Khóa luận tốt nghiệp công nghệ sinh học evaluation of genetic diversity of melaleuca cajuputi populations at dong thap muoi center for research conservation and development of medicinal plants based on issr markers and leaf morphological characteristics

Khóa luận đánh giá đa dạng di truyền của quần thể Melaleuca cajuputi tại Đồng Tháp Mười dựa trên chỉ thị ISSR và đặc điểm hình thái lá.

• Tác giả: Nguyen Thi Huong Thao Vi
• Người hướng dẫn: Pham Duc Toan, PhD
• Trường học: Nong Lam University Ho Chi Minh City
• Chuyên ngành: Biotechnology
• Đề tài: Đánh Giá Đa Dạng Di Truyền Của Quần Thể Melaleuca cajuputi Tại Trung Tâm Đồng Tháp Mười
• Loại tài liệu: Graduation Thesis
• Năm xuất bản: 2019 - 2023
• Địa điểm: Thu Duc City

Mục lục chi tiết

• ACKNOWLEDGEMENT
• CONFIRMATION AND COMMITMENT
• ABSTRACT
• TÓM TẮT
• 1. CHAPTER 1: Introduction
• 1.1. Objectives of the research
• 1.2. Researching contents
• 1.3. Taxonomy and Distribution of Melaleuca cajuputi
• 1.4. Origin and descriptions of Melaleuca cajuputi
• 1.5. Uses of Melaleuca cajuputi
• 2. MATERIALS AND METHODS
• 2.1. Research time and location
• 2.2. Plant material and Sampling
• 2.3. Evaluation of genetic diversity of Melaleuca cajuputi populations based on morphological characteristics of the leaves
• 2.4. Using ISSR molecular markers to evaluate genetic diversity of Melaleuca cajuputi populations
• 2.5. The quality checking of DNA by electrophoresis technique
• 2.6. Screening and optimization of ISSR primers
• 2.7. PCR amplification and gel electrophoresis
• 2.8. Band scoring and data analysis
• 3. RESULTS AND DISCUSSION
• 3.1. Total DNA extraction from M. cajuputi
• 3.2. Results of ISSR-PCR reaction
• 3.3. Screening and optimization of ISSR primers
• 3.4. Genetic distance between pairs of M. cajuputi populations
• 4. CONCLUSIONS AND SUGGESTIONS
• LIST OF ABBREVIATIONS
• LIST OF TABLES
• LIST OF FIGURES

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Đánh Giá Đa Dạng Di Truyền Của Quần Thể Melaleuca cajuputi

Đánh giá đa dạng di truyền của quần thể Melaleuca cajuputi tại Trung Tâm Đồng Tháp Mười là một nghiên cứu quan trọng nhằm hiểu rõ hơn về sự đa dạng sinh học của loài cây này. Melaleuca cajuputi không chỉ có giá trị kinh tế mà còn có vai trò quan trọng trong bảo tồn môi trường. Nghiên cứu này sử dụng các chỉ thị phân tử ISSR và đặc điểm hình thái lá để phân tích sự khác biệt di truyền giữa các quần thể.

1.1. Ý Nghĩa Của Đánh Giá Đa Dạng Di Truyền

Đánh giá đa dạng di truyền giúp xác định mức độ đa dạng của các quần thể Melaleuca cajuputi, từ đó có thể đưa ra các biện pháp bảo tồn hiệu quả hơn. Sự đa dạng này không chỉ quan trọng cho sự phát triển bền vững mà còn cho việc ứng dụng trong y học.

1.2. Mục Tiêu Nghiên Cứu

Mục tiêu chính của nghiên cứu là đánh giá sự đa dạng di truyền của các quần thể Melaleuca cajuputi tại Trung Tâm Đồng Tháp Mười, từ đó góp phần vào việc bảo tồn và phát triển nguồn gen cho mục đích dược liệu.

II. Vấn Đề Đối Mặt Với Quần Thể Melaleuca cajuputi

Quần thể Melaleuca cajuputi đang phải đối mặt với nhiều thách thức, bao gồm sự khai thác quá mức và biến đổi khí hậu. Những yếu tố này đã ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự tồn tại và phát triển của loài cây này. Việc đánh giá đa dạng di truyền sẽ giúp nhận diện các quần thể có khả năng thích ứng tốt hơn với điều kiện môi trường thay đổi.

2.1. Tác Động Của Khai Thác Quá Mức

Khai thác quá mức cho mục đích sản xuất tinh dầu đã dẫn đến sự suy giảm nghiêm trọng về số lượng và chất lượng của các quần thể Melaleuca cajuputi. Điều này đòi hỏi cần có các biện pháp bảo tồn hiệu quả.

2.2. Biến Đổi Khí Hậu Và Ảnh Hưởng Đến Di Truyền

Biến đổi khí hậu gây ra những thay đổi trong môi trường sống của Melaleuca cajuputi, ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và phát triển của loài cây này. Nghiên cứu di truyền sẽ giúp xác định các quần thể có khả năng chống chịu tốt hơn.

III. Phương Pháp Đánh Giá Đa Dạng Di Truyền

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp hiện đại như chỉ thị phân tử ISSR và phân tích hình thái lá để đánh giá sự đa dạng di truyền của các quần thể Melaleuca cajuputi. Phương pháp này cho phép xác định chính xác các khác biệt di truyền giữa các quần thể, từ đó đưa ra các kết luận khoa học đáng tin cậy.

3.1. Sử Dụng Chỉ Thị ISSR Trong Nghiên Cứu

Chỉ thị ISSR là một công cụ mạnh mẽ trong phân tích di truyền, cho phép phát hiện sự đa hình di truyền với độ chính xác cao. Nghiên cứu đã sử dụng 12 chỉ thị ISSR để phân tích 10 quần thể Melaleuca cajuputi.

3.2. Phân Tích Hình Thái Lá

Phân tích hình thái lá giúp bổ sung thông tin về sự khác biệt giữa các quần thể. Các đặc điểm như kích thước, hình dạng và màu sắc lá được ghi nhận và so sánh để đánh giá sự đa dạng di truyền.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Đánh Giá Đa Dạng Di Truyền

Kết quả nghiên cứu cho thấy có sự khác biệt di truyền rõ rệt giữa các quần thể Melaleuca cajuputi. Phân tích ISSR đã chỉ ra rằng có 112 băng đa hình trong tổng số 122 băng được khuếch đại, cho thấy mức độ đa dạng di truyền cao trong các quần thể này.

4.1. Phân Nhóm Các Quần Thể

Dựa trên kết quả phân tích, các quần thể Melaleuca cajuputi được chia thành 4 nhóm chính. Điều này cho thấy sự phân bố di truyền không đồng đều giữa các quần thể.

4.2. Mức Độ Đa Dạng Di Truyền

Chỉ số PIC dao động từ 0.38 đến 0.48, cho thấy mức độ đa dạng di truyền cao. Kết quả này có ý nghĩa quan trọng trong việc bảo tồn và phát triển nguồn gen của Melaleuca cajuputi.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Nghiên Cứu

Kết quả nghiên cứu không chỉ có giá trị trong việc bảo tồn Melaleuca cajuputi mà còn mở ra hướng đi mới cho việc phát triển các sản phẩm từ loài cây này. Việc hiểu rõ về đa dạng di truyền sẽ giúp tối ưu hóa quy trình sản xuất và nâng cao chất lượng sản phẩm.

5.1. Bảo Tồn Nguồn Gen

Nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học cho việc bảo tồn nguồn gen của Melaleuca cajuputi. Các biện pháp bảo tồn cần được triển khai để duy trì sự đa dạng di truyền của loài cây này.

5.2. Phát Triển Sản Phẩm Dược Liệu

Kết quả nghiên cứu có thể được ứng dụng trong việc phát triển các sản phẩm dược liệu từ Melaleuca cajuputi, góp phần nâng cao giá trị kinh tế cho người dân địa phương.

VI. Kết Luận Và Hướng Tương Lai Của Nghiên Cứu

Nghiên cứu đã chỉ ra sự đa dạng di truyền phong phú của các quần thể Melaleuca cajuputi tại Trung Tâm Đồng Tháp Mười. Những phát hiện này không chỉ có giá trị trong việc bảo tồn mà còn mở ra nhiều cơ hội cho nghiên cứu và phát triển trong tương lai.

6.1. Tầm Quan Trọng Của Đánh Giá Đa Dạng Di Truyền

Đánh giá đa dạng di truyền là cần thiết để bảo tồn và phát triển bền vững các quần thể Melaleuca cajuputi. Nghiên cứu này sẽ là nền tảng cho các nghiên cứu tiếp theo.

6.2. Hướng Nghiên Cứu Tương Lai

Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về các đặc điểm di truyền và sinh thái của Melaleuca cajuputi để có thể đưa ra các biện pháp bảo tồn hiệu quả hơn trong tương lai.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trung tâm Nghiên cứu Bảo tồn và Phát triển Cây Dược liệu Đồng Tháp Mười (huyện Mộc Hóa, tỉnh Long An) là khu bảo tồn sở hữu hơn 1.000 hecta rừng Tràm nguyên sinh. Trong hệ sinh thái này, loài Tràm Gió (Melaleuca cajuputi Powell), thuộc họ Sim (Myrtaceae), giữ vai trò then chốt với nhiều giá trị ứng dụng thực tiễn đa dạng. Cây không chỉ cung cấp gỗ cừ phục vụ xây dựng, bột giấy, than củi mà còn là nguồn nguyên liệu chiết xuất tinh dầu Tràm (chứa hàm lượng lớn hợp chất hoạt tính sinh học như 1,8-cineole) có tác dụng kháng khuẩn, chống oxy hóa, ứng dụng trong dược phẩm và mỹ phẩm.

Tuy nhiên, áp lực khai thác quá mức nguồn tinh dầu tự nhiên đã khiến nguồn gen của loài Tràm Gió đối mặt với nguy cơ suy giảm và xói mòn di truyền nghiêm trọng. Trong công tác quản lý và bảo tồn, việc đánh giá sự đa dạng di truyền bằng các chỉ thị hình thái truyền thống gặp nhiều trở ngại do đặc tính hình thái lá dễ bị biến đổi dưới tác động của các yếu tố ngoại cảnh (dinh dưỡng, độ ẩm, chế độ ngập nước, ánh sáng) và khó phân biệt giữa các cá thể hay quần thể có quan hệ di truyền gần gũi.

Nhằm cung cấp cơ sở dữ liệu khoa học chính xác phục vụ công tác bảo tồn và phát triển nguồn gen cây dược liệu, đề tài đã đặt ra các mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:

• Mục tiêu nghiên cứu: Đánh giá mối quan hệ di truyền (phylogenetic) của các quần thể Tràm Gió (Melaleuca cajuputi) phục vụ công tác bảo tồn và phát triển nguồn gen dược liệu tại Khu Bảo tồn Dược liệu Đồng Tháp Mười, huyện Mộc Hóa, tỉnh Long An.
• Nhiệm vụ nghiên cứu:
  1. Nhiệm vụ 1: Đánh giá tính đa dạng di truyền của các quần thể Tràm Gió dựa trên các đặc điểm hình thái lá.
  2. Nhiệm vụ 2: Ứng dụng chỉ thị phân tử ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) để đánh giá cấu trúc và mức độ đa dạng di truyền của các quần thể Tràm Gió.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: 10 quần thể Tràm Gió (Melaleuca cajuputi), ký hiệu từ TG01 đến TG10. Mỗi quần thể thu thập ngẫu nhiên 5 cá thể, tổng số mẫu phân tích là 50 mẫu lá.
• Phạm vi không gian: Thu mẫu thực địa tại Trung tâm Nghiên cứu Bảo tồn và Phát triển Cây Dược liệu Đồng Tháp Mười (xã Bình Phong Thạnh, huyện Mộc Hóa, tỉnh Long An; tọa độ GPS từ 10,72719°N - 10,74155°N và 106,08576°E - 106,09787°E). Các thí nghiệm sinh học phân tử được thực hiện tại Phòng 205 - Bộ môn Sinh học Phân tử, Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
• Phạm vi thời gian: Nghiên cứu được triển khai thực hiện từ tháng 09/2023 đến tháng 12/2023.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết

• Hệ thống phân loại và đặc tính thực vật học: Loài Melaleuca cajuputi Powell thuộc chi Melaleuca, họ Myrtaceae, bộ Myrtales. Cây có khả năng thích nghi cao với điều kiện đất phèn, ngập úng và đất nghèo dinh dưỡng.
• Hệ thống chỉ thị di truyền: Khóa luận so sánh ba nhóm chỉ thị:
  • Chỉ thị hình thái (Morphological markers): Trực quan, chi phí thấp nhưng số lượng tính trạng hạn chế, dễ bị biến đổi bởi điều kiện môi trường.
  • Chỉ thị hóa sinh (Biochemical markers/Allozymes): Dựa trên tính đa hình của protein/enzyme, nhưng số lượng hệ enzyme khảo sát bị hạn chế.
  • Chỉ thị phân tử DNA (Molecular markers): Phản ánh trực tiếp biến dị ở cấp độ vật chất di truyền, không phụ thuộc vào giai đoạn phát triển của mô và điều kiện ngoại cảnh.
• Nguyên lý chỉ thị ISSR (Inter Simple Sequence Repeats): Kỹ thuật PCR sử dụng một mồi đơn có chiều dài 16 - 25 bp mang các đoạn lặp vi vệ tinh (di-, tri-, tetra- hoặc penta-nucleotide), có thể có hoặc không có nucleotide neo (anchored) ở đầu 5' hoặc 3'. ISSR khuếch đại vùng DNA nằm giữa hai trình tự lặp vi vệ tinh ngược hướng nằm trong khoảng cách khuếch đại được của Taq polymerase. ISSR là chỉ thị trội (dominant marker), có độ lặp lại cao, tính đa hình lớn và không đòi hỏi thông tin giải trình tự bộ gen trước khi thiết kế mồi.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

• Thu thập và đánh giá hình thái lá: Quy trình thu thập và đo đạc kích thước lá được tiến hành theo tiêu chuẩn của Viện Tài nguyên Di truyền Thực vật Quốc tế (IPGRI, 1999). Các chỉ tiêu theo dõi gồm: màu sắc lá (non, trung gian, già), số lượng gân lá, lông tơ ở chồi non, chiều dài lá, chiều rộng lá và dạng hình thái phiến lá.
• Quy trình tách chiết DNA tổng số: Tách chiết DNA từ mô lá non theo quy trình CTAB cải tiến của Doyle và Doyle (1987). Mẫu lá được nghiền mịn trong đệm chiết xuất, ủ nhiệt 65°C trong 40 phút, xử lý khử protein bằng hỗn hợp dung môi Chloroform : Isoamyl alcohol (CI, tỷ lệ 24:1), kết tủa DNA bằng dung dịch NaCl 6M và Isopropanol ở -20°C, rửa tủa bằng Ethanol 70%, hòa tan trong đệm TE 1X và bảo quản ở -20°C.
• Kiểm tra chất lượng DNA: Điện di DNA tổng số trên gel agarose 0,5% trong đệm TAE 1X ở hiệu điện thế 100V trong 15 phút, quan sát dưới ánh sáng tia cực tím (UV).
• Sàng lọc và tối ưu hóa phản ứng ISSR-PCR:
  • Khảo sát 21 mồi ISSR (chuỗi mồi UBC từ Đại học British Columbia).
  • Tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp ($T_a$) cho các phản ứng khuếch đại.
  • Thành phần phản ứng PCR (simplex PCR) gồm mồi ISSR (10 µM), DNA khuôn mẫu pha loãng 10 lần, và nước cất vô trùng trong tổng thể tích phản ứng chuẩn.
  • Chu trình luân nhiệt trên máy Applied Biosystems 2720: Biến tính ban đầu ở 94°C (2 phút); 40 chu kỳ lặp gồm [94°C (30 giây) - $T_a$ tối ưu (45 giây) - 72°C (2 phút)]; kéo dài chuỗi kết thúc ở 72°C (10 phút).
• Điện di phân tích sản phẩm PCR: Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5% trong đệm TAE 1X, điện áp 100V trong 40 phút. Sử dụng thang chuẩn trọng lượng phân tử HyperLadder™ 1 kb (Bioline) để xác định kích thước các băng DNA.
• Mã hóa và xử lý số liệu di truyền:
  • Băng điện di được mã hóa nhị phân: '1' cho sự hiện diện của băng, '0' cho sự vắng mặt của băng.
  • Tính toán các chỉ số di truyền: Hàm lượng thông tin đa hình ($PIC = 2f(1-f)$ với $f$ là tần số xuất hiện băng), Tỷ lệ băng đa hình ($P%$), Hệ số phức hợp hiệu quả (EMR), Chỉ số mồi ($MI = PIC \times EMR$), và Khả năng phân giải ($Rp = \sum [1 - 2|0,5 - p|]$).
  • Phân tích cụm và xây dựng cây phát sinh di truyền (dendrogram) theo phương pháp UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean) bằng phần mềm NTSYSpc phiên bản 2.10z.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Giới thiệu (Introduction)

Chương 1 làm rõ tính cấp thiết của việc nghiên cứu đa dạng di truyền loài Tràm Gió (Melaleuca cajuputi) tại Khu Bảo tồn Đồng Tháp Mười trong bối cảnh nguồn gen dược liệu đang bị đe dọa do khai thác. Tác giả trình bày tổng quan về ưu điểm của chỉ thị phân tử ISSR so với các chỉ thị truyền thống, từ đó xác lập 1 mục tiêu tổng quát và 2 nội dung nghiên cứu trọng tâm của khóa luận.

Chương 2: Tổng quan tài liệu (Taxonomy and Distribution of Melaleuca cajuputi)

Chương này tổng hợp các cơ sở lý luận và công trình nghiên cứu trong và ngoài nước:

• Hệ thống phân loại học của chi Melaleuca và 3 phân loài Tràm Gió chính: subsp. cajuputi, subsp. cumingiana, và subsp. platyphylla, cùng sự phân bố địa lý của chúng tại Đông Nam Á và Australia.
• Giá trị kinh tế và dược học của Tràm Gió: Ứng dụng làm gỗ xây dựng, cốp pha, giấy sợi; thành phần hóa học của tinh dầu (chứa 41% - 71,2% 1,8-cineole); hoạt tính kháng khuẩn (ức chế E. coli, S. aureus, P. aeruginosa...), kháng oxy hóa.
• Tình hình đa dạng sinh học và nhu cầu bảo tồn nguồn gen dược liệu tại Việt Nam và tại Khu Bảo tồn Dược liệu Đồng Tháp Mười (bảo tồn hơn 90 nguồn gen dược liệu, 20 loài đạt chuẩn GACP).
• Đánh giá so sánh các loại chỉ thị di truyền trong nghiên cứu thực vật: Chỉ thị hình thái, chỉ thị hóa sinh và chỉ thị phân tử (RFLP, RAPD, AFLP, SSR, ISSR), nhấn mạnh tính ưu việt của chỉ thị ISSR.

Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (Materials and Methods)

Trình bày chi tiết toàn bộ thiết kế thực nghiệm:

• Danh sách 10 quần thể Tràm Gió (TG01 - TG10) kèm bảng toạ độ địa lý GPS cụ thể cho từng điểm thu mẫu.
• Quy trình thu thập dữ liệu hình thái lá theo chuẩn IPGRI (1999).
• 10 bước trong quy trình tách chiết DNA bằng đệm CTAB và phương pháp kiểm tra độ tinh sạch DNA bằng điện di gel agarose.
• Bảng trình tự 21 mồi ISSR (UBC 808 đến UBC 890) dùng để sàng lọc.
• Thành phần hóa chất phản ứng PCR, chế độ nhiệt của máy luân nhiệt và các công thức toán học tính toán các chỉ số di truyền ($PIC, EMR, MI, Rp$) cùng phương pháp phân cụm UPGMA trên phần mềm NTSYSpc 2.10z.

Chương 4: Kết quả và thảo luận (Results and Discussion)

Trình bày chi tiết các dữ liệu thực nghiệm thu được:

• Đặc điểm hình thái lá: Chiều dài lá dao động từ 4,3 đến 10,5 cm. 50 mẫu nghiên cứu được phân chia thành 3 nhóm hình thái lá: Nhóm I (lá thuôn hẹp hai đầu - 10 mẫu), Nhóm II (lá hình oval - 9 mẫu), và Nhóm III (lá hình trứng/ovate - 31 mẫu).
• Kết quả tách chiết DNA: 50 mẫu DNA tổng số đều cho băng điện di sáng rõ, nguyên vẹn, đảm bảo chất lượng cho các phản ứng khuếch đại tiếp theo.
• Sàng lọc mồi và phản ứng ISSR-PCR: Từ 21 mồi ban đầu, đã chọn lọc được 12 mồi ISSR tối ưu tại nhiệt độ bắt cặp $T_a = 52^\circ\text{C}$. Tổng số 12 mồi này đã khuếch đại được 122 băng DNA (kích thước 300 - 3000 bp), trong đó có 112 băng đa hình ($91,26%$).
• Hệ số khoảng cách di truyền và cây phả hệ UPGMA: Hệ số khoảng cách di truyền giữa các cặp quần thể dao động từ 0,06 đến 0,62 (trung bình 0,27). Cặp quần thể TG06 và TG10 có khoảng cách di truyền lớn nhất (0,62), trong khi cặp TG03 và TG04 có khoảng cách nhỏ nhất (0,06). Cây phân nhóm di truyền chia 10 quần thể thành 4 nhóm chính.

Chương 5: Kết luận và kiến nghị (Conclusions and Suggestions)

Tổng kết các phát hiện chính của đề tài về tính đa hình di truyền cao của các quần thể Tràm Gió tại Đồng Tháp Mười và đưa ra 3 kiến nghị kỹ thuật nhằm hoàn thiện quy trình phân tích và đối chứng kiểu hình - kiểu gen.

---

Kết quả và đóng góp của nghiên cứu

Kết quả định lượng chính

Nghiên cứu đã thu thập và phân tích các số liệu thực nghiệm cụ thể sau:

Thông số nghiên cứu	Kết quả ghi nhận trong khóa luận
Số lượng quần thể và cá thể khảo sát	10 quần thể (TG01 đến TG10), 50 cá thể
Phân nhóm hình thái lá (50 mẫu)	3 nhóm: Nhóm I (10 mẫu), Nhóm II (9 mẫu), Nhóm III (31 mẫu)
Số mồi ISSR khảo sát / Số mồi chọn lọc	21 mồi khảo sát / 12 mồi chọn lọc tối ưu ($T_a = 52^\circ\text{C}$)
Tổng số băng DNA khuếch đại	122 băng (trung bình 10,17 băng/mồi)
Số băng đa hình (Polymorphic bands)	112 băng
Tỷ lệ đa hình trung bình ($P%$)	91,26% (cao nhất: UBC825, UBC890, UBC841, UBC850, UBC873 đạt 100%; thấp nhất: UBC843 đạt 75%)
Kích thước đoạn DNA khuếch đại	300 bp – 3000 bp
Chỉ số thông tin đa hình ($PIC$)	Dao động từ 0,38 đến 0,48 (trung bình 0,44; cao nhất ở mồi UBC880)
Chỉ số mồi ($MI$)	Dao động từ 1,89 (mồi UBC843) đến 6,00 (mồi UBC825), trung bình 3,8
Hệ số khoảng cách di truyền	Dao động từ 0,06 đến 0,62 (trung bình 0,27)
Khoảng cách di truyền lớn nhất / nhỏ nhất	Lớn nhất: Cặp TG06 – TG10 (0,62); Nhỏ nhất: Cặp TG03 – TG04 (0,06)
Kết quả phân nhóm di truyền UPGMA	4 nhóm chính: - Nhóm I: TG01, TG02 - Nhóm II: TG03, TG04 - Nhóm III: TG05, TG06, TG07, TG08 - Nhóm IV: TG09, TG10

                 SƠ ĐỒ PHÂN NHÓM DI TRUYỀN UPGMA (10 QUẦN THỂ)
                                 

Đóng góp khoa học và thực tiễn

• Về mặt khoa học: Đề tài chứng minh được sự đa dạng di truyền ở mức độ phân tử của các quần thể Tràm Gió tại Đồng Tháp Mười với tỷ lệ đa hình $91,26%$, cao hơn tỷ lệ $85,63%$ từng được công bố trong nghiên cứu trên cây Tràm lá dài (Melaleuca leucadendra L.) của tác giả Lê Sơn và cộng sự (2022). Nghiên cứu khẳng định chỉ thị ISSR có độ phân giải cao và tính ổn định vượt trội trong việc phân định các kiểu gen có biểu hiện hình thái tương đồng.
• Về mặt thực tiễn: Cung cấp cơ sở dữ liệu di truyền học chuẩn xác cho Ban Quản lý Trung tâm Nghiên cứu Bảo tồn và Phát triển Cây Dược liệu Đồng Tháp Mười, hỗ trợ định hướng công tác thu thập, bảo tồn nguồn gen, tránh lai cận huyết và lựa chọn các dòng bố mẹ phục vụ công tác nhân giống, sản xuất tinh dầu đạt chuẩn dược liệu.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp theo

Hạn chế của nghiên cứu

• Kỹ thuật ISSR bản chất là chỉ thị trội (dominant marker), không phân biệt được trạng thái đồng hợp tử và dị hợp tử tại từng locus gen khảo sát.
• Các đặc điểm hình thái lá (kích thước, màu sắc, dạng phiến lá) chịu tác động nhiều bởi vi khí hậu và độ tuổi của cành lá, dẫn đến việc phân nhóm hình thái chưa hoàn toàn tương thích tuyệt đối với kết quả phân nhóm di truyền phân tử.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

Theo đề xuất của tác giả trong Chương 5:

1. Tiếp tục tối ưu hóa quy trình sàng lọc hệ thống mồi ISSR.
2. Tiến hành phản ứng PCR lặp lại lần 2 với các mồi ISSR đã chọn lọc để kiểm chứng độ tái lập và tính ổn định tuyệt đối của các băng khuếch đại.
3. Ứng dụng các thuật toán kiểm định thống kê chuyên sâu (như kiểm định Duncan ở mức ý nghĩa 5%) đối với các tính trạng hình thái lá để tăng cường độ tin cậy khi so sánh, đối chiếu giữa dữ liệu kiểu hình và kiểu gen quần thể.

---

Giá trị tham khảo của khóa luận

• Đối tượng tham khảo phù hợp:
  • Sinh viên, học viên cao học chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Nông học, Lâm sinh, Dược học và Bảo tồn Đa dạng Sinh học.
  • Các kỹ thuật viên phòng thí nghiệm thực hiện các phân tích đa dạng di truyền trên các đối tượng thực vật thân gỗ có chứa hàm lượng tinh dầu và hợp chất thứ cấp cao.
• Các nội dung có giá trị tham khảo chuyên môn cao:
  • Quy trình chiết tách DNA tổng số từ lá Tràm (loại mô giàu tannin, polyphenol và tinh dầu) đảm bảo độ tinh sạch cho phản ứng PCR mà không bị đứt gãy.
  • Bộ thông số thực nghiệm của 12 mồi ISSR tối ưu (nhiệt độ bắt cặp $52^\circ\text{C}$, chu trình nhiệt, nồng độ hóa chất).
  • Phương pháp mã hóa ma trận nhị phân và quy trình phân tích cụm UPGMA bằng phần mềm NTSYSpc 2.10z trong di truyền học quần thể thực vật.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao nghiên cứu cần kết hợp cả chỉ thị hình thái lá và chỉ thị phân tử ISSR?

Đặc điểm hình thái lá là phương pháp nhận diện truyền thống, trực quan và dễ thực hiện tại thực địa. Tuy nhiên, tính trạng hình thái lá Tràm Gió dễ bị biến đổi bởi điều kiện môi trường (đất ngập nước, ánh sáng, độ dinh dưỡng). Chỉ thị phân tử ISSR cho phép tiếp cận trực tiếp vào hệ gen DNA, không bị ảnh hưởng bởi môi trường hay tuổi cây, giúp phân biệt rõ ràng các quần thể có hình thái tương đồng nhưng khác biệt về mặt di truyền.

2. Có bao nhiêu mồi ISSR đã được sàng lọc và bao nhiêu mồi được chọn cho phân tích chính thức?

Nghiên cứu đã sàng lọc ban đầu 21 mồi ISSR (từ UBC 808 đến UBC 890). Qua khảo sát ở các dải nhiệt độ bắt cặp khác nhau, tác giả đã chọn lọc được 12 mồi cho sản phẩm khuếch đại rõ nét, cường độ băng sáng và tỷ lệ đa hình cao ở nhiệt độ bắt cặp tối ưu là $52^\circ\text{C}$ (loại bỏ 9 mồi do băng mờ hoặc không xuất hiện băng).

3. Mức độ đa hình di truyền của 10 quần thể Tràm Gió được thể hiện qua các chỉ số nào?

Tính đa hình được thể hiện qua:

• Tỷ lệ băng đa hình đạt $91,26%$ (112/122 băng).
• Chỉ số thông tin đa hình ($PIC$) trung bình đạt 0,44 (dao động từ 0,38 đến 0,48).
• Chỉ số mồi ($MI$) trung bình đạt 3,8 (dao động từ 1,89 đến 6,00).
• Hệ số khoảng cách di truyền giữa các quần thể dao động từ 0,06 đến 0,62 (trung bình 0,27).

4. Kết quả phân tích phân cụm UPGMA đã chia 10 quần thể Tràm Gió thành mấy nhóm?

Dựa trên hệ số tương đồng di truyền và khoảng cách di truyền trung bình 0,27, sơ đồ cây phát sinh UPGMA chia 10 quần thể Tràm Gió thành 4 nhóm chính:

• Nhóm I: Gồm 2 quần thể TG01 và TG02.
• Nhóm II: Gồm 2 quần thể TG03 và TG04.
• Nhóm III: Gồm 4 quần thể TG05, TG06, TG07 và TG08.
• Nhóm IV: Gồm 2 quần thể TG09 và TG10.

5. Cặp quần thể Tràm Gió nào có sự khác biệt di truyền lớn nhất và cặp nào có quan hệ gần gũi nhất?

Cặp quần thể TG06 và TG10 có hệ số khoảng cách di truyền lớn nhất là 0,62, thể hiện mức độ sai khác di truyền cao nhất và phân bố xa nhau nhất trên cây phả hệ. Ngược lại, cặp quần thể TG03 và TG04 có khoảng cách di truyền nhỏ nhất là 0,06, thể hiện mức độ tương đồng di truyền cao nhất và nằm gần nhau nhất trên sơ đồ phân cụm.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Nguyễn Thị Hương Thảo Vi đã hoàn thành việc đánh giá đa dạng di truyền của 10 quần thể Tràm Gió (Melaleuca cajuputi) tại Trung tâm Nghiên cứu Bảo tồn và Phát triển Cây Dược liệu Đồng Tháp Mười thông qua kết hợp hình thái lá và 12 chỉ thị phân tử ISSR. Kết quả phân tích ghi nhận tỷ lệ đa hình đạt $91,26%$, chỉ số $PIC$ trung bình 0,44 và phân chia 10 quần thể thành 4 nhóm di truyền rõ rệt bằng phương pháp UPGMA. Công trình cung cấp dẫn liệu khoa học xác thực, đóng góp thiết thực cho công tác bảo tồn, quản lý nguồn gen và nhân giống cây Tràm Gió phục vụ mục đích chiết xuất dược liệu bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY HO CHI MINH CITY FACULTY OF BIOLOGICAL SCIENCES EVALUATION OF GENETIC DIVERSITY OF Melaleuca cajuputi POPULATIONS AT DONG THAP MUOI CENTER FOR RESEARCH CONSERVATION AND DEVELOPMENT OF MEDICINAL PLANTS BASED ON ISSR MARKERS AND LEAF MORPHOLOGICAL CHARACTERISTICS Major : BIOTECHNOLOGY Student : NGUYEN THI HUONG THAO VI Student code 219126263 Academic year : 2019 - 2023 Thu Duc City, 04/2024 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY HO CHI MINH CITY FACULTY OF BIOLOGICAL SCIENCES GRADUATION THESIS EVALUATION OF GENETIC DIVERSITY OF Melaleuca cajuputi POPULATIONS AT DONG THAP MUOI CENTER FOR RESEARCH CONSERVATION AND DEVELOPMENT OF MEDICINAL PLANTS BASED ON ISSR MARKERS AND LEAF MORPHOLOGICAL CHARACTERISTICS Advisor Student PHAM DUC TOAN. PhD NGUYEN THI HUONG THAO VI Thu Duc City, 04/2024 ACKNOWLEDGEMENT I would like to express my deep appreciation to the leadership of the Nong Lam University Ho Chi Minh City and the Faculty of Biological Sciences for providing me with the most favorable conditions to conduct this research. I extend my heartfelt gratitude to Dr. Pham Duc Toan, my thesis advisor, for his unwavering support, mentorship, and guidance throughout my academic journey.

For my research, I want to express my appreciation to Pharmacist Bui Dac Thang at Dong Thap Muoi Center for Research Conservation and Development of Medicinal Plants for assisting me in the sample collection process. This research would not have been possible without the help of all those who accompanied me during this challenging time. Therefore, I would like to express my gratitude to the members of Room 205 at the Research Institute of Biotechnology and Environment for their assistance in achieving my goals. And finally, I want to honor my family for providing me with the strength to overcome challenges.

CONEIRMATION AND COMMITMENT My name is Nguyen Thi Huong Thao Vi, Class: DH19SHC, Student ID: 19126263, major in Biotechnology, Nong Lam University Ho Chi Minh City. This graduation thesis is the outcome of my research, and I affirm that the results presented are entirely truthful and unbiased. I will take all responsibilities before the Council for these commitments. Thu Due City, 04/2024 Student’s signature il ABSTRACT This study evaluated the similarities and differences between ten Melaleuca cajuputi populations selected from the Dong Thap Muoi Center for Research Conservation and Development of Medicinal Plants based on leaf morphological characteristics and ISSR markers.

The leaf phenotyping and genotyping results showed that ten Melaleuca cajuputi populations were grouped into four major clusters. A total of 12 ISSR markers showed 122 bands, of which 112 were polymorphic bands, reaching a rate of 91. The PIC index ranged from 0.48 and showed a high polymorphism level in the studied populations. The dendrogram generated from the UPGMA clustering method illustrated genetic differences among the ten M.

cajuputi populations and displayed genetic distance coefficients ranging from 0.62 and an average of 0. In summary, this study demonstrated significant genetic differences between ten Melaleuca cajuputi populations, which could be difficult to distinguish morphologically. The findings contribute significantly to the conservation and development of the genetic resources of Melaleuca cajuputi for medicinal purposes at the Dong Thap Muoi Center for Research Conservation and Development of Medicinal Plants. Keyword: Dong Thap Muoi Center for Research Conservation and Development of Medicinal Plants, ISSR, Melaleuca cajuputi, Genetic diversity, Population.

1H TÓM TẮT Trong nghiên cứu này, các đặc điểm hình thái lá được dùng đề đánh giá sự giống nhau và khác nhau giữa mười quân thể Tràm Gió thu thập tại Trung tâm Nghiên cứu Bao tồn và Phát triển cây được liệu Đồng Tháp Mười. Qua kết quả đánh giá, 21 dấu chỉ thị phân tử ISSR bat kỳ, có 12 dấu chỉ thị phân tử ISSR cho kết quả, nên 12 dấu chỉ thị này được dùng để đánh giá mối tương quan di truyền của 10 quần thể Tràm Gió. Dựa vào đặc điểm hình thái lá và kiểu gen có thé chia các quan thé Tràm Gió thành 4 nhóm chính. Kết quả đánh giá bằng 12 dấu chỉ thị phân tử ISSR đã khuếch đại tổng số 122 băng, trong đó có 112 băng đa hình đạt tỉ lệ 91,26%.