Luận văn thạc sĩ: Đánh giá khả năng sản xuất gonadotropin màng đệm ngựa (eCG) từ dòng tế bào HEK 293

Luận văn thạc sĩ đánh giá khả năng sản xuất gonadotropin màng đệm ngựa (eCG) từ dòng tế bào HEK 293, ứng dụng trong nghiên cứu sinh học.

• Tác giả: Nguyễn Bá Nghị
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Thị Mộng Điệp
• Trường học: Đại học Quy Nhơn
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Đánh giá khả năng sản xuất gonadotropin màng đệm ngựa (eCG) từ dòng tế bào HEK 293
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Bình Định

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
• 1.1. Tổng quan về hormone gonadotropin
• 1.2. Hormone kích thích nang trứng (Follicle-stimulating hormone, FSH)
• 1.3. Hormone tạo hoàng thể (Luteinizing hormone, LH)
• 1.4. Gonadotropin màng đệm ở người (Human chorionic gonadotropin, hCG)
• 1.5. Tổng quan về eCG
• 1.5.1. Nguồn gốc và cấu trúc của eCG
• 1.5.1.1. Nguồn gốc của eCG
• 1.5.1.2. Cấu trúc của eCG
• 1.6. Ứng dụng của eCG trong hỗ trợ sinh sản
• 1.7. Tình hình sử dụng eCG trong hỗ trợ sinh sản ở động vật
• 1.8. Tế bào HEK 293 (Human Embryonic Kidney 293)
• 1.8.1. Nguồn gốc của HEK 293
• 1.8.2. Ứng dụng của HEK 293
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Hóa chất và thiết bị
• 2.3. Nội dung nghiên cứu
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Nuôi cấy tế bào
• 2.4.2. Theo dõi và cấy truyền tế bào
• 2.4.3. Phương pháp chuyển nạp gen vào tế bào HEK 293
• 2.4.4. Phương pháp xác định nồng độ cAMP
• 2.4.5. Phương pháp xét nghiệm ELISA “Sandwich”
• 2.4.6. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Tỷ lệ sống của tế bào HEK sau khi rã đông từ -196°C
• 3.2. Khả năng sản xuất eCG tái tổ hợp của tế bào HEK 293 trong môi trường có bổ sung protein
• 3.3. Khả năng sản xuất eCG tái tổ hợp của tế bào HEK 293 trong môi trường không có bổ sung protein
• 3.4. Xác định đặc tính sinh học của eCG tái tổ hợp thông qua nồng độ cAMP nội bào
• 3.5. Ảnh hưởng của eCG đến tỷ lệ sống của tế bào Leydig mLTC-1 trong quá trình nuôi cấy in vitro
• DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về hormone gonadotropin

Gonadotropin là nhóm hormone glycoprotein bao gồm FSH, LH, và hCG. Chúng đóng vai trò quan trọng trong hệ thống sinh sản của động vật có vú. Cấu trúc của các hormone này gồm hai tiểu đơn vị α và β, trong đó tiểu đơn vị α giống nhau ở cả ba hormone, còn tiểu đơn vị β mang tính đặc hiệu. Glycosyl hóa là quá trình quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học và thời gian bán hủy của các hormone này. Sự glycosyl hóa liên kết N và O tạo ra các đồng dạng khác nhau, với mức độ glycosyl hóa cao làm tăng thời gian bán hủy. eCG (Equine Chorionic Gonadotropin) là một hormone đặc biệt với cấu trúc glycosyl hóa phức tạp, giúp nó có thời gian bán hủy dài hơn so với các hormone khác.

1.1. Hormone kích thích nang trứng FSH

FSH có tiểu đơn vị β gồm 111 axit amin với bốn vị trí glycosyl hóa liên kết N. Sự sialyl hóa cao giúp tăng cường ổn định chuyển hóa và kéo dài thời gian bán hủy của FSH. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc kích thích sự phát triển của nang trứng ở động vật.

1.2. Hormone tạo hoàng thể LH

LH có tiểu đơn vị β gồm 121 axit amin với một vị trí glycosyl hóa liên kết N. Số lượng axit sialic thấp khiến LH có thời gian bán hủy ngắn, chỉ từ 20 đến 30 phút. LH đóng vai trò chính trong quá trình rụng trứng và hình thành hoàng thể.

1.3. Gonadotropin màng đệm ở người hCG

hCG có tiểu đơn vị β tương tự LH nhưng với đoạn carboxyterminal dài và bốn vị trí glycosyl hóa liên kết O. Số lượng axit sialic cao giúp hCG có thời gian bán hủy dài hơn, khoảng 24 giờ. hCG được sử dụng rộng rãi trong hỗ trợ sinh sản.

II. Tổng quan về eCG

eCG (Equine Chorionic Gonadotropin) là hormone được tiết ra từ màng đệm sinh học của ngựa mang thai. Nó có cấu trúc glycosyl hóa phức tạp với 45% trọng lượng phân tử là carbohydrate. eCG có khả năng kích thích cả FSH và LH, làm cho nó trở thành công cụ quan trọng trong hỗ trợ sinh sản. Thời gian bán hủy dài của eCG là do sự glycosyl hóa mạnh, đặc biệt là sự gắn kết của axit sialic. Hiện nay, eCG tự nhiên được sử dụng rộng rãi trong chăn nuôi, nhưng việc sản xuất eCG tái tổ hợp từ dòng tế bào HEK 293 đang được nghiên cứu để thay thế.

2.1. Nguồn gốc và cấu trúc của eCG

eCG được tiết ra từ các tế bào sinh dưỡng bào thai của màng đệm ngựa trong giai đoạn đầu thai kỳ. Cấu trúc của eCG gồm hai tiểu đơn vị α và β, với tiểu đơn vị β giống hệt với LHβ nhưng được glycosyl hóa mạnh hơn. Sự khác biệt này giúp eCG có thời gian bán hủy dài hơn so với LH.

2.2. Ứng dụng của eCG

eCG được sử dụng rộng rãi trong chăn nuôi để kích thích dậy thì, đảo ngược chu kỳ động dục, và cải thiện khả năng sinh sản. Tuy nhiên, việc sử dụng eCG tự nhiên đang gặp phải các vấn đề về đạo đức và chi phí, dẫn đến nhu cầu sản xuất eCG tái tổ hợp từ dòng tế bào HEK 293.

III. Dòng tế bào HEK 293

HEK 293 là dòng tế bào thận phôi người được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu sinh học và sản xuất protein tái tổ hợp. Dòng tế bào này có khả năng chuyển nạp gen dễ dàng và phát triển thuận lợi trong môi trường nuôi cấy. HEK 293 đã được sử dụng để sản xuất các protein điều trị và là vật chủ tiềm năng cho việc sản xuất eCG tái tổ hợp. Nghiên cứu này nhằm đánh giá khả năng sản xuất eCG từ dòng tế bào HEK 293, thay thế cho dòng tế bào CHO truyền thống.

3.1. Nguồn gốc và ứng dụng của HEK 293

HEK 293 có nguồn gốc từ tế bào thận phôi người và được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu sinh học. Dòng tế bào này có khả năng biểu hiện gen cao và được sử dụng để sản xuất các protein tái tổ hợp, bao gồm các hormone và kháng thể.

3.2. Ưu điểm của HEK 293 trong sản xuất eCG

So với dòng tế bào CHO, HEK 293 có tỷ lệ tế bào chết thấp hơn và khả năng chuyển nạp gen hiệu quả hơn. Điều này làm cho HEK 293 trở thành vật chủ tiềm năng cho việc sản xuất eCG tái tổ hợp với hiệu suất cao.

IV. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp nuôi cấy tế bào, chuyển nạp gen, và xác định nồng độ cAMP để đánh giá khả năng sản xuất eCG từ dòng tế bào HEK 293. Các phương pháp bao gồm nuôi cấy tế bào, theo dõi tỷ lệ sống, và xét nghiệm ELISA để đo nồng độ eCG. Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp bằng chứng về việc sử dụng HEK 293 để sản xuất eCG tái tổ hợp.

4.1. Nuôi cấy tế bào và chuyển nạp gen

Tế bào HEK 293 được nuôi cấy trong môi trường có bổ sung protein và không bổ sung protein. Quá trình chuyển nạp gen được thực hiện để biểu hiện eCG tái tổ hợp. Tỷ lệ sống của tế bào được theo dõi sau khi chuyển nạp.

4.2. Xác định nồng độ eCG

Nồng độ eCG được xác định bằng phương pháp ELISA sandwich. Kết quả cho thấy khả năng sản xuất eCG của tế bào HEK 293 trong các điều kiện nuôi cấy khác nhau.

V. Kết quả và bàn luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy tế bào HEK 293 có khả năng sản xuất eCG tái tổ hợp với hiệu suất cao. Tỷ lệ sống của tế bào sau khi chuyển nạp gen đạt trên 90%, và nồng độ eCG được sản xuất ra đáp ứng yêu cầu sử dụng. Nghiên cứu này mở ra tiềm năng sử dụng HEK 293 để sản xuất eCG tái tổ hợp thay thế cho eCG tự nhiên.

5.1. Tỷ lệ sống của tế bào HEK 293

Tỷ lệ sống của tế bào HEK 293 sau khi chuyển nạp gen đạt trên 90%, cho thấy khả năng phục hồi và phát triển tốt của tế bào trong môi trường nuôi cấy.

5.2. Khả năng sản xuất eCG tái tổ hợp

Nồng độ eCG được sản xuất từ tế bào HEK 293 đạt mức cao, đáp ứng yêu cầu sử dụng trong hỗ trợ sinh sản. Kết quả này khẳng định tiềm năng của HEK 293 trong sản xuất eCG tái tổ hợp.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Gonadotropin màng đệm ngựa (Equine Chorionic Gonadotropin - eCG) là một hormone glycoprotein quan trọng được tiết ra từ màng đệm của ngựa cái mang thai trong giai đoạn đầu thai kỳ, có khả năng kích thích hoạt động của hormone kích thích nang trứng (FSH) và hormone tạo hoàng thể (LH) ở các loài không phải ngựa. Thời gian bán hủy của eCG trong cơ thể các loài khác nhau dao động từ 5 giờ ở chuột đến hơn 45 giờ ở gia súc, nhờ vào mức độ glycosyl hóa cao chiếm khoảng 45% trọng lượng phân tử. Hiện nay, eCG tự nhiên được thu thập từ máu ngựa cái mang thai, tuy nhiên phương pháp này gây tranh cãi về đạo đức và sức khỏe động vật, đồng thời chưa có sản phẩm eCG tái tổ hợp thương mại do chi phí sản xuất cao.

Luận văn tập trung đánh giá khả năng sản xuất eCG chuỗi đơn tái tổ hợp từ dòng tế bào HEK 293, một dòng tế bào thận phôi người có khả năng phát triển thuận lợi và chuyển nạp gen hiệu quả. Mục tiêu nghiên cứu là xác định hiệu suất sản xuất eCG tái tổ hợp, đặc tính sinh học thông qua nồng độ cAMP nội bào, cũng như ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy có hoặc không có bổ sung protein đến khả năng sản xuất hormone. Nghiên cứu được thực hiện tại Trung tâm nghiên cứu động vật thực nghiệm, Học viện Quân Y, trong năm 2021.

Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa khoa học trong việc mở rộng lựa chọn dòng tế bào sản xuất hormone tái tổ hợp, giảm sự phụ thuộc vào dòng tế bào truyền thống CHO. Về thực tiễn, nghiên cứu góp phần phát triển nguồn hormone eCG tái tổ hợp có thời gian bán hủy dài, ứng dụng trong ngành dược phẩm thú y, hỗ trợ sinh sản động vật, đồng thời giảm thiểu các vấn đề đạo đức liên quan đến thu thập hormone tự nhiên.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Cấu trúc và chức năng của hormone gonadotropin: eCG là một glycoprotein gồm hai tiểu đơn vị α và β, với các vị trí glycosyl hóa N và O quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học và thời gian bán hủy. Sự glycosyl hóa mạnh mẽ, đặc biệt là gắn axit sialic, làm tăng thời gian tồn tại của hormone trong huyết thanh.

• Hoạt động sinh học kép của eCG: eCG có khả năng kích thích cả thụ thể FSH và LH ở các loài không phải ngựa, nhờ sự tương đồng cấu trúc của các thụ thể này, tạo điều kiện cho ứng dụng rộng rãi trong hỗ trợ sinh sản.

• Dòng tế bào HEK 293: Dòng tế bào thận phôi người được biến đổi bởi adenovirus, có khả năng phát triển nhanh, dễ chuyển nạp gen và biểu hiện protein tái tổ hợp hiệu quả. HEK 293 được sử dụng làm vật chủ sản xuất protein tái tổ hợp nhờ khả năng glycosyl hóa phức tạp phù hợp với các hormone glycoprotein.

Các khái niệm chính bao gồm: glycosyl hóa N và O, thời gian bán hủy hormone, hoạt động sinh học của gonadotropin, chuyển nạp gen, và biểu hiện protein tái tổ hợp.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Dòng tế bào HEK 293 được sử dụng để chuyển nạp plasmid chứa gene mã hóa chuỗi đơn eCG. Các hóa chất và thiết bị được chuẩn bị tại Trung tâm nghiên cứu động vật thực nghiệm, Học viện Quân Y.

• Phương pháp nuôi cấy tế bào: Tế bào HEK 293 được rã đông từ nitơ lỏng (-196°C), nuôi cấy trong môi trường EMEM có bổ sung huyết thanh bò (FBS) hoặc không bổ sung protein, duy trì ở 37°C, 5% CO2. Tế bào được theo dõi mật độ và tỷ lệ sống qua nhuộm Trypan blue và đếm tế bào Thoma.

• Chuyển nạp gen: Sử dụng chất truyền nhiễm X-tremeGENE HP-DNA để chuyển nạp plasmid chứa gene eCG hoặc GFP (đối chứng). Tỷ lệ DNA/chất truyền nhiễm là 1:2, với lượng DNA 2 µg cho mỗi giếng 6 giếng trên đĩa nuôi cấy.

• Xác định nồng độ eCG: Thu mẫu phần nổi môi trường nuôi cấy sau 48 giờ chuyển nạp, định lượng eCG bằng kỹ thuật ELISA “Sandwich” với kháng thể đặc hiệu α-eCG.

• Đánh giá đặc tính sinh học: Đo nồng độ cAMP nội bào trong tế bào mLTC-1 sau kích thích bằng eCG tái tổ hợp, sử dụng plasmid Glosensor-22F luciferase và máy đo huỳnh quang.

• Phân tích số liệu: Dữ liệu được xử lý bằng phần mềm GraphPad Prism, sử dụng kiểm định ANOVA để so sánh sự khác biệt, với mức ý nghĩa thống kê p < 0,05.

• Timeline nghiên cứu: Tế bào được nuôi cấy và chuyển nạp trong vòng 48 giờ, sau đó thu mẫu và phân tích trong các ngày tiếp theo. Quá trình nuôi cấy và cấy truyền tế bào kéo dài khoảng 6 ngày để đảm bảo ổn định tế bào.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Tỷ lệ sống của tế bào HEK 293 sau rã đông: Tế bào HEK 293 sau khi rã đông từ nitơ lỏng có tỷ lệ sống ổn định trên 97% qua 3 lần cấy truyền, mật độ tế bào đạt 80-90% diện tích bề mặt sau 48 giờ nuôi cấy, đảm bảo điều kiện tốt cho chuyển nạp gen.

2. Khả năng sản xuất eCG tái tổ hợp trong môi trường có bổ sung protein: Sau 48 giờ chuyển nạp, nồng độ eCG trong phần nổi môi trường nuôi cấy đạt khoảng 110-150 ng/ml, tương đương với mẫu đối chứng eCG NZY-01. Tín hiệu ELISA tăng theo thể tích mẫu, chứng tỏ tế bào HEK 293 đã sản xuất eCG hiệu quả.

3. Ảnh hưởng của môi trường không bổ sung protein: Tế bào HEK 293 vẫn duy trì khả năng sản xuất eCG trong môi trường không có bổ sung protein, tuy nhiên nồng độ eCG thấp hơn so với môi trường có FBS hoặc BSA, cho thấy protein bổ sung hỗ trợ tăng hiệu suất sản xuất.

4. Đặc tính sinh học của eCG tái tổ hợp qua nồng độ cAMP nội bào: eCG tái tổ hợp kích thích tăng nồng độ cAMP trong tế bào mLTC-1 theo liều lượng, với mức tăng cAMP tương tự eCG tự nhiên, chứng minh hoạt tính sinh học của hormone tái tổ hợp được bảo toàn.

Thảo luận kết quả

Tỷ lệ sống cao của tế bào HEK 293 sau rã đông và cấy truyền cho thấy dòng tế bào này ổn định và thích hợp cho sản xuất protein tái tổ hợp. Khả năng sản xuất eCG tái tổ hợp đạt nồng độ trên 100 ng/ml trong môi trường có bổ sung protein là kết quả tích cực, tương đương với các nghiên cứu sử dụng dòng tế bào CHO truyền thống. Môi trường không bổ sung protein làm giảm hiệu suất sản xuất, có thể do thiếu các yếu tố hỗ trợ sự biểu hiện và tiết protein, phù hợp với các báo cáo trước đây về vai trò của huyết thanh trong nuôi cấy tế bào.

Nồng độ cAMP nội bào tăng theo liều eCG tái tổ hợp chứng tỏ hormone có hoạt tính sinh học kép, kích thích thụ thể FSH và LH, phù hợp với cơ chế hoạt động của eCG tự nhiên. Kết quả này cũng đồng nhất với các nghiên cứu về eCG tái tổ hợp trong các dòng tế bào động vật có vú khác.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ ELISA thể hiện nồng độ eCG theo thời gian và điều kiện môi trường, cùng biểu đồ cAMP nội bào theo liều lượng eCG, giúp minh họa rõ ràng hiệu quả sản xuất và hoạt tính sinh học của hormone tái tổ hợp.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy: Khuyến nghị bổ sung protein như FBS hoặc BSA trong môi trường nuôi cấy để tăng hiệu suất sản xuất eCG tái tổ hợp, nhằm đạt nồng độ hormone cao hơn trong vòng 48-72 giờ. Chủ thể thực hiện: Trung tâm nghiên cứu động vật thực nghiệm, thời gian 6 tháng.

2. Phát triển quy trình chuyển nạp gen hiệu quả: Nâng cao tỷ lệ chuyển nạp DNA plasmid vào tế bào HEK 293 bằng các kỹ thuật mới như electroporation hoặc lipofection cải tiến, nhằm tăng sản lượng eCG. Chủ thể thực hiện: Phòng thí nghiệm sinh học phân tử, thời gian 1 năm.

3. Nghiên cứu mở rộng đặc tính sinh học: Thực hiện các thử nghiệm in vivo để đánh giá tác dụng sinh học của eCG tái tổ hợp trên các loài động vật mục tiêu, so sánh với eCG tự nhiên về hiệu quả sinh sản. Chủ thể thực hiện: Viện nghiên cứu thú y, thời gian 1-2 năm.

4. Ứng dụng sản xuất công nghiệp: Xây dựng quy trình sản xuất eCG tái tổ hợp quy mô lớn sử dụng dòng tế bào HEK 293, giảm chi phí và đảm bảo an toàn sinh học, hướng tới thương mại hóa sản phẩm. Chủ thể thực hiện: Doanh nghiệp dược phẩm thú y, thời gian 2-3 năm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu sinh học phân tử và tế bào: Nghiên cứu về biểu hiện protein tái tổ hợp, chuyển nạp gen và sản xuất hormone glycoprotein có thể áp dụng các phương pháp và kết quả trong luận văn để phát triển các sản phẩm tương tự.

2. Chuyên gia dược phẩm thú y: Quan tâm đến phát triển hormone hỗ trợ sinh sản cho động vật, có thể sử dụng kết quả nghiên cứu để cải tiến quy trình sản xuất eCG tái tổ hợp, giảm phụ thuộc vào nguồn hormone tự nhiên.

3. Người làm trong ngành chăn nuôi và thú y: Áp dụng các hormone tái tổ hợp có thời gian bán hủy dài để đồng bộ hóa chu kỳ sinh sản, nâng cao hiệu quả sinh sản và năng suất đàn vật nuôi.

4. Sinh viên và học viên cao học chuyên ngành sinh học thực nghiệm, công nghệ sinh học: Tham khảo phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật chuyển nạp gen và phân tích hoạt tính sinh học hormone trong luận văn để phát triển kỹ năng nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao chọn dòng tế bào HEK 293 để sản xuất eCG tái tổ hợp?
   HEK 293 có khả năng phát triển nhanh, dễ chuyển nạp gen và biểu hiện protein glycoprotein phức tạp nhờ hệ thống glycosyl hóa tương tự tế bào người, giúp sản xuất hormone có hoạt tính sinh học cao.

2. Khả năng sản xuất eCG của HEK 293 so với dòng tế bào CHO như thế nào?
   Nghiên cứu cho thấy HEK 293 có thể sản xuất eCG với nồng độ tương đương hoặc cao hơn trong môi trường có bổ sung protein, đồng thời duy trì hoạt tính sinh học qua xét nghiệm cAMP.

3. Tại sao cần bổ sung protein trong môi trường nuôi cấy?
   Protein bổ sung như FBS hoặc BSA cung cấp các yếu tố dinh dưỡng và hỗ trợ quá trình biểu hiện, gắn kết và tiết protein, giúp tăng hiệu suất sản xuất hormone tái tổ hợp.

4. Hoạt tính sinh học của eCG tái tổ hợp được đánh giá như thế nào?
   Hoạt tính được đánh giá qua nồng độ cAMP nội bào trong tế bào mLTC-1 sau kích thích bằng eCG, với kết quả cho thấy hormone tái tổ hợp kích thích tăng cAMP tương tự hormone tự nhiên.

5. Ứng dụng thực tiễn của eCG tái tổ hợp trong ngành thú y là gì?
   eCG tái tổ hợp có thể được sử dụng để đồng bộ hóa chu kỳ động dục, kích thích rụng trứng và tăng tỷ lệ thụ tinh ở các loài gia súc, giảm thiểu rủi ro và chi phí so với hormone tự nhiên.

Kết luận

• Dòng tế bào HEK 293 có khả năng phát triển ổn định và duy trì tỷ lệ sống trên 97% sau rã đông và cấy truyền, phù hợp cho sản xuất protein tái tổ hợp.
• HEK 293 sản xuất eCG chuỗi đơn tái tổ hợp với nồng độ đạt khoảng 110-150 ng/ml trong môi trường có bổ sung protein, tương đương với mẫu hormone tự nhiên.
• eCG tái tổ hợp kích thích tăng nồng độ cAMP nội bào trong tế bào mLTC-1, chứng minh hoạt tính sinh học kép của hormone được bảo toàn.
• Môi trường nuôi cấy có bổ sung protein giúp tăng hiệu suất sản xuất eCG, trong khi môi trường không bổ sung protein làm giảm nồng độ hormone thu được.
• Nghiên cứu mở ra hướng phát triển hormone eCG tái tổ hợp từ dòng tế bào HEK 293, góp phần đa dạng hóa nguồn sản xuất hormone hỗ trợ sinh sản trong ngành dược phẩm thú y.

Next steps: Tối ưu hóa quy trình nuôi cấy và chuyển nạp gen, mở rộng đánh giá hoạt tính sinh học in vivo, phát triển quy trình sản xuất công nghiệp.

Call to action: Các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp trong lĩnh vực sinh học phân tử và dược phẩm thú y nên hợp tác để ứng dụng kết quả nghiên cứu vào sản xuất và thương mại hóa hormone eCG tái tổ hợp, góp phần nâng cao hiệu quả chăn nuôi bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1. Tổng quan về hormone gonadotropin Ba gonadotropins, hormone kích thích nang trứng (FSH), hormone tạo hoàng thể (LH) và hormone màng đệm ở người (hCG), là glycoprotein bao gồm hai tiểu đơn vị protein liên kết không cộng hóa trị, tiểu đơn vị α và β [15]. Tiểu đơn vị α chứa 92 axit amin và giống nhau ở hormone FSH, LH và hCG. Ngược lại, các tiểu đơn vị β khác biệt và mang lại tính đặc hiệu cho hormone cũng như các đặc tính sinh học khác nhau.

Hoạt tính sinh học của nó được cung cấp bởi sự gắn kết của các gốc carbohydrate, tạo thành các chất dị phân tử. Mức độ và mô hình glycosyl hóa truyền tải phổ của các điện tích, hoạt tính sinh học và thời gian bán hủy khác nhau đối với mỗi glycoprotein [16]. Glycoprotein có hai kiểu glycosyl hóa cơ bản: glycosyl hóa liên kết O, được đặc trưng bởi một carbohydrate N-acetylgalactosamine (GalNAc) gắn với nhóm hydroxyl của một axit amin, serine hoặc threonine, và glycosyl hóa liên kết N, được đặc trưng bởi một N-acetyl glucosamine (GlcNAc) gắn với nhóm amit của asparagin (Asn) [17]. Các oligosaccharide thường kết thúc bằng axit sialic và / hoặc được sulfo hóa GalNAc liên kết với β1-4 (SO3-4GalNAc) [18].

Các phân tử có một số lượng lớn Gal-NAcs đã sulfo hóa biến mất khỏi vòng tuần hoàn nhanh hơn so với các đồng dạng ít sulfo hóa hơn do ái lực của chúng với các thụ thể SO3-4GalNAc ở gan [18]. Mặt khác, nhiều axit sialic sẽ làm tăng thời gian bán hủy [18], [19]. Cách phân tử gonadotropin Các tiểu đơn vị alpha và beta được biểu thị bằng các sợi màu đỏ và xanh lam, các chuỗi carbohydrate được biểu thị bằng các quả bóng màu xám. Hormone kích thích nang trứng (Follicle-stimulating hormone, FSH) Tiểu đơn vị β của FSH bao gồm 111 AA với bốn vị trí glycosyl hóa liên kết N, hai vị trí trên tiểu đơn vị α (Asn52 và Asn78) và hai trên tiểu đơn vị β (Asn7 và Asn24) [17].

Do đó, mỗi tiểu đơn vị được gắn với hai đơn vị carbohydrate với các thành phần thay đổi, lần lượt tạo ra các đồng dạng khác nhau với thời gian bán hủy trong huyết tương và hoạt tính sinh học khác nhau (dao động từ 3 đến 4 giờ) (Hình 1. Dư lượng axit sialic phổ biến hơn nhiều trong FSH so với dư lượng sulfo hóa [19]. Tăng sialyl hóa giúp tăng cường sự ổn định chuyển hóa FSH bằng cách giảm độ lọc thải ở cầu thận bởi các thụ thể sialoglycoprotein ở gan, đây là vị trí chính để lọc thải gonadotropin [20]. Hormone tạo hoàng thể (Luteinizing hormone, LH) Tiểu đơn vị β LH bao gồm 121 AA, đây là một sự khác biệt mang lại hoạt tính sinh học cụ thể và tạo điều kiện thuận lợi cho sự tương tác của nó với thụ thể LH [21].

Tiểu đơn vị β của LH chứa một vị trí duy nhất có liên kết N e 7 glycosyl hóa (Asn 30) và ít dư lượng axit sialic hơn (chỉ 1 hoặc 2), vì vậy LH có thời gian bán hủy ngắn chỉ từ 20 đến 30 phút (Hình 1. Gonadotropin màng đệm ở người (Human chorionic gonadotropin, hCG) Mặc dù tiểu đơn vị β của hCG có trình tự AA tương tự như LH, nhưng sự khác biệt đáng chú ý là sự hiện diện của một đoạn carboxyterminal (CTP) dài với 24 AA có chứa bốn vị trí oligosaccharide liên kết O (Hình 1. Ngoài ra, tiểu đơn vị β hCG chứa hai vị trí glycosyl hóa liên kết N so với một vị trí LH duy nhất. Do số lượng cả vị trí glycosyl hóa và dư lượng axit sialic cao hơn (khoảng 20) so với LH, hCG thể hiện thời gian bán hủy cuối dài hơn rõ rệt là 24 giờ so với khoảng 30 phút đối với LH [20].

Tổng quan về eCG 1. Nguồn gốc và cấu trúc của eCG 1. Nguồn gốc của eCG Equine Chorionic Gonadotropin (eCG) là một loại hormone được tiết ra trong màng đệm sinh học của ngựa mang thai, trước đây được gọi là huyết thanh ngựa chữa (Pregnant Mare’s serum Gonadotropin - PMSG) thuộc họ nội tiết tố glycoprotein. eCG được tạo ra bởi ngựa cái trong thời kỳ đầu mang thai (ngày 40 đến ngày 140) bởi các tế bào sinh dưỡng bào thai của màng đệm, chúng bám vào, xâm nhập vào thực bào biểu mô và gắn vào tử cung như những chiếc cốc nội mạc tử cung chuyên biệt.

Quá trình này bắt đầu vào ngày 36 của thai kỳ. Cấu trúc tuyến tính của gonadotropin ở động vật có vú cho thấy các vị trí gắn carbohydrate Những ngày đầu tiên khi tiến hành nghiên cứu về gonadotropin đã cho thấy rằng huyết thanh từ con ngựa mang thai được tiêm vào động vật thí nghiệm đã làm kích thích sự tăng trưởng của buồng trứng. Thành phần hoạt tính sinh học của kích thích tố này được đặt tên là gonadotropin huyết thanh ngựa mang thai (PMSG) để phản ánh sự xuất hiện trong giai đoạn từ tháng thứ 2 đến tháng thứ 5 của thai kỳ. Một thời gian sau đó, chất đóng vai trò kích thích này đã được xác định có mặt trong tử cung ngựa, dẫn đến gợi ý rằng nó có nguồn gốc từ bào thai [1].

Các nghiên cứu vào đầu những năm 1970 đã xác nhận rằng, nguồn gốc của hormone này là từ các tế bào chronic bào thai xâm nhập biểu mô tử cung để tạo thành các lớp nội mạc tử cung. Phát hiện này đã dẫn đến việc đổi tên hormone PMSG thành gonadotropin màng đệm ngựa (Equine Chorionic Gonadotropin – eCG) [1]. Các nghiên cứu đã chứng minh rằng eCG được tổng hợp và tiết ra tương tự như gonadotropin tuyến yên (FSH, LH), nó được chuyển hóa sau khi được e 9 glycosyl hóa. Giải trình tự axit amin cho thấy cấu trúc chính của eCGβ giống hệt với LHβ.

Cả hai hiển thị một phần mở rộng đầu cuối carboxyl của 30 axit amin, và đuôi này được glycosyl hóa mạnh (Hình 1. Các nghiên cứu sau đó đã chứng minh rằng chúng là hai sản phẩm của cùng một gen đơn [22]. Sự glycosyl hóa đã phân biệt chúng, vì chuỗi LH được bổ sung với oligosacchrides sialyl hóa và sunlfat, trong khi các dạng sialy hóa chiếm ưu thế trong phân tử eCGβ glycosyl hóa mạnh hơn [23]. Sự khác biệt này, đặc biệt là sự gắn kết của axit sialic, dẫn tới một trong những tính chất quan trọng nhất là thời gian bán rã sinh học kéo dài của eCG, dài hơn sáu lần so với LH [24].

Cấu trúc của eCG Là thành viên khác của gia đình bao gồm hormone tạo hoàng thể (LH), hormone kích thích nang trứng (FSH) và hormone kích thích tuyến giáp (TSH). Phân tích protein đã chứng minh rằng eCG được tổng hợp và tiết ra hai tiểu đơn vị α và β liên kết khác nhau và không tương đồng. Trong cùng một loài, tiểu đơn vị α được mã hóa với một gen duy nhất và chung cho tất cả các hormone glycoprotein, trong khi các gen khác nhau mã hóa cho tiểu đơn vị β, mang lại tính đặc hiệu cho các dị thể hormone glycoprotein. Ở ngựa, ngược lại với động vật linh trưởng, cả hai tiểu đơn bị LHβ và CGβ đều được mã hóa bởi cùng một gen và do đó hormone tái tổ hợp được gọi là eLH/CG.

Cả eCG nhau thai và eLH tuyến yên đều biểu hiện hoạt động kép (LH và FSH) ở các loài không phải ngựa với tỷ lệ hoạt động FSH/LH giống hệt nhau [25]. Mặc dù eCG và eLH biểu hiện các chuỗi polypeptide α và β giống hệt nhau, nhưng hàm lượng carbonhydrate của chúng khác nhau. Thật vậy, eCG là loại được glycosyl hóa nặng nhất trong tất cả các hormone glycoprotein với 45% là carbohydrate theo trọng lượng so với 30% đối với eLH. e 10 eCG có ba N-saccharides, hai trên α và một trên β.

Tiểu đơn vị α, bao gồm 96 axit amin, mang hai chuỗi oligosaccharide liên kết phức tạp kiểu N nằm ở asparagin (Asn) 56 và 82 trong khi tiểu đơn vị β bao gồm 149 axit amin chỉ có một ở Asn 13. Ngoài N-glycan, các tiểu đơn vị eLH và eCG đều sở hữu peptit đầu tận cùng carboxyl (CTP) gồm 29 axit amin (β121–149), được O-glycosyl hóa ở cùng 12 gốc serine hoặc threonine [26]. Các hormone nhau thai tuyến yên cũng khác biệt mạnh mẽ bởi sự kết thúc N-glycan của chúng với axit sialic (Siaα2, 3Gal) trên eCG và N-acetyl glactosamines sulfate (SO4-4-GalNac) trong eLH [27]. Vị trí và cấu trúc chuỗi carbohydrate của gonadotropins ngựa Vị trí của N- và O-glycans trong tiểu đơn vị α và β của eLH và eCG, và trong tiểu đơn vị b tái tổ hợp thiếu CTP của nó.

Bảng dưới: Các cấu trúc điển hình của chuỗi bên N- carbohydrate (bên trái) và chuỗi bên O-carbohydrate (bên phải) của eCG và eLH tự nhiên e 11 và của eLH/CG tái tổ hợp được thể hiện tương ứng trong các dòng tế bào Sf9 và Mimik. Trong O-glycan, số mô típ N-acetyl-lactosaminyl (n) trong eCG lớn hơn nhiều so với eLH. Sự khác biệt đáng chú ý về trọng lượng phân tử của chúng về cơ bản là do sự hiện diện của poly-N-acetyllacosaminyl O-glycans được disialyl hóa lâu hơn trên eCG với tỷ lệ phần trăm O-glycans được gắn tại vị trí serine và threonine lớn hơn [26], [28] (Hình 1. Những khác biệt về cấu trúc này giải thích tại sao eCG có thời gian bán hủy vượt trội như vậy so với eLH.

Do đó các đặc tính sinh học của nó, eCG đã được sử dụng từ lâu trong các quy trình thụ tinh nhân tạo. Tuy nhiên, các chế phẩm thương mại của eCG được tinh chế một phần từ huyết thanh ngựa cái đang mang thai (PMSG) có thể chứa các chất gây ô nhiễm với các nguy cơ vệ sinh tiềm ẩn. Các thụ thể LH của ngựa cho thấy tương đồng cao với các thụ thể LH ở động vật có vú khác, cũng như khả năng liên kết LH từ các loài khác [29]. Trong khi eCG tương tác độc quyền với thụ thể LH ở ngựa, nó chỉ hiển thị một phần nhỏ hoạt động như LH [30].

Tuy nhiên, eCG liên kết với hoàng thể ngựa trong thời gian mang thai sớm, có thể cung cấp hỗ trợ nội tiết tố để duy trì thai kỳ. Vào khoảng ngày 40 của thai kỳ, các cấu trúc hoàng thể xuất hiện trong buồng trứng, trùng hợp với sự bắt đầu bài tiết eCG từ các ống nội mạc tử cung. Đây có thể là kết quả của sự rụng trứng bổ sung, vì sự khởi đầu của chúng đã được chứng minh là đi kèm với sự xuất hiện của noãn bào trong buồng trứng và có sự gia tăng đồng thời progesterone trong máu. Mối quan hệ thời gian giữa hai sự kiện này cho thấy eCG có thể gây ra sự rụng trứng bổ sung và hỗ trợ nội tiết tố đủ để tiếp tục mang thai [1].