kéo dài trên 7 ngày và không đáp ứng với kháng sinh thông thường. Đây là hệ quả của việc giải phóng hàng loạt các cytokine gây viêm như IL-1, IL-6 và TNF-α. Bên cạnh đó, gan lách to là một dấu hiệu thực thể gần như luôn xuất hiện, phản ánh sự thâm nhiễm của các tế bào lympho và đại thực bào hoạt hóa vào các cơ quan này. Theo các nghiên cứu, gan to và lách to được ghi nhận ở khoảng 90% và 84% các trường hợp [44]. Mức độ to của gan lách có thể thay đổi tùy theo giai đoạn hoạt động của bệnh. Các triệu chứng khác như phát ban dạng dát sẩn, hạch to, và các biểu hiện thần kinh trung ương cũng cần được xem xét trong chẩn đoán phân biệt.

2.2. Tiêu chuẩn chẩn đoán HLH 2004 và những thách thức

Việc chẩn đoán HLH dựa trên bộ tiêu chuẩn được Hiệp hội Mô bào công bố năm 2004 (HLH-2004) [23]. Chẩn đoán được xác định khi thỏa mãn một trong hai nhóm tiêu chuẩn: (1) Chẩn đoán phân tử xác định đột biến gen gây FHL (ví dụ: đột biến gen STXBP2), hoặc (2) có ít nhất 5 trong 8 tiêu chí sau: sốt, lách to, giảm các dòng tế bào máu (từ 2 dòng trở lên), tăng triglyceride và/hoặc giảm fibrinogen, hình ảnh thực bào trong tủy xương/gan/lách/hạch, giảm hoạt tính tế bào NK, ferritin máu >500 ng/ml, và tăng nồng độ sCD25. Thách thức lớn nhất là các tiêu chí này có thể không xuất hiện đồng thời ở giai đoạn đầu của bệnh, và một số xét nghiệm như đo hoạt tính tế bào NK hoặc sCD25 không phổ biến ở nhiều cơ sở y tế. Điều này có thể dẫn đến chẩn đoán chậm trễ, làm mất đi cơ hội điều trị sớm.

III. Phương Pháp Xét Nghiệm Di Truyền STXBP2 Tầm Soát Đột Biến

Xác định các đột biến gen STXBP2 là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán xác định Hội chứng thực bào máu gia đình loại 5 (FHL5). Phương pháp cốt lõi được sử dụng trong nghiên cứu là giải trình tự DNA theo phương pháp Sanger, một kỹ thuật cho phép đọc chính xác trình tự nucleotide của gen. Quy trình bắt đầu bằng việc tách chiết DNA bộ gen (gDNA) từ mẫu máu ngoại vi của bệnh nhân. DNA sau đó được sử dụng làm khuôn trong phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để khuếch đại có chọn lọc 19 exon của gen STXBP2. Việc thiết kế các cặp mồi đặc hiệu là bước quan trọng để đảm bảo chỉ vùng gen mục tiêu được nhân lên. Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch để loại bỏ các thành phần không mong muốn và tiến hành phản ứng giải trình tự (Cycle Sequencing). Kết quả thu được là một sắc ký đồ, từ đó phân tích trình tự nucleotide và so sánh với trình tự tham chiếu từ các cơ sở dữ liệu như NCBI. Xét nghiệm di truyền STXBP2 có thể phát hiện các loại đột biến khác nhau, bao gồm đột biến sai nghĩa, đột biến vô nghĩa, lệch khung, hoặc đột biến tại vị trí nối. Việc phát hiện đột biến không chỉ khẳng định chẩn đoán mà còn có ý nghĩa quan trọng trong việc tư vấn di truyền cho gia đình, giúp xác định người mang gen và sàng lọc cho các thành viên khác, cũng như định hướng cho các quyết định sinh sản trong tương lai.

3.1. Kỹ thuật giải trình tự Sanger trong khảo sát đột biến gen

Phương pháp giải trình tự Sanger, hay còn gọi là phương pháp kết thúc chuỗi dideoxy, là nền tảng của chẩn đoán di truyền phân tử trong nhiều thập kỷ. Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên việc tổng hợp các đoạn DNA có độ dài khác nhau, kết thúc tại một nucleotide cụ thể (A, T, G, hoặc C) bằng cách sử dụng các dideoxynucleotide (ddNTP) được đánh dấu huỳnh quang. Trong nghiên cứu về đột biến gen STXBP2, kỹ thuật này được áp dụng để xác định chính xác từng nucleotide trong 19 vùng mã hóa (exon) của gen. Sau phản ứng, các đoạn DNA được phân tách theo kích thước bằng điện di mao quản, và một máy dò laser sẽ ghi nhận tín hiệu huỳnh quang, từ đó tái tạo lại trình tự DNA. Đây là phương pháp có độ chính xác cao để xác nhận các biến thể điểm hoặc các thay đổi nhỏ trên gen.

3.2. Phân tích dữ liệu và xác định biến thể di truyền SNP

Sau khi có được trình tự DNA từ máy giải trình tự, bước tiếp theo là phân tích dữ liệu. Trình tự của bệnh nhân được so sánh (align) với trình tự gen STXBP2 tham chiếu (ví dụ: NG_016709 từ NCBI) bằng các phần mềm tin sinh học như CLC Main Workbench. Bất kỳ sự khác biệt nào về nucleotide đều được ghi nhận. Các biến thể này sau đó được tra cứu trên các cơ sở dữ liệu như ClinVar hoặc dbSNP để xác định xem chúng là một tính đa hình đơn nucleotide (SNP) phổ biến trong dân số hay là một đột biến gây bệnh đã được báo cáo. Đối với các biến thể mới chưa từng được công bố, các công cụ dự đoán như Polyphen-2 có thể được sử dụng để đánh giá khả năng gây hại của sự thay đổi amino acid tương ứng. Quá trình này giúp phân biệt giữa các biến thể lành tính và các đột biến gây ra FHL5.

IV. Cách Tiếp Cận Điều Trị Hội Chứng Thực Bào Máu Do STXBP2

Việc điều trị hội chứng thực bào máu do đột biến gen STXBP2 đòi hỏi một chiến lược kép: kiểm soát ngay lập tức tình trạng viêm hệ thống dữ dội và tiến tới điều trị triệt để nguyên nhân di truyền. Giai đoạn đầu tập trung vào việc dập tắt "cơn bão cytokine" bằng các phác đồ hóa-miễn dịch liệu pháp. Phác đồ điều trị HLH-94 và phiên bản cải tiến HLH-2004 là những phác đồ chuẩn quốc tế, kết hợp etoposide (một tác nhân hóa trị liệu) và dexamethasone (một loại corticosteroid mạnh). Các thuốc này giúp tiêu diệt các tế bào miễn dịch hoạt động quá mức, từ đó làm giảm sản xuất cytokine. Cyclosporine A, một loại thuốc ức chế tế bào T, cũng thường được bổ sung để duy trì sự ổn định của bệnh. Tuy nhiên, các liệu pháp này chỉ mang tính tạm thời và không thể sửa chữa khiếm khuyết di truyền cơ bản. Đối với bệnh nhân FHL5, phương pháp điều trị duy nhất có khả năng chữa khỏi bệnh là ghép tế bào gốc tạo máu (HSCT). Quy trình này thay thế toàn bộ hệ thống miễn dịch khiếm khuyết của bệnh nhân bằng một hệ thống miễn dịch khỏe mạnh từ người hiến tặng. HSCT thường được tiến hành sau khi bệnh nhân đã đạt được sự thuyên giảm bằng phác đồ hóa-miễn dịch. Thành công của HSCT phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm việc tìm được người hiến tặng phù hợp và kiểm soát các biến chứng sau ghép.

4.1. Phác đồ điều trị HLH 94 và HLH 2004 Liệu pháp miễn dịch

Phác đồ điều trị HLH-94, được công bố bởi Hiệp hội Mô bào, đã cải thiện đáng kể tỷ lệ sống của bệnh nhân HLH. Phác đồ này bao gồm một giai đoạn tấn công kéo dài 8 tuần với etoposide và dexamethasone. Mục tiêu là nhanh chóng kiểm soát tình trạng tăng viêm. Phác đồ HLH-2004 sau đó đã được giới thiệu với việc bổ sung cyclosporine A ngay từ giai đoạn tấn công và sử dụng steroid trong tủy sống cho các trường hợp có liên quan đến hệ thần kinh trung ương [23]. Những liệu pháp miễn dịch và hóa trị này đóng vai trò là "cầu nối" quan trọng, giúp bệnh nhân ổn định và đủ điều kiện để tiến hành phương pháp điều trị triệt để hơn.

4.2. Ghép tế bào gốc tạo máu Giải pháp điều trị triệt để cho FHL5

Do FHL5 là một bệnh suy giảm miễn dịch bẩm sinh gây ra bởi đột biến gen STXBP2, hóa trị liệu không thể giải quyết gốc rễ vấn đề. Ghép tế bào gốc tạo máu (HSCT) là phương pháp duy nhất mang lại hy vọng chữa khỏi. Quá trình này nhằm mục đích thay thế các tế bào tiền thân tạo máu mang đột biến của bệnh nhân bằng các tế bào gốc khỏe mạnh từ người hiến tặng (thường là người thân phù hợp HLA hoặc người hiến tặng không cùng huyết thống). Hệ thống miễn dịch mới được hình thành từ các tế bào gốc này sẽ có chức năng bình thường, có khả năng kiểm soát các phản ứng miễn dịch và ngăn ngừa bệnh tái phát. HSCT là một thủ thuật phức tạp với nhiều rủi ro, nhưng đối với FHL5, đây là lựa chọn mang lại cơ hội sống lâu dài tốt nhất.

4.3. Tầm quan trọng của tư vấn di truyền trong quản lý bệnh

Khi một bệnh nhân được chẩn đoán mắc FHL5 do đột biến gen STXBP2, tư vấn di truyền trở thành một phần không thể thiếu trong việc quản lý toàn diện. Vì đây là bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường, cả cha và mẹ đều là người mang gen bệnh (dị hợp tử) nhưng không có biểu hiện triệu chứng. Tư vấn viên di truyền sẽ giải thích về cơ chế di truyền của bệnh, nguy cơ 25% sinh con mắc bệnh trong mỗi lần mang thai, và 50% nguy cơ sinh con là người mang gen. Việc này giúp gia đình hiểu rõ về bệnh, đưa ra các quyết định sáng suốt về kế hoạch hóa gia đình, và xem xét các lựa chọn như chẩn đoán trước sinh hoặc chẩn đoán di truyền tiền làm tổ. Ngoài ra, việc sàng lọc cho anh chị em ruột của bệnh nhân cũng rất quan trọng để phát hiện sớm các trường hợp mắc bệnh khác trong gia đình.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Hội chứng thực bào máu (Hemophagocytic Lymphohistiocytosis - HLH) là một hội chứng suy giảm miễn dịch và rối loạn điều hòa miễn dịch hiếm gặp nhưng có thể đe dọa trực tiếp đến tính mạng người bệnh. Hội chứng này được mô tả lần đầu tiên vào năm 1939 bởi Scott và Robb-Smith, đặc trưng bởi phản ứng viêm tăng sinh nghiêm trọng xuất phát từ sự hoạt hóa và tăng sinh mất kiểm soát của các tế bào lympho T cùng đại thực bào. Tình trạng này dẫn đến cơn bão cytokine, gây tổn thương tế bào lan tỏa, hủy hoại mô và suy đa cơ quan. Bệnh nhân HLH thường khởi phát bệnh trong những tháng đầu hoặc năm đầu đời với các biểu hiện lâm sàng điển hình như sốt cao kéo dài, gan lách to, giảm các dòng tế bào máu ngoại vi, tăng nồng độ triglyceride, giảm fibrinogen máu, kèm theo các tổn thương hệ thần kinh trung ương.

Về mặt căn nguyên, HLH được phân chia thành hai thể chính:

1. HLH thể thứ phát (Secondary HLH): Thường khởi phát sau các yếu tố kích thích như nhiễm siêu vi (đặc biệt là Epstein-Barr Virus - EBV chiếm tới 40% trường hợp tại Nhật Bản), các bệnh lý tự miễn/tự viêm (hội chứng hoạt hóa đại thực bào - MAS), các khối u ác tính huyết học (chiếm 60% trường hợp MAHS ở trẻ em là u lympho không Hodgkin), hoặc sau ghép tạng và ức chế miễn dịch.
2. HLH thể nguyên phát hay HLH có tính chất gia đình (Familial Hemophagocytic Lymphohistiocytosis - FHL): Là bệnh lý di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường với tỷ lệ mắc ở trẻ dưới 1 tuổi ước tính khoảng 1,1/100.000 (tại Thụy Điển tỷ lệ mắc khoảng 1/50.000 trẻ đẻ sống). FHL được phân chia thành 5 phân nhóm (subtype) tương ứng với các đột biến gen: FHL1 (nhiễm sắc thể 9q21.3-22, chưa rõ gen), FHL2 (PRF1), FHL3 (UNC13D), FHL4 (STX11), và FHL5 (STXBP2).

Gen STXBP2 định vị tại vùng 19p13.2 trên nhiễm sắc thể số 19, có chiều dài 10.774 bp gồm 19 exon, chịu trách nhiệm mã hóa protein Munc18-2 (593 acid amin, khối lượng phân tử khoảng 66,5 kDa). Protein này đóng vai trò then chốt trong việc kiểm soát sự lắp ráp phức hợp SNARE, điều hòa quá trình vận chuyển nội bào và hòa màng để giải phóng các hạt ly giải (chứa perforin và granzyme B) từ tế bào lympho T gây độc (CTL) và tế bào giết tự nhiên (NK) đến khe miễn dịch (IS) nhằm tiêu diệt tế bào đích. Khi gen STXBP2 bị đột biến, quá trình hòa màng bị gián đoạn, làm suy giảm hoặc mất hoàn toàn hoạt tính gây độc tế bào, dẫn đến thể bệnh FHL5. Nếu không được chẩn đoán sớm để can thiệp phác đồ ức chế miễn dịch và ghép tế bào gốc tạo máu (HCT), thời gian sống trung bình của bệnh nhân FHL chỉ kéo dài từ 2 đến 6 tháng.

Tại Việt Nam, các nghiên cứu di truyền học phân tử trước đây đã tiến hành tầm soát đột biến trên gen PRF1 (Hoàng Anh Vũ và cộng sự, 2012) và gen UNC13D (Hoàng Anh Vũ và cộng sự, 2013). Tuy nhiên, các khảo sát đột biến trên gen STXBP2 vẫn còn là khoảng trống nghiên cứu. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn đó, khóa luận xác định 4 mục tiêu và nhiệm vụ cụ thể:

1. Khuếch đại thành công 19 exon của gen STXBP2 bằng kỹ thuật PCR.
2. Thực hiện giải trình tự chuỗi DNA các exon bằng phương pháp Sanger cải tiến.
3. Phân tích và khảo sát các biến đổi nucleotide, đột biến tại các vùng exon của gen mục tiêu bằng công cụ tin sinh học.
4. Tạo tiền đề quy trình kỹ thuật cho các nghiên cứu phát hiện đột biến gen STXBP2 trên cỡ mẫu lâm sàng lớn hơn, hỗ trợ chẩn đoán sớm, định hướng phác đồ điều trị và tư vấn di truyền phả hệ.

• Đối tượng nghiên cứu: 19 vùng exon của gen STXBP2 trên mẫu DNA bộ gen (gDNA) tách chiết từ máu ngoại vi của bệnh nhân được chẩn đoán HLH theo tiêu chuẩn HLH-2004.
• Phạm vi không gian và thời gian: Nghiên cứu được thực hiện tại Trung tâm Y sinh học phân tử - Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh và Khoa Công nghệ sinh học - Trường Đại học Mở TP. Hồ Chí Minh, hoàn thành vào tháng 06 năm 2019.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và tiêu chuẩn chẩn đoán

Nghiên cứu vận dụng khung tiêu chuẩn chẩn đoán quốc tế HLH-2004 của Hiệp hội Mô bào Thế giới (Henter và cộng sự, 2004). Theo tiêu chuẩn này, chẩn đoán xác định HLH được thiết lập khi thỏa mãn một trong hai nhóm tiêu chuẩn:

• Nhóm 1: Chẩn đoán sinh học phân tử xác định có đột biến bệnh lý trên các gen liên quan đến FHL (PRF1, UNC13D, STX11, STXBP2).
• Nhóm 2: Thỏa mãn ít nhất 5 trên 8 tiêu chí lâm sàng và cận lâm sàng:
  1. Sốt $\ge 38,5^\circ\text{C}$ kéo dài trên 7 ngày.
  2. Lách to $> 3\text{ cm}$ dưới bờ sườn trái.
  3. Giảm ít nhất 2 trong 3 dòng tế bào máu ngoại vi (Hemoglobin $< 90\text{ g/l}$, Tiểu cầu $< 100 \times 10^3/\mu\text{l}$, Bạch cầu hạt trung tính $< 1,0 \times 10^3/\mu\text{l}$).
  4. Tăng Triglyceride máu lúc đói ($\ge 3,0\text{ mmol/l}$ hoặc $\ge 265\text{ mg/dl}$) và/hoặc giảm Fibrinogen máu ($< 150\text{ mg/dl}$).
  5. Có hiện tượng thực bào máu trong tủy xương, lách, hạch hoặc gan.
  6. Giảm hoặc mất hoạt tính gây độc của tế bào NK.
  7. Ferritin huyết thanh $> 500\text{ ng/ml}$ (mức $> 10.000\text{ ng/ml}$ có độ nhạy 90% và độ đặc hiệu 96%).
  8. Nồng độ thụ thể Interleukin-2 hòa tan (sCD25) tăng $> 2.400\text{ U/ml}$ (hoặc gấp $> 2$ lần giá trị trung bình theo lứa tuổi).

Cơ sở phân tử của đề tài dựa trên cơ chế tương tác giữa protein Munc18-2 (mã hóa bởi STXBP2) và Syntaxin 11 (mã hóa bởi STX11) để cấu tạo phức hợp SNARE điều hòa túi tiết ly giải. Đề tài cũng khảo sát cơ sở dữ liệu đột biến ClinVar (NCBI), ghi nhận hơn 100 biến thể của gen STXBP2, trong đó phổ biến nhất là đột biến sai nghĩa (missense mutation - 39 biến thể), đột biến lệch khung (frameshift mutation - 2 biến thể) và đột biến vị trí cắt nối (splice site mutation - 2 biến thể, tiêu biểu như c.1247-1G>C tại exon 15).

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu kết hợp hai giai đoạn: khảo sát in silico (tin sinh học) và khảo sát thực nghiệm sinh học phân tử:

Bước thực hiện	Kỹ thuật / Công cụ sử dụng	Mục đích và thông số kỹ thuật
Khai thác dữ liệu & Thiết kế mồi	Cơ sở dữ liệu NCBI (mã số truy cập NG_016709), phần mềm CLC Main Workbench v5.5, Primer-BLAST, OligoAnalyzer 3.1 (IDT).	Thu nhận trình tự gen chuẩn STXBP2 (10.774 bp); thiết kế và đánh giá các thông số vật lý ($T_m$, $T_a$, cấu trúc bậc hai Hairpin/Self-dimer/Cross-dimer) của 5 cặp mồi PCR khuếch đại 19 exon.
Tách chiết gDNA	Bộ kit QIAamp DNA Blood Mini Kit (cột silica), máy đo quang phổ NanoDrop 2000.	Tách chiết gDNA từ mẫu máu ngoại vi chống đông bằng EDTA/citrate; đánh giá nồng độ và độ tinh sạch qua tỷ số $A_{260}/A_{280}$ (đạt chuẩn trong khoảng 1,7 – 2,0).
Phản ứng PCR	Bộ hóa chất Takara Taq Hot Start Version (Takara Bio), máy luân nhiệt Mastercycler Pro S (Eppendorf).	Khuếch đại 5 phân đoạn chứa 19 exon với thể tích phản ứng $15\ \mu\text{l}$ ($1,5\ \mu\text{l}$ Buffer 10X; $1,5\ \mu\text{l}$ dNTP 2,5 mM; $0,75\ \mu\text{l}$ mồi F/R $10\ \mu\text{M}$; $0,15\ \mu\text{l}$ Taq HS 5U/$\mu\text{l}$; $1,5\ \mu\text{l}$ gDNA; $8,85\ \mu\text{l}$ $\text{H}_2\text{O}$); chu trình 45 chu kỳ.
Điện di kiểm tra	Gel agarose 1,5% trong đệm TBE 0,5X, nhuộm GelRed 5X, máy đọc gel Geldoc-It (UVP), thang chuẩn 1kb Plus DNA Ladder.	Đánh giá kích thước và độ đặc hiệu của các phân đoạn PCR dưới điện thế 100V trong 30 phút.
Tinh sạch sản phẩm PCR	Enzyme ExoSAP-IT PCR Product Cleanup (Thermo Scientific).	Thủy phân mồi dư và dNTP chưa phản ứng ($3\ \mu\text{l}$ sản phẩm PCR + $1\ \mu\text{l}$ ExoSAP-IT + $1\ \mu\text{l}$ $\text{H}_2\text{O}$); ủ nhiệt ở $37^\circ\text{C}$ trong 15 phút, vô hoạt enzyme ở $80^\circ\text{C}$ trong 15 phút.
Giải trình tự chuỗi (Cycle Sequencing)	Bộ hóa chất BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems).	Phản ứng giải trình tự một chiều với 10 mồi chuyên biệt; thể tích $9,8\ \mu\text{l}$ ($0,8\ \mu\text{l}$ BigDye v3.1; $1,5\ \mu\text{l}$ Sequencing Buffer; $2\ \mu\text{l}$ mồi $1,6\ \mu\text{M}$; $1\ \mu\text{l}$ DNA tinh sạch; $4,5\ \mu\text{l}$ $\text{H}_2\text{O}$); chu trình nhiệt 25 chu kỳ.
Tủa và Phân tích trình tự	Muối $\text{NH}_4\text{OAc}$ 5M pH=7, Ethanol tuyệt đối, Hi-Di Formamide, máy ABI 3500 Genetic Analyzer.	Biến tính sản phẩm ở $96^\circ\text{C}$ trong 2 phút, nạp đĩa 96 giếng chạy điện di mao quản; phân tích sắc ký đồ (chromatogram) bằng CLC Main Workbench v5.5, tra cứu SNP trên NCBI dbSNP và dự đoán tác động đột biến qua Polyphen-2.

Trình tự và đặc tính của 5 cặp mồi PCR khuếch đại 19 exon gen STXBP2 được thiết kế trong nghiên cứu:

Cụm Exon	Tên mồi	Trình tự mồi ($5' \rightarrow 3'$)	Kích thước mồi (nt)	Kích thước phân đoạn khuếch đại (bp)
Exon 1 – 4	STXBP2-g1F STXBP2-g4R	ACCTTGGGACACACCCGGAA CGTATACACATGCACACATG	20 20	2.806
Exon 5 – 6	STXBP2-g5F STXBP2-g6R4	TGTTTGCACATGGTGGCAGA CAAGTGATCCTCCTGCCCTG	20 20	520
Exon 7 – 13	STXBP2-g7F STXBP2-g13R	ATTCGGCAAAGCAGGCTTCA AGAACCCCCCATCTCTACAG	20 20	1.754
Exon 14 – 16	STXBP2-g14F STXBP2-g16R	ATCCCCTTCCCTGACACATA AAGGGAATGCCAGCAATGAG	20 20	1.906
Exon 17 – 19	STXBP2-g17F STXBP2-g19R	AGGATCTTGGCCCCTGAATA AGAGCGACGGGAAGAGTTTA	20 20	801

Nội dung chính theo từng chương

Đặt vấn đề

Tác giả nêu bật tính cấp thiết của việc nghiên cứu hội chứng HLH và phân nhóm di truyền FHL. Với tỷ lệ tử vong cao nếu không được can thiệp kịp thời, việc xác định chính xác đột biến gen có vai trò quyết định giúp phân biệt HLH nguyên phát với HLH thứ phát. Đề tài nhấn mạnh tầm quan trọng của gen STXBP2 (gây thể FHL5) – một gen chưa từng được nghiên cứu đột biến tại Việt Nam trước thời điểm này. Từ đó, chương xác lập 4 mục tiêu nghiên cứu cụ thể nhằm xây dựng và tối ưu quy trình giải trình tự DNA phục vụ phát hiện đột biến trên 19 exon của gen STXBP2.

Phần I: Tổng quan

Chương Tổng quan cung cấp hệ thống cơ sở lý thuyết toàn diện gồm 3 trụ cột chính:

1. Tổng quan về hội chứng HLH: Phân tích chi tiết khái niệm, phân loại thể nguyên phát (FHL1-5, hội chứng Griscelli type 2 do gen RAB27A, hội chứng Chediak-Higashi do gen LYST, hội chứng XLP-1 do SH2D1A, XLP-2 do BIRC4) và thể thứ phát. Trình bày số liệu dịch tễ học, cơ chế bệnh sinh liên quan đến sự suy giảm chức năng ly giải của tế bào CTL/NK dẫn đến kích hoạt đại thực bào giải phóng quá mức IFN-$\gamma$, TNF-$\alpha$, IL-1, IL-6. Tổng hợp các biểu hiện lâm sàng (sốt 91%, gan to 90%, lách to 84%, thiếu máu/giảm tiểu cầu 80%, vàng da 72%, triệu chứng thần kinh 47%), các chỉ số cận lâm sàng, tiêu chuẩn chẩn đoán HLH-2004 và các phác đồ điều trị quốc tế (HLH-94 kết hợp Etoposide, Dexamethasone, Cyclosporine A và HLH-2004).
2. Tổng quan về gen STXBP2: Trình bày chi tiết vị trí locus 19p13.2, kích thước gen (10.774 bp với 19 exon), cấu trúc và chức năng sinh học của protein Munc18-2 trong việc tương tác với Syntaxin 11 điều hòa phức hợp SNARE giải phóng hạt ly giải chứa perforin và granzyme B. Thống kê dữ liệu đột biến quốc tế trên cơ sở dữ liệu ClinVar (NCBI) và các đột biến phổ biến theo Pagel và cộng sự (2012) như c.1430C>T (p.Pro477Leu), c.1621G>A (p.Gly541Ser), c.1247-1G>C. Khái quát đặc điểm của các đa hình đơn nucleotide (SNP) trong hệ gen người.
3. Kỹ thuật di truyền phân tử: Trình bày nguyên lý phản ứng chuỗi Polymerase (PCR), nguyên lý điện di trên gel agarose, lịch sử và nguyên lý giải trình tự DNA theo phương pháp gián đoạn chuỗi của Sanger (sử dụng ddNTP) so với phương pháp hóa học của Maxam-Gilbert, nguyên lý hoạt động của máy giải trình tự mao quản tự động ABI 3500 Genetic Analyzer cùng các cơ sở dữ liệu trực tuyến (NCBI) và phần mềm CLC Sequence Viewer / CLC Main Workbench.

Phần II: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương này quy định chi tiết toàn bộ trang thiết bị, hóa chất, công cụ trực tuyến và quy trình thực nghiệm:

• Vật liệu và công cụ: Mẫu máu ngoại vi bệnh nhân HLH thu nhận theo tiêu chuẩn HLH-2004; các công cụ tin sinh học (NCBI Gene mã NG_016709, IDT OligoAnalyzer 3.1, Primer-BLAST, Polyphen-2, phần mềm CLC Main Workbench v5.5).
• Quy trình thực nghiệm chuẩn hóa:
  • Quy trình tách chiết gDNA từ mẫu máu bằng cột silica của bộ kit QIAamp DNA Blood Mini Kit, kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ bằng NanoDrop 2000.
  • Thiết lập thành phần phản ứng PCR thể tích $15\ \mu\text{l}$ với enzyme Takara Taq Hot Start và chu trình nhiệt 45 chu kỳ.
  • Kỹ thuật điện di gel agarose 1,5% nhuộm GelRed để kiểm tra kích thước sản phẩm.
  • Quy trình tinh sạch sản phẩm PCR bằng enzyme ExoSAP-IT ($37^\circ\text{C}$ trong 15 phút, vô hoạt ở $80^\circ\text{C}$ trong 15 phút).
  • Phản ứng Cycle Sequencing sử dụng BigDye Terminator v3.1 thể tích $9,8\ \mu\text{l}$ với 10 mồi giải trình tự xuôi/ngược chuyên biệt cho từng exon (Bảng mồi chi tiết gồm STXBP2-g1R, g3R, g4R, g6R, g8R, g9R, g11F, g15R, g16F, g19R).
  • Quy trình tủa sản phẩm Cycle Sequencing bằng muối $\text{NH}_4\text{OAc}$ 5M và Ethanol, hòa tan trong Hi-Di Formamide, biến tính nhiệt $96^\circ\text{C}$ trong 2 phút và nạp mẫu vào hệ thống ABI 3500 Genetic Analyzer.
  • Phân tích dữ liệu sắc ký đồ, gióng hàng so sánh với trình tự chuẩn trên CLC Main Workbench v5.5 và đánh giá tác động biến thể bằng Polyphen-2.

Phần III: Kết quả và thảo luận

Chương III trình bày chi tiết các phát hiện thu được từ cả hai bước nghiên cứu:

• Kết quả khảo sát in silico: Thu nhận thành công cấu trúc toàn bộ 10.774 bp của gen STXBP2 từ mã truy cập NG_016709. Thiết kế thành công 5 cặp mồi PCR đặc hiệu bao phủ 19 exon với các kích thước lý thuyết phân đoạn: Exon 1–4 (2.806 bp), Exon 5–6 (520 bp), Exon 7–13 (1.754 bp), Exon 14–16 (1.906 bp), Exon 17–19 (801 bp). Các mồi đều có nhiệt độ nóng chảy $T_m$ và nhiệt độ bắt cặp $T_a$ tương đồng, không tạo cấu trúc bậc hai bền vững và đạt độ đặc hiệu tuyệt đối khi kiểm tra bằng Primer-BLAST.
• Kết quả khảo sát thực nghiệm:
  • Tách chiết thành công gDNA từ mẫu máu bệnh phẩm, đo mật độ quang học trên NanoDrop 2000 xác nhận DNA thu được đạt nồng độ cao và tỷ lệ $A_{260}/A_{280}$ nằm trong giới hạn tinh sạch tiêu chuẩn ($1,7 - 2,0$).
  • Phản ứng PCR khuếch đại thành công cả 5 phân đoạn gen mục tiêu; kết quả điện di gel agarose 1,5% cho thấy các vạch sản phẩm sắc nét, sáng rõ, kích thước hoàn toàn trùng khớp với thang chuẩn 1kb Plus DNA Ladder và không xuất hiện vạch ở giếng chứng âm.
  • Tinh sạch thành công sản phẩm PCR bằng ExoSAP-IT loại bỏ hoàn toàn dNTP và mồi dư mà không làm suy hao nồng độ DNA khuôn mẫu.
  • Phản ứng Cycle Sequencing và phân tích điện di mao quản trên máy ABI 3500 Genetic Analyzer cho tín hiệu sắc ký đồ huỳnh quang rõ ràng, đường nền phẳng, đỉnh sóng tách biệt rõ nét.
  • Phân tích và so sánh trình tự nucleotide của 19 exon với chuỗi gDNA chuẩn bằng CLC Main Workbench v5.5, xác định các vị trí đồng hợp tử (1 đỉnh sóng) và dị hợp tử (2 đỉnh sóng chồng lấp), tra cứu các biến thể nucleotide trên NCBI dbSNP và phần mềm Polyphen-2.

Phần IV: Kết luận và đề nghị

Tác giả tổng kết lại các mục tiêu đã hoàn thành, khẳng định đã xây dựng thành công quy trình kỹ thuật hoàn chỉnh để khuếch đại và giải trình tự 19 exon gen STXBP2. Đề xuất các kiến nghị mở rộng nghiên cứu trên cỡ mẫu bệnh nhân lớn hơn nhằm đánh giá tần suất đột biến gen STXBP2 trong quần thể bệnh nhân HLH tại Việt Nam, phục vụ chẩn đoán xác định và tư vấn di truyền.

Kết quả và đóng góp

Kết quả kỹ thuật và số liệu thực nghiệm

Nghiên cứu đã đạt được các kết quả định lượng cụ thể được ghi nhận trong văn bản khóa luận:

• Thiết kế hệ thống mồi PCR và giải trình tự: Thiết lập thành công bộ 5 cặp mồi PCR khuếch đại phân đoạn dài bao phủ toàn bộ 19 exon của gen STXBP2 và bộ 10 mồi chuyên biệt cho phản ứng giải trình tự Cycle Sequencing:
  • Phân đoạn Exon 1 – 4: Kích thước sản phẩm khuếch đại đạt 2.806 bp.
  • Phân đoạn Exon 5 – 6: Kích thước sản phẩm khuếch đại đạt 520 bp.
  • Phân đoạn Exon 7 – 13: Kích thước sản phẩm khuếch đại đạt 1.754 bp.
  • Phân đoạn Exon 14 – 16: Kích thước sản phẩm khuếch đại đạt 1.906 bp.
  • Phân đoạn Exon 17 – 19: Kích thước sản phẩm khuếch đại đạt 801 bp.
• Tối ưu hóa quy trình luân nhiệt và phản ứng: Xác lập công thức phản ứng PCR thể tích nhỏ $15\ \mu\text{l}$ với Takara Taq Hot Start 5U/$\mu\text{l}$ qua 45 chu kỳ; quy trình tinh sạch ExoSAP-IT nhanh trong 30 phút ($37^\circ\text{C}$ và $80^\circ\text{C}$); phản ứng Cycle Sequencing với BigDye Terminator v3.1 thể tích $9,8\ \mu\text{l}$ qua 25 chu kỳ.
• Phân tích dữ liệu giải trình tự: Thu nhận thành công dữ liệu sắc ký đồ huỳnh quang của toàn bộ 19 exon trên hệ thống ABI 3500 Genetic Analyzer; phân tích sự biến đổi nucleotide ở trạng thái đồng hợp tử và dị hợp tử, tra cứu đối chiếu trên cơ sở dữ liệu NCBI và công cụ Polyphen-2.

Đóng góp khoa học và ứng dụng thực tiễn

• Hoàn thiện quy trình di truyền phân tử cho gen STXBP2 tại Việt Nam: Đây là công trình đầu tiên tại Việt Nam thiết lập quy trình hoàn chỉnh từ khâu thiết kế mồi, PCR, tinh sạch ExoSAP-IT đến giải trình tự chuỗi Sanger cho toàn bộ 19 exon của gen STXBP2.
• Bổ sung vào hệ thống chẩn đoán FHL: Nghiên cứu là bước tiếp nối quan trọng cho các công trình trước đây về gen PRF1 (FHL2) và UNC13D (FHL3), góp phần hoàn thiện bộ công cụ sinh học phân tử để tầm soát các nguyên nhân di truyền gây hội chứng thực bào máu gia đình tại Việt Nam.
• Giá trị hỗ trợ lâm sàng: Quy trình kỹ thuật cung cấp công cụ chẩn đoán xác định cho các bác sĩ lâm sàng, hỗ trợ phân biệt FHL với HLH thứ phát, định hướng chỉ định sớm liệu pháp ghép tế bào gốc tạo máu và cung cấp căn cứ khoa học cho công tác tư vấn di truyền phả hệ trước sinh.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế của nghiên cứu:
  • Quy mô khảo sát thực nghiệm ban đầu còn hạn chế về số lượng mẫu bệnh phẩm do khuôn khổ của một khóa luận tốt nghiệp đại học và tính chất hiếm gặp của bệnh lý HLH.
  • Kỹ thuật giải trình tự Sanger truyền thống dù có độ chính xác cao nhưng đòi hỏi thực hiện nhiều phản ứng giải trình tự đơn lẻ cho từng cụm exon.
• Hướng nghiên cứu tiếp theo được tác giả đề xuất:
  • Triển khai áp dụng quy trình kỹ thuật đã tối ưu hóa để khảo sát phát hiện đột biến gen STXBP2 trên các cỡ mẫu bệnh nhân HLH lớn hơn tại các bệnh viện huyết học và nhi khoa.
  • Hoàn thiện và chuẩn hóa quy trình thành xét nghiệm chẩn đoán phân tử thường quy tại các phòng xét nghiệm y sinh học phân tử.
  • Kết hợp tầm soát đồng thời các gen FHL khác (PRF1, UNC13D, STX11, RAB27A) để xây dựng bức tranh dịch tễ học di truyền phân tử toàn diện về hội chứng thực bào máu ở trẻ em Việt Nam.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo chuyên môn giá trị cho nhiều đối tượng trong lĩnh vực y sinh học:

• Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu viên: Thuộc các chuyên ngành Công nghệ sinh học, Y sinh học phân tử, Di truyền học, Huyết học - Truyền máu và Nhi khoa có thể tham khảo phương pháp luận kết hợp giữa mô phỏng tin sinh học (in silico) và thực nghiệm sinh học phân tử.
• Kỹ thuật viên phòng xét nghiệm di truyền: Có thể tham khảo trực tiếp các bảng thông số kỹ thuật chi tiết, bao gồm:
  • Trình tự 5 cặp mồi PCR và 10 mồi giải trình tự exon gen STXBP2.
  • Thành phần và chu trình luân nhiệt của phản ứng PCR thể tích $15\ \mu\text{l}$ dùng enzyme Takara Taq Hot Start.
  • Quy trình tinh sạch sản phẩm PCR bằng ExoSAP-IT và quy trình Cycle Sequencing với BigDye Terminator v3.1 kết hợp tủa muối $\text{NH}_4\text{OAc}$ nạp máy ABI 3500.
• Bác sĩ lâm sàng huyết học và nhi khoa: Cung cấp tài liệu tổng quan toàn diện về sinh bệnh học, tiêu chuẩn chẩn đoán HLH-2004 và ý nghĩa của việc phát hiện đột biến gen STXBP2 trong phân loại FHL5.

Câu hỏi thường gặp

1. Gen STXBP2 có cấu trúc như thế nào và đột biến gen này gây ra bệnh cảnh gì?
Gen STXBP2 (Syntaxin Binding Protein 2) nằm trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể số 19 tại vị trí 19p13.2 (từ nucleotide 7.625.590 đến 7.636.363), có tổng chiều dài 10.774 bp gồm 19 exon. Gen mã hóa protein Munc18-2 gồm 593 amino acid (kích thước 66,5 kDa) có chức năng điều khiển lắp ráp phức hợp SNARE để giải phóng các hạt ly giải chứa perforin và granzyme B từ tế bào CTL/NK. Đột biến trên gen STXBP2 dẫn đến hội chứng thực bào máu có tính chất gia đình thể 5 (FHL5).

2. Tại sao nghiên cứu lại chia 19 exon của gen STXBP2 thành 5 phân đoạn để thực hiện PCR?
Để tối ưu hóa hiệu quả khuếch đại và giải trình tự toàn bộ 19 exon, tác giả đã thiết kế 5 cặp mồi PCR tạo ra 5 phân đoạn có kích thước phù hợp: Exon 1–4 (2.806 bp), Exon 5–6 (520 bp), Exon 7–13 (1.754 bp), Exon 14–16 (1.906 bp), và Exon 17–19 (801 bp). Cách tiếp cận này giúp giảm thiểu số lượng phản ứng PCR tổng thể mà vẫn đảm bảo khuếch đại bao phủ toàn vẹn các vùng exon mục tiêu cùng các vị trí nối intron lân cận.

3. Quy trình tinh sạch sản phẩm PCR bằng enzyme ExoSAP-IT được thực hiện theo thông số nào?
Phản ứng tinh sạch được thực hiện với tổng thể tích $5\ \mu\text{l}$ (gồm $3\ \mu\text{l}$ sản phẩm PCR, $1\ \mu\text{l}$ enzyme ExoSAP-IT và $1\ \mu\text{l}$ $\text{H}_2\text{O}$). Chu trình nhiệt trên máy Mastercycler Pro S diễn ra ở $37^\circ\text{C}$ trong 15 phút để enzyme thủy phân mồi dư và dNTP, sau đó nâng lên $80^\circ\text{C}$ trong 15 phút để vô hoạt enzyme, và giữ mẫu ở $4^\circ\text{C}$.

4. Tiêu chuẩn chẩn đoán hội chứng thực bào máu HLH-2004 gồm những điều kiện gì?
HLH được chẩn đoán khi thỏa mãn ít nhất 1 trong 2 nhóm tiêu chuẩn: Nhóm 1 là chẩn đoán phân tử phát hiện đột biến trên các gen PRF1, UNC13D, STX11, hoặc STXBP2. Nhóm 2 là thỏa mãn ít nhất 5 trên 8 tiêu chí lâm sàng/xét nghiệm: Sốt $\ge 38,5^\circ\text{C} > 7$ ngày; Lách to $> 3\text{ cm}$; Giảm ít nhất 2 dòng tế bào máu; Tăng Triglyceride ($\ge 3,0\text{ mmol/l}$) và/hoặc giảm Fibrinogen ($< 150\text{ mg/dl}$); Hiện tượng thực bào máu ở tủy/gan/lách/hạch; Giảm hoạt tính tế bào NK; Ferritin $> 500\text{ ng/ml}$; Tăng thụ thể IL-2 hòa tan (sCD25 $> 2.400\text{ U/ml}$).

5. Hệ thống thiết bị và phần mềm chính được sử dụng để giải trình tự và phân tích đột biến trong khóa luận là gì?
Nghiên cứu sử dụng hóa chất BigDye Terminator v3.1 trên máy luân nhiệt Mastercycler Pro S (Eppendorf) cho phản ứng Cycle Sequencing, giải trình tự mao quản trên hệ thống ABI 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Dữ liệu trình tự được phân tích, gióng hàng bằng phần mềm CLC Main Workbench v5.5, đối chiếu với cơ sở dữ liệu NCBI (mã truy cập NG_016709) và dự đoán tác động biến thể bằng công cụ trực tuyến Polyphen-2.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Thị Lan Vi đã xây dựng và chuẩn hóa thành công quy trình kỹ thuật khuếch đại và giải trình tự toàn bộ 19 exon của gen STXBP2 bằng phương pháp Sanger cải tiến trên hệ thống ABI 3500. Công trình kết hợp chặt chẽ giữa thiết kế mô phỏng tin sinh học và thực nghiệm sinh học phân tử tối ưu, bao gồm các bước tách chiết gDNA, PCR 5 phân đoạn, tinh sạch bằng ExoSAP-IT và phân tích sắc ký đồ huỳnh quang. Kết quả nghiên cứu là tiền đề khoa học thực nghiệm quan trọng, bổ sung mảnh ghép gen STXBP2 (FHL5) vào hệ thống tầm soát di truyền hội chứng thực bào máu cùng với các gen PRF1 và UNC13D đã công bố trước đây tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Được biết đến đầu tiên vào năm 1939, hội chứng thực bào máu (Hemophagocytic Lymphohistiocytosis - HLH) biết đến như một rối loạn hiếm gặp, có thể đe dọa tính mạng, đặc trưng bởi phản ứng viêm rất nghiêm trọng, gây ra bởi sự tăng sinh các tế bào lympho và đại thực bào hoạt hóa quá mức, tăng cytokine, làm tổn thương tế bào, suy đa cơ quan. Những người mắc phải HLH thường biểu hiện các triệu chứng bệnh trong những tháng đầu hoặc năm đầu của bệnh. Các triệu chứng có thể bao gồm sốt, gan to, lách to, giảm tế bào máu ngoại vi và có thể có biểu hiện triệu chứng thần kinh trung ương đi kèm [29]. HLH được chia làm hai thể gồm: hội chứng thực bào máu nguyên phát (Primary HLH) và hội chứng thực bào máu thứ phát (Secondary HLH).

HLH nguyên phát hay còn được biết đến là HLH có tính chất gia đình (Familial Hemophagocytic Lymphohistiocytosis - FHL), là một bệnh di truyền lặn nằm trên nhiễm sắc thể thường do đột biến trên các gen PRF1, UNC13D, STX11, STXBP2 tương ứng với các subtype FHL2, FHL3, FHL4 và FHL5, được tìm thấy nhiều ở những thành viên cùng huyết thống cha mẹ và thường có biểu hiện lâm sàng lúc tuổi nhỏ.Tỷ lệ trẻ em mắc phải FHL dưới 1 tuổi ước tính khoảng 1,1/100. Trong đó, gen STXBP2 nằm trên nhiễm sắc thể số 19, có vai trò mã hóa cho protein Munc18-2 tham gia vào quá trình vận chuyển trong tế bào, điều khiển SNARE (các thụ thể protein gắn các yếu tố nhạy cảm N - ethylmaleimide hòa tan) đảm nhiệm việc lắp ráp phức hợp và giải phóng các hạt ly giải các tế bào nhiễm, do đó đột biến trên gen này là một trong những nguyên nhân gây ra FHL (còn biết đến với tên gọi FHL5) [43]. Những năm gần đây, FHL này ngày càng được chú ý nhiều hơn vì tầm quan trọng trong việc quyết định điều trị sớm với thuốc ức chế miễn dịch [5] mà việc sử dụng thuốc ức chế miễn dịch chỉ có thể tạm thời kiểm soát bệnh. Hiện nay, phương pháp ghép tế bào gốc tạo máu được coi là cách duy nhất có khả năng chữa khỏi bệnh.

1 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THỊ LAN VI Xuất phát từ thực tiễn trên, nhóm tiến hành thực hiện đề tài “KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN GEN STXBP2 TRONG HỘI CHỨNG THỰC BÀO MÁU BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ DNA” với mục tiêu cụ thể sau: − Khuếch đại thành công 19 exon gen STXBP2. − Thực hiện giải trình tự bằng phương pháp Sanger. − Phân tích và khảo sát đột biến tại các vùng exon của gen mục tiêu. − Tiền đề cho nghiên cứu phát hiện đột biến gen STXBP2 trong hội chứng thực bào máu tiếp theo với số lượng mẫu lớn, để có thể ứng dụng kỹ thuật vào chẩn đoán trên lâm sàng, giúp các bác sĩ lâm sàng đưa ra chuẩn đoán sớm, liệu pháp điều trị thích hợp cũng như tư vấn di truyền cho bố, mẹ, anh/chị, em ruột.

2 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THỊ LAN VI PHẦN I: TỔNG QUAN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THỊ LAN VI PHẦN I. Tổng quan về HLH 1. Khái niệm Hội chứng thực bào máu (Hemophagocytic Lymphohistiocytosis - HLH) được Scott và Robb-Smith mô tả đầu tiên vào năm 1939 [36], được biết đến là một rối loạn hiếm gặp, có thể đe dọa tính mạng, đặc trưng bởi phản ứng viêm rất nghiêm trọng, gây ra bởi sự tăng sinh các tế bào lympho và đại thực bào hoạt hóa quá mức, tăng cytokine, làm tổn thương tế bào, suy đa cơ quan [20]. Những người mắc phải HLH thường biểu hiện các triệu chứng bệnh trong những tháng đầu hoặc năm đầu của bệnh.

Các triệu chứng có thể bao gồm sốt, gan lách to, giảm tế bào máu ngoại vi, tăng triglyceride máu, giảm fibrinogen máu, thường có co giật và có thể có biểu hiện triệu chứng thần kinh trung ương đi kèm [29]. Phân loại HLH được chia làm hai thể bao gồm: HLH thể nguyên phát hay HLH có tính chất gia đình (Primary or Familial HLH) chia thành 5 subtype tương ứng với sự bất thường trên các gen PRF1, UNC13D, STX11, STXBP2 và HLH thể thứ phát (Secondary HLH) [29]. HLH nguyên phát HLH nguyên phát được phân thành 2 nhóm nhỏ: (1) HLH có tính chất gia đình (FHL) và (2) HLH liên quan tới sự thiếu hụt bẩm sinh của hệ thống miễn dịch như hội chứng Griscelli type 2 (GS2), hội chứng Chediak- Higashi (CHS) và rối loạn thâm nhiễm lympho liên quan đến nhiễm sắc thể X type 1 và 2 (XLP1, XLP2) [28]. FHL là bệnh di truyền do gen lặn nằm trên nhiễm sắc thể thường (gồm nhiễm sắc thể số 6, 9, 10, 17 và 19) hoặc nhiễm sắc thể giới tính X [7].

Có thể tự xuất hiện hoặc khởi phát sau khi nhiễm trùng, thường có biểu hiện lâm sàng từ lúc tuổi nhỏ, tỷ lệ trẻ em mắc bệnh dưới 1 tuổi là 1,1/100. Tuy nhiên cũng không loại trừ trường hợp FHL ở trẻ lớn hơn [20] và tỷ lệ mắc bệnh là như nhau ở cả nam và nữ. 3 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THỊ LAN VI 1. HLH thứ phát HLH thứ phát (Secondary HLH) hay HLH mắc phải chiếm tỷ lệ cao hơn HLH nguyên phát, thường xảy ra sau một yếu tố khởi phát thường là sau nhiễm siêu vi.

Thể thứ phát có thể tìm thấy trong các bệnh tự miễn, bệnh ác tính (bạch cầu huyết, lymphoma) và bệnh do rối loạn chuyển hóa [1, 23] có thể gặp ở tất cả các lứa tuổi nhưng thường xuất hiện ở trẻ lớn và người lớn [6]. Cả hai nhóm HLH thứ phát và FHL đều có thể khởi phát sau quá trình nhiễm khuẩn, nên rất khó có thể phân biệt hai nhóm này bằng các triệu chứng lâm sàng nếu không sử dụng các phương pháp xét nghiệm sinh học phân tử. Nguyên nhân Ở HLH di truyền hay FHL gây ra do sự bất thường về gen nằm trên các nhiễm sắc thể thường số 6, 9, 10, 17 và 19 chiếm khoảng 25% các trường hợp HLH [7]. HLH thứ phát gây ra do yếu tố gia đình hoặc gen, thường được tìm thấy trong các bệnh nhiễm trùng, bệnh tự viêm, tự miễn (được biết đến phổ biến như hội chứng hoạt hóa đại thực bào - MAS), bệnh lý ác tính, ức chế miễn dịch, cấy ghép tế bào gốc tạo máu, cấy ghép nội tạng, nhiễm HIV và các bệnh chuyển hóa [1, 29].

Nguyên nhân gây HLH ở cả 2 thể nguyên phát và thứ phát được trình bày chi tiết trong Bảng 1. 4 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THỊ LAN VI Bảng 1. Nguyên nhân dẫn đến HLH [28]. Vị trí Phân loại HLH Gen Protein nhiễm sắc thể HLH nguyên phát HLH có tính chất gia đình (FHL) FHL1 Chưa xác định Chưa xác định 9q21.3-22 FHL2 PRF1 Perforin 10q21-22 FHL3 UNC13D Munc 13-4 17q25 FHL4 STX11 Syntaxin 11 6q24 Protein 2 gắn FHL5 STXBP2 vào Syntaxin 19p13.2-3 hay Munc 18-2 Hội chứng thiếu hụt miễn dịch liên quan đến HLH nguyên phát Hội chứng Griscelli type 2 RAB27A Rab27a 1q42.2 Hội chứng Chediak- Higashi LYST Lyst 15q21 XLP - 1 SH2D1A SAP xq25 XLP - 2 BIRC4 XIAP xq25 Ngoài ra còn có các bệnh miễn dịch hiếm gặp như HPS-2, SCID, ITK HLH thứ phát Tác nhân nhiễm trùng Bệnh tự viêm và tự miễn (MAS) Bệnh lý ác tính Bệnh ức chế miễn dịch, cấy ghép tế bào gốc tạo máu, cấy ghép nội tạng, HIV và các bệnh rối loạn chuyển hóa 5 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THỊ LAN VI Chú thích: − XLP-1: rối loạn thâm nhiễm Lympho liên quan đến nhiễm sắc thể X type 1.

− XLP-2: rối loạn thâm nhiễm Lympho liên quan đến nhiễm sắc thể X type 2. − HPS-2: Hội chứng Hermansky-Pudlak type 2 (Hermansky-Pudlak syndrome 2). − SCID: Bệnh thiếu hụt miễn dịch tổ hợp trầm trọng (severe combined immunodeficiency). − ITK: interleukin-2 inducible T-cell kinase.

Dịch tễ học Tỷ lệ mắc hội chứng HLH đã được báo cáo là 1/50. Tuy nhiên, các nghiên cứu chưa ấn bản ước tính con số có thể tăng hơn một ít theo thời gian vì các nhà lâm sàng gần đây đã có cải thiện về việc phát hiện triệu chứng lâm sàng để đưa ra các chẩn đoán chính xác về bệnh. Theo đó, một ước tính gần đây về tỷ lệ mắc HLH ở những người dưới 18 tuổi là 1,07/100. Tỷ lệ mắc FHL ước tính ở Thụy Điển là 0,12/100.000 trẻ em dưới 15 tuổi mỗi năm hoặc với tần suất 1/50.000 trẻ đẻ sống [31], hầu như các trường hợp mắc bệnh đều được chẩn đoán trong vòng một năm đầu sau sanh [20] và tỷ lệ mắc bệnh là như nhau ở cả nam và nữ.

Tuy nhiên, cũng không loại trừ chuẩn đoán FHL ở trẻ trên 1 tuổi [40]. Tỷ lệ mắc HLH ở người lớn mặc dù không được biết chính xác, nhưng người ta ước tính rằng có khoảng 1/2.000 người lớn nhập viện tại các trung tâm y tế địa phương [34, 35]. Năm khiếm khuyết di truyền FHL đã được xác định, tương ứng với 5 subtype của FHL (Bảng 1. Tần số xuất hiện của các subtype HLH là khác nhau giữa các chủng tộc [41].

Ở Châu Á có khoảng 70 - 80% ở bệnh nhân FHL biểu hiện bệnh dưới 1 tuổi, và chỉ có 10% bệnh nhân có triệu chứng biểu hiện trong giai đoạn sơ sinh [29]. Các trường hợp FHL hầu như đều tử vong nếu không được điều trị, thời gian sống trung bình được báo cáo trong các nghiên cứu là khác nhau từ 2 - 6 tháng sau khi được chẩn đoán [8]. 6 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THỊ LAN VI Các trường hợp được chẩn đoán HLH thứ phát thường đi kèm với nhiễm trùng, đặc biệt là nhiễm EBV. Tại Nhật Bản, khoảng 40% bệnh nhân HLH có liên quan đến nhiễm EBV [26].

HLH phát triển trong bệnh lý ác tính, được biết với tên gọi là bệnh ác tính liên quan đến HLH (MAHS). Trong một nghiên cứu với tất cả 52 trẻ mắc phải MAHS thì có 60% trường hợp liên kết với u lympho không Hodgkin (Non- hodgkin’s lymphoma), tiếp theo là bệnh bạch cầu cấp (Leukemias), hội chứng rối loạn sinh tủy (Myelodysplastic syndromes), bệnh mụ bào (Langerhans cell histiocytosis). Ngoài ra, HLH thứ phát còn được tìm thấy trong các trường hợp ức chế miễn dịch, sau khi cấy ghép [30]. Trái ngược với FHL, HLH thứ phát thường xuất hiện ở độ tuổi lớn hơn.

HLH thứ phát trên một số bệnh nhân có thể tự giới hạn vì bệnh nhân có thể phục hồi hoàn toàn sau khi được điều trị chăm sóc hỗ trợ (tiêm immunoglobulin tĩnh mạch). Tuy nhiên, sự thuyên giảm lâu dài không cần sử dụng liệu pháp ức chế miễn dịch và gây độc tế bào là không thể trong phần lớn các bệnh nhân HLH ở người lớn có triệu chứng trên hệ thần kinh trung ương (CNS).