Luận văn thạc sĩ bước đầu đánh giá tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym ache của sâm vũ diệp panax bipinnatifidus seem và tam thất hoang panax stipuleanatus h t tsai et k m feng trên thực nghiệm

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu bước đầu đánh giá tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym ache của sâm vũ diệp panax bipinnatifidus, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề xuất

• Tác giả: Lưu Thị Huyền Trang
• Người hướng dẫn: Dương Thị Ly Hương
• Trường học: Đại Học Quốc Gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược học
• Đề tài: Bước Đầu Đánh Giá Tác Dụng Chống Oxy Hóa Và Ức Chế Enzym AChE Của Sâm Vũ Diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) Và Tam Thất Hoang (Panax stipuleanatus H. Feng) Trên Thực Nghiệm
• Loại tài liệu: Khóa Luận Tốt Nghiệp Đại Học
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan về chi Panax L.
• 1.2. Vị trí phân loại
• 1.3. Đặc điểm hình thái chung của chi Panax L.
• 1.4. Thành phần hóa học chính của chi Panax L.
• 1.5. Tác dụng dược lý của một số loài thuộc chi Panax L.
• 1.6. Tổng quan về Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai & Feng)
• 1.7. Tổng quan về gốc tự do
• 1.8. Các ROS và RNS
• 1.9. Một số phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa
• 1.10. Tổng quan về Acetylcholin và bệnh lý liên quan
• 1.11. Bệnh Alzheimer và giả thuyết về vai trò của hệ cholinergic đối với bệnh Alzheimer
• 1.12. Một số phương pháp thường dùng trong nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase in vitro
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Dung môi, hóa chất
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang
• 2.5. Đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang
• 2.6. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Kết quả thực nghiệm
• 3.2. Kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang
• 3.3. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang
• 3.4. Bàn luận kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro Sâm vũ diệp và Tam thất hoang
• 3.5. Bàn luận kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang
• KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về tác dụng chống oxy hóa của Sâm Vũ Diệp và Tam Thất Hoang

Sâm Vũ Diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam Thất Hoang (Panax stipuleanatus H. Feng) là hai loài cây thuốc quý thuộc chi Panax, nổi bật với khả năng chống oxy hóa. Nghiên cứu cho thấy các hợp chất saponin trong hai loài này có tác dụng bảo vệ tế bào, giảm thiểu tổn thương do gốc tự do gây ra. Gốc tự do là nguyên nhân chính dẫn đến nhiều bệnh lý nghiêm trọng, bao gồm bệnh Alzheimer. Việc đánh giá tác dụng chống oxy hóa của Sâm Vũ Diệp và Tam Thất Hoang không chỉ có ý nghĩa trong y học cổ truyền mà còn mở ra hướng đi mới trong nghiên cứu dược liệu hiện đại.

1.1. Tác dụng chống oxy hóa của Sâm Vũ Diệp

Sâm Vũ Diệp chứa nhiều saponin, có khả năng quét gốc tự do và bảo vệ tế bào khỏi tổn thương. Nghiên cứu cho thấy dịch chiết từ Sâm Vũ Diệp có khả năng ức chế sự hình thành gốc tự do, từ đó giảm thiểu nguy cơ mắc các bệnh thoái hóa thần kinh. Các thử nghiệm in vitro cho thấy nồng độ IC50 của Sâm Vũ Diệp trong phương pháp DPPH rất khả quan, cho thấy hiệu quả chống oxy hóa mạnh mẽ.

1.2. Tác dụng chống oxy hóa của Tam Thất Hoang

Tam Thất Hoang cũng chứa nhiều saponin, có tác dụng tương tự như Sâm Vũ Diệp. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng dịch chiết từ Tam Thất Hoang có khả năng ức chế gốc tự do và bảo vệ tế bào thần kinh. Kết quả thử nghiệm cho thấy Tam Thất Hoang có thể làm giảm thiểu tổn thương tế bào do stress oxy hóa, từ đó hỗ trợ điều trị các bệnh lý liên quan đến thoái hóa thần kinh.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu tác dụng của Sâm Vũ Diệp và Tam Thất Hoang

Mặc dù Sâm Vũ Diệp và Tam Thất Hoang đã được sử dụng trong y học cổ truyền, nhưng việc nghiên cứu tác dụng sinh học của chúng vẫn còn nhiều hạn chế. Các nghiên cứu hiện tại chủ yếu tập trung vào thành phần hóa học mà chưa đi sâu vào cơ chế tác động. Thách thức lớn nhất là thiếu các nghiên cứu lâm sàng để khẳng định hiệu quả và độ an toàn của hai loài này trong điều trị bệnh.

2.1. Thiếu dữ liệu lâm sàng

Nhiều nghiên cứu hiện tại chỉ dừng lại ở mức độ in vitro mà chưa có đủ dữ liệu lâm sàng để khẳng định tác dụng của Sâm Vũ Diệp và Tam Thất Hoang. Điều này gây khó khăn trong việc áp dụng các kết quả nghiên cứu vào thực tiễn điều trị.

2.2. Cần nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động

Để hiểu rõ hơn về tác dụng của Sâm Vũ Diệp và Tam Thất Hoang, cần có các nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động của các hợp chất trong chúng. Việc này sẽ giúp xác định rõ ràng hơn vai trò của các hợp chất saponin trong việc chống oxy hóa và bảo vệ tế bào.

III. Phương pháp nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym AChE

Để đánh giá tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym AChE của Sâm Vũ Diệp và Tam Thất Hoang, các phương pháp nghiên cứu hiện đại đã được áp dụng. Các phương pháp như DPPH, ABTS và Ellman được sử dụng để xác định khả năng chống oxy hóa và ức chế enzym. Những phương pháp này cho phép đánh giá chính xác hiệu quả của các hợp chất trong hai loài cây này.

3.1. Phương pháp DPPH trong đánh giá tác dụng chống oxy hóa

Phương pháp DPPH là một trong những phương pháp phổ biến nhất để đánh giá khả năng chống oxy hóa. Sử dụng dung dịch DPPH, các nhà nghiên cứu có thể xác định nồng độ IC50 của Sâm Vũ Diệp và Tam Thất Hoang, từ đó đánh giá hiệu quả chống oxy hóa của chúng.

3.2. Phương pháp Ellman trong đánh giá ức chế enzym AChE

Phương pháp Ellman được sử dụng để đánh giá khả năng ức chế enzym AChE của Sâm Vũ Diệp và Tam Thất Hoang. Phương pháp này cho phép xác định nồng độ ức chế 50% (IC50) của các hợp chất trong dịch chiết, từ đó đánh giá khả năng điều trị bệnh Alzheimer.

IV. Kết quả nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym AChE

Kết quả nghiên cứu cho thấy cả Sâm Vũ Diệp và Tam Thất Hoang đều có tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym AChE mạnh mẽ. Các giá trị IC50 cho thấy hiệu quả của chúng trong việc bảo vệ tế bào và hỗ trợ điều trị các bệnh lý liên quan đến thoái hóa thần kinh. Những kết quả này mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các sản phẩm từ hai loài cây này.

4.1. Kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa

Kết quả thử nghiệm cho thấy Sâm Vũ Diệp có khả năng chống oxy hóa cao hơn so với Tam Thất Hoang. Điều này cho thấy Sâm Vũ Diệp có thể là một nguồn dược liệu quý trong việc phát triển các sản phẩm chống oxy hóa.

4.2. Kết quả đánh giá ức chế enzym AChE

Cả hai loài đều cho thấy khả năng ức chế enzym AChE tốt, với Sâm Vũ Diệp có hiệu quả cao hơn. Điều này cho thấy tiềm năng của chúng trong việc hỗ trợ điều trị bệnh Alzheimer và các bệnh lý liên quan đến thoái hóa thần kinh.

V. Kết luận và triển vọng nghiên cứu trong tương lai

Nghiên cứu về tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym AChE của Sâm Vũ Diệp và Tam Thất Hoang đã chỉ ra tiềm năng lớn của hai loài này trong y học. Tuy nhiên, cần có thêm nhiều nghiên cứu lâm sàng để khẳng định hiệu quả và độ an toàn của chúng. Việc phát triển các sản phẩm từ hai loài này có thể mở ra hướng đi mới trong điều trị các bệnh lý liên quan đến thoái hóa thần kinh.

5.1. Triển vọng phát triển sản phẩm từ Sâm Vũ Diệp

Sâm Vũ Diệp có tiềm năng lớn trong việc phát triển các sản phẩm chống oxy hóa và hỗ trợ điều trị bệnh Alzheimer. Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc chiết xuất và phát triển các sản phẩm từ loài này.

5.2. Triển vọng phát triển sản phẩm từ Tam Thất Hoang

Tam Thất Hoang cũng có thể được phát triển thành các sản phẩm dược liệu với tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ tế bào. Cần có thêm nghiên cứu để khai thác tối đa tiềm năng của loài này trong y học.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Gốc tự do cùng các chất hoạt động chứa oxy (ROS) và nitơ (RNS) là những tác nhân gây tổn thương tế bào thông qua quá trình biến tính protein, đột biến DNA và peroxy hóa lipid màng. Tình trạng mất cân bằng giữa sự gia tăng các gốc tự do và khả năng chống oxy hóa nội sinh dẫn đến stress oxy hóa, được xem là nguyên nhân bệnh sinh quan trọng của nhiều rối loạn thoái hóa thần kinh mạn tính, đặc biệt là bệnh Alzheimer. Thống kê dịch tễ học tại khu vực châu Á ghi nhận khoảng 35 triệu người mắc bệnh Alzheimer và dự báo tăng lên 62,8 triệu người vào năm 2050; riêng tại Việt Nam có hơn 9 triệu người bị sa sút trí tuệ. Về mặt bệnh học, giả thuyết cholinergic khẳng định sự suy giảm tổng hợp chất dẫn truyền thần kinh Acetylcholin (ACh) đóng vai trò trung tâm trong quá trình suy giảm nhận thức. Vì vậy, việc sử dụng các thuốc ức chế enzym Acetylcholinesterase (AChE) để làm chậm quá trình thủy phân ACh kết hợp với các chất chống oxy hóa bảo vệ tế bào thần kinh là một hướng điều trị nền tảng trong thực hành lâm sàng.

Các loài thực vật thuộc chi Panax L. (họ Nhân sâm - Araliaceae) chứa thành phần hoạt chất chính là các saponin triterpenoid (ginsenoside), vốn đã được chứng minh có hoạt tính sinh học đa dạng như chống oxy hóa, kháng viêm và bảo vệ tế bào thần kinh. Tại Việt Nam, Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. Feng) là hai loài dược liệu phân bố tự nhiên chủ yếu ở vùng núi cao Tây Bắc, được đồng bào bản địa sử dụng theo kinh nghiệm dân gian làm thuốc bổ, cầm máu và giảm đau. Mặc dù các nghiên cứu hóa thực vật trước đó đã phân lập được nhiều hợp chất saponin khung dammaran và oleanan từ hai loài này, dữ liệu thực nghiệm về hoạt tính chống oxy hóa cũng như khả năng ức chế enzym AChE của chúng vẫn còn rất hạn chế.

Đề tài được thực hiện trong khuôn khổ Chương trình Tây Bắc với nhiệm vụ mã số KHCN-TB.07C/13-18 nhằm giải quyết hai mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

1. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang trên in vitro.
2. Đánh giá tác dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang trên in vitro.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu bao gồm mẫu cao chiết giàu saponin từ thân rễ Sâm vũ diệp và toàn cây tươi Tam thất hoang được thu hái tại Sa Pa (tỉnh Lào Cai) vào tháng 3 năm 2016, đã được giám định tên khoa học chuẩn xác bởi các chuyên gia thực vật học thuộc Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu. Các thí nghiệm sàng lọc sinh học in vitro được triển khai tại phòng thí nghiệm Bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng, Khoa Y Dược (Đại học Quốc gia Hà Nội).

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận dựa trên khung lý thuyết phân loại học thực vật của Takhtajan (1987) về chi Panax L., lý thuyết bệnh sinh học thần kinh về vai trò của stress oxy hóa và giả thuyết cholinergic trong bệnh Alzheimer. Về mặt hóa thực vật, khung lý thuyết tập trung vào nhóm hợp chất saponin triterpenoid gồm các dẫn chất của protopanaxadiol, protopanaxatriol, octillol và acid oleanolic. Về mặt cấu trúc sinh học phân tử, enzym AChE được phân tích qua 4 vị trí gắn hoạt động đặc hiệu: vị trí ester hóa, hố oxyanion, vị trí anion và túi acyl.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được thiết kế theo các quy trình chuẩn hóa in vitro trong ngành dược học:

• Phương pháp quét gốc tự do DPPH (1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl): Dựa trên nguyên tắc các chất có hoạt tính chống oxy hóa sẽ cho điện tử hoặc hydro để trung hòa gốc tự do DPPH bền trong môi trường methanol, làm giảm cường độ hấp thụ quang của dung dịch tại bước sóng $\lambda = 517\text{ nm}$. Đối chứng dương sử dụng L-acid ascorbic (vitamin C) ở dải nồng độ từ 0,0290625 mg/ml đến 1,86 mg/ml. Cao giàu saponin của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang được thử nghiệm ở các nồng độ 6,2; 12,4; 24,8 và 49,6 mg/ml.
• Phương pháp đo quang ức chế enzym AChE (phương pháp Ellman cải tiến): Cơ chất acetylthiocholin iodid (ATCI 2,5 mM) bị phân giải bởi enzym AChE (loại mã số EC 3.1.1.7, hoạt độ 0,5 IU/ml trong đệm Tris-HCl) tạo thành thiocholin. Chất này phản ứng với thuốc thử DTNB (acid 5,5'-dithiobis-2-nitrobenzoic 2,5 mM) trong môi trường đệm natri phosphat pH 8,0 để giải phóng hợp chất mang màu vàng là acid 5-thio-2-nitrobenzoic, được định lượng bằng máy đo quang phổ hấp thụ tại bước sóng $\lambda = 412\text{ nm}$. Chất ức chế đối chứng dương là berberin clorid ở các nồng độ từ 0,05 đến 20 µg/ml; các mẫu cao thử nghiệm được khảo sát ở các nồng độ 250, 500, 1000, 2000 và 4000 µg/ml.
• Hóa chất và trang thiết bị: Sử dụng enzym AChE, DPPH, DTNB, ATCI, L-acid ascorbic (Merck), dimethyl sulfoxide (DMSO), methanol. Thiết bị đo quang là máy quang phổ Cary 60 UV-Vis (Agilent Technologies, Hoa Kỳ), cân phân tích Mettler Toledo độ chính xác 0,1 mg, máy đo pH Mettler Toledo và máy siêu âm Ultrasonic Cleaners AC-150H (MRC, Israel).
• Phương pháp xử lý số liệu: Mọi thí nghiệm được lặp lại 2 lần độc lập. Sai số giữa các lần đo được tính theo độ lệch chuẩn (SD). Số liệu được xử lý thống kê sinh học và tính toán giá trị $IC_{50}$ (nồng độ ức chế 50%) bằng phần mềm chuyên dụng SigmaPlot phiên bản 10.0.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương này hệ thống hóa các dữ liệu khoa học về vị trí phân loại, đặc điểm hình thái, vùng phân bố địa lý và thành phần hóa học của chi Panax L., bao gồm 289 hợp chất saponin đã biết cùng các nhóm chất polyacetylen, acid hữu cơ, polysaccarit và flavonoid. Tác giả tổng hợp dược tính đã được công nhận của các loài nhân sâm (Panax ginseng), tam thất (Panax notoginseng) và sâm Mỹ (Panax quinquefolius). Đối với Sâm vũ diệp và Tam thất hoang, tổng quan cập nhật các công bố của Liang et al. (2010), Nguyễn Hữu Tùng et al. (2011) và Trần Thanh Hà et al. (2015), chỉ ra sự hiện diện phong phú của saponin khung oleanan (các bifinoside A–C, stipuleanoside R1–R2, spinasaponin A methyl ester) và khung dammaran (ginsenoside Rb1, Rd, Re, Rg2...).

Phần tổng quan bệnh học phân tích chi tiết cơ chế tổn thương tế bào do các dạng ROS ($O_2^{\bullet-}$, $^{\bullet}OH$, $H_2O_2$) và RNS ($NO^{\bullet}$, $ONOO^-$) gây stress oxy hóa, liên hệ trực tiếp đến các bệnh lý thoái hóa thần kinh như xơ cứng teo cơ một bên (ALS), Parkinson và Alzheimer. Đồng thời, chương 1 trình bày giải phẫu chức năng của hệ cholinergic, động học enzym AChE và cơ chế tác dụng của các thuốc điều trị Alzheimer được FDA và EMA cấp phép (donepezil, rivastigmine, galantamine, memantine, tacrine). Tác giả so sánh ưu nhược điểm của các phương pháp sàng lọc ức chế AChE in vitro (phương pháp Ellman, phương pháp muối Fast Blue B dạng đo quang và sắc ký lớp mỏng sinh học, phương pháp điện di mao quản).

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn gốc mẫu dược liệu thu thập tại Sa Pa (Lào Cai) vào tháng 3/2016 và quy trình điều chế cao giàu saponin. Quy trình chiết xuất Tam thất hoang sử dụng phương pháp chiết cồn 50% ở nhiệt độ 90°C (tỷ lệ dung môi/dược liệu 10/1, chiết 3 lần, 1 giờ/lần), cô dịch chiết dưới áp suất giảm thành cao lỏng 1:20, làm giàu saponin qua cột nhựa hấp phụ macroporous resin D101, rửa giải bằng ethanol 80%, sau đó thu hồi dung môi và sấy chân không ở 55–60°C trong 24 giờ.

Quy trình thực nghiệm đo quang quét gốc tự do DPPH và thử nghiệm ức chế AChE theo phương pháp Ellman được chuẩn hóa chi tiết về thể tích, thứ tự phối trộn dung dịch, nhiệt độ và thời gian ủ (ủ 15 phút ở nhiệt độ phòng đối với phản ứng DPPH; ủ 15 phút với enzym và ủ tiếp 10 phút sau khi thêm cơ chất DTNB/ATCI đối với phản ứng Ellman). Công thức tính phần trăm chống oxy hóa và phần trăm ức chế enzym (%I) được thiết lập cùng thuật toán xác định độ lệch chuẩn SD và phương pháp ngoại suy đồ thị phi tuyến tính trên phần mềm SigmaPlot 10.0.

Chương 3: Kết quả và bàn luận

Chương 3 trình bày toàn bộ số liệu đo quang thực nghiệm, biểu đồ hồi quy liều - đáp ứng và các phân tích học thuật chuyên sâu.

Bảng 1: Hoạt tính chống oxy hóa quét gốc tự do DPPH của mẫu thử và đối chứng

Nồng độ mẫu thử	Mẫu thử / Đối chứng	% Chống oxy hóa trung bình (%)	Độ lệch chuẩn (SD)
0,0290625 mg/ml	Vitamin C	8,41	0,0311
0,058125 mg/ml	Vitamin C	25,63	0,0127
0,11625 mg/ml	Vitamin C	46,20	0,0141
0,2325 mg/ml	Vitamin C	73,71	0,0275
0,46 mg/ml	Vitamin C	81,81	0,0063
0,93 mg/ml	Vitamin C	97,92	0,0063
1,86 mg/ml	Vitamin C	98,38	0,0042
6,2 mg/ml	Sâm vũ diệp	30,74	0,0247
12,4 mg/ml	Sâm vũ diệp	42,65	0,0084
24,8 mg/ml	Sâm vũ diệp	58,16	0,0169
49,6 mg/ml	Sâm vũ diệp	75,28	0,0311
6,2 mg/ml	Tam thất hoang	19,00	0,0176
12,4 mg/ml	Tam thất hoang	33,38	0,0176
24,8 mg/ml	Tam thất hoang	42,20	0,0084
49,6 mg/ml	Tam thất hoang	62,46	0,0134

Bảng 2: Hoạt tính ức chế enzym Acetylcholinesterase in vitro

Nồng độ	Berberin clorid (%I ± SD)	Sâm vũ diệp (%I ± SD)	Tam thất hoang (%I ± SD)
0,05 µg/ml	6,50 ± 0,0113	-	-
0,1 µg/ml	18,70 ± 0,0247	-	-
2 µg/ml	51,92 ± 0,0063	-	-
5 µg/ml	54,71 ± 0,0077	-	-
10 µg/ml	56,68 ± 0,0544	-	-
20 µg/ml	60,74 ± 0,0516	-	-
250 µg/ml	-	18,35 ± 0,0579	15,33 ± 0,0113
500 µg/ml	-	26,48 ± 0,0183	14,92 ± 0,0247
1000 µg/ml	-	13,24 ± 0,0523	14,23 ± 0,0049
2000 µg/ml	-	31,53 ± 0,0063	14,29 ± 0,0183
4000 µg/ml	-	26,19 ± 0,0021	11,32 ± 0,0473

Phần bàn luận làm rõ: Sâm vũ diệp thể hiện hoạt tính chống oxy hóa DPPH cao hơn Tam thất hoang nhưng cả hai đều có giá trị thấp hơn nhiều so với vitamin C. Tác giả so sánh kết quả này với công trình của Trần Công Luận (2002) trên in vivo (cao saponin toàn phần ức chế malondialdehyde ở mức 25–100 µg/ml) và phân tích rằng quá trình làm giàu phân đoạn saponin bằng cột resin D101 có thể đã loại bỏ các nhóm hợp chất polyphenol và flavonoid vốn có khả năng dập tắt gốc tự do rất mạnh. Đối với thử nghiệm ức chế AChE, việc cao giàu saponin chưa thể hiện tác dụng được giải thích là do các ginsenoside có hoạt tính cao trên thần kinh (như Rb1, Rg1, Rg3) chiếm hàm lượng thấp trong mẫu thử, hoặc do cơ chế bảo vệ cholinergic của saponin trong cơ thể sống đòi hỏi quá trình chuyển hóa qua vi khuẩn đường ruột (tạo hợp chất Compound K) mà mô hình in vitro không mô phỏng được.

Kết quả và đóng góp

Khóa luận đã xác định được các số liệu định lượng thực nghiệm cụ thể sau:

• Xác định giá trị $IC_{50}$ chống oxy hóa trong phương pháp quét gốc tự do DPPH:
  • Cao giàu saponin Sâm vũ diệp: $IC_{50} = 18,000\text{ mg/ml}$.
  • Cao giàu saponin Tam thất hoang: $IC_{50} = 31,620\text{ mg/ml}$.
  • Chất chuẩn đối chứng Vitamin C: $IC_{50} = 0,126\text{ mg/ml}$.
• Đánh giá hoạt tính ức chế enzym AChE in vitro:
  • Chất chuẩn Berberin clorid thể hiện hoạt tính ức chế mạnh với $IC_{50} = 1,454\text{ \mu g/ml}$.
  • Cao giàu saponin của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang ở dải nồng độ từ 250 đến 4000 µg/ml chưa thể hiện tác dụng ức chế enzym AChE; phần trăm ức chế không tăng theo nồng độ (Sâm vũ diệp dao động trong khoảng 13,24% – 31,53%; Tam thất hoang dao động trong khoảng 11,32% – 15,33%) và chưa xác định được giá trị $IC_{50}$.

Các giải pháp và kiến nghị khoa học do tác giả đề xuất:

• Tiếp tục tối ưu hóa các thông số kỹ thuật của quy trình thử nghiệm (tỷ lệ cơ chất, thời gian và nhiệt độ ủ).
• Mở rộng khảo sát hoạt tính sinh học trên các phân đoạn chiết dung môi khác nhau hoặc trên từng hợp chất saponin tinh khiết được phân lập từ Sâm vũ diệp và Tam thất hoang.
• Triển khai đánh giá tác dụng chống oxy hóa trên mô hình in vivo thông qua phương pháp nghiền đồng thể mô và định lượng chỉ số malondialdehyde (MDA).
• Đánh giá khả năng bảo vệ tế bào thần kinh cholinergic trong bệnh Alzheimer trên mô hình động vật thực nghiệm in vivo.

Về mặt đóng góp học thuật, đây là công trình bước đầu cung cấp dữ liệu định lượng có tính hệ thống về hoạt tính chống oxy hóa DPPH và khả năng tương tác với enzym AChE in vitro của phân đoạn cao giàu saponin từ hai loài dược liệu đặc hữu Sa Pa, đóng góp cơ sở dữ liệu thực nghiệm phục vụ định hướng nghiên cứu và phát triển sản phẩm của đề tài Chương trình Tây Bắc.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận có các hạn chế được tác giả ghi nhận:

• Thử nghiệm chỉ mới dừng lại ở mức độ sàng lọc in vitro bước đầu trên phân đoạn cao giàu saponin toàn phần, chưa tiến hành thử nghiệm trên các hợp chất saponin đơn lẻ hoặc các phân đoạn chiết phân cực khác (như phân đoạn chứa polyphenol, flavonoid).
• Phương pháp đánh giá chống oxy hóa chỉ sử dụng mô hình gốc tự do DPPH trong dung môi hữu cơ, chưa khảo sát trên các mô hình dập tắt gốc tự do khác có tính sinh học cao hơn như gốc hydroxyl ($^{\bullet}OH$) hay phương pháp khử màu ABTS.
• Thử nghiệm ức chế AChE in vitro chưa phản ánh được các biến đổi chuyển hóa sinh học của saponin khi đi qua hệ tiêu hóa ở cơ thể động vật.

Hướng nghiên cứu tiếp theo bao gồm việc hoàn thiện quy trình phân lập các saponin tinh khiết, đánh giá hoạt tính chống oxy hóa và bảo vệ thần kinh trên mô hình nuôi cấy tế bào và mô hình động vật sống (in vivo), kết hợp định lượng các enzym chống oxy hóa nội sinh như superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) và glutathione peroxidase (GSH-PX).

Giá trị tham khảo

Tài liệu là nguồn tham khảo hữu ích cho:

• Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Dược học, Dược lý học, Hóa thực vật và Dược liệu học quan tâm đến quy trình sàng lọc hoạt tính sinh học in vitro.
• Các nhà nghiên cứu đang thực hiện đề tài về chi Panax L. và các cây thuốc vùng Tây Bắc.

Các nội dung có giá trị tham khảo cao nhất trong khóa luận gồm:

• Quy trình chiết xuất và làm giàu saponin bằng cột nhựa hấp phụ macroporous resin D101 từ nguồn dược liệu tươi.
• Quy trình pha chế hóa chất, thiết lập nồng độ và các bước tiến hành thực nghiệm đo quang chuẩn hóa cho hai phương pháp thử nghiệm sinh học: quét gốc tự do DPPH và ức chế enzym AChE theo kỹ thuật Ellman cải tiến.

Câu hỏi thường gặp

Mẫu dược liệu Sâm vũ diệp và Tam thất hoang trong nghiên cứu có nguồn gốc từ đâu và được thu hái vào thời điểm nào?
Mẫu thân rễ Sâm vũ diệp và toàn cây tươi Tam thất hoang được thu hái tự nhiên tại Sa Pa, tỉnh Lào Cai vào tháng 3 năm 2016, sau đó được giám định tên khoa học chính xác tại Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu.

Giá trị $IC_{50}$ chống oxy hóa trong thử nghiệm DPPH của hai loại cao dược liệu là bao nhiêu so với chất chuẩn?
Giá trị $IC_{50}$ chống oxy hóa của cao giàu saponin Sâm vũ diệp là 18,000 mg/ml, Tam thất hoang là 31,620 mg/ml, cao hơn rất nhiều so với chất đối chứng dương là vitamin C ($IC_{50} = 0,126\text{ mg/ml}$).

Kết quả thử nghiệm ức chế enzym AChE của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang trên in vitro thể hiện như thế nào?
Cả hai mẫu cao giàu saponin ở dải nồng độ từ 250 đến 4000 µg/ml đều chưa thể hiện hoạt tính ức chế enzym AChE in vitro; tỷ lệ ức chế dao động thấp (13,24% – 31,53% ở Sâm vũ diệp và 11,32% – 15,33% ở Tam thất hoang) và không tăng phụ thuộc vào liều thử nghiệm.

Chất nào được sử dụng làm đối chứng dương trong thử nghiệm ức chế enzym AChE và kết quả đạt được là bao nhiêu?
Chất đối chứng dương được sử dụng là berberin clorid ở dải nồng độ 0,05 – 20 µg/ml, cho kết quả ức chế enzym AChE phụ thuộc rõ rệt vào nồng độ với giá trị $IC_{50} = 1,454\text{ \mu g/ml}$.

Phương pháp thống kê và phần mềm nào đã được sử dụng để xử lý số liệu thực nghiệm?
Số liệu thực nghiệm được tính toán sai số bằng độ lệch chuẩn (SD) dựa trên công thức thống kê sinh học và được xử lý, dựng đồ thị, tính toán giá trị $IC_{50}$ thông qua phần mềm SigmaPlot phiên bản 10.0.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Lưu Thị Huyền Trang đã hoàn thành việc đánh giá thực nghiệm bước đầu về hoạt tính chống oxy hóa DPPH và khả năng ức chế enzym AChE in vitro của cao giàu saponin từ Sâm vũ diệp và Tam thất hoang thu hái tại Sa Pa. Kết quả chỉ ra rằng cả hai loài đều có hoạt tính dập tắt gốc tự do DPPH ở mức độ thấp ($IC_{50}$ lần lượt là 18,000 mg/ml và 31,620 mg/ml), đồng thời chưa thể hiện tác dụng ức chế enzym AChE trong điều kiện thử nghiệm đo quang in vitro. Công trình cung cấp hệ thống số liệu định lượng gốc và quy trình thực nghiệm rõ ràng, tạo cơ sở khoa học cần thiết cho các nghiên cứu chuyên sâu tiếp theo trên từng hoạt chất tinh khiết cũng như trên các mô hình dược lý in vivo.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Tổng quan về chi Panax L. Vị trí phân loại Theo hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan (1987), chi Panax L. có vị trí phân loại như sau: Giới Thực vật (Planta) Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida) Phân lớp Hoa hồng (Rosidae) Bộ Hoa tán (Apiales) Họ Ngũ gia bì (Nhân sâm) (Araliaceae) Chi Panax L.

Tuy nhiên, nhiều nhà phân loại học đã có những nghiên cứu về thực vật của các loài thuộc chi Panax L. Đặc điểm hình thái chung của chi Panax L. Cây thân thảo, sống nhiều năm nhờ thân rễ. Thân rễ ngắn hoặc thon dài, phân nhánh.

Các loài khác nhau của chi Panax L. có sự khác nhau về độ bền của rễ (rễ các loài P. vietnamensis Ha & Grushv. Sun dễ bị thủy phân hơn) và hình dạng của rễ.

Lá kép chân vịt, mọc vòng từ 3 – 5 lá, mép lá có răng cưa hoặc xẻ thùy lông chim. Cụm hoa tán đơn, hoa lưỡng tính có bầu dưới. Hoa có 5 lá đài hàn liền ở dưới, tràng 5, nhị 5. Bầu 2-3 có khi đến 5 ô.

Quả mọng, hình cầu có khi hơi dẹt, hạt dẹt, có nội nhũ mịn [41]. Phân bố Trên thế giới, theo trang The plant list, đã có 261 loài đã được định danh. Trong đó, có 13 tên khoa học đã được chấp thuận, 235 tên đồng nghĩa và 13 tên loài chưa xác định chính xác thông tin. Có 2 loài phân bố ở Đông Bắc Mỹ Seemann 1868; Burkill 1902; Graham 1966; Proctor and Bailey 1987).

Các loài khác phân bố ở châu Á (Burkill 1902; Hara 1970; Wen and Zimmer 1996). Ở châu Á, vùng Đông Nam Trung Quốc và phía Đông của dãy Himalaya là nơi phân bố của nhiều loài khác nhau thuộc chi Panax L. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Thành phần hóa học chính của chi Panax L.

Các hợp chất saponin hay còn được biết đến là các ginsenoside là thành phần chính cho tác dụng sinh học trong các loài thuộc chi Panax L. Ngoài ra, nhiều hợp chất chuyển hóa thứ cấp như các acid hữu cơ, ester, các polysaccarit, các amino acid, các sterol, flavonoid và các carben… cũng đã được tìm thấy trong các loài thực vật thuộc chi Panax L. Hợp chất saponin Hợp chất saponin hay ginsenosid là oligosaccarit của triterpenoid khung dammaran hoặc oleanan. Các nhà khoa học đã phân lập và xác định cấu trúc của ít nhất 289 saponin khác nhau.

Dựa vào cấu trúc của các sapogenin, các ginsenosid đã biết có thể được phân loại thành 6 nhóm khác nhau: saponin dẫn chất của protopanaxadiol, saponin dẫn chất của protopanaxatriol, saponin dẫn chất của octillol, saponin dẫn chất của acid oleanolic, saponin có chuỗi bên C17 biến đổi và các saponin khác. Trong đó, sponin dẫn chất của protopanaxadiol, saponin dẫn chất của protopanaxatriol, saponin dẫn chất của octillol và saponin dẫn chất của acid oleanolic là phổ biến nhất. Hợp chất polyacetylen Polyacetylen thường là các hydrocarbon mạch thẳng 17 và 18 carbon. Tác dụng dược lý của một số loài thuộc chi Panax L 1.

Nhâm sâm (Panax ginseng C. Mey) Nhâm sâm là một trong những vị thuốc quý, được sử dụng với nhiều tác dụng khác nhau, trong đó cho tác dụng chính là điều trị các bệnh tinh thần và mệt mỏi. Ngoài ra, nhân sâm cũng đã được nghiên cứu và cho thấy có nhiều tác dụng khác nhau. Thành phần chính saponin trong Nhâm sâm có tác dụng chống oxy hóa, chống viêm, chống ung thư; giúp cải thiện chức năng của hệ tim mạch, hạ cholesterol và lipid máu; và chống kết tập tiểu cầu.

Tam thất (Panax notoginseng (Burk. Chen) (Sanchi ginseng) Tam thất cũng cho nhiều tác dụng sinh học khác nhau. Dịch chiết saponin của Tam thất có tác dụng bảo vệ hệ thần kinh trung ương và hệ tim mạch. Thành phần saponin trong dược liệu cũng cho thấy tác dụng hạ đường 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] huyết, kích thích hệ miễn dịch, chống khối u, chống viêm, giảm đau, chống oxy hóa, chống huyết khối, phòng ngừa xơ vữa động mạch, giúp hạ huyết áp và tăng hoạt động của tinh trùng.

Sâm Mỹ cũng có tác dụng chống oxy hóa và tác dụng tốt trên hệ tim mạch, giúp làm giảm nhồi máu cơ tim và sự chết theo chương trình (apoptosis) của các tế bào cơ tim. Tương tự như Nhâm sâm, Sâm Mỹ cũng có tác dụng chống huyết khối và chống kết tập tiểu cầu. Ngoài ra, loài này cũng cho tác dụng hạ đường huyết [39]. Tổng quan về Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai & Feng) Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai & Feng) là 2 loài thuộc chi Panax L., họ Nhâm sâm (Araliaceae).

Đây là 2 loài cây được tìm thấy mọc tự nhiên ở vùng núi phía bắc Việt Nam, hiện nay đang được quan tâm phát triển trồng. Các nghiên cứu nhiều cả về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của 2 loài này còn hạn chế. Sâm vũ diệp – Panax bipinnatifidus Seem. 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.

Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. Feng) Về thành phần hóa học: Theo các kết quả nghiên cứu, các saponin là thành phần chính của 2 loài Sâm vũ diệp và Tam thất hoang. Sâm vũ diệp Năm 1989, nhóm nghiên cứu Trung Quốc đã công bố phân lập được 13 saponin khung dammaran từ lá Sâm vũ diệp ở Trung Quốc, trong đó bao gồm một số ginseng saponin đặc trưng như ginsenosid F1, F2, F3, Rg2, Rb, Rd, Re và Rb3 [50]. Năm 2011, nhóm nghiên cứu Việt Nam - Hàn Quốc đã phân lập và xác định được cấu trúc của 10 saponin khung oleanan trong rễ của Sâm vũ diệp trong dịch chiết methanol.

Trong đó, xuất hiện 3 hợp chất mới là các bifinoside A—C và 7 hợp chất đã biết bao gồm narcissiflorine methyl ester, chikusetsusaponin IVa, pseudoginsenosid RP1 methyl ester, stipuleanosid R1, pseudoginsenosid RT1 methyl ester, momordin IIe và stipuleanosid R2 methyl ester. [46] Năm 2015, nhóm tác giả Viện Dược liệu (Trần Thanh Hà, Đỗ Thị Hà, Nguyễn Minh Khởi) đã bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học của Sâm vũ diệp và đã phân lập được một hỗn hợp saponin bao gồm stigmasterol-3-O-β- D-glucopyranosid và β-sitosterol-3-O-βD-glucopyranosid, glycosphingolipid: 1-O-(β-D-glucopyranosyl)-N(1,3,4-trihydroxytridec-8-en-2-yl) heptacosanamid, dichaccarid: saccharose từ phân đoạn chiết ethyl acetat rễ của Sâm vũ diệp. Ngoài ra, trong Sâm vũ diệp cũng có các hợp chất 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] triterpenoide, tinh dầu, acid amin, acid hữu cơ, đường khử, polyuronic và những nguyên tố vi lượng [5, 6]. Lần đầu tiên hợp chất polyacetylen được nhận diện trong Sâm vũ diệp và Tam thất hoang [6].

Tam thất hoang Kết quả nghiên cứu cho thấy phần thân rễ Tam thất hoang chứa nhiều saponin khung oleanan (hầu hết đều là saponin dẫn chất acid oleanolic) với hàm lượng tương đối cao cùng một số saponin khung dammaran với hàm lượng thấp. Năm 2002, trên cơ sở phân tích bằng HPLC-MS/MS, nhóm nghiên cứu ở Đại học Toyama (Toyama, Nhật Bản) phát hiện thêm thành phần saponin khung dammaran bao gồm các ginsenosid Rb1, Rc, Rb3 và Rd với hàm lượng nhỏ từ dich chiết ethanol của Tam thất hoang được thu hái ở Trung Quốc [53]. Năm 2010, nhóm nghiên cứu Việt Nam - Hàn Quốc công bố xác định được 15 hợp chất saponin khung oleanan trong đó có một chất mới là spinasaponin A methyl ester, 3 hợp chất polyme, một sesquitecpen và một acid béo. Về tác dụng dược lý: Trong dân gian, 2 loài được sử dụng với công dụng là thuốc bổ, cầm máu, giảm đau… Các hợp chất có hoạt tính sinh học được xác định có trong Sâm vũ diệp có thể giải thích một phần cho các tác dụng chống oxy hóa, chống ung thư, chống mệt mỏi, chống bệnh tiểu đường, cải thiện chức năng sinh sản… của cây theo y học cổ truyền đã sử dụng.

[29, 39, 40] Năm 2010, nhóm nghiên cứu của Liang, Chun, et al. tiến hành đánh giá khả năng ức chế khối u của các hợp chất saponin phân lập từ Tam thất hoang. Kết quả cho thấy các hợp chất trong dịch chiết cho tác dụng chống khối u trên các dòng tế bào ung thư của người HL-60 (bệnh bạch cầu ác tính) và HCT-116 (ung thư ruột kết) với các giá trị IC50 là khác nhau của từng hợp chất [34]. Năm 2011, nhóm nghiên cứu tiếp tục đánh giá khả 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] năng ức chế NF – κB của các triterpenoid khung oleanan cho thấy một số hợp chất có tác dụng ức chế phụ thuộc liều đến khả năng phiên mã của TNF – α có ảnh bởi NF – kB.

Tổng quan về gốc tự do 1. Khái niệm Gốc tự do là trạng thái cấu trúc của phân tử có một điện tử lẻ ở quỹ đạo điện tử ngoài cùng [31], trong khi các phân tử của hệ sinh học đều có số điện tử chẵn ở lớp ngoài cùng [4, 20]. Vì vậy gốc tự do có đặc điểm là rất kém ổn định, chúng sẵn sàng phản ứng với phân tử hoặc nguyên tử lân cận, cho đi hoặc nhận thêm một điện tử để hoàn chỉnh quỹ đạo điện tử ngoài cùng của mình. Các ROS và RNS Các gốc tự do hay nói chính xác là các chất hoạt động chứa oxy (Reactive Oxygen Species - ROS ) và các chất hoạt động chứa nito (Reactive Nitrogen Species - RNS) là các dẫn xuất dạng khử của oxy và nito phân tử.

Chúng được chia thành hai nhóm lớn là các gốc tự do và các dẫn xuất không phải là gốc tự do (tiền thân của các gốc tự do). Các chất hoạt động chứa oxy và nito chính [18] 8 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] ROS được coi là một trong những nguyên nhân chính gây tổn thương mô. Tuy nhiên, sự cân bằng giữa sự sản sinh ROS và hoạt động của hệ thống chống oxy hóa trong cơ thể sống giúp duy trì sự phá hủy của quá trình oxy hóa ở mức độ thấp. Khi sự mất cân bằng xảy ra nghiêm trọng, sản sinh nhiều ROS sẽ gây ra stress oxy hóa.

ROS là nguyên nhân gây ra các bệnh tim mạch, tiểu đường, viêm khớp dạng thấp, ung thư và rối loạn thần kinh [47]. Tương tự như ROS, RNS có vai trò kép, vừa cho tác dụng có lợi vừa có thể gây hại cho hệ thống sống. Nitric oxid là chất được biết sớm nhất với vai trò là phân tử làm giãn nở mạch máu, kiểm soát lượng máu lưu thông đến các bộ phận của cơ thể. Đồng thời, nó có thể là trung gian gây độc tế bào do phá hủy các enzym chuyển hóa bằng phán ứng với superoxid, peroxynitrit.

[18] Các ROS và RNS đươc tạo ra một cách tất yếu trong quá trình trao đổi chất và tùy thuộc vào nồng độ mà chúng có tác động xấu, tốt đến cơ thể.