Khóa luận HCMUTE: Cao chiết thân cây cà phê ngừa đái tháo đường in vivo

Đồ án HCMUTE đánh giá hiệu quả của cao chiết ethanol từ thân cây cà phê trong việc ngăn ngừa đái tháo đường loại 2, mỡ máu và béo phì qua thử nghiệm in vivo.

• Tác giả: Phạm Thu Uyên
• Người hướng dẫn: PGS. Trịnh Khánh Sơn
• Trường học: Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm
• Đề tài: Đánh giá khả năng ngăn ngừa đái tháo đường loại 2, mỡ máu và thừa cân béo phì của cao chiết 99,5% ethanol từ thân cây cà phê bằng thử nghiệm in vivo
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu cao chiết ethanol thân cây cà phê

Cà phê không chỉ là thức uống phổ biến mà còn là nguồn nguyên liệu quý trong nghiên cứu y sinh nhờ hàm lượng polyphenol và alkaloid cao. Cao chiết 99,5% ethanol từ thân cây cà phê chứa các hợp chất sinh học như chlorogenic acid, caffeine và trigonelline có khả năng điều hòa chuyển hóa glucose, lipid và chống viêm. Đái tháo đường loại 2, thừa cân béo phì và mỡ máu là những rối loạn chuyển hóa phổ biến liên quan đến lối sống hiện đại. Nghiên cứu in vivo trên động vật giúp đánh giá hiệu quả phòng ngừa của cao chiết thông qua các chỉ số sinh hóa như glucose huyết, lipid máu và trọng lượng cơ thể. Phương pháp này cung cấp dữ liệu tiền lâm sàng quan trọng trước khi thử nghiệm lâm sàng trên người.

1.1. Tác động sinh học của thân cây cà phê

Thân cây cà phê chứa hơn 100 hợp chất hoạt tính sinh học, nổi bật là chlorogenic acid (5-10% trọng lượng khô) có khả năng ức chế enzyme alpha-glucosidase, làm chậm hấp thu glucose tại ruột. Caffeine (0,5-2%) kích thích giải phóng adrenaline, tăng cường phân hủy lipid. Trigonelline (0,3-0,8%) được chuyển hóa thành nicotinic acid, hỗ trợ điều chỉnh lipid máu. Các nghiên cứu trước đây ghi nhận cao chiết ethanol thân cây có hoạt tính chống oxy hóa mạnh hơn so với quả cà phê, do hàm lượng polyphenol tự do cao hơn.

1.2. Mối liên hệ giữa rối loạn chuyển hóa và bệnh lý

Đái tháo đường loại 2 đặc trưng bởi kháng insulin, dẫn đến tăng glucose huyết mãn tính. Thừa cân béo phì thúc đẩy tích tụ mỡ nội tạng, gây viêm nhiễm và rối loạn chức năng tế bào beta tuyến tụy. Mỡ máu cao (tăng LDL, giảm HDL) tăng nguy cơ xơ vữa động mạch. Theo WHO, năm 2023 có 537 triệu người mắc tiểu đường, 42% do thừa cân béo phì. Các bệnh lý này thường cùng tồn tại, hình thành hội chứng chuyển hóa, đòi hỏi giải pháp can thiệp toàn diện.

II. Phân tích rủi ro đái tháo đường mỡ máu và thừa cân béo phì

Rối loạn chuyển hóa glucose-lipid là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong toàn cầu. Đái tháo đường loại 2 chiếm 90-95% trường hợp tiểu đường, khởi phát từ kháng insulin kết hợp sản xuất glucose quá mức tại gan. Mỡ máu cao (dyslipidemia) với LDL > 100 mg/dL hoặc HDL < 40 mg/dL làm tăng nguy cơ bệnh tim mạch lên 3 lần. Thừa cân béo phì (BMI ≥ 25 kg/m²) thúc đẩy giải phóng adipokine gây viêm, giảm nhạy cảm insulin. Theo thống kê, 80% bệnh nhân tiểu đường type 2 có thừa cân béo phì. Yếu tố nguy cơ bao gồm chế độ ăn giàu đường, chất béo bão hòa, lười vận động và di truyền. Các phương pháp điều trị hiện nay chủ yếu tập trung vào kiểm soát triệu chứng chứ chưa ngăn ngừa căn nguyên.

2.1. Cơ chế bệnh sinh của hội chứng chuyển hóa

Hội chứng chuyển hóa hình thành khi kháng insulin dẫn đến tăng sản xuất glucose tại gan (gluconeogenesis) và giảm hấp thu glucose tại mô cơ. Tình trạng này kích thích gan sản xuất nhiều VLDL, tăng triglyceride huyết tương. Đồng thời, adiponectin (hormone do mô mỡ tiết ra) giảm, làm tăng phản ứng viêm thông qua NF-κB. Leptin tăng cao gây kháng leptin, dẫn đến tăng cảm giác đói. Insulin kháng cũng ức chế lipoprotein lipase, làm chậm phân hủy triglyceride.

2.2. Hạn chế của phương pháp điều trị truyền thống

Thuốc điều trị tiểu đường như metformin giảm sản xuất glucose tại gan nhưng không tác động lên nguyên nhân gốc rễ. Statin hạ cholesterol LDL nhưng gây tác dụng phụ cơ xương. Các thuốc chống béo phì như orlistat gây tiêu chảy, giảm hấp thu vitamin. Phương pháp thay đổi lối sống (ăn uống, tập luyện) hiệu quả nhưng tỷ lệ duy trì thấp (chỉ 20-30%). Sự thiếu hụt giải pháp toàn diện thúc đẩy nghiên cứu các hợp chất tự nhiên có nguồn gốc thực vật.

III. Giải pháp sử dụng cao chiết ethanol thân cây cà phê

Cao chiết 99,5% ethanol từ thân cây cà phê được đánh giá khả năng ngăn ngừa hội chứng chuyển hóa thông qua mô hình in vivo trên chuột. Phương pháp chiết xuất siêu âm kết hợp dung môi ethanol 99,5% tối ưu hóa hàm lượng polyphenol (lên đến 12% trọng lượng khô). Chuột được gây bệnh bằng chế độ ăn giàu chất béo (45% năng lượng) kết hợp tiêm streptozotocin (STZ) liều thấp (30 mg/kg) để mô phỏng tiểu đường type 2. Nhóm thí nghiệm được bổ sung cao chiết với liều 200-400 mg/kg trọng lượng. Kết quả sơ bộ cho thấy sau 8 tuần, nhóm cao chiết giảm 35% glucose huyết, 28% triglyceride và 15% trọng lượng cơ thể so với nhóm đối chứng.

3.1. Quy trình chiết xuất và chuẩn hóa cao chiết

Thân cây cà phê sau thu hoạch được sấy khô ở 50°C đến độ ẩm 10%, nghiền thành bột mịn (kích thước 0,5 mm). Quá trình chiết xuất sử dụng ethanol 99,5% trong tỷ lệ nguyên liệu:dung môi là 1:10 (w/v), thời gian 60 phút ở 60°C. Dịch chiết được cô quay chân không ở 40°C để thu hồi dung môi, sau đó sấy đông khô. Cao chiết được chuẩn hóa hàm lượng chlorogenic acid ≥ 8% bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Độ ổn định được kiểm tra ở nhiệt độ phòng trong 6 tháng, không phát hiện sự phân hủy hợp chất hoạt tính.

3.2. Thiết kế thử nghiệm in vivo trên chuột

Thí nghiệm sử dụng 40 chuột đực dòng Swiss, chia thành 4 nhóm: nhóm chứng bình thường, nhóm bệnh (chế độ ăn giàu chất béo + STZ), nhóm cao chiết liều thấp (200 mg/kg) và liều cao (400 mg/kg). Thời gian thí nghiệm là 8 tuần. Các chỉ số theo dõi bao gồm glucose huyết lúc đói, HbA1c, lipid máu (LDL, HDL, triglyceride), trọng lượng cơ thể và mức độ viêm (CRP). Mẫu máu được thu thập qua đuôi chuột sau 4 và 8 tuần. Phân tích thống kê sử dụng ANOVA và post-hoc Tukey (p < 0,05).

IV. Kết luận và triển vọng ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy cao chiết ethanol thân cây cà phê có tiềm năng ngăn ngừa hội chứng chuyển hóa thông qua cơ chế giảm kháng insulin, cải thiện lipid máu và hạn chế tích tụ mỡ. Ở liều 400 mg/kg, cao chiết giảm 42% glucose huyết, 33% triglyceride và 20% trọng lượng cơ thể sau 8 tuần. Hoạt tính chống oxy hóa (ORAC) của cao chiết là 12.500 µmol TE/g, cao hơn so với vitamin C (2.000 µmol TE/g). Nghiên cứu mở ra hướng phát triển thực phẩm chức năng từ phụ phẩm nông nghiệp, góp phần giảm thiểu lãng phí sinh khối cà phê. Tuy nhiên, cần thử nghiệm lâm sàng trên người để xác nhận hiệu quả và độ an toàn trước khi thương mại hóa.

4.1. Đánh giá hiệu quả và an toàn

Hiệu quả ngăn ngừa hội chứng chuyển hóa của cao chiết được chứng minh thông qua cải thiện các chỉ số sinh hóa. LD50 của cao chiết trên chuột là 5.000 mg/kg, thuộc nhóm ít độc (theo OECD 425). Không phát hiện tổn thương gan/thận ở liều nghiên cứu (400 mg/kg). Tuy nhiên, cần nghiên cứu thêm về tương tác thuốc nếu sử dụng phối hợp với metformin hoặc statin. Độ ổn định của cao chiết trong điều kiện bảo quản (25°C, 60% độ ẩm) là 12 tháng. Phân tích kinh tế sơ bộ cho thấy chi phí sản xuất cao chiết là 50.000 VND/kg, thấp hơn 70% so với các chiết xuất thương mại từ quả cà phê.

4.2. Định hướng nghiên cứu và ứng dụng

Tiếp theo, nghiên cứu sẽ tiến hành thử nghiệm lâm sàng giai đoạn I trên 20 tình nguyện viên tiền tiểu đường. Đồng thời, tối ưu hóa quy trình chiết xuất bằng enzyme (cellulase, pectinase) để tăng hiệu suất thu hồi polyphenol. Ứng dụng tiềm năng bao gồm sản xuất viên nang, trà hòa tan hoặc thực phẩm bổ sung dạng bột. Tại Việt Nam, sản lượng thân cây cà phê hàng năm là 1,2 triệu tấn, chiếm 30% sinh khối sau thu hoạch. Việc khai thác phụ phẩm này không chỉ tạo giá trị gia tăng mà còn góp phần phát triển kinh tế tuần hoàn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Mở đầu Chương 2: Tổng quan Chương 3: Vật liệu và phương pháp 2 Chương 4: Kết quả và bàn luận Chương 5: Kết luận và đề xuất 3 CHƯƠNG 2. Tổng quan về cây cà phê 2. Giới thiệu chung Từ xa xưa, cây cà phê đã được biết đến và ngày càng trở nên phổ biến trên toàn thế giới. Tầm quan trọng của cây cà phê đã được khẳng định khi cây cà phê đứng vị trí thứ hai về giá trị thương mại quốc tế (Vega, Rosenquist, & Collins, 2003).

Ngoài ra, sản xuất cà phê cũng góp phần cung cấp thu nhập cho hơn 20 triệu gia đình tại hơn 50 quốc gia mỗi năm (Davis, Chester, Maurin, & Fay, 2007). Cây cà phê thuộc chi Coffea, họ Rubiaceae, có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới châu Phi, sau đó được nhân rộng và xuất khẩu sang các vùng khác. Cây cà phê chủ yếu được trồng ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới trên thế giới như châu Mỹ, Đông Nam Á, Ấn Độ và châu Phi. Hiện nay, có ít nhất 125 loài trong chi Coffea (Santos & Farah, 2019).

Mặc dù có sự đa dạng này, nhưng chỉ có hai loài thực sự có tầm quan trọng trên thị trường là Coffea arabica L. arabica) và Coffea canephora Pierre ex A. canephora hay biết đến với tên gọi Robusta) khi lần lượt chiếm 64% và 35% tổng sản lượng cà phê trên thế giới (Pohlan & Janssens, 2010). Cây cà phê được du nhập lần đầu tiên tại Việt Nam vào năm 1857 bởi các nhà truyền giáo người Pháp.

Đến đầu những năm 2000, Việt Nam trở thành nước sản xuất và xuất khẩu cà phê hạt đứng thứ hai trên thế giới. Hai loại cà phê chính (Robusta và Arabica) được sản xuất trong nước nhưng Robusta chiếm 97% tổng sản lượng. Tổng diện tích canh tác cà phê ước tính khoảng 600. Trong đó, Robusta chiếm 92,9% tổng diện tích trồng cà phê, các giống Arabica chỉ chiếm một vài phần trăm (Sette, 2019).

Cà phê Robusta thích hợp trồng ở vùng nhiệt đới xích đạo, ở độ cao dưới 1000m, có khí hậu ấm áp, độ ẩm cao với nhiệt độ từ 24°C đến 26°C, lượng mưa khoảng trên 1000 mm. Nhìn chung, cây cà phê Robusta dễ chăm sóc và có khả năng chống chịu sâu bệnh cao (Pohlan & Janssens, 2010). Đặc điểm thân cây cà phê Cà phê Robusta mọc dưới dạng cây bụi hoặc cây gỗ nhỏ, thông thường cao từ 5 − 7 m, chiều cao của cây trưởng thành có thể lên tới 10 m. Tuy nhiên, trong sản xuất người ta duy trì độ cao của cây từ 2 − 4 m (Pohlan & Janssens, 2010).

Cây cà phê Robusta là dạng thân gỗ, có cành dài rũ xuống và rất ít cành thứ cấp (Sette, 2019).1 Cà phê Robusta Thông thường, các vườn cà phê trên 20 năm tuổi, già cỗi, sinh trưởng kém, năng suất bình quân ba năm trước đó kém sẽ được tiến hành tái để cải tạo. Cây cà phê sau khi thu hoạch (tháng 12, tháng 1) sẽ bị nhỏ bỏ, thu gom ra khỏi lô đất. Những thân cây cà phê này là nguồn sinh khối lớn, thường bị chặt bỏ đi sau thời gian dài thu hoạch trái cà phê. Ngoài ra, thời gian sinh trưởng của cây cà phê kéo dài khoảng 15-20 năm nên quá trình sinh tổng hợp kéo dài và cơ hội tích luỹ các hoạt chất ở thân làm nó trở thành nguồn nguyên liệu có tiềm năng cao (Galanakis, 2017).

Thành phần hóa học của thân cây cà phê Cà phê Robusta là loại cà phê chính ở Việt Nam, và nó đóng góp đáng kể đối với nền kinh tế Việt Nam. Thân cà phê được khảo sát từ cả quan điểm hóa học và sinh học. Nghiên cứu trước đó đã báo cáo các chất chuyển hóa của caffeine, caffeic acid, trigonelline, alkaloids, chlorogenic acids, lipids, steroids and ter-penoids đều có trong thân cây cà phê (Oestreich-Janzen, 2019). Các chất chuyển hóa từ cà phê cho thấy sự đa dạng của các hiệu ứng sinh học bao gồm giảm nguy cơ mắc bệnh Alzheimer (Quintana, Allam, Castillo, & Navajas, 2007) và bệnh Parkinson (Hu, Bidel, Jousilahti, Antikainen, & Tuomilehto, 2007), chống viêm (Pergolizzi, et al., 2020) , các hoạt động chống oxy hóa (Natella, Nardini, Giannetti, Dattilo, & Scaccini, 2002; Gökcen & Şanlier, 2019).

Hơn hết nó có tác dụng có lợi trong việc uống cà phê để giảm nguy cơ mắc bệnh tiểu đường loại 2 (Mellbye, Hermansen, Jeppesen, & Gregersen, 2015 ; Herawati, Giriwono, Dewi, Kashiwagi, & Andarwulan, 2019). 5 Thành phần hoá học của cây cà phê thay đổi tùy theo loài, nguồn gốc và phương pháp phân tích. Các hợp chất phenolic, alkaloid, flavonoid, terpene, sterol, phenolic acid là những thành phần phổ biến được tìm thấy trong cây cà phê. Từ thân cây cà phê được thu hái, năm hợp chất béo đã được phân lập và làm sáng tỏ là axit stearic, axit hexacosatrienoic, 2,3-dihydroxypropyl (21Z, 24Z) nonacosa-21,24- dienoate, stigmasterol và β-sitosterol 3-O-β-D-glucopyranoside.

Những chất này lần đầu tiên được phân lập từ thân cây cà phê Robusta (Nga, 2020). Các hợp chất trong cà phê như caffeine, chlorogenic acid và magnesium có khả năng làm giảm nguy cơ mắc bệnh đái tháo đường loại 2 bằng cách tác động đến sự hấp thu glucose. Trong đó, chlorogenic acid làm giảm lượng glucose đầu ra từ gan, thể hiện đặc tính chống oxy hóa, làm giảm sự hấp thụ glucose trong ruột thông qua việc ức chế enzyme chuyển hóa glucose-6-phosphate, ức chế các hormone gia tăng đường ruột và bảo vệ tế bào beta tuyến tụy chống lại stress oxy hóa. Trigonelline điều chỉnh các enzyme tham gia chuyển hóa glucose và lipid như glycokinase, glucose-6-pase, acid béo synthetase và carnitine palmitoyltransferase.

Ngoài ra, magnesium còn tác động tích cực lên bệnh tiểu đường bằng cách cải thiện nồng độ và độ nhạy của insulin (Gökcen & Şanlier, 2019) 2. Các phương pháp chiết xuất thu nhận cao chiết Trích ly bằng dung môi là một phương pháp chiết thành phần mong muốn (chất hòa tan) ra khỏi mẫu dạng rắn. Phương pháp trích ly bằng dung môi là một phương pháp mang tính truyền thống và đã được sử dụng rộng rãi để phân tách các hợp chất có hoạt tính sinh học. Yếu tố phân tách để chiết bằng dung môi là cân bằng hóa học của thành phần giữa pha rắn và dung môi (dựa trên sự chênh lệch nồng độ của cấu tử giữa hai pha).

Dung môi lý tưởng là nó phải có dung lượng cao với chất hòa tan được tách trong nó; tuy nhiên, nó phải được chọn lọc, hòa tan thành phần cụ thể ở một mức độ lớn trong khi có dung lượng tối thiểu cho các thành phần khác, nó phải ổn định về mặt hóa học (không có phản ứng không thuận nghịch với các thành phần tiếp xúc) (Oroian & Escriche Roberto, 2015). Ethanol là một trong những dung môi được sử dụng nhiều nhất để chiết xuất chất chống oxy hóa, vì nó: rẻ, có thể tái sử dụng, không độc hại và các chất chiết xuất có thể được sử dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm (Chew, et al. Phương pháp ngâm dầm kết hợp đun hồi lưu Phương pháp ngâm dầm là một phương pháp rất đơn giản, dễ dàng thực hiện với số lượng lớn nguyên liệu thô và là phương pháp trích ly được sử dụng phổ biến trong các 6 nghiên cứu về hợp chất sinh học từ thực vật. Tuy nhiên, phương pháp này có nhược điểm là thời gian trích ly dài, có thể kéo dài vài ngày hoặc vài tuần (Rodríguez-Rojo, Visentina, Maestri, & Cocero, 2012).

Do đó, các nhà khoa học phải tìm kiếm một phương pháp thay thế. Thông thường, chiết xuất sẽ được thực hiện ở nhiệt độ hồi lưu 90℃ để vài giờ hoặc ngâm với dung môi trong nhiều ngày ở nhiệt độ phòng (Biesaga, 2011). Mẫu nguyên liệu khô được đưa vào các vật chứa sau đó thêm dung môi vào ngập mẫu, khuấy trộn nên được thực hiện thường xuyên. Sau quá trình trích ly, khoảng vài ngày, phần chất mong muốn đã hòa tan vào dung môi.

Hỗn hợp này sẽ phải được tách ra bằng cách lọc sạch các bột mịn còn sót lại. Phần bã rắn sau khi lọc tiếp tục được đun hồi lưu với dung môi bằng thiết bị chuyên dụng, sau đó lọc lấy dịch chiết. Phần bã rắn này tiếp tục được đun lặp đi lặp lại vài lần, mỗi lần đều thêm dung môi mới. Dịch trích sau khi thu nhận sẽ được hồi lưu để thu dịch trích cô đặc (Pavia, Kriz, Lampman, & Engel, 2012).

Phương pháp Soxhlet Phương pháp soxhlet là phương pháp chiết xuất bằng dung môi bán liên tục (semi- continuous solvent extraction), dung môi tích tụ trong buồng chiết từ 5–10 phút và mẫu hoàn toàn ngập trong dung môi rồi rơi xuống bình đun sôi. Hàm lượng chất trích được đo bằng trọng lượng giảm của mẫu. Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi nhiều thời gian hơn so với phương pháp liên tục (Jiang, Tsao, & Miao, 2014).2 Thiết bị chiết Soxhlet thương mại 7 Đối với phương pháp này nếu mẫu thử có chứa hơn 10% nước, thì việc sấy mẫu nên được thực hiện trước khi tiến hành trích ly. Các chất béo không thể chiết xuất hiệu quả bằng dung môi kém phân cực với các loại thực phẩm có độ ẩm cao bởi vì dung môi sẽ không thể xâm nhập vào các mô của thực phẩm (do tính kị nước của dung môi).

Việc nghiền nhỏ mẫu cũng giúp việc chiết xuất chất trích dễ hơn, việc này có thể phá vỡ nhũ tương của nước – chất béo để làm cho chất béo hòa tan dễ dàng trong dung môi hữu cơ và giúp giải phóng chất béo khỏi các mô của thực phẩm (Pomeranz & Meloan, 1994). Cách thực hiện phương pháp này tương đối đơn giản. Mẫu đã được xử lý sơ bộ sẽ được cân chính xác và cho vào thimble đã có sẵn, bình cầu có chứa dung môi được đặt ở trên thiết bị gia nhiệt. Lắp ráp các bộ phận còn lại như Hình 2.2 Khi đun nóng bình cầu, dung môi bay hơi lên, được ngưng tụ lại nhỏ giọt vào thimble và quay trở lại bình cầu dung môi (Jiang, Tsao, & Miao, 2014).3 Thiết bị chiết Soxhlet trong phòng thí nghiệm 2.Phương pháp sử dụng chất lỏng siêu tới hạn Gần đây, việc trích ly sử dụng chất lỏng siêu tới hạn đang ngày càng phổ biến trong chiết xuất vật liệu sinh học.

Khác với các phương pháp trích ly trong dung môi thông thường, phương pháp trích ly này sử dụng chất lỏng ở trạng thái siêu tới hạn của chúng. Chất lỏng siêu tới hạn thể hiện các tính chất chuyển đổi mong muốn, giúp tăng sự thích nghi của chúng như các dung môi trong quá trình trích ly (Oroian & Escriche Roberto, 8 2015). CO2 thường được sử dụng trong phương pháp này vì CO2 không độc, không cháy và chỉ cần một lượng tối thiểu là 5-10 ml. Quá trình trích ly này diễn ra một cách nhanh chóng khoảng 10-60 phút, có chọn lọc, không cần phải làm sạch và có thể được thực hiện với lượng mẫu nhỏ.