Khóa luận tốt nghiệp công nghệ sinh học histological evaluation of ovarian tissue derived from vietnamese women after cryopreservation and xenotransplantation into nod

Luận văn tốt nghiệp kỹ thuật nghiên cứu tốt nghiệp công nghệ sinh học histological evaluation of ovarian tissue derived from vietnamese, điều tra thực trạng, phân tích số liệu, đề

• Tác giả: Tran Xuan My
• Người hướng dẫn: MSc. Dang Thanh Long
• Trường học: Nong Lam University - Ho Chi Minh City
• Chuyên ngành: Biotechnology
• Đề tài: Histological Evaluation Of Ovarian Tissue Derived From Vietnamese Women After Cryopreservation And Xenotransplantation
• Loại tài liệu: Undergraduate Thesis
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Thu Duc City

Mục lục chi tiết

• ACKNOWLEDGEMENT
• AFFIRMATION AND COMMITMENT
• ABSTRACT
• 1. CHAPTER 1: Problem statement
• 1.1. Objectives
• 1.2. Contents
• 1.3. Ovarian gross anatomy
• 1.4. Ovarian microanatomy
• 1.5. Folliculogenesis
• 1.5.1. Resting primordial follicle
• 2. CHAPTER 2: LITERATURE REVIEW
• 2.1. Ovarian tissue cryopreservation (OTC)
• 2.2. Techniques of Cryopreservation for Ovarian Tissue
• 2.3. Indications for ovarian tissue cryopreservation
• 3. CHAPTER 3: MATERIALS AND METHODS
• 3.1. Period and location
• 3.2. Materials and methods for research
• 3.3. Experimental design
• 3.4. Preparation of tissue
• 3.5. Slow-freezing protocol and thawing procedure
• 3.6. Vitrification protocol and warming procedure
• 3.7. Xenotransplantation of human ovarian tissue
• 4. CHAPTER 4: RESULTS AND DISCUSSIONS
• 4.1. Graft recovery rate and macroscopy
• 4.2. Histological assessment
• 4.3. Proportion of morphological normal and atretic follicles
• 4.4. Proportion of primordial and growing follicles
• 5. CHAPTER 5: CONCLUSIONS AND SUGGESTIONS
• LIST OF ABBREVIATIONS
• LIST OF TABLES
• LIST OF FIGURES

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Đánh Giá Mô Học Tế Bào Buồng Trứng

Đánh giá mô học tế bào buồng trứng là một lĩnh vực nghiên cứu quan trọng trong y học, đặc biệt là trong việc bảo tồn khả năng sinh sản của phụ nữ. Nghiên cứu này tập trung vào việc đánh giá mô buồng trứng của phụ nữ Việt Nam sau khi thực hiện cryopreservation và xenotransplantation. Việc hiểu rõ về cấu trúc và chức năng của mô buồng trứng sẽ giúp cải thiện các phương pháp điều trị và bảo tồn khả năng sinh sản.

1.1. Mô Học Tế Bào Buồng Trứng Khái Niệm Cơ Bản

Mô học tế bào buồng trứng liên quan đến việc nghiên cứu cấu trúc và chức năng của các tế bào trong buồng trứng. Các tế bào này bao gồm tế bào trứng, tế bào vỏ và các tế bào hỗ trợ khác. Việc hiểu rõ về mô học tế bào buồng trứng là cần thiết để đánh giá hiệu quả của các phương pháp cryopreservation.

1.2. Tầm Quan Trọng Của Cryopreservation Trong Bảo Tồn Sinh Sản

Cryopreservation là một phương pháp quan trọng giúp bảo tồn mô buồng trứng và khả năng sinh sản của phụ nữ. Phương pháp này cho phép lưu trữ mô buồng trứng trong thời gian dài mà không làm giảm chất lượng tế bào. Nghiên cứu cho thấy rằng cryopreservation có thể bảo tồn một số lượng lớn các nang trứng nguyên thủy.

II. Thách Thức Trong Nghiên Cứu Mô Học Tế Bào Buồng Trứng

Mặc dù có nhiều tiến bộ trong nghiên cứu mô học tế bào buồng trứng, nhưng vẫn tồn tại nhiều thách thức. Các vấn đề như tỷ lệ tổn thương tế bào trong quá trình cryopreservation và xenotransplantation cần được giải quyết. Việc đánh giá chính xác các yếu tố ảnh hưởng đến sự sống sót của tế bào là rất quan trọng.

2.1. Tổn Thương Tế Bào Trong Cryopreservation

Cryopreservation có thể gây tổn thương tế bào do hình thành tinh thể băng trong quá trình đông lạnh. Tổn thương này có thể dẫn đến sự giảm số lượng và chất lượng của các nang trứng. Nghiên cứu cho thấy rằng phương pháp đông lạnh chậm có thể gây tổn thương nhiều hơn so với phương pháp vitrification.

2.2. Khó Khăn Trong Xenotransplantation

Xenotransplantation là một phương pháp phức tạp, đòi hỏi sự tương thích giữa mô của người và động vật. Việc đánh giá sự sống sót và phát triển của mô buồng trứng sau khi cấy ghép vào mô hình chuột NOD/SCID là một thách thức lớn trong nghiên cứu này.

III. Phương Pháp Cryopreservation Tế Bào Buồng Trứng

Có hai phương pháp chính trong cryopreservation tế bào buồng trứng: đông lạnh chậm và vitrification. Mỗi phương pháp có những ưu điểm và nhược điểm riêng. Việc lựa chọn phương pháp phù hợp có thể ảnh hưởng đến tỷ lệ sống sót của tế bào sau khi cấy ghép.

3.1. Phương Pháp Đông Lạnh Chậm

Phương pháp đông lạnh chậm là một trong những kỹ thuật phổ biến nhất trong cryopreservation. Tuy nhiên, phương pháp này có nguy cơ cao gây tổn thương tế bào do hình thành tinh thể băng. Nghiên cứu cho thấy rằng tỷ lệ sống sót của tế bào sau khi đông lạnh chậm thường thấp hơn so với vitrification.

3.2. Phương Pháp Vitrification

Vitrification là một phương pháp tiên tiến hơn, giúp giảm thiểu tổn thương tế bào bằng cách chuyển đổi mô thành trạng thái thủy tinh. Phương pháp này đã cho thấy tỷ lệ sống sót cao hơn và khả năng phục hồi tốt hơn so với đông lạnh chậm.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Về Mô Học Tế Bào Buồng Trứng

Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng tỷ lệ nang trứng atretic cao hơn đáng kể trong các mẫu mô sau khi cryopreservation và xenotransplantation. Sự khác biệt giữa hai phương pháp đông lạnh cũng được ghi nhận, với vitrification cho kết quả tốt hơn trong việc bảo tồn số lượng nang trứng nguyên thủy.

4.1. Tỷ Lệ Nang Trứng Atretic Sau Cryopreservation

Nghiên cứu cho thấy rằng tỷ lệ nang trứng atretic trong các mẫu mô sau cryopreservation cao hơn so với mẫu mô tươi. Điều này cho thấy rằng cryopreservation có thể ảnh hưởng tiêu cực đến sự phát triển của nang trứng.

4.2. So Sánh Giữa Hai Phương Pháp Cryopreservation

Kết quả cho thấy rằng phương pháp vitrification có tỷ lệ sống sót cao hơn so với đông lạnh chậm. Điều này cho thấy rằng vitrification có thể là một lựa chọn tốt hơn cho việc bảo tồn mô buồng trứng.

V. Kết Luận Về Đánh Giá Mô Học Tế Bào Buồng Trứng

Nghiên cứu này đã chỉ ra rằng cryopreservation và xenotransplantation là những phương pháp tiềm năng trong việc bảo tồn khả năng sinh sản của phụ nữ. Tuy nhiên, cần có thêm nhiều nghiên cứu để cải thiện các phương pháp này và giảm thiểu tổn thương tế bào.

5.1. Tương Lai Của Nghiên Cứu Mô Học Tế Bào Buồng Trứng

Tương lai của nghiên cứu mô học tế bào buồng trứng hứa hẹn sẽ mang lại nhiều tiến bộ trong việc bảo tồn khả năng sinh sản. Các phương pháp mới và cải tiến sẽ giúp nâng cao tỷ lệ sống sót của tế bào và cải thiện kết quả điều trị.

5.2. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Nghiên Cứu

Nghiên cứu này có thể được áp dụng trong thực tiễn để cải thiện các phương pháp điều trị cho phụ nữ bị ảnh hưởng bởi ung thư. Việc bảo tồn mô buồng trứng có thể giúp nhiều phụ nữ duy trì khả năng sinh sản sau khi điều trị.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY - HO CHI MINH CITY FACULTY OF BIOLOGICAL SCIENCES HISTOLOGICAL EVALUATION OF OVARIAN TISSUE DERIVED FROM VIETNAMESE WOMEN AFTER CRYOPRESERVATION AND XENOTRANSPLANTATION INTO NOD/SCID MICE Major : BIOTECHNOLOGY Student : TRAN XUAN MY Student ID : 18126097 Academic year : 2018 — 2022 Thu Duc City, 03/2023 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY - HO CHI MINH CITY FACULTY OF BIOLOGICAL SCIENCES UNDERGRADUATE THESIS HISTOLOGICAL EVALUATION OF OVARIAN TISSUE DERIVED FROM VIETNAMESE WOMEN AFTER CRYOPRESERVATION AND XENOTRANSPLANTATION INTO NOD/SCID MICE Science Advisor Student MSc. DANG THANH LONG TRAN XUAN MY Thu Duc City, 03/2023 ACKNOWLEDGEMENT The topic of my graduation thesis in biotechnology, "Histological evaluation of ovarian tissue derived from vietnamese women after cryopreservation and xenotransplantation into NOD/SCID mice”, is the result of my unwavering efforts and the enthusiastic support and encouragement of teachers, friends, and family. So then, I would like to express my heartfelt gratitude to those who helped me during my study and scientific research. First and foremost J am extremely grateful to my advisors, Mr.

Dang Thanh Long, who directly guided and provided invaluable advice, continuous support, and patience during my stuydy. I would like to give special thanks to my friends, lab mates, colleagues, and research team for the cherished time spent together in the lab, and in social settings. Additionally, I would also like to thank the research team of Tu Du Hospital for giving me the opportunity to participate in this project. Thank you to the administrator, and all of the teachers at Nong Lam University - Ho Chi Minh City, Department of Biological Sciences, Laboratory of Stem Cell Research and Application — University of Science, Vietnam National University Ho Chi Minh city for creating favorable conditions for me to complete my graduation project.

Finally, I would like to reveal my gratitude to my family for always being present, supportive, and encouraging. AFFIRMATION AND COMMITMENT My name is Tran Xuan My, student ID: 18126097, class: DH18SHD (Phone: [phone], email: [e-mail]), of Biotechnology, Nong Lam University Ho Chi Minh city. This is my graduation thesis, directly carried out by myself, as part of project of Tu Du Hospital. The data and information in the research are sincere and objective.

I take full responsibility for these commitments to the committee. Thu Duc City, 6th February, 2023 Student’s signature ABSTRACT Human ovarian tissue cryopreservation 1s an important procedure for preserving fertility. Slow freezing and vitrification are the two most common cryopreservation methods. The objective of this research was to compare the effects of conventional and rapid freezing on human ovarian tissue using a xenotransplantation model.

Ovarian tissue fragments from eight patients were randomly divided into three groups: Group 1: control samples (fresh tissue); Group 2: experimental samples after slow freezing and transplantation (SE/T); and Group 3: experimental samples after vitrification and transplantation (VT/T). Tissue samples from the SF/T and VT/T groups were grafted and retrieved after 7 days. Histological examination of all tissue fragments was performed using hematoxylin and eosin staining. The rate of atretic follicles was significantly higher in both the SF/T (P<0,0001) and VT/T (P<0,0001) groups compared with the control group.

The number of primordial follicles decreased after cryopreservation and xenotransplantation and was significantly higher in the slow freezing group than in the vitrification group (P<0,05). Following these findings, vitrification can be suggested as an appropriate alternative to slow cryopreservation. Keywords: ovarian tissue cryopreservation; slow-freezing; vitrification; fertility preservation; xenotransplantation. il TABLE OF CONTENTS AFFIRMATION AND COMMITMENT si neeiiedeeiasdiiidelkeseiseissi 1 ge) Se a eer il AEE OE CII EIN EDS escsssnsessen evens sept A SESSA ES AL 11 LIS TOR ABBE VLA IOI KG ẽếẽốếốếốếố ốc vi Lisle LS ocean ee vil LIST (OP FIGURED co eeeeesrereenbreeeosiiogagisyfsdtedesisteEaseiloi0i618t40G0101g109461001615400000170700001g.ccccccccccescesecesseseeeseeneseceeeeesceseeeseeeaseeeesseseneseeeeeeeeees | Pe ee | |.

0N RE aZ 13 CGIHI(ETSs:tttizigi0000139071166000235852IĐEEEDNGESSEIHEEBS.ERHALGEESEEEQESSSEEESLSEBDHEEESSSEERSEEGASISISEEIEEEG15GE-248Đ0G 2 CHAP TER.LITERUAT URE, RW IEW saa crenunnscvianstucsenituansusiiviinesinisiinicwesteitieuiiiassineinsvsisirssy 3 2. 3 Deal cals: QNAEVAIY DTUSS ANAL OULY wscscesesonumecesearccwisasiemstveestosstemonaue cit asiahirayposiencatanteeneremntamemsmenenuansases 3 2, 2). OM ARIAT TN IOT ORM ALOINY. a cocsscnvs san sean sacnpreesanea sms incuamiun ne Sexetu pasaimespensasncp smsacnapmeneasnaranas 3 CR LG cL See a ee ee eT eee ee ee ee eee 4 2.

esting: peimmond tall T(ÌNG l€,. Growing preantral (primary and secondary) folÏIcÌe.-- ------ + ++-s<++s++ss+ze+zsxss 5 2 cd, CREONMIILP RMÍYH| (Pettey PTOI cure sauenanrecnsinnen ananeseasmananasiniucon wesnunansaauenencneaanenauaaens 6 2. ch 2 1c ng 4gp 6l, ph sóe 8 iliv, XXIIĐH:THÌNGIR tuangaebeiengasxebighisrioieigll38i00010101040x6568010 eS Na asm EN TaN TONNER 8 2. Ovarian tissue cryopreservation (OÏTC).

Lechniques of Cryopreservation Tor OVALIET [BS áo eeesesendiiiiEAASPEASU1000530. 11 Pde Ls SUC C CAG gan gang ga ha tngnoGi680001408020311008581300G0195505833SSSERSGEREGRSLESXIGGSAS4G09503803308028560 11 Ce ool. Indications for ovarian tissue CrYODF€S€TVAfIOH. Methods of ovarian tissue eVaÏUafIOT.

-- -- - - - << 3216110111111 111 11 151111 TT ky 16 lb bai k COMTI BID ccnssacssecesos oss ec 4a NSA USL BSE SRS UR 17 2.cnnnnncroneennsnnesansnnnenntanrenngenesoangnesanrangeeanenasmenennagacananenussonesns 18 CHAPTER 3; MATEREALS AINDD MT HỖ scicecsusesncancesnee vaceanin eaccanevancarnecnmasmenmnmeney sae 20 3. Period and location ou 1n. Materials and methods for research.L0IWBNDI SOVEREIGN VAIS ITD, a ccscacscss seein icine ce mecrninanastia aeons 20 Tin cau. PRINT sci NS aR Sp ASAE a RRR 20 3.3), Experimental Peston eoccsnsssenas weseuseeuveemeuerueans ute nates eeREI 20 3.- Preparation: OF TSSUC DIeGGS.

Slow-freezing protocol and thawing procedure. Vitrification protocol and warming prOC€dUT. Kenotransplantation of humari Ovariath [RE cau cong ng n0 g1 G0 l4 H2 S515 35 46G9355060i 60454 23 '3.S/6:, 1LUNBMG pRomensing BI. SGGEIOHTHỦTNEE se-seeecscssz6Esi0sio550530016.

RESULTS AND DISCUSSIONS eÝeeeeeaeaeiiee-e=sssse 27 lu |. ROS cosnnunma meena RAE REE 2Í 4. Graitrecovery rake antl MacrascO Me ASDCGÍ: ninicisaisancrmmarasinossaimsatuutinncssmmnanenvniins ZT 4. 28 OP eC TẢ TT sau nga ggginGguribuibtiinlbiludgagii8ilgbidigiostiASGS940000I80QÀNGEĐd.3; Grows Lollielé £alC enccrceserererneceareswacnearee eee cameron Tie meee eR 30 | Se a 31 CHAPTER 5.

CONCLUSIONS AND SUGGESTIONS. 40 5D Dae DUES (OTIS beter retreat cee eee eer et ere er rete re de 40 REPEREING ED enmcnsassennannsas saneneceaeranesaseannsnanarexequunsrsnanasunauanaeeeaenenarnamusimeanesauseanneauaanciues 4] JS 2) er | 1V LIST OF ABBREVIATIONS CPA : Cryoprotective agent DMSO : Dimethyl sulfoxide EG : Ethylene glycol GC : Granulosa cell H&E : Hematoxylin and eosin HAS : Human serum albumin NK : Natural killer cell NOD/SCID : Nonobese diabetic/severe combined immunodeficiency OTC : Ovarian tissue cryopreservation PKC : Protein kinase C SCID : Severe combined immunodeficiency SF : Slow-freezing ST/T : Slow-freezing/transplantation VT : Vitrification VT/T : Vitrification/transplantation Vi LIST OF TABLES Table 3. Tissue processing schedule (Processor: Dako-Tissue Tek VIP® 5 Jr) vii LIST OF FIGURES Figure 2. The process of folliculogenesis and oogenesis (Jones & Lopez, 2014).

Diagram of the experimental design. ieee cee eeececeeeeeeeeeceeteeceeceseeceeceeceeeeeetens 21 Figure 4. Human ovarian cortical after xenotransplantation. (a) Ovarian graft (the circle) was visible from the outside through the skin; (b) The graft is attached to the surrounding tissue and appeared white; (c) Arrow indicate several blood vessels from the graft linked to the connective EAS SUS AT ORL ts cscrsaxestesionrnea tours a aetna a ll de ce ea oT oS 27 Figure 4.

Histological assessment of untreated, slow-frozen and vitrified t†1ssues. Proportion of morphological normal and atretic follicles in fresh, SF/T and VT/T Figure 4. Proportion of primordial and growing (intermediate, primary and secondary) follicles in fresh, SF/T and VT/T BTOUD.- --- - c6 2212213513351 1511 93115315111 111 211 111 11 T11 n1 HH HH kg 30 Figure 4. Human ovarian cortical after xenotransplantation.

(a) Ovarian graft (the circle) was visible from the outside through the skin; (b) The graft is attached to the surrounding tissue and appeared white; (c) Arrow indicate several blood vessels from the graft linked to the connective TISSUS SPOUTa ssccccsssesnusansnesameneaae reaver maser cameea nasa henna aE AEE R aE NER RONSON RERROAENS 37 Figure 4. Histological assessment of untreated, slow-frozen and vitrified f1Issues. Proportion of morphological normal and atretic follicles in fresh, SF/T and VT/T IPTOUDÏL6013612252NSSEEGIESESLERGENGEESGHESSSS40438g83380I1SLSBSSEES81SBBELHECEGSESSGHNGSNDESEMGHLGSSSGĐSBAQSBSS023BIGRSGGEI2BĐASUS85533053888 29 Figure 4. Proportion of primordial and growing (intermediate, primary and secondary) follicles int fresh, SE/T Gitd WILT.

SEO pa scessessssssscsssssssessiss sn siowunne aisananwianssaneacaeasusensesnssaseswansssscsmpeersesnanunase 30 Figure 4. Human ovarian cortical after xenotransplantation. Histological assessment of untreated, slow-frozen and vitrified †1ssues. Proportion of morphological normal and atretic follicles in fresh, SF/T and VT/T PT OU Pismeceonnecnmrecenneeemmnnesnxnssemencenaa cmon mneen wenenaersaneeonens meena reruamnrene sce eunmer eam eam ENS 29 Figure 4.

Proportion of primordial and growing (intermediate, primary and secondary) follicles int fresh, SE/T aiid VL/T BPOUDy cencussesnenremeitenn caine menor a eeranceinmmenets 30 Vill CHAPTER 1. Problem statement According to American Cancer Society statistical data, in 2022, up to 983,160 women will be diagnosed with cancer (Siegel, Miller, Fuchs, & Jemal, 2022). The survival rate of cancer patients has increased as a result of modern diagnostic tools combined with advanced chemotherapy and radiation (Ruan et al. However, after the treatment process, the ovaries were severely damaged.

Therapeutic radiotoxic and cytotoxic chemical agents have a particularly devastating effect on primordial follicles, leading to depletion of ovarian content and premature menopause (Arapaki et al. For that reason, the preservation of fertility in cancer-affected women and prepubertal girls is a contentious issue. Currently, the most popular preservation methods are those involving cryopreservation, such as freezing oocytes, embryos, and ovarian tissue (S. Sheshpari et al.

In particular, cryopreservation of ovarian tissue is a bright spot because it has the potential to preserve a large number of primordial and primary follicles, and restore endocrine function (S. Sheshpari et al. It can be performed quickly without requiring ovarian stimulation or delaying cancer treatment. The number of live births reported in 2018 was more than 130 and 360 autotransplantations took place with a successful pregnancy rate of 30% (Arapaki et al.

The two most common cryopreservation methods for frozen human ovarian tissue are slow freezing and vitrification. The majority of live births were reported following the slow freezing of ovarian tissue (Arapaki et al. This method, however, has the risk of producing ice crystals that damage cells. In contrast, vitrification is the widely used method for cryopreservation of embryos and eggs (Jones & Shikanov, 2020) due to a glassy amorphous phase transition mechanism (high viscosity) in a high concentration of cryoprotectant (Bojic et al.

However, there is little information on the cryopreservation of ovarian tissue using vitrification (Lee et al. Consequently, we compared the freezing effects of the two freezing methods on human ovarian tissue. Beside that, animal tissue transplantation is considered an efficient way of studying follicular function and development in vivo (Ruan et al. Thus, we would choose to transplant human ovarian tissue into an immunocompromised mouse model for one week before performing hematoxylin and eosin histological analyses to assess and compare the effects of slow freezing and vitrification on the survival and growth of follicles and stromal cell populations.

Objectives To compare the cryopreservation effect of slow freezing versus vitrification on human ovarian tissue by histological morphology after xenotransplantation. Contents To achieve the mentioned objectives, this research conducted 4 contents: Content 1: Human ovarian tissue xenotransplantation into NOD/SCID mice. Content 2: Evaluation of follicle count. Content 3: Evaluation of atertic follicle rate.

Content 4: Evaluation of growing follicle rate. Ovarian gross anatomy The primary reproductive organs of women are the ovaries, which are located in ovarian fossae in the upper pelvic cavity on either side of the uterus (Modules, n. The ovaries are oval in structure and almond-shaped with a yellowish white color. in a mature ovary, the dimensions are approximately 2,5 to 5 cm in length, 1,5 to 3 cm in width, and 1 cm in thickness.

They are loosely held and attached to the nearby organs by a number of ligaments. The ovarian ligament is responsible for attaching the ovary to the uterus. Blood vessels that carry nutrients and hormones to the ovary are found in the suspensory ligament, which connects the lateral surface of the ovary to the pelvic wall. Finally, the broad ligament is a thin layer of connective tissue that covers and stabilizes the uterus, fallopian tubes, and ovaries on the wall and floor of the pelvic cavity.

As a result, this ligament may play a role in allowing the oocyte to release from the ovary into the fallopian tube and travel down into the uterus (Jones & Lopez, 2014).