Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Chó nhà (Canis lupus familiaris) là loài động vật được con người thuần hóa từ chó sói cổ đại từ khoảng 10.000 đến 11.000 năm trước và hiện diện rộng rãi trên khắp các châu lục. Tại Việt Nam, nguồn gen chó bản địa bao gồm 4 giống chó địa phương tiêu biểu: giống chó nhà thông thường (chó Cỏ/chó Vàng), giống chó cộc đuôi H'Mông, giống chó Bắc Hà, chó Lài (Dingo Đông Dương) và giống chó xoáy Phú Quốc. Trong khi các nghiên cứu trước đây về chó nhà tại Việt Nam chủ yếu tập trung vào bệnh lý và kỹ thuật chăm sóc nuôi dưỡng, các dữ liệu về đa dạng di truyền học phân tử và đặc tính phát sinh chủng loài của quần thể chó nhà ở các địa phương vẫn còn rất hạn chế. Đặc biệt, mối quan hệ di truyền giữa quần thể chó nhà sinh sống tại đất liền khu vực Tây Nam Bộ và giống chó quý Phú Quốc (Kiên Giang) chưa được khảo sát đầy đủ.

Đề tài được thực hiện nhằm xây dựng bộ dữ liệu phân tử về đặc tính di truyền của quần thể chó nhà tại thành phố Rạch Giá, tỉnh Kiên Giang, qua đó cung cấp cơ sở dữ liệu đối sánh phục vụ nghiên cứu nguồn gốc và mức độ đa dạng di truyền của giống chó Phú Quốc.

Nghiên cứu tập trung giải quyết 6 nội dung nhiệm vụ cụ thể:

  1. Thu nhận mẫu lông và ghi chép thông tin lý lịch của các cá thể chó nhà tại thành phố Rạch Giá.
  2. Thực hiện tách chiết DNA tổng số từ phần gốc chân lông của các mẫu thu thập.
  3. Sử dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại vùng trình tự kiểm soát (CR) chứa vùng siêu biến HV1 bằng cặp mồi đặc hiệu 15412F và 16625R.
  4. Giải trình tự nucleotide tự động hai chiều đoạn sản phẩm PCR và tiến hành hiệu chỉnh trình tự.
  5. So sánh, đối chiếu trình tự các mẫu nghiên cứu với cơ sở dữ liệu quốc tế GenBank bằng công cụ BLAST.
  6. Xây dựng cây phát sinh chủng loài nhằm định danh haplotype và đánh giá quan hệ di truyền của các mẫu khảo sát.
  • Đối tượng nghiên cứu: 23 cá thể chó nhà (Canis lupus familiaris) không có quan hệ huyết thống, mang các đặc điểm hình thái của chó nhà bản địa Việt Nam (vóc dáng trung bình, chiều cao 34 - 57 cm, chân cao, đuôi dạng bông lau, không có dải lông xoáy trên lưng).
  • Phạm vi không gian: Thu thập mẫu thực địa tại thành phố Rạch Giá, tỉnh Kiên Giang; quá trình phân tích thực nghiệm và tin sinh học được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học - Viện Bảo tồn Nguồn gen NTT, Trường Đại học Nguyễn Tất Thành (Quận 4, TP. Hồ Chí Minh).
  • Phạm vi thời gian: Đề tài được triển khai từ tháng 02/2017 đến tháng 08/2017.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Cơ sở lý thuyết di truyền học ty thể

Hệ gen ty thể động vật có vú (mtDNA) có kích thước dao động trong khoảng 16 - 17,5 kb (ở chó nhà là 16.727 bp), tồn tại dưới dạng phân tử DNA vòng đôi khép kín. MtDNA có các đặc tính di truyền ưu việt trong nghiên cứu tiến hóa và phát sinh loài: di truyền theo dòng mẹ qua tế bào chất của noãn bào, ở trạng thái đơn bội không có hiện tượng tái tổ hợp di truyền, và có tốc độ tích lũy đột biến cao gấp 10 - 25 lần so với DNA nhân.

Vùng kiểm soát (Control Region - CR) có chiều dài khoảng 1.270 bp (từ vị trí 15.458 đến 16.727), là vùng không mã hóa duy nhất chứa điểm khởi đầu sao chép và các promoter phiên mã của mtDNA. Vùng CR được chia thành:

  • Vùng siêu biến 1 (HV1): Nằm ở đầu 5', dài khoảng 672 bp (vị trí 15.458 - 16.130), có mức độ đa hình rất cao và chứa đoạn "hotspot" dài 60 bp (15.993 - 16.053 bp) với 32 điểm đột biến tập trung, được ứng dụng làm chỉ thị phân tử để xác định haplotype và phân loại 6 nhóm kiểu đơn bội (haplogroup) chính trên thế giới (A, B, C, D, E, F).
  • Vùng lặp lại nối tiếp biến đổi (VNTR): Dài khoảng 300 bp (vị trí 16.130 - 16.430), có số lượng bản sao thay đổi tùy từng cá thể.
  • Vùng siêu biến 2 (HV2): Dài khoảng 350 bp (vị trí 16.430 - 16.727), có tốc độ tiến hóa chậm và mang tính bảo thủ cao hơn.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

  • Tách chiết DNA tổng số: Áp dụng phương pháp phân tách bằng Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol (PCI tỉ lệ 25:24:1) kết hợp ủ nhiệt giải phóng DNA từ 50 - 60 gốc chân lông với đệm chiết (Tris-HCl 10 mM pH 8; Triton X-100 1%; SDS 1%; EDTA 10 mM) và enzyme Proteinase K (20 mg/ml) ủ qua đêm ở 55°C. Tủa DNA bằng NaCl 5M và ethanol tuyệt đối lạnh ở -20°C, sau đó rửa cặn tủa bằng ethanol 70%.
  • Kiểm tra chất lượng DNA: Đo mật độ quang học (OD) tại các bước sóng 230 nm, 260 nm, 280 nm và 320 nm bằng máy quang phổ kế để tính nồng độ DNA ($C_{DNA} = (OD_{260} - OD_{320}) \times 50\text{ ng/µl}$) và kiểm tra độ tinh sạch qua tỷ số $OD_{260}/OD_{280}$ (ngưỡng chuẩn 1,8 - 2,0) và $OD_{260}/OD_{230}$ (ngưỡng 2,0 - 2,2). Kiểm tra độ nguyên vẹn của DNA bằng điện di trên gel agarose 1% trong đệm TBE 1X ở hiệu điện thế 90 - 120 V, nhuộm Ethidium Bromide (EtBr) và soi dưới ánh sáng tử ngoại (UV).
  • Phản ứng PCR khuếch đại vùng CR/HV1: Do đoạn VNTR có kích thước biến động gây khó khăn cho việc đặt mồi nội tại vùng HV1, phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu bắt cặp ở hai đầu vùng kiểm soát để khuếch đại đoạn trình tự 1.232 bp chứa toàn bộ HV1:
    • Mồi xuôi 15412F: 5'-CCACTATCAGCACCCAAAG-3' ($T_m = 53,2^\circ\text{C}$, 19 bp)
    • Mồi ngược 16625R: 5'-AGACTACGAGACCAAATGCG-3' ($T_m = 54,6^\circ\text{C}$, 20 bp) Thành phần phản ứng gồm HS Prime Taq DNA Polymerase 2X Master Mix (GeNet Bio), mồi xuôi/ngược (10 µM), dNTPs (10 mM), DNA khuôn và nước cất vô trùng trong tổng thể tích 25 µl.
  • Giải trình tự gen: Sản phẩm PCR đạt chuẩn được gửi giải trình tự nucleotide tự động hai chiều theo phương pháp kết thúc chuỗi Sanger (dùng thuốc nhuộm huỳnh quang huỳnh quang ddNTPs) tại Công ty Biotex Nam Khoa.

Phương pháp xử lý dữ liệu và Tin sinh học

  • Hiệu chỉnh trình tự: Sử dụng phần mềm FinchTV 1.0 để đọc biểu đồ sắc phổ huỳnh quang (chromatogram), kiểm tra và loại bỏ các tín hiệu mơ hồ ở hai đầu đọc gần primer; phần mềm SeaView 4.4 để căn gióng thẳng hàng (alignment) hai chiều xuôi - ngược và xuất trình tự đồng nhất (Consensus sequence).
  • So sánh dữ liệu: Sử dụng công cụ BLAST trên cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI) để kiểm tra độ tương đồng của trình tự mẫu với dữ liệu quốc tế.
  • Phân tích phát sinh loài: Phân tích đoạn trình tự 582 bp thuộc vùng HV1 trên phần mềm MEGA (phiên bản 6.0 và 7.0) để xác định các vị trí đa hình đơn nucleotide (SNP) và haplotype. Cây phát sinh chủng loài được thiết lập bằng thuật toán Neighbor-Joining (NJ) dựa trên mô hình khoảng cách di truyền Kimura 2-parameter, kiểm định độ tin cậy của các nhánh bằng phương pháp Bootstrap với 1.000 lần lặp.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa các tư liệu lý thuyết và tổng quan nghiên cứu liên quan đến đối tượng và phương pháp:

  • Phân loại học sinh giới của loài chó nhà (Canis lupus familiaris), nguồn gốc tiến hóa từ chó sói cổ đại và đặc điểm hình thái của các giống chó địa phương Việt Nam. Trình bày chi tiết đặc điểm phân loại, hình thái (xoáy lưng, chân có màng bơi) và các kết quả nghiên cứu di truyền đã công bố về giống chó Phú Quốc (Thái Kế Quân và cs., 2016; Đinh Trần Mỹ Đức, 2013; Trương Nguyễn Thị Như Mai, 2013; Nguyễn Văn Tú, 2015; Hà Thị Cẩm, 2015).
  • Nguyên lý kỹ thuật tách chiết DNA bằng phenol-chloroform, nguyên lý phân tách phân tử bằng điện di trên gel agarose/polyacrylamide, nguyên tắc phản ứng chuỗi polymerase (PCR) và các yếu tố ảnh hưởng (nhiệt độ gắn mồi, nồng độ ion $Mg^{2+}$, dNTP, chất lượng Taq polymerase).
  • Lịch sử và nguyên lý giải trình tự DNA từ phương pháp hóa học Maxam - Gilbert (1977), phương pháp enzyme Sanger (1977) đến giải trình tự mao quản tự động ABI dùng chất huỳnh quang.
  • Cấu trúc, đặc tính sinh học của mtDNA động vật có vú, cấu trúc vùng kiểm soát (CR), các vùng HV1, HV2, VNTR và khái niệm về chỉ thị SNP.
  • Lược khảo các công trình nghiên cứu mtDNA chó trên thế giới (Carles Vilà và cs., 1997; Gökçek, 2005 về chó Kangal Thổ Nhĩ Kỳ; Pang và cs., 2009 khảo sát 1.543 cá thể chó toàn cầu xác định 6 haplogroup; Li và Zhang, 2012 về chó Ngao Tây Tạng) và các nghiên cứu về chó bản địa tại Việt Nam.

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 trình bày chi tiết danh mục vật liệu, thiết bị, hóa chất và toàn bộ quy trình thực nghiệm:

  • Danh sách 23 mẫu lông chó nhà (kí hiệu từ R1 đến R23) thu thập tại các hộ gia đình ở TP. Rạch Giá, Kiên Giang kèm mô tả kiểu hình màu lông (vàng, luốc xám, vàng trắng, đen đốm, mực đen, nâu đen, vàng vện, đốm trắng...).
  • Bảng danh mục dụng cụ phòng thí nghiệm, thiết bị phân tích (máy PCR Esco, bộ điện di Consort, tủ ấm, máy ly tâm Wisespin, máy quang phổ...) và hóa chất tinh khiết của các hãng Merck, Sigma, GeneOn, GeNet Bio.
  • Giới thiệu bộ công cụ tin sinh học: FinchTV 1.0, SeaView 4.4, MEGA 6.0/7.0.
  • Quy trình chuẩn hóa 10 bước tách chiết DNA tổng số từ mẫu lông có cải tiến thể tích NaCl 5M.
  • Chi tiết thông số cặp mồi 15412F/16625R và bảng thành phần phản ứng PCR chuẩn (thể tích 25 µl).
  • Thiết lập 3 chu trình nhiệt PCR khác nhau ở nhiệt độ bắt cặp mồi ($T_a$) phù hợp với từng nhóm mẫu: $49^\circ\text{C}$ (áp dụng cho 16 mẫu), $54^\circ\text{C}$ (áp dụng cho 4 mẫu: R10, R11, R14, R15) và $55^\circ\text{C}$ (áp dụng cho 3 mẫu: R3, R22, R23).
  • Tiêu chuẩn gửi mẫu giải trình tự Sanger và quy trình xử lý, kiểm tra đối soát tín hiệu chromatogram hai chiều nhằm loại bỏ sai sót khi đọc base tự động.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm và biện luận sinh học:

  • Kết quả tách chiết DNA: Điện di gel agarose 1% của 23 mẫu đều xuất hiện một băng DNA tổng số đậm, rõ nét, nằm phía trên thang chuẩn 1 kb, không có hiện tượng đứt gãy hay vệt dài (smear). Giá trị đo quang phổ cho thấy nồng độ DNA dao động từ 57,0 ng/µl (mẫu R1) đến 181,3 ng/µl (mẫu R5); tỷ số $OD_{260}/OD_{280}$ của đa số mẫu đạt ngưỡng sạch từ 1,62 đến 2,10.
  • Kết quả tối ưu hóa phản ứng PCR: Sau khi hiệu chỉnh chu trình nhiệt bắt cặp mồi tương ứng cho từng nhóm mẫu ($49^\circ\text{C}$, $54^\circ\text{C}$ và $55^\circ\text{C}$), điện di sản phẩm PCR của toàn bộ 23 mẫu cho thấy 100% mẫu khuếch đại thành công một băng duy nhất, sáng rõ, đúng kích thước lý thuyết khoảng 1.232 bp.
  • Kết quả giải trình tự và phân tích đoạn 582 bp vùng HV1:
    • 100% các mẫu (23/23 mẫu) được đọc rõ tín hiệu hai chiều, hiệu chỉnh và xuất trình tự đồng nhất Consensus.
    • So sánh BLAST trên GenBank khẳng định tất cả các mẫu đều thuộc loài chó nhà (Canis lupus familiaris) với độ tương đồng cao.
    • Phân tích đa hình nucleotide (SNP) trên đoạn 582 bp xác định được các vị trí biến dị đặc trưng.
    • Dựa trên các SNP, xác định được 9 haplotype khác nhau xuất hiện trong 23 cá thể khảo sát, bao gồm: A11, A17, A18, A73 (thuộc Haplogroup A); B1, B3 (thuộc Haplogroup B); C2, C3 (thuộc Haplogroup C) và E4 (thuộc Haplogroup E).
    • Tần số phân bố các nhóm kiểu đơn bội: Nhóm A chiếm tỷ lệ cao nhất với 60%, nhóm C chiếm 20%, nhóm B chiếm 10% và nhóm E chiếm 10%.
    • Sự xuất hiện của haplotype E4 tại quần thể chó nhà Rạch Giá là phát hiện sinh học đáng chú ý, tương đồng với dòng haplotype E4 tìm thấy ở chó Phú Quốc (Thái Kế Quân và cs., 2016; Nguyễn Văn Tú, 2015).

Kết quả và đóng góp

Kết quả định lượng chính

Nghiên cứu đã hoàn thành việc thu thập mẫu, tách chiết DNA, khuếch đại PCR, giải trình tự Sanger và định loại phân tử thành công cho toàn bộ 23 mẫu chó nhà tại Rạch Giá.

Chỉ số di truyền Kết quả định lượng trong nghiên cứu
Số lượng mẫu phân tích ($n$) 23 mẫu lông
Kích thước đoạn PCR khuếch đại 1.232 bp (chứa trọn vẹn vùng HV1)
Kích thước đoạn giải trình tự phân tích 582 bp (vùng HV1)
Số lượng Haplotype phát hiện 9 haplotype (A11, A17, A18, A73, B1, B3, C2, C3, E4)
Tỷ lệ Haplogroup A 60% (các haplotype A11, A17, A18, A73)
Tỷ lệ Haplogroup B 10% (các haplotype B1, B3)
Tỷ lệ Haplogroup C 20% (các haplotype C2, C3)
Tỷ lệ Haplogroup E 10% (haplotype E4)

Đóng góp khoa học của đề tài

  • Xây dựng dữ liệu di truyền học thực chứng: Đề tài là công trình đầu tiên công bố dữ liệu giải trình tự 582 bp vùng siêu biến HV1 trên hệ gen ty thể của quần thể chó nhà bản địa tại thành phố Rạch Giá, tỉnh Kiên Giang.
  • Chứng minh mức độ đa dạng di truyền cao: Quần thể chó nhà Rạch Giá có cấu trúc di truyền đa dạng với 4 nhóm kiểu đơn bội (A, B, C, E) và 9 haplotype khác nhau.
  • Phát hiện dòng gen cổ quý hiếm: Xác định được sự hiện diện của haplotype E4 (thuộc nhóm E - nhóm haplotype hiếm trên thế giới, chỉ chiếm khoảng 1 - 2% ở quần thể toàn cầu và phân bố hạn chế ở Đông Á). Việc ghi nhận E4 ở chó nhà Rạch Giá cung cấp dữ liệu đối sánh quan trọng cho thấy sự giao thoa di truyền hoặc mối liên hệ phát sinh loài gần gũi giữa chó nhà đất liền Tây Nam Bộ và giống chó xoáy Phú Quốc (vốn có tỷ lệ nhóm E lên đến 16,7%).

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế của nghiên cứu:

    • Dung lượng mẫu khảo sát còn nhỏ ($n = 23$ cá thể) và phạm vi thu mẫu mới chỉ giới hạn trong địa bàn thành phố Rạch Giá, chưa đại diện cho toàn bộ các huyện thị thuộc tỉnh Kiên Giang và vùng Đồng bằng sông Cửu Long.
    • Phân tích mới tập trung vào đoạn 582 bp thuộc vùng HV1 của hệ gen ty thể, phản ánh quan hệ di truyền theo dòng mẹ đơn lẻ, chưa khảo sát các chỉ thị trên nhiễm sắc thể nhân hoặc nhiễm sắc thể giới tính Y.

  • Hướng nghiên cứu tiếp theo:

    • Mở rộng quy mô thu mẫu với số lượng cá thể lớn hơn tại nhiều tỉnh thành Nam Bộ để đánh giá toàn diện cấu trúc quần thể chó nhà Việt Nam.
    • Tiến hành giải trình tự toàn bộ hệ gen ty thể (complete mitochondrial genome) nhằm xác lập các đột biến đặc trưng ở mức độ toàn diện.
    • Kết hợp phân tích các chỉ thị di truyền trên nhiễm sắc thể giới tính Y (dòng bố) và chỉ thị vi vệ tinh (microsatellite/STR) hoặc hệ thống SNP trên DNA nhân để làm sáng tỏ lịch sử tiến hóa, dòng chảy gen (gene flow) và hiện tượng lai tạp giữa chó nhà đất liền và giống chó đảo Phú Quốc.

Giá trị tham khảo

  • Đối tượng thụ hưởng: Sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Di truyền học động vật, Sinh học ứng dụng, Chăn nuôi - Thú y và Bảo tồn đa dạng sinh học.
  • Nội dung có giá trị tham khảo chuyên sâu:
    • Quy trình thực nghiệm 10 bước tách chiết DNA chất lượng cao từ mẫu gốc chân lông động vật không xâm lấn, tiết kiệm chi phí và hóa chất.
    • Bảng thông số kỹ thuật tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR và chu trình nhiệt bắt cặp mồi ($49^\circ\text{C}$, $54^\circ\text{C}$, $55^\circ\text{C}$) đối với cặp mồi 15412F và 16625R để khuếch đại vùng CR.
    • Quy trình phân tích dữ liệu giải trình tự Sanger, sử dụng phối hợp các phần mềm chuyên dụng (FinchTV, SeaView, MEGA) trong xử lý chromatogram, căn gióng chuỗi và xây dựng cây phát sinh loài phục vụ định loại phân tử.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao nghiên cứu sử dụng mẫu lông thay vì mẫu máu hay mô cơ để tách chiết DNA?

Mẫu lông (có giữ lại gốc chân lông) là phương pháp thu mẫu phi xâm lấn, không gây đau đớn hay ảnh hưởng đến sức khỏe của động vật, thuận tiện cho việc vận chuyển và bảo quản thực địa từ Rạch Giá về TP. Hồ Chí Minh. Dù cấu trúc chất nền của lông bền vững, quy trình sử dụng hỗn hợp đệm tẩy (SDS, Triton X-100) và Proteinase K ủ qua đêm ở $55^\circ\text{C}$ đã phá vỡ màng tế bào hiệu quả, cho nồng độ DNA dao động từ 57,0 đến 181,3 ng/µl, đáp ứng tốt cho phản ứng PCR.

2. Vì sao phản ứng PCR không khuếch đại riêng vùng HV1 mà phải khuếch đại đoạn dài 1.232 bp?

Ngay sau vị trí kết thúc của vùng siêu biến HV1 là đoạn trình tự lặp lại nối tiếp VNTR dài khoảng 300 bp với số lượng bản sao biến động lớn giữa các cá thể. Sự không ổn định này khiến việc thiết kế mồi đặc hiệu ngay sát vùng HV1 gặp khó khăn. Do đó, tác giả lựa chọn cặp mồi 15412F và 16625R bắt cặp ở hai đầu bảo thủ của vùng kiểm soát CR để khuếch đại phân đoạn 1.232 bp chứa trọn vẹn vùng HV1 bên trong.

3. Nghiên cứu đã tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp ($T_a$) của phản ứng PCR như thế nào cho 23 mẫu lông?

Do chất lượng khuôn DNA ở các mẫu có sự khác biệt, tác giả đã chia 23 mẫu thành 3 nhóm phản ứng với nhiệt độ bắt cặp điều chỉnh:

  • Nhiệt độ $49^\circ\text{C}$ (chu kỳ 35 vòng): Áp dụng thành công cho 16 mẫu (R1, R2, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R12, R13, R16, R17, R18, R19, R20, R21).
  • Nhiệt độ $54^\circ\text{C}$ (chu kỳ 35 vòng): Áp dụng cho 4 mẫu (R10, R11, R14, R15).
  • Nhiệt độ $55^\circ\text{C}$ (chu kỳ 35 vòng): Áp dụng cho 3 mẫu (R3, R22, R23). Tất cả đều cho sản phẩm PCR đơn băng, rõ nét ở kích thước ~1.232 bp.

4. Kết quả phát hiện 9 haplotype và sự xuất hiện của nhóm E mang ý nghĩa sinh học gì?

Phân tích 582 bp vùng HV1 đã xác định 9 haplotype (A11, A17, A18, A73, B1, B3, C2, C3, E4). Trong đó, nhóm A chiếm ưu thế (60%), phản ánh đúng đặc trưng phân bố của chó nhà toàn cầu. Đáng chú ý, việc phát hiện haplotype E4 (chiếm 10%) chứng minh quần thể chó nhà tại Rạch Giá còn bảo lưu dòng gen cổ thuộc nhóm E (vốn chỉ chiếm 1 - 2% trên thế giới và tập trung ở Đông Á), cho thấy mối tương đồng di truyền quan trọng với dòng E4 từng được ghi nhận ở chó xoáy Phú Quốc (16,7%).

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Lê Quế Phương đã chuẩn hóa thành công quy trình tách chiết DNA từ mẫu lông và tối ưu hóa phản ứng PCR khuếch đại đoạn 1.232 bp vùng kiểm soát ty thể ở 23 cá thể chó nhà tại thành phố Rạch Giá, tỉnh Kiên Giang. Kết quả giải trình tự và phân tích 582 bp vùng siêu biến HV1 đã xác định được 9 haplotype thuộc 4 nhóm kiểu đơn bội với tỷ lệ 60% nhóm A, 20% nhóm C, 10% nhóm B và 10% nhóm E. Đề tài đã cung cấp cơ sở dữ liệu di truyền học phân tử thực chứng có giá trị, làm sáng tỏ sự hiện diện của haplotype quý hiếm E4 trên đất liền và tạo tiền đề khoa học cho các nghiên cứu chuyên sâu về nguồn gốc tiến hóa của giống chó Phú Quốc.