Dòng hóa biểu hiện và tinh chế protein alpha momorcharin trong e coli tiềm năng kháng nấm nguy hại trong nông nghiệp

Chuyên khảo nông nghiệp phân tích Dòng hóa biểu hiện và tinh chế protein alpha momorcharin trong e coli tiềm năng kháng nấm nguy hại, đánh giá các khía cạnh quan trọng, đề xuất

• Tác giả: Nguyễn Thị Thu Thảo
• Người hướng dẫn: TS. Đặng Thanh Dũng
• Trường học: Trường Đại Học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Dòng Hóa, Biểu Hiện Và Tinh Chế Protein Alpha-Momorcharin Trong E. Coli Tiềm Năng Kháng Nấm Nguy Hại Trong Nông Nghiệp
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Nguồn gốc
• 1.2. Cấu trúc của α-MMC
• 1.3. Cơ chế hoạt động của protein α-MMC
• 1.4. Vai trò sinh học và tiềm năng của protein α-MMC
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 2.2. Vật liệu sinh học
• 2.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và môi trường
• 2.4. Phương pháp thực hiện
• 2.4.1. Dòng hóa tạo vector pTD7 trong E. coli
• 2.4.2. Phản ứng PCR thu nhận gen mục tiêu α-MMC
• 2.4.3. Phản ứng cắt mở vòng plasmid pET28a và xử lý gene mục tiêu
• 2.4.4. Phản ứng nối gene mục tiêu vào plasmid pET-28a
• 2.4.5. Biến nạp sản phẩm nối vào tế bào chủ E. coli DH5α khả nạp
• 2.4.6. Sàng lọc dòng tế bào E. coli DH5α mang vector pTD7
• 2.4.7. E. coli BL21(DE3) mang vector tái tổ hợp pTD7 biểu hiện protein α-MMC
• 2.4.8. Biến nạp tạo chủng E. coli BL21(DE3) mang vector tái tổ hợp pTD7
• 2.4.9. Kiểm tra biểu hiện của protein α-MMC trong chủng E. coli
• 2.4.10. Tinh chế protein α-MMC
• 2.4.11. Khảo sát hoạt tính kháng nấm của protein α-MMC
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Dòng hóa tạo vector pTD7-MMC
• 3.2. Phản ứng PCR thu nhận gen α-MMC
• 3.3. Tạo vector tái tổ hợp pTD7
• 3.4. Sàng lọc các dòng tế bào E. coli DH5α mang vector pTD7
• 3.5. E. coli BL21(DE3) mang vector pTD7-MMC và kiểm tra sự biểu hiện protein α-MMC
• 3.6. Tinh chế protein α-MMC
• 3.7. Khảo sát hoạt tính kháng nấm của protein α-MMC
• 4. KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Protein Alpha Momorcharin và Ứng Dụng 55 Ký Tự

Alpha-momorcharin (α-MMC) là một protein thuộc nhóm RIPs (ribosome inactivating proteins), nổi bật với hoạt tính rRNA N-glicosidase. α-MMC có khả năng bất hoạt ribosome, ức chế tổng hợp protein, và được tìm thấy ở nhiều loài thực vật. Nghiên cứu cho thấy RIPs xuất hiện ở trên 50 loài thuộc 14 họ thực vật, cả cây một và hai lá mầm. RIPs không chỉ có ở họ Bầu bí (Cucurbitaceae) mà còn ở nhiều họ khác như Cẩm chướng (Caryophylaceae), Thầu dầu (Euphorbiaceae), Hòa thảo (Poaceae), họ Đậu (Fabaceae), họ Hoa phấn (Nygtaginaceae). RIPs tồn tại ở hầu hết các bộ phận của cây, đặc biệt là ở hạt và quả. Theo Stirpe (1982), RIPs được phân chia thành hai loại chính là loại một và loại hai. Protein α-MMC thuộc loại một, là một chuỗi polypeptide đơn với trọng lượng phân tử khoảng 29 kDa, được Yeung và cộng sự (1985) tinh chế từ hạt mướp đắng (Momordica charantia).

1.1. Nguồn Gốc và Phân Loại Protein Alpha Momorcharin RIPs

Theo Stirpe (1982) protein α-MMC thuộc nhóm RIPs (ribosome inactivating proteins) là những độc tố thực vật có các đặc tính sinh - dược học rất đa dạng trong đó nổi bật là hoạt tính rRNA N-glicosidase. Do đó, α-MMC có khả năng bất hoạt các ribosome trong tế bào nhân thực bằng cách ức chế sự kéo dài của chuỗi polypeptide dẫn đến ức chế tổng hợp protein trong giai đoạn dịch mã của tế bào. Cấu trúc không gian của α –MMC [Protein Data Bank file 1aha] RIPs được phát hiện ở hơn 50 loài thuộc 14 họ thực vật, bao gồm cả cây một và hai lá mầm của thực vật hạt kín.

1.2. Cấu Trúc và Đặc Điểm Sinh Học Của Alpha Momorcharin

Protein α-MMC (CAA40869.1) thuộc nhóm protein bất hoạt ribosome được tìm thấy trong hạt trái mướp đắng (hay trái khổ qua) gồm 286 amino acid. Trong đó, tiểu phần hoạt tính có 246 amino acid (từ vị trí amino acid 24 đến vị trí amino acid 269) với tổng trọng lượng cấu trúc khoảng 29kDa.

II. Vấn Đề Nấm Bệnh Nguy Hại và Giải Pháp Nông Nghiệp 58 Ký Tự

Nông nghiệp Việt Nam đang đối mặt với thách thức lớn từ dịch bệnh, đặc biệt là do nấm gây ra. Các biện pháp truyền thống như chọn giống, luân canh, cải tạo đất chưa đủ hiệu quả. Việc lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học gây mất cân bằng sinh thái, ô nhiễm môi trường và nguy cơ kháng thuốc. Kỹ thuật biến đổi gen (GMO) còn nhiều tranh cãi và hạn chế ứng dụng. Theo Doehlemann và cs (2017), dịch bệnh do nấm, virus và vi khuẩn gây ra thiệt hại lớn cho sản xuất nông nghiệp. Cần có giải pháp thay thế thuốc hóa học, an toàn và hiệu quả hơn. Việc sử dụng các chất chiết xuất từ thực vật được xem là lựa chọn tốt nhất vì hạn chế tác động tới môi trường sinh thái và ít gây nguy hiểm tới người tiêu dùng. Alpha-momorcharin (α-MMC) có triển vọng lớn như một giải pháp thay thế.

2.1. Tác Hại Của Nấm Bệnh Trong Nông Nghiệp Hiện Đại

Việt Nam là nước có truyền thống phát triển nông nghiệp từ lâu đời nay vì thế việc trồng và xuất khẩu nông sản ngày càng đạt kết quả cao. Tuy nhiên vấn đề khó khăn mà nền nông nghiệp ở Việt Nam cũng như trên toàn thế giới đang gặp phải đó là dịch bệnh phát sinh trong đó nấm, virus và vi khuẩn là các tác nhân gây bệnh chính. Đây là nguyên nhân dẫn đến các thiệt hại lớn cho sản xuất nông nghiệp trong nước cũng như trên toàn thế giới (Doehlemann và cs, 2017).

2.2. Hậu Quả Của Việc Lạm Dụng Thuốc Bảo Vệ Thực Vật Hóa Học

Để làm giảm thiệt hại và tăng năng suất cho cây trồng chọi với dịch bệnh do nấm gây ra, hiện nay người nông dân đã và đang sử dụng các biện pháp phòng và trị bệnh như chọn giống sạch bệnh hay kháng bệnh, luân canh, xen canh, cải tạo đất để tiêu diệt các tác nhân gây bệnh, vệ sinh đồng ruộng sau mỗi vụ thu hoạch tuy nhiên hiệu quả đạt được từ các phương pháp này chưa cao. Vì thế họ đã sử dụng liên tục các loại thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc hóa học trong canh tác nông nghiệp. Điều này gây mất cân bằng sinh thái trầm trọng, ảnh hưởng tới hệ sinh vật và vi sinh vật trong đất, dẫn tới hiện tượng kháng thuốc, gây ô nhiễm môi trường đất, ô nhiễm nguồn nước thậm chí lượng thuốc hóa học bị tích lũy trong nông sản dễ dẫn tới nhiễm độc cho con người.

III. Phương Pháp Dòng Hóa và Biểu Hiện Protein Alpha MMC 59 Ký Tự

Sử dụng hệ thống E. coli để sản xuất protein α-MMC đang được quan tâm. Đề tài nghiên cứu tập trung vào quá trình dòng hóa, biểu hiện và tinh chế protein α-MMC trong E. coli nhằm tạo ra một nguồn cung cấp ổn định và hiệu quả. Các bước bao gồm: tạo dòng vector tái tổ hợp pTD7 mang gene α-MMC, biến nạp vào E. coli BL21(DE3), nuôi cấy, cảm ứng biểu hiện, và tinh chế protein. Mục tiêu là thu được protein có độ tinh sạch cao, sẵn sàng cho các nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính kháng nấm và ứng dụng trong nông nghiệp. Việc này giúp khắc phục khó khăn trong chiết xuất protein từ hạt mướp đắng. Đề tài: “ DÒNG HOÁ, BIỂU HIỆN VÀ TINH CHẾ PROTEIN ALPHA-MOMORCHARIN TRONG E. COLI TIỀM NĂNG KHÁNG NẤM NGUY HẠI TRONG NÔNG NGHIỆP”.

3.1. Tạo Dòng Vector Tái Tổ Hợp Mang Gene Alpha Momorcharin

Thiết kế và tạo dòng vector tái tổ hợp pTD7 mang gene α-MMC. coli BL21(DE3) mang vector tái tổ hợp pTD7.

3.2. Biểu Hiện Protein Alpha Momorcharin trong E. coli BL21 DE3

• Biểu hiện, nuôi cấy và cảm ứng với chất cảm ứng sau đó kiểm tra biểu hiện.

IV. Quy Trình Tinh Chế và Đánh Giá Hoạt Tính Kháng Nấm 59 Ký Tự

Sau khi biểu hiện, protein α-MMC được tinh chế để loại bỏ các tạp chất và thu được sản phẩm có độ tinh khiết cao. Quá trình này có thể bao gồm các bước như sắc ký ái lực, sắc ký trao đổi ion, và lọc gel. Hoạt tính kháng nấm của protein được đánh giá thông qua các thử nghiệm in vitro trên các chủng nấm gây bệnh quan trọng trong nông nghiệp, như Fusarium spp., Aspergillus spp., và Magnaporthe grisea. Kết quả sẽ cho thấy khả năng ức chế sự phát triển của nấm và tiềm năng ứng dụng trong kiểm soát bệnh hại cây trồng. Việc khảo sát hoạt tính kháng nấm của protein α-MMC được tiến hành để xác định hiệu quả.

4.1. Các Bước Tinh Chế Protein Alpha Momorcharin Hiệu Quả

• Tinh chế protein α-MMC.

4.2. Khảo Sát Hoạt Tính Kháng Nấm Của Protein Tinh Chế

• Thử nghiệm khảo sát hoạt tính kháng nấm của protein α-MMC.

V. Kết Quả Nghiên Cứu Tiềm Năng Ứng Dụng Alpha Momorcharin 57 Ký Tự

Nghiên cứu của Zhu và cộng sự (2013) đã chứng minh hoạt tính kháng virus rộng của α-MMC, bao gồm Chilli veinal mottle virus (Chi VMV), Cucumber mosaic virus (CMV), và Tobacco mosaic virus (TMV), cũng như khả năng kháng nhiều loại nấm gây bệnh cho cây trồng như Fusarium spp., Aspergillus spp., Sclerotinia sclerotiorum, Bipolaris maydis, và Magnaporthe grisea. Điều này mở ra triển vọng lớn trong việc sử dụng α-MMC như một giải pháp thay thế để phòng và kiểm soát bệnh do nấm gây ra. Hiện nay, Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu về protein α-MMC.

5.1. Hoạt Tính Kháng Virus và Nấm Bệnh Của Alpha Momorcharin

Đặc biệt, theo công trình nghiên cứu của Zhu và cộng sự (2013), cho thấy hoạt tính kháng virus của chất này khá rộng: kháng được với Chilli veinal mottle virus (Chi VMV), Cucumber mosaic virus (CMV), Tobacco mosaic virus (TMV), kháng nhiều loại nấm gây bệnh cho cây trồng bao gồm: nấm Fusarium spp., nấm Aspergillus spp., nấm Sclerotinia sclerotiorum, nấm Bipolaris maydis, nấm Magnaporthe grisea. Qua đó cho thấy triển vọng to lớn khi sử dụng α-MMC như là một giải pháp thay thế để đề phòng và kiểm soát bệnh do nấm gây ra.

5.2. Ứng Dụng Thực Tiễn trong Nông Nghiệp Bền Vững

Tuy nhiên, quá trình chiết xuất protein α-MMC từ hạt trái mướp đắng còn gặp nhiều khó khăn trong việc thu nhận protein có độ tinh sạch cao cũng như khó khăn trong việc triển khai ứng dụng α-MMC với quy mô lớn trong nông nghiệp. Nhằm giải quyết vấn đề trên, việc sử dụng hệ thống vi khuẩn cho sản xuất α-MMC đang được quan tâm.

VI. Kết Luận và Hướng Phát Triển Protein Alpha Momorcharin 57 Ký Tự

Nghiên cứu về dòng hóa, biểu hiện và tinh chế protein α-MMC trong E. coli mở ra tiềm năng lớn trong việc phát triển các chế phẩm sinh học kháng nấm an toàn và hiệu quả cho nông nghiệp. Việc sản xuất α-MMC bằng hệ thống vi khuẩn giúp khắc phục các hạn chế của việc chiết xuất từ nguồn thực vật tự nhiên. Hướng phát triển tiếp theo bao gồm tối ưu hóa quy trình sản xuất, đánh giá hiệu quả trên các loại cây trồng khác nhau, và nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động của α-MMC lên nấm bệnh. Ngoài ra, cần chú trọng đến an toàn sinh học và khả năng ứng dụng thực tiễn của sản phẩm. Việc tạo ra chế phẩm α-MMC giúp phát triển nền nông nghiệp bền vững.

6.1. Tóm Tắt Kết Quả và Ý Nghĩa Khoa Học

Hiện nay, Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu về protein α-MMC do đó chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “ DÒNG HOÁ, BIỂU HIỆN VÀ TINH CHẾ PROTEIN ALPHA-MOMORCHARIN TRONG E. COLI TIỀM NĂNG KHÁNG NẤM NGUY HẠI TRONG NÔNG NGHIỆP”.

6.2. Hướng Nghiên Cứu và Ứng Dụng Trong Tương Lai

❖ Mục tiêu - Tạo dòng, biểu hiện, thu nhận và tinh chế protein α-MMC với độ tinh sạch cao trong hệ thống vi khuẩn E. coli nhằm kháng nấm bệnh trong cây trồng đồng thời tạo nền tảng cho các nghiên cứu sâu hơn phục vụ cho việc phát triển nền nông nghiệp bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU Nguyễn Thị Thu Thảo Khóa luận tốt nghiệp Trang 4 GVHD: ĐẶNG THANH DŨNG 1. Nguồn gốc Theo Stirpe (1982) protein α-MMC thuộc nhóm RIPs (ribosome inactivating proteins) là những độc tố thực vật có các đặc tính sinh - dược học rất đa dạng trong đó nổi bật là hoạt tính rRNA N-glicosidase. Do đó, α-MMC có khả năng bất hoạt các ribosome trong tế bào nhân thực bằng cách ức chế sự kéo dài của chuỗi polypeptide dẫn đến ức chế tổng hợp protein trong giai đoạn dịch mã của tế bào.

Cấu trúc không gian của α –MMC [Protein Data Bank file 1aha] RIPs được phát hiện ở hơn 50 loài thuộc 14 họ thực vật, bao gồm cả cây một và hai lá mầm của thực vật hạt kín. RIPs không chỉ được tìm thấy ở họ Bầu bí (Cucurbitaceae) với rất nhiều chi gồm các cây thuốc quý như Trichosanthes, Luffa, mà còn thấy ở rất nhiều các họ thực vật khác như Cẩm chướng (Caryophylaceae), Thầu dầu (Euphorbiaceae), Hoà thảo (Poaceae), Họ đậu (Fabaceae), họ Hoa phấn (Nygtaginaceae). RIPs được tìm thấy ở hầu hết các bộ phận của cây như hạt, rễ, lá, củ, quả, vỏ cây. đặc biệt tồn tại nhiều ở hạt và quả, ít hơn ở lá và thân.

Sự phân bố RIPs trên các mô khác nhau tùy thuộc vào từng loài thực vật (Brar, 2017). Hiện nay, RIPs được phân chia chủ yếu thành hai loại là RIPs loại một và RIPs loại hai. RIPs loại một (Hình 1.2A) bao gồm một chuỗi polypeptide đơn với hoạt tính N-glycosidase. RIPs loại hai chứa hai chuỗi polypeptide (chuỗi A và chuỗi B, hình 1.2B) được liên kết với nhau thông qua cầu nối disulfide, chuỗi A hoạt động như RIPs loại một với trọng lượng khoảng 30 kDa còn chuỗi B là một phân tử có hoạt tính cần Nguyễn Thị Thu Thảo Khóa luận tốt nghiệp Trang 5 GVHD: ĐẶNG THANH DŨNG cho sự bám vào thụ thể đầu N galactosyl trên bề mặt tế bào đích và tạo điều kiện cho chuỗi A xâm nhập vào tế bào chất của tế bào.

Do đó, RIP loại hai có khả năng gây độc cao. Ngoài ra còn có RIPs loại bốn (Hình 1.2C) gồm hai chuỗi A với hoạt tính N-glycosidases hoạt động trên rRNA nhân thực và hai chuỗi B với chức năng chưa được biết đến. Khi miền bổ sung có chức năng chưa biết được loại bỏ, protein hoạt động tương tự như RIP loại một (Zhu và cs, 2018). Sơ đồ phân loại protein bất hoạt ribosome thực vật (RIPs).

Trong đó, protein α-MMC thuộc RIPs loại một là một chuỗi polypeptide đơn với trọng lượng phân tử khoảng 29 kDa được Yeung và cộng sự (1985) tinh chế thành công từ hạt trái mướp đắng (Momordica charantia). Phân loại trái mướp đắng theo Singh và cộng sự (2016) như sau: Họ Cucurbitaceae ( bầu, bí) Chi Momordica Loài M.charanti Tên Momordica chinenus, Momordica elegans, Momordica indica, đồng nghĩa Momordica operculata, Momordica sinenuns và Silyos fauriei. Hình ảnh quả mướp đắng (giống Ấn Độ) (A) lát cắt thẳng đứng của quả (B) mặt cắt ngang của quả (C) nhìn gần hơn về quả (D) Nguyễn Thị Thu Thảo Khóa luận tốt nghiệp Trang 6 GVHD: ĐẶNG THANH DŨNG 1. Cấu trúc của α-MMC.

Protein α-MMC (CAA40869.1) thuộc nhóm protein bất hoạt ribosome được tìm thấy trong hạt trái mướp đắng (hay trái khổ qua) gồm 286 amino acid. Trong đó, tiểu phần hoạt tính có 246 amino acid (từ vị trí amino acid 24 đến vị trí amino acid 269) với tổng trọng lượng cấu trúc khoảng 29kDa. Empty: không có cấu trúc thứ cấp B: cầu nối beta S: điểm nối T: chỗ uốn cong E: sợi nếp gấp beta H: chuỗi xoắn alpha Hình 1. Chuỗi trình tự của α-MMC (Nguồn ngân hàng dữ liệu protein PDB).

Cấu trúc của α-MMC đã được xác định thông qua phương pháp nhiễu xạ tia X ở độ phân giải 2. Chuỗi polypeptide của α-MMC gấp thành hai miền tương tác tạo thành một khe hở trên bề mặt protein bao gồm 9 α-helices và 10 β-sheets: α1,11- 23; α2, 86-91; α3,111-118; α4, 129-139; α5, 144-163; α6, 165-173; α7, 183-191; α8, 192-202; α9, 231-234; β1, 3-5; β2, 27-31; β3, 34-37; β4, 47-53; β5, 59-65; β6, 70-76; Nguyễn Thị Thu Thảo Khóa luận tốt nghiệp Trang 7 GVHD: ĐẶNG THANH DŨNG β7, 79-82; β8, 101-104; β9, 208-215; β10, 223-227. Trong đó tương tác kỵ nước, cặp ion và liên kết hydro giúp ổn định toàn bộ nếp gấp và cấu trúc thứ cấp của protein Hình 1. Biểu đồ vị trí cấu trúc thứ cấp của phân tử α -MMC khi nhìn về phía khe hở vị trí hoạt động ( Ren và cs, 1994).

Vị trí hoạt động của α-MMC nằm ở giữa khe hở và bao gồm các amino axit tham gia vào hoạt động. Trong đó Tyr70, Tyr111, Glu160, Argl63 và Trp192 là bất biến hình thành trung tâm hoạt động và phần còn lại được bảo tồn cao trong protein không liên quan trực tiếp đến việc hình thành các trung tâm hoạt động, như Phe-4, Tyr-14, Phe-17, Arg-22, Leu-52 và Arg-122. Những axit amin này liên quan đến sự ổn định hình học của các trung tâm hoạt động (Ren và cs, 1994). Cơ chế hoạt động của protein α-MMC Protein α-MMC đã được chứng minh có nhiều hoạt tính quan trọng trong nông nghiệp như kháng nấm và kháng virus.

Mô hình cơ chế phòng ngự trực tiếp của α- MMC chống lại mầm bệnh nấm và virus được mô tả như trong Hình 1. α-MMC có thể ức chế mầm bệnh trực tiếp bằng cách xâm nhập vào vách tế bào thông qua lưới nội chất (1) để vào tế bào chất và dựa vào hoạt tính N-glycosidase (2) có thể nhắm đến mầm bệnh ở vùng nội bào hoặc ngoại bào dẫn đến ức chế sự phát triển tổng hợp protein do đó ngăn chặn sự phát triển của nấm và tiêu diệt tế bào nấm (3). Nhưng ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy nguyên nhân chính gây độc trong các tế bào mầm bệnh là do khả năng gây ra ức chế ngược apoptosis của chúng Nguyễn Thị Thu Thảo Khóa luận tốt nghiệp Trang 8 GVHD: ĐẶNG THANH DŨNG (4). Protein α-MMC hoạt động ức chế tổng hợp protein nhờ vào hoạt tính xúc tác N- glycosidase để giải phóng một phân tử adenin đặc trưng (A4324 đánh dấu dựa trên 28S rRNA của gan chuột) do đó phân cắt cầu nối N-glycosidic giữa adenine đặc hiệu và ribose (6).

Quá trình khử purine do thủy phân liên kết N-glycosidic diễn ra trên vùng bảo tồn cao Sarcin/Ricin Loop của rRNA làm gián đoạn sự tương tác của yếu tố kéo dài II (EF-2) khiến ribosome không thể bám vào và cuối cùng ức chế tổng hợp protein ở bước dịch mã gây chết tế bào. Mô hình cơ chế phòng vệ của α-MMC chống lại mầm bệnh (Brar, 2017). Cụ thể trong cấu trúc tiểu phần hoạt tính, ba amino acid: Ile71, Glu160 và Arg163 đóng vai trò quan trọng trong khả năng xúc tác thủy phân của α-MMC. Trong khi Glu160 tích điện âm đóng vai trò ổn định ion oxycarbonium, những liên kết hydrogen ở vị trí N1 và N3 của Adenine với Ile71 và Arg163 tạo điều kiện thuận lợi cho việc α-MMC bẻ gãy liên kết cộng hóa trị giữa N9 của Adenine và C1 của khung Nguyễn Thị Thu Thảo Khóa luận tốt nghiệp Trang 9 GVHD: ĐẶNG THANH DŨNG đường (Hình 1.

Sự bẻ gãy liên kết giữa Adenine và khung đường bởi α-MMC dẫn đến bất hoạt RNA ribosome và ức chế sự tổng hợp protein trong tế bào làm giết chết tế bào. Cơ chế xúc tác thủy phân liên kết N-glycosidase giữa Adenine và khung đường trong phân tử RNA ribosome (Ren và cs, 1994). Vai trò sinh học và tiềm năng của protein α-MMC. Hiện nay RIPs đóng vai trò quan trọng trong nhiều lĩnh vực và được nghiên cứu phổ biến vì độc tính của chúng với khả năng hoạt động sinh học ức chế tổng hợp protein dựa vào hoạt tính N-glycosidase , do đó RIPs là một nhân tố tiềm năng với ứng dụng hứa hẹn nhất của RIPs trong y học thực nghiệm là phòng chống trị liệu ung thư bằng cách sử dụng protein này như một loại độc tố miễn dịch, liên hợp hoặc các tinh thể tái tổ hợp trong đó chúng được liên kết với các khối u hoặc các kháng thể trung gian gắn kết với các tế bào ác tính (Citores và cs, 2016).

Đặc biệt, ứng dụng trong nông nghiệp của RIPs là kháng nấm và kháng lại virus gây hại cho cây trồng.Các nghiên cứu mới gần đây đã chứng minh α-MMC có thể giúp tăng sức đề kháng của thực vật để chống lại các tác nhân gây hại như virus, vi khuẩn, nấm trong in vitro và in vivo. Trong cây trồng chuyển gen như cây lúa, sự biểu hiện protein α-MMC có thể ngăn chặn bệnh đạo ôn (Huang và cs, 2014). Do đó có thể ứng dụng protein tiềm năng này vào các cơ chế phòng ngự của cây trồng bằng công nghệ chuyển gen giúp thực vật tăng sức đề kháng nấm, kháng vi khuẩn, kháng virus và kháng côn trùng.) Nguyễn Thị Thu Thảo Khóa luận tốt nghiệp Trang 10 GVHD: ĐẶNG THANH DŨNG Hình 1. Mô hình kháng bệnh gây hại cho cây trồng của RIP (Zhu và cs, 2018).

Nghiên cứu của Zhu và cộng sự (2013) đã cho thấy khả năng kháng virus hiệu quả bao gồm virus gây bệnh khảm trên cây như Chilli veinal mottle virus (Chi VMV), Cucumber mosaic virus (CMV), Tobacco mosaic virus (TMV) và Turnip mosaic potyvirus (TuMV). Kết quả được thể hiện như trong Hình 1. Mức độ sao chép và biểu hiện của virus trong lá cây thuốc lá (Zhu và cs, 2013). (A) Kết quả realtime-PCR phân tích mức độ sao chép của virus.

(B) Triệu chứng của lá cây khi được ủ với RNA virus. Đối chứng: phun 0.02M đệm PBS; Xử lý: lá cây được tiền xử lý với 0.5 mg/mL α-MMC. Nguyễn Thị Thu Thảo Khóa luận tốt nghiệp Trang 11 GVHD: ĐẶNG THANH DŨNG Kết quả cho thấy nồng độ của α-MMC tỉ lệ với mức độ kháng virus gây hại cho thực vật. Trong đó, cây bị nhiễm virus Chi VMV cho thấy các triệu chứng như vết đốm xanh đậm, xuất hiện dải dọc theo gân lá, đốm vòng hoại tử và biến dạng lá.

Cây bị nhiễm virus chi CMV bề mặt lá nhăn nheo, khảm. Nhiễm virus chi TMV cây xuất hiện triệu chứng khảm xanh đậm cùng với sự biến dạng và phồng lá cây trong khi ở lá cây được xử lí với 0,5 mg/mL α-MMC không xuất hiện các triệu chứng trên. Hơn nữa, tính chất kháng nấm đầy tiềm năng của α-MMC chống lại nấm gây bệnh tấn công vào lúa mì, bắp, lúa… đã được báo cáo bao gồm các loại nấm Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium graminearum, Bipolaris maydis, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, kết quả được thể hiện như Hình 1. Hoạt tính kháng nấm của protein α-MMC ức chế sự tăng trưởng sợi nấm gây bệnh ( Zhu và cs , 2013).

Đối chứng: đệm PBS; Xử lý: α-MMC 500µg/ml Kết quả cho thấy protein α-MMC chống lại tất cả các mầm bệnh thực vật thử nghiệm với sự ức chế nảy mầm và thể hiện hoạt tính kháng nấm rộng rãi.