Khóa luận tốt nghiệp công nghệ sinh học evaluation of genetic diversity of melaleuca cajuputi populations at dong thap muoi center for research conservation and development of medicinal plants based on issr markers and leaf morphological characteristics

Khóa luận đánh giá đa dạng di truyền của quần thể Melaleuca cajuputi tại Đồng Tháp Mười dựa trên chỉ thị ISSR và đặc điểm hình thái lá.

• Tác giả: Nguyen Thi Huong Thao Vi
• Người hướng dẫn: Pham Duc Toan, PhD
• Trường học: Nong Lam University Ho Chi Minh City
• Chuyên ngành: Biotechnology
• Đề tài: Đánh Giá Đa Dạng Di Truyền Của Quần Thể Melaleuca cajuputi Tại Trung Tâm Đồng Tháp Mười
• Loại tài liệu: Graduation Thesis
• Năm xuất bản: 2019 - 2023
• Địa điểm: Thu Duc City

Mục lục chi tiết

• ACKNOWLEDGEMENT
• CONFIRMATION AND COMMITMENT
• ABSTRACT
• TÓM TẮT
• 1. CHAPTER 1: Introduction
• 1.1. Objectives of the research
• 1.2. Researching contents
• 1.3. Taxonomy and Distribution of Melaleuca cajuputi
• 1.4. Origin and descriptions of Melaleuca cajuputi
• 1.5. Uses of Melaleuca cajuputi
• 2. MATERIALS AND METHODS
• 2.1. Research time and location
• 2.2. Plant material and Sampling
• 2.3. Evaluation of genetic diversity of Melaleuca cajuputi populations based on morphological characteristics of the leaves
• 2.4. Using ISSR molecular markers to evaluate genetic diversity of Melaleuca cajuputi populations
• 2.5. The quality checking of DNA by electrophoresis technique
• 2.6. Screening and optimization of ISSR primers
• 2.7. PCR amplification and gel electrophoresis
• 2.8. Band scoring and data analysis
• 3. RESULTS AND DISCUSSION
• 3.1. Total DNA extraction from M. cajuputi
• 3.2. Results of ISSR-PCR reaction
• 3.3. Screening and optimization of ISSR primers
• 3.4. Genetic distance between pairs of M. cajuputi populations
• 4. CONCLUSIONS AND SUGGESTIONS
• LIST OF ABBREVIATIONS
• LIST OF TABLES
• LIST OF FIGURES

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Đánh Giá Đa Dạng Di Truyền Của Quần Thể Melaleuca cajuputi

Đánh giá đa dạng di truyền của quần thể Melaleuca cajuputi tại Trung Tâm Đồng Tháp Mười là một nghiên cứu quan trọng nhằm hiểu rõ hơn về sự đa dạng sinh học của loài cây này. Melaleuca cajuputi không chỉ có giá trị kinh tế mà còn có vai trò quan trọng trong bảo tồn môi trường. Nghiên cứu này sử dụng các chỉ thị phân tử ISSR và đặc điểm hình thái lá để phân tích sự khác biệt di truyền giữa các quần thể.

1.1. Ý Nghĩa Của Đánh Giá Đa Dạng Di Truyền

Đánh giá đa dạng di truyền giúp xác định mức độ đa dạng của các quần thể Melaleuca cajuputi, từ đó có thể đưa ra các biện pháp bảo tồn hiệu quả hơn. Sự đa dạng này không chỉ quan trọng cho sự phát triển bền vững mà còn cho việc ứng dụng trong y học.

1.2. Mục Tiêu Nghiên Cứu

Mục tiêu chính của nghiên cứu là đánh giá sự đa dạng di truyền của các quần thể Melaleuca cajuputi tại Trung Tâm Đồng Tháp Mười, từ đó góp phần vào việc bảo tồn và phát triển nguồn gen cho mục đích dược liệu.

II. Vấn Đề Đối Mặt Với Quần Thể Melaleuca cajuputi

Quần thể Melaleuca cajuputi đang phải đối mặt với nhiều thách thức, bao gồm sự khai thác quá mức và biến đổi khí hậu. Những yếu tố này đã ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự tồn tại và phát triển của loài cây này. Việc đánh giá đa dạng di truyền sẽ giúp nhận diện các quần thể có khả năng thích ứng tốt hơn với điều kiện môi trường thay đổi.

2.1. Tác Động Của Khai Thác Quá Mức

Khai thác quá mức cho mục đích sản xuất tinh dầu đã dẫn đến sự suy giảm nghiêm trọng về số lượng và chất lượng của các quần thể Melaleuca cajuputi. Điều này đòi hỏi cần có các biện pháp bảo tồn hiệu quả.

2.2. Biến Đổi Khí Hậu Và Ảnh Hưởng Đến Di Truyền

Biến đổi khí hậu gây ra những thay đổi trong môi trường sống của Melaleuca cajuputi, ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và phát triển của loài cây này. Nghiên cứu di truyền sẽ giúp xác định các quần thể có khả năng chống chịu tốt hơn.

III. Phương Pháp Đánh Giá Đa Dạng Di Truyền

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp hiện đại như chỉ thị phân tử ISSR và phân tích hình thái lá để đánh giá sự đa dạng di truyền của các quần thể Melaleuca cajuputi. Phương pháp này cho phép xác định chính xác các khác biệt di truyền giữa các quần thể, từ đó đưa ra các kết luận khoa học đáng tin cậy.

3.1. Sử Dụng Chỉ Thị ISSR Trong Nghiên Cứu

Chỉ thị ISSR là một công cụ mạnh mẽ trong phân tích di truyền, cho phép phát hiện sự đa hình di truyền với độ chính xác cao. Nghiên cứu đã sử dụng 12 chỉ thị ISSR để phân tích 10 quần thể Melaleuca cajuputi.

3.2. Phân Tích Hình Thái Lá

Phân tích hình thái lá giúp bổ sung thông tin về sự khác biệt giữa các quần thể. Các đặc điểm như kích thước, hình dạng và màu sắc lá được ghi nhận và so sánh để đánh giá sự đa dạng di truyền.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Đánh Giá Đa Dạng Di Truyền

Kết quả nghiên cứu cho thấy có sự khác biệt di truyền rõ rệt giữa các quần thể Melaleuca cajuputi. Phân tích ISSR đã chỉ ra rằng có 112 băng đa hình trong tổng số 122 băng được khuếch đại, cho thấy mức độ đa dạng di truyền cao trong các quần thể này.

4.1. Phân Nhóm Các Quần Thể

Dựa trên kết quả phân tích, các quần thể Melaleuca cajuputi được chia thành 4 nhóm chính. Điều này cho thấy sự phân bố di truyền không đồng đều giữa các quần thể.

4.2. Mức Độ Đa Dạng Di Truyền

Chỉ số PIC dao động từ 0.38 đến 0.48, cho thấy mức độ đa dạng di truyền cao. Kết quả này có ý nghĩa quan trọng trong việc bảo tồn và phát triển nguồn gen của Melaleuca cajuputi.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Nghiên Cứu

Kết quả nghiên cứu không chỉ có giá trị trong việc bảo tồn Melaleuca cajuputi mà còn mở ra hướng đi mới cho việc phát triển các sản phẩm từ loài cây này. Việc hiểu rõ về đa dạng di truyền sẽ giúp tối ưu hóa quy trình sản xuất và nâng cao chất lượng sản phẩm.

5.1. Bảo Tồn Nguồn Gen

Nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học cho việc bảo tồn nguồn gen của Melaleuca cajuputi. Các biện pháp bảo tồn cần được triển khai để duy trì sự đa dạng di truyền của loài cây này.

5.2. Phát Triển Sản Phẩm Dược Liệu

Kết quả nghiên cứu có thể được ứng dụng trong việc phát triển các sản phẩm dược liệu từ Melaleuca cajuputi, góp phần nâng cao giá trị kinh tế cho người dân địa phương.

VI. Kết Luận Và Hướng Tương Lai Của Nghiên Cứu

Nghiên cứu đã chỉ ra sự đa dạng di truyền phong phú của các quần thể Melaleuca cajuputi tại Trung Tâm Đồng Tháp Mười. Những phát hiện này không chỉ có giá trị trong việc bảo tồn mà còn mở ra nhiều cơ hội cho nghiên cứu và phát triển trong tương lai.

6.1. Tầm Quan Trọng Của Đánh Giá Đa Dạng Di Truyền

Đánh giá đa dạng di truyền là cần thiết để bảo tồn và phát triển bền vững các quần thể Melaleuca cajuputi. Nghiên cứu này sẽ là nền tảng cho các nghiên cứu tiếp theo.

6.2. Hướng Nghiên Cứu Tương Lai

Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về các đặc điểm di truyền và sinh thái của Melaleuca cajuputi để có thể đưa ra các biện pháp bảo tồn hiệu quả hơn trong tương lai.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY HO CHI MINH CITY FACULTY OF BIOLOGICAL SCIENCES EVALUATION OF GENETIC DIVERSITY OF Melaleuca cajuputi POPULATIONS AT DONG THAP MUOI CENTER FOR RESEARCH CONSERVATION AND DEVELOPMENT OF MEDICINAL PLANTS BASED ON ISSR MARKERS AND LEAF MORPHOLOGICAL CHARACTERISTICS Major : BIOTECHNOLOGY Student : NGUYEN THI HUONG THAO VI Student code 219126263 Academic year : 2019 - 2023 Thu Duc City, 04/2024 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY HO CHI MINH CITY FACULTY OF BIOLOGICAL SCIENCES GRADUATION THESIS EVALUATION OF GENETIC DIVERSITY OF Melaleuca cajuputi POPULATIONS AT DONG THAP MUOI CENTER FOR RESEARCH CONSERVATION AND DEVELOPMENT OF MEDICINAL PLANTS BASED ON ISSR MARKERS AND LEAF MORPHOLOGICAL CHARACTERISTICS Advisor Student PHAM DUC TOAN. PhD NGUYEN THI HUONG THAO VI Thu Duc City, 04/2024 ACKNOWLEDGEMENT I would like to express my deep appreciation to the leadership of the Nong Lam University Ho Chi Minh City and the Faculty of Biological Sciences for providing me with the most favorable conditions to conduct this research. I extend my heartfelt gratitude to Dr. Pham Duc Toan, my thesis advisor, for his unwavering support, mentorship, and guidance throughout my academic journey.

For my research, I want to express my appreciation to Pharmacist Bui Dac Thang at Dong Thap Muoi Center for Research Conservation and Development of Medicinal Plants for assisting me in the sample collection process. This research would not have been possible without the help of all those who accompanied me during this challenging time. Therefore, I would like to express my gratitude to the members of Room 205 at the Research Institute of Biotechnology and Environment for their assistance in achieving my goals. And finally, I want to honor my family for providing me with the strength to overcome challenges.

CONEIRMATION AND COMMITMENT My name is Nguyen Thi Huong Thao Vi, Class: DH19SHC, Student ID: 19126263, major in Biotechnology, Nong Lam University Ho Chi Minh City. This graduation thesis is the outcome of my research, and I affirm that the results presented are entirely truthful and unbiased. I will take all responsibilities before the Council for these commitments. Thu Due City, 04/2024 Student’s signature il ABSTRACT This study evaluated the similarities and differences between ten Melaleuca cajuputi populations selected from the Dong Thap Muoi Center for Research Conservation and Development of Medicinal Plants based on leaf morphological characteristics and ISSR markers.

The leaf phenotyping and genotyping results showed that ten Melaleuca cajuputi populations were grouped into four major clusters. A total of 12 ISSR markers showed 122 bands, of which 112 were polymorphic bands, reaching a rate of 91. The PIC index ranged from 0.48 and showed a high polymorphism level in the studied populations. The dendrogram generated from the UPGMA clustering method illustrated genetic differences among the ten M.

cajuputi populations and displayed genetic distance coefficients ranging from 0.62 and an average of 0. In summary, this study demonstrated significant genetic differences between ten Melaleuca cajuputi populations, which could be difficult to distinguish morphologically. The findings contribute significantly to the conservation and development of the genetic resources of Melaleuca cajuputi for medicinal purposes at the Dong Thap Muoi Center for Research Conservation and Development of Medicinal Plants. Keyword: Dong Thap Muoi Center for Research Conservation and Development of Medicinal Plants, ISSR, Melaleuca cajuputi, Genetic diversity, Population.

1H TÓM TẮT Trong nghiên cứu này, các đặc điểm hình thái lá được dùng đề đánh giá sự giống nhau và khác nhau giữa mười quân thể Tràm Gió thu thập tại Trung tâm Nghiên cứu Bao tồn và Phát triển cây được liệu Đồng Tháp Mười. Qua kết quả đánh giá, 21 dấu chỉ thị phân tử ISSR bat kỳ, có 12 dấu chỉ thị phân tử ISSR cho kết quả, nên 12 dấu chỉ thị này được dùng để đánh giá mối tương quan di truyền của 10 quần thể Tràm Gió. Dựa vào đặc điểm hình thái lá và kiểu gen có thé chia các quan thé Tràm Gió thành 4 nhóm chính. Kết quả đánh giá bằng 12 dấu chỉ thị phân tử ISSR đã khuếch đại tổng số 122 băng, trong đó có 112 băng đa hình đạt tỉ lệ 91,26%.

Chỉ số PIC dao động từ 0,38 - 0,48 và cho thấy mức độ đa hình cao của các quan thé trong nghiên cứu này. Kết qua phân tích phân nhóm dựa vào phương pháp UPGMA đã chứng minh các quần thể Tràm Gió có sự đa dang về kiểu gen và có hệ số tương đồng dao động từ 0,06 - 0,62 và trung bình là 0,27. Tóm lại, nghiên cứu này chỉ ra rằng có sự biến đổi về mặt di truyền giữa các quan thé, mà hình thái học khó có thé phân biệt được, góp phan quan trọng vào việc bao tồn và phát triển nguồn gen cây Tram Gió cho mục đích làm dược liệu tại Trung tâm Bảo tồn và Phát triển cây dược liệu Đồng Tháp Mười. Từ khóa: Da dang di truyền, Tràm Gió, Trung tâm Bảo tồn và Phát triển cây được liệu Đồng Tháp Mười, ISSR, quan thể.

IV TABLE OF CONTENTS Page ACKNOWLEDGEMENT ssssnssinssnsnuosoniiEoDLSL81030333808831010883101535138033N133LS.08 1 CONFIRMATION AND COMMITMENT .ccccccesceceeseeseeseeseeeceeeeeceeesecseeseeseeseeneens il ABSTRAGT sáccizxáxcszxcssss15g660116156 0011438818368055035343EĐSEES3SiESI83880485355/083685005895880835ã0UĐS0S5.E58 11 TRE css ghnghhhggH3,g2Xu.S180G3008105:0/0300301:1Ó30ã003808::758003030i062Gã8028018010:78880:50588006-000 iv TABLEIOE COUN BI NNLlIỒI,veassuaikesisaoseiodssauuliigigSiSgigg53641900988800030004508910188g5ngiugzdizV0014010003.gxẴ V LIST OF ABBREVIATIONS áenebecsosresvatiEDu80561595506015SL58S0SG301856568403595E3LSSSGEESLSSSSSĐSuM vil LIST OF TABLESG.---ocserocreerensensansnssnstanennenssnegesensnssenssacenseatenenerensanesentatseeennnens Vili loi: OER IGUIR BJĐssxsusis6iifodees5uconSloB0iooogdioioSggggifujS880180 ener amr th ae UDRP URLS 1X CHAPTER 1. 1 1;2-ObJ©6LWES: Of te T€SGHG sọ nu BnHá n0 tà HA IESSGEQSESSCASENHEESIBIHGEOIREIGSIHGEHEIUGGEESDNHHSI.SES2S3818 2 V3 ,EIESEäTGHITEGGIIGTIEssienspaiestionintidtoiidhistotgggtoGigGISESGE.GHSAIISSBRRISNSS0S804B-HISGENSH2REIUSSg5E 4208800001 3 2. Taxonomy and Distribution of Melaleuca €@j1Đ1ÍÌ. Origin and descriptions of Melaleuca Cajiput .- 2-55-5552 <++s£+s++t+s+seeeseeseerses 5 2 Bin WISES OF MCLG CUCH CAFU PUTT tưng wseceesexwsse cones nas tis 5 STE LEASES ES UES PAE SEE 5 Bus PMelWwOOd atid Paper ciácsi6166 006152186 L8 X6 cae a Ses esas asa een.

cee areas eee 5 23, 2 SSCA Oil GIS tH AO wis csssiviiesausnacie cheaesosin enn tanowindnhslenn sai oubesiliaup Sais aiane da Ua 5 2. Antimicrobial, antioxidant, antibacterial of Melaleuca cajuputi. Conservation and, Development of Melaleuca cajuputi at Dong Thap Muoi Center for Research Conservation and, Development of Medicinal pÏants. The biodiversity situation in VI€tTaT.

The genelie IVETSILY. Genetic markers and, their applications for genetic diversity analysis in plants. LŨ 2:8, li Morpholo steal titat Mere csaysoe bi dong gi phöôgitgaSgsggiSDgiASbBSiSESISEgISÙSGBSQHHÄS:0g. 11 D823belo el ear aaa PINES secrets leer tte tA A CR 12 2.

non-PCR-based, molecular markers (hybridization-based, marker). PCR-Based, molecular markers, Inter Simple Sequence Repeat (ISSR). MATERIALS AND METHODS.-- -----5-cc2ccsxsrrsrrrrrrrrrrree 18 3;1„ Research time aiid loCatl Oi wsccceceescusesencaserenssemunnauamneameenem enema 18 3. Plait matetial anid.

SaiiplinS SHALE BY. Evaluation of genetic diversity of Melaleuca cajuputi populations based on morphological characteristics of the ÏeaV€s. Using ISSR molecular markers to evaluate of genetic diversity of Melaleuca (ELON VEY UE TT ag 018)OLENA 8 10) | (Sane ee mere Renee ere ree eee ee ee ee 20 ScAnL DINA CACO caves sesnnssssvessssusnnnsnvees 0836546 0515EE100ĐGSSSSĐS84391604159/34883514558383040000058 20 3. The quality checking of DNA by electrophoresis technique.

Screening and optimization of ISSR pTIITS. PCR amplification and gel electrophoresis. Band, scorns and. data analy SiS vcceccesceeasemsernenmnmanesrenmanresneemnmanerenmmemeaes 23 CHAPTER 4.

RESULTS AND CONCLUSION.ee 26 A Js RESUS) x. sasnsisasccans nie đồ 1E 3088011003800068ã 806 sae wt casas een Cn wena SESE Sea CLARNATA ARAN 26 4.charaGLETISEÍGS:::s‹sxssxsssssss5s5556152351551114565 014 155505 L3386 99958530 05450 26 4. Total DNA extraction from M. Results of ISSR-PCR reactIoT.- --- 5 cà 1 1S HH n1 HH He 28 4.

Screening and, optimization of ISSR prIm€fs. Product of PCR-ISSR reaCf1OT. -- --- 5 5 2+ ng ng nhờ28 4. Genetic distance between pairs of M.

DISCUSSION vas as em aaa re OR 31 CHAPTER 5: CONCLUSIONS AND SUGGESTIONS. 0H, HH Họ HH TH TH ch 0á 0 34 522, SUS BOSTONG aces carseat thameee Loinh GioGữAuösÊx lG33:-SB/SSIBBLSXSEQhuiptNdgu2 tà dREiL0E84. 35 ye0 EDN) DD. ea ee ee ee ee eee ee 40 vi LIST OF ABBREVIATIONS AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism : Base pair Cl : Chloroform/Isoamyl alcohol DNA : Deoxyribonucleic acid E : East EDTA : Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid EMR : Effective multiplex ratio IPGRI : International plant Genetic Resources Institute ISSR : Inter Simple Sequence Repeats ITS : Internal transcribed spacer M.

cajuputi : Melaleuca cajuputi MI : Marker Index N : North NTSYS pe : Numerical Taxonomy System personal computer P : Percentage polymorphism PCI : Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol PCR : Polymerase chain reaction PIC : Polymorphic information content RAPD : Random Amplified Polymorphic DNA Rp : Resolving power SSR : Simple Sequence Repeats TAE : Tris-Acetate-EDTA TE : Tris - EDTA UPGMA : Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Vil LIST OE TABLES Page Table 3. List of ten ẤM. cajuputi populations collected at the Dong Thap Muoi Center for Research Conservation and Development of Medicinal Plants.(continue) List of ten MZ cajuputi populations collected at the Dong Thap Muoi Center for Research Conservation and Development of Medicinal Plants. PCR primers used in this SCT€€TITIE.

Reagents for the simplex PCR reaction mixture with each primet. Leaf shape grouping of 50 M. The 12 ISSR primers selected to continue performing the ISSR-PCR. Details of the ISSR primer used in the present study.

The genetic distance coefficient of ten M. 30 Vill LIST OF FIGURES Page Figure 2. cajuputi at Dong Thap Muoi Center for Research Conservation and Development:of Medicinal Plants svs.c<vesecspsssannananuenniiovevneninsacierm venues 3 Figure 2. cajuputi distribution 1n the WOorld.-- 5 5-55 2<*>+s+ss+esxs 4 Figure 2.

A hypothetical scheme of the concept of an ISSR marker defined by the intervening DNA sequence between the SSR, CTCTC FC TC T. Images to evaluate the morphological characteristics of some M. cajuputi SAIN DISS cus pcceiemarmmmteeevamaaettalweare dre RRR Tm ne eee ae ee ae mo 26 Figure 4. The total electrophoresis DNA of ten M.

The electrophoresis results screening of 21 ISSR primer PCR with a fandomly DNA Sample TM COfUPULL. on scs nc: oncsasesnessinsatastavnnssieavean assndbiuncnssaanasiimn ddessendisess 28 Figure 4. Product electrophoresis of ten M. cajuputi populations with UBC854 HALT 1 ergs emer to sic osteo al neti in sre oR 29 Figure 4.

Dendrogram generated from UPGMA clustering method of ten M. cajuputi populations based on ISSR anaÌys1S.-- -- 5225 * S2 £sssseereeesrrrreerrrrrrrsrrrxresrrxee OL 1x CHAPTER 1. Introduction Dong Thap Muoi Center for Research Conservation and Development of Medicinal Plants is conservation zone of over 1.000 hectares of pristine Melaleuca Forest, where makes up the soul of this ecosystem is the Me/aleuca cajuputi-a medicine marvel known for its health benefits member of the Myrtaceae family, Melaleuca cajuputi has multifaceted uses, from fuelwood and paper (Trung, 2008) production to essential oil distillation (Silva et al., 2007), available antimicrobial and antioxidant (Al- Abd z al. This versatile plant extends its applications to cosmetics and as a spice in food (Septiana et a/.

However, due to over-exploitation for essential oil, which has endangered the survival of this species, Melaleuca cajuputi was on the list of species with high conservation risk. There were many studies on the application of molecular markers in the assessment of genotypic diversity of Myrtaceae plants, such as using SSR markers to evaluate 114 genotypes of Melaleuca alternifolia (Voelker and Shepherd, 2020) or study the genetic diversity of Melaleuca spp. by ITS indicator and RAPD analysis in Thua Thien Hue province (Tran Thi Ngoc Tram ef a/., 2021) and many other studies. The molecular approach to plant genotyping is more effective than traditional morphological markers because it allows direct access to the plant genome, which is not influenced by the environment and can be detected 1n all stages of development.

There have not been many studies on morphological and genetic characteristics among Melaleuca cajuputi populations. The Inter-simple sequence repeats (ISSRs) markers are well-established in population genetics and have proven efficacy in capturing genetic diversity in tree and shrub populations and studies of cultivars (Wang ef al. The ISSR is that no sequence data are required for primer synthesis. Because the analytical procedures include PCR, only low quantities of template DNA are required.