Nghiên cứu định lượng Paraquat trong huyết tương bằng điện di mao quản (CE-C4D)

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu quy trình định lượng paraquat trong huyết tương bằng phương pháp CE-C4D. Tối ưu hóa điều kiện và xác nhận giá trị phương pháp.

• Tác giả: Đỗ Thị Trang
• Người hướng dẫn: Tạ Thị Thảo
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Hóa phân tích
• Đề tài: Nghiên cứu định lượng paraquat trong huyết tương người bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc (CE-C4D)
• Loại tài liệu: Luận văn Thạc sĩ Khoa học
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Phương Pháp CE C4D Trong Định Lượng Paraquat

Điện di mao quản (CE) kết hợp với detector đo độ dẫn không tiếp xúc (C4D) là một phương pháp phân tích hiện đại được ứng dụng rộng rãi trong định lượng paraquat huyết tương. Phương pháp CE-C4D mang lại những ưu điểm vượt trội so với các kỹ thuật truyền thống như sắc ký lỏng (HPLC) hay sắc ký khí khối phổ (GC-MS). Với khả năng phân tách cao, độ nhạy tốt và yêu cầu lượng mẫu nhỏ, phương pháp CE-C4D đã trở thành công cụ quan trọng trong các trung tâm chống độc và phòng xét nghiệm. Nghiên cứu tại Đại học Quốc gia Hà Nội đã chứng minh hiệu quả của phương pháp này trong việc xác định nồng độ paraquat ở các bệnh nhân ngộ độc, mở ra những khả năng mới trong chẩn đoán và điều trị lâm sàng.

1.1. Nguyên Lý Hoạt Động Của CE C4D

Điện di mao quản (CE) sử dụng điện trường để tách các phân tử dựa trên điện tích và kích thước. Detector C4D (Contactless Conductivity Detection) đo độ dẫn không tiếp xúc của các phân tử được tách. Phương pháp này cho phép xác định paraquat huyết tương với độ chuyên biệt cao, không cần tiếp xúc vật lý giữa điện cực và dung dịch, từ đó giảm hiện tượng ô nhiễm và kéo dài tuổi thọ thiết bị phân tích.

1.2. Ưu Điểm Của Phương Pháp CE C4D

Định lượng paraquat bằng CE-C4D có nhiều ưu điểm: (1) độ phân tách cao, (2) khối lượng mẫu cần thiết nhỏ, (3) thời gian phân tích nhanh, (4) độ nhạy tốt với hợp chất ion. Phương pháp này đặc biệt hiệu quả trong các mẫu huyết tương phức tạp, cho phép xác định chính xác nồng độ paraquat mà không cần tiền xử lý phức tạp so với các phương pháp truyền thống.

II. Quy Trình Tiền Xử Lý Mẫu Huyết Tương

Tiền xử lý mẫu huyết tương là bước quan trọng quyết định độ chính xác của phương pháp CE-C4D định lượng paraquat. Mẫu huyết tương chứa nhiều thành phần phức tạp như protein, ion, lipid có thể gây cản trở quá trình phân tách và phát hiện paraquat. Nghiên cứu tại Bệnh viện Bạch Mai sử dụng phương pháp chiết pha rắn (SPE) để loại bỏ các chất gây nhiễu. Quá trình này bao gồm việc sử dụng EDTA 10⁻³M để loại bỏ các cation như Na⁺ và Ca²⁺, điều chỉnh pH mẫu, và lựa chọn dung dịch rửa tạp phù hợp. Các thông số như nồng độ EDTA, tỉ lệ axit acetic trong dung dịch rửa giải được khảo sát chi tiết để đạt hiệu suất tối ưu.

2.1. Phương Pháp Chiết Pha Rắn SPE

Chiết pha rắn (SPE) là kỹ thuật tiền xử lý được sử dụng để định lượng paraquat trong huyết tương. Cột C18 được sử dụng để hấp phụ các cation Na⁺ và Ca²⁺, từ đó giảm tín hiệu nhiễu. Quá trình SPE giúp loại bỏ hiệu quả các chất phức tạp trong mẫu, làm sạch mẫu và tập trung paraquat, nâng cao độ nhạy của phương pháp CE-C4D.

2.2. Vai Trò Của EDTA Trong Tiền Xử Lý

EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) đóng vai trò quan trọng trong việc loại bỏ các cation gây nhiễu trong mẫu huyết tương. Việc sử dụng EDTA 10⁻³M giúp tăng tín hiệu paraquat và cải thiện độ phân tách. Nồng độ EDTA tối ưu được xác định thông qua các thí nghiệm khảo sát, đảm bảo không làm mất paraquat nhưng vẫn loại bỏ được các yếu tố gây nhiễu.

III. Xây Dựng Đường Chuẩn Và Đánh Giá Hiệu Suất Phương Pháp

Đường chuẩn paraquat được xây dựng trên nền mẫu huyết tương để phản ánh điều kiện phân tích thực tế. Nghiên cứu sử dụng các nồng độ khác nhau của paraquat chuẩn để tạo lập mối quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và tín hiệu phát hiện. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) được xác định dựa trên tỷ lệ tín hiệu-nhiễu. Độ chính xác của phương pháp được đánh giá qua các chỉ số như độ chụm (độ lặp lại), độ chọn lọc và độ hồi phục. Các kết quả phân tích bằng CE-C4D được đối chứng với HPLC để xác nhận độ tin cậy, chứng minh rằng phương pháp CE-C4D có khả năng định lượng chính xác paraquat trong các mẫu lâm sàng.

3.1. Thiết Lập Đường Chuẩn Tuyến Tính

Đường chuẩn paraquat được xây dựng từ các dung dịch chuẩn có nồng độ từ thấp đến cao trên nền huyết tương. Mối quan hệ giữa nồng độ paraquat và diện tích đỉnh được phân tích để xác định hệ số tương quan (R²). Kết quả cho thấy tuyến tính tốt, cho phép định lượng paraquat chính xác trong phạm vi nồng độ lâm sàng.

3.2. Đánh Giá Độ Tin Cậy Của Phương Pháp

Độ tin cậy của phương pháp CE-C4D được đánh giá thông qua độ chụm (độ lặp lại), độ chính xác và độ chọn lọc. Độ không đảm bảo đo (uncertainty) được ước lượng bằng cách phân tích các yếu tố ảnh hưởng từ đường chuẩn và tiền xử lý mẫu. Việc đối chứng kết quả với HPLC xác nhận rằng phương pháp CE-C4D có thể thay thế các phương pháp truyền thống trong định lượng paraquat huyết tương.

IV. Ứng Dụng Lâm Sàng Và Kết Quả Phân Tích Mẫu Thực Tế

Phương pháp CE-C4D đã được áp dụng thành công để định lượng paraquat trong mẫu huyết tương từ các bệnh nhân ngộ độc tại Trung tâm Chống độc - Bệnh viện Bạch Mai. Các mẫu thực tế được xử lý theo quy trình tiền xử lý đã tối ưu hóa, sau đó phân tích bằng CE-C4D. Kết quả cho thấy nồng độ paraquat trong các mẫu bệnh nhân khác nhau, cung cấp thông tin quan trọng cho việc đánh giá mức độ độc và lập kế hoạch điều trị. Định lượng paraquat huyết tương giúp các bác sĩ hiểu rõ hơn về động học dược của paraquat trong cơ thể, hỗ trợ quyết định lâm sàng. Nghiên cứu này chứng minh rằng phương pháp CE-C4D là một công cụ mạnh mẽ, có thể thay thế hoặc bổ sung cho các phương pháp hiện có trong các trung tâm chống độc và phòng xét nghiệm lâm sàng.

4.1. Quy Trình Phân Tích Mẫu Lâm Sàng

Mẫu huyết tương từ bệnh nhân ngộ độc được tiền xử lý theo phương pháp SPE với các điều kiện tối ưu. Sau khi chiết xuất, mẫu được phân tích bằng CE-C4D với các thông số đã được xác định. Kết quả định lượng paraquat được ghi lại và so sánh với đường chuẩn. Quy trình này đảm bảo độ chính xác cao, thời gian phân tích nhanh, phù hợp với yêu cầu lâm sàng khẩn cấp.

4.2. Ý Nghĩa Lâm Sàng Và Triển Vọng Ứng Dụng

Định lượng paraquat huyết tương bằng CE-C4D cung cấp thông tin về nồng độ độc hại, giúp dự đoán kết cục lâm sàng và điều chỉnh chiến lược điều trị. Phương pháp này có triển vọng lớn để phát triển thành một công cụ tiêu chuẩn trong các bệnh viện, đặc biệt là tại các trung tâm chống độc. Ưu điểm của CE-C4D về độ nhạy, độ chính xác và chi phí thấp làm cho nó trở thành lựa chọn hàng đầu cho các phòng xét nghiệm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Paraquat (viết tắt của paraquaternary bipyridyl) là một thuốc diệt cỏ giá thành rẻ , hiệu quả diệt cỏ rất tốt nên thƣờng đƣợc sử dụng rộng rãi tại Việt Nam. Mặc dù paraquat (PQ) rất thân thiện với môi trƣờng nhƣng lại rất độc đối với con ngƣời. Liều tử vong của PQ đối với ngƣời trƣởng thành ƣớc tính là khoảng 10 ml dung dịch 20%. Trong những năm gần đây, trên thế giới cũng nhƣ Việt Nam đã có rất nhiều trƣờng hợp ngộ độc PQ (do vô tình hay có chủ ý) [2].

Tại trung tâm Chống độc (TTCĐ) - bệnh viện Bạch Mai, số lƣợng bệnh nhân ngộ độc PQ gia tăng đáng kể, năm 2014 đã có 391 ca ngộ độc, năm 2015 đã tăng lên đến 401 ca, năm 2016 là 458 ca và 6 tháng đầu năm 2017 là 200 ca. Trong đó tỉ lệ tử vong là 72,9% [3]. Hầu hết các bệnh nhân ngộ độc PQ đều ở mức độ nặng và tỉ lệ tử vong rất cao. Trƣớc thực tế đó, trong những năm trƣớc đã có rất nhiều quốc gia (32 quốc gia) cấm lƣu hành và sử dụng PQ, tuy nhiên đến ngày 08/02/2017 Việt Nam mới ban hành thông tƣ về việc loại bỏ PQ ra khỏi danh mục các hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) đƣợc phép sử dụng [1].

Mặc dù vậy, số lƣợng bệnh nhân ngộ độc PQ và đến cấp cứu tại TTCĐ có suy giảm nhƣng không đáng kể (từ tháng 1/2017- 6/2017 đã có khoảng 200 ca ngộ độc). Để định lƣợng PQ trong huyết tƣơng, các phƣơng pháp phân tích thƣờng đƣợc sử dụng bao gồm: phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC- MS), sắc ký khí khối phổ (GC-MS), phƣơng pháp điện di mao quản khối phổ (CE-MS), phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)… Hiện tại, việc phân tích PQ phục vụ cho chẩn đoán và điều trị cũng đã đƣợc triển khai tại trung tâm Chống độc - bệnh viện Bạch Mai (sử dụng phƣơng pháp so màu để định tính PQ và định lƣợng nồng độ PQ trong huyết tƣơng bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC). Tuy nhiên, nhiều bệnh viện tuyến địa phƣơng chƣa đƣợc trang bị thiết bị HPLC, trong khi đó việc định lƣợng sớm nồng độ PQ trong huyết tƣơng để xác định mức độ nặng và tiên lƣợng khả năng sống cũng nhƣ tiến hành lọc máu hấp phụ là rất quan trọng. Do đó, một vấn đề đặt ra là làm thế nào để có đƣợc một trang thiết bị có giá thành thấp, 1 có thể trang bị đƣợc tại địa phƣơng mà vẫn có thể xác định đƣợc nồng độ PQ trong huyết tƣơng, phục vụ nhanh chóng, kịp thời trong điều trị.

Trên cơ sở đó, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu định lượng paraquat trong huyết tương người bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc (CE-C4D)” với hi vọng đóng góp một phần trong chẩn đoán và điều trị sớm cho những bệnh nhân ngộ độc paraquat tại các bệnh viện tuyến địa phƣơng. Luận văn này thực hiện với mục tiêu nghiên cứu quy trình xử lý mẫu paraquat trong huyết tƣơng, từ đó định lƣợng paraquat bằng phƣơng pháp điện dimao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc (CE- C4D). 2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Tổng quan về paraquat 1.

Công thức hóa học, tính chất lý hoá học của paraquat  Công thức hóa học Paraquat là từ viết tắt của paraquaternary bipyridyl, tên khoa học là 1,1'- dimethyl-4,4' bipyridilium. PQ thuộc nhóm hợp chất amin bậc 4, là thuốc diệt cỏ đƣợc sử dụng rộng rãi nhất hiện nay với đặc tính diệt cỏ nhanh và hiệu quả. Paraquat có khối lƣợng phân tử tƣơng đối là 186,2 g/mol và có công thức hóa học nhƣ Hình 1. Công thức hóa học của paraquat Tuy nhiên, hiện nay paraquat thƣờng đƣợc sử dụng dƣới dạng muối và chủ yếu là muối dichloride nhƣ Hình 1.

Công thức hóa học dạng muối paraquat  Tính chất lý, hóa học của paraquat PQ thƣờng có màu trắng hơi vàng, không mùi, tỷ trọng ở 20 oC là 1,240 - 1,260; điểm chảy 175-180oC, điểm sôi khoảng 300oC và pH của dung dịch PQ trong nƣớc là 6,5-7,5. 3 PQ thƣờng ở dạng muối, chủ yếu là muối dichloride ở dạng tinh thể trắng, PQ ổn định trong môi trƣờng axit hoặc trung tính, không ổn định trong môi trƣờng kiềm. PQ tan tốt trong nƣớc (độ tan 700 g/l ở 20 oC), ít tan trong các dung môi hữu cơ, PQ bị phân hủy dƣới ánh sáng UV, bị bất hoạt bởi các tác nhân hoạt động bề mặt anionic và bởi đất sét, bị mất hoạt tính nhanh khi tiếp xúc với đất, PQ không bay hơi. Dung dịch PQ đặc ăn mòn thép, tấm thiếc, sắt mạ kẽm và nhôm [39].

Thực trạng sử dụng paraquat hiện nay Paraquat thuộc nhóm trừ cỏ dại Bipyridylium đƣợc tập đoàn ICI phát minh năm 1955, đƣợc thƣơng mại hóa và sử dụng năm 1962 [34]. Hiện nay, ngoài công ty Syngenta (Thụy Sỹ), Sundat (Singapore) và United Phosphorus (Ấn Độ) thì hơn 15 doanh nghiệp thuốc BVTV Trung Quốc sản xuất và đƣa ra thị trƣờng thế giới một lƣợng lớn thuốc trừ cỏ PQ. PQ đƣợc sản xuất và sử dụng chủ yếu ở 2 dạng chế phẩm SG (hạt tan trong nƣớc) và SL (dung dịch đậm đặc), PQ và thành phẩm chƣa PQ thuộc nhóm độc loại II, không tồn tại lâu trong môi trƣờng sống, tan nhanh trong nƣớc. Hiện tại, có hơn 90 quốc gia đăng ký và sử dụng PQ (với mức độ sử dụng khác nhau), trong đó có nhiều nƣớc có nền nông nghiệp phát triển.

Tuy nhiên, với thực trạng ngộ độc và tử vong do PQ trên thế giới, rất nhiều quốc gia phải xem xét lại công tác quản lý thuốc trừ cỏ PQ, rà soát lại mức độ sử dụng, thậm chí có thể hạn chế, cấm sử dụng. Trong danh mục thuốc BVTV đƣợc phép sử dụng ở Việt Nam (ban hành kèm theo thông tƣ số 21/2013/TT-BNNPTNT) ngày 16/4/2013 của Bộ trƣởng Bộ NN & PTNT) có 45 tên thƣơng phẩm thuốc paraquat, trong đó 41 thành phẩm dạng SL, 3 thành phẩm dạng AS và 1 thành phẩm dạng WP. Tổng số thuốc Paraquat đƣợc nhập vào VN năm 2011 là 6895,698 lít, năm 2012 là 10699,374 lít (tăng 15% so sới năm 2011)và năm 2013 là 9953,223 lít (giảm 7% so với năm 2012). Tổng cộng số lƣợng paraquat thành phẩm 20% đƣợc nhập khẩu và sử dụng ở VN trong 3 năm (2011-2013) là 27548,295 lít (lƣợng dùng trung bình từ 1,5 – 2,0 L/ha).

Trong 4 số này 17% lƣợng nhập khẩu từ Syngenta, 70% từ các công ty Trung quốc, số còn lại từ Singapore và Ấn Độ. Lƣợng thuốc trừ cỏ chứa thành phần PQ vẫn đƣợc nƣớc ta ƣu tiên sử dụng hàng đầu trong việc diệt cỏ. Bên cạnh đó, có rất nhiều ngƣời dân sử dụng sai mục đích của thuốc trừ cỏ PQ đó là dùng để tự tử. Hàng năm, trung tâm Chống độc – bệnh viện Bạch Mai đã tiếp nhận rất nhiều trƣờng hợp ngộ độc PQ và trong số đó tỉ lệ tử vong rất cao.

Năm 2011 tỉ lệ tử vong đối với các bệnh nhân ngộ độc PQ là 72,9%. Tỉ lệ này tiếp tục đƣợc gia tăng trong những năm gần đây. Trƣớc thực trạng đó, đầu năm 2017 (08/02/2017), Bộ NN & PTNT đã đƣa ra quyết định loại bỏ PQ ra khỏi danh mục thuốc BVTV đƣợc phép sử dụng tại Việt Nam. Tuy nhiên, với lƣợng PQ đã nhập những năm trƣớc (theo thống kê trên) thì PQ vẫn còn tồn dƣ rất nhiều, có thể sử dụng đƣợc trong một thời gian khá dài.

Do vậy, nguy cơ ngƣời dân dùng PQ tự tử vẫn có khả năng xảy ra cao. Diquat cũng là một hóa chất diệt cỏ nhanh và hiệu quả. Diquat có tính chất khá giống với paraquat, trong điều kiện thích hợp diquat có thể chuyển thành paraquat và ngƣợc lại. Tuy nhiên, ở Việt Nam, diquat không đƣợc tìm thấy trong các báo cáo về thành phần thuốc bảo vệ thực vật.

Cơ chế gây độc của paraquat Cơ chế gây độc của PQ [13] đƣợc thể hiện ở Hình 1. Cơ chế gây độc của paraquat 5 Trong giai đoạn đầu của chu trình này, ion PQ 2+ cùng với NADPH trải qua một phản ứng tạo ra ion paraquat bị khử (PQ +) và NADP+, PQ+ phản ứng hầu nhƣ ngay lập tức với oxy tái tạo lại PQ 2+ và gốc superoxid. Có sẵn NADPH và oxy, chu trình oxy hoá - khử của PQ xảy ra liên tục, với việc NADPH liên tục bị mất đi và không ngừng tạo ra gốc superoxid. Gốc tự do superoxid sau đó phản ứng với bản thân nó để tạo ra peroxid hydro (H2O2) và với H2O2 cùng Fe để tạo thành gốc tự do hydroxyl [17],[ 32].

Cạn kiệt NADPH dẫn tới chết tế bào. Chu trình oxy hoá - khử tạo thành gốc tự do hydroxyl dẫn tới nhiều cơ chế làm tổn thƣơng tế bào: phản ứng với lipid trên màng tế bào (peroxide hoá lipid), DNA và các protein tối cần thiết cho tế bào sống sót cũng bị các gốc tự do hydroxyl phá hủy [11],[ 35],[ 36]. Dược động học paraquat 1. Hấp thu Ở đƣờng tiêu hoá PQ đƣợc hấp thu rất nhanh nhƣng ít (5-10%).

Hấp thu chủ yếu ở ruột non. Khi dạ dày ruột bị tổn thƣơng lan rộng, số lƣợng chất độc đƣợc hấp thu sẽ tăng lên, PQ không gắn với protein huyết tƣơng. Nồng độ đỉnh của PQ trong huyết tƣơng đạt đƣợc trong vòng 2 giờ sau uống [5]. Tiếp xúc qua da, hấp thu vào cơ thể nói chung chỉ xảy ra khi tiếp xúc kéo dài hoặc da bị tổn thƣơng.

Tiếp xúc với PQ qua đƣờng hô hấp không làm cho lƣợng PQ đƣợc hấp thu đến mức đủ để gây nhiễm độc. Bởi vì kích thƣớc các hạt chứa PQ lớn (hầu hết trên 100 m) làm cho PQ không đi sâu đƣợc xuống đƣờng hô hấp để hấp thu [5]. Mắt tiếp xúc với PQ sẽ bị tổn thƣơng, nhƣng không đủ để gây nhiễm độc toàn thân. Phân bố Sau khi uống, PQ phân bố nhanh chóng nhất tới tất cả các cơ quan chính nhƣ phổi, thận, gan và cơ, đăc biêṭ là phổi , PQ sẽ bi ̣žkhƣ̉Ÿ thành da ̣žng gốc tƣ ̣ž do hoaṭ tính cao [7].

Thể tích phân bố của PQ là 1,2 - 1,6 l/kg. PQ đạt đƣợc nồng độ cao và tồn tại lâu hơn trong phổi, nồng độ trong phổi có thể cao hơn so với nồng độ huyết tƣơng gấp 50 lần. Sau uống 5-7 giờ, nồng độ 6 PQ trong tổ chức phổi đạt cao nhất. Tuy nhiên, lƣợng PQ huyết tƣơng cũng cần đạt đến một ngƣỡng tới hạn để cho quá trình hấp thu ở phổi diễn ra [10].

PQ qua đƣợc nhau thai. Trong một nghiên cứu, nồng độ PQ trong dịch ối và máu dây rốn, bào thai cao hơn nồng độ trong máu mẹ 4-6 lần [10]. Không có bào thai nào sống sót.