Tách Chiết Tinh Khiết và Ứng Dụng Hợp Chất Có Hoạt Tính Sinh Học Từ Nấm Vân Chi Coriolopsis Aspera

Chuyên khảo phân tích Tách chiết tinh sạch và ứng dụng hợp chất có hoạt tính sinh học từ nấm vân chi coriolopsis aspera, đánh giá các khía cạnh quan trọng, đề xuất hướng nghiên

• Tác giả: Nguyễn Ngọc Thuần
• Người hướng dẫn: PGS. TS Đàm Sao Mai
• Trường học: Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM
• Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm
• Đề tài: Tách Chiết, Tinh Sạch Và Ứng Dụng Hợp Chất Có Hoạt Tính Sinh Học Từ Nấm Vân Chi (Coriolopsis aspera)
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: TP.HCM

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Giới thiệu nấm vân chi
• 1.2. Thành phần hóa học của nấm vân chi
• 1.2.1. Terpenoid và steroid
• 1.2.2. Hợp chất phenolic
• 1.2.3. Các hợp chất khác
• 1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly
• 1.3.1. Ảnh hưởng nhiệt độ
• 1.3.2. Ảnh hưởng thời gian
• 1.3.3. Ảnh hưởng loại dung môi
• 1.3.4. Ảnh hưởng tỷ lệ dung môi với nguyên liệu
• 1.3.5. Ảnh hưởng kỹ thuật chiết xuất
• 1.3.6. Một số ảnh hưởng khác
• 1.4. Tinh sạch định danh chất
• 1.4.1. Kỹ thuật sắc ký lọc gel
• 1.4.2. Kỹ thuật sắc ký bảng mỏng (TLC)
• 1.5. Hoạt tính sinh học
• 1.5.1. Hoạt tính chống oxy hóa
• 1.5.2. Hoạt tính kháng vi sinh vật
• 1.5.3. Hoạt tính ức chế tế bào ung thư
• 1.6. Kỹ thuật sấy phun tạo sản phẩm bột hòa tan
• 1.7. Thời gian bảo quản
• 1.8. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
• 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.1.2. Thiết bị và hóa chất
• 2.1.3. Địa điểm nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Phương pháp lấy và xử lí mẫu
• 2.2.2. Phương pháp xử lý mẫu nguyên liệu
• 2.2.3. Nghiên cứu điều kiện trích ly
• 2.2.4. Tinh sạch, định danh chất trong dịch trích ly
• 2.2.5. Xác định thành phần hoạt tính tổng (TFC, TTC, TFC)
• 2.2.6. Thử hoạt tính sinh học của cao chiết ethanol
• 2.2.7. Nghiên cứu ứng dụng tạo sản phẩm bột theo phương pháp sấy phun
• 2.2.8. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả xử lý mẫu
• 3.2. Điều kiện trích ly
• 3.2.1. Ảnh hưởng loại dung môi để trích ly các hợp chất có HTSH
• 3.2.2. Tối ưu hóa trong công đoạn trích ly TPC, TFC và TTC
• 3.3. Định tính thành phần hoạt tính sinh học
• 3.4. Phân lập và tinh sạch hợp chất từ cao CoAEO
• 3.5. Hoạt tính sinh học từ cao CoAEO
• 3.5.1. Xác định khả năng khử gốc tự do
• 3.5.2. Xác định hoạt tính gây độc và ức chế tế bào ung thư của cao CoAEO
• 3.5.3. Hoạt tính kháng vi sinh vật của cao CoAEO
• 3.6. Đánh giá độc tính dịch cao CoAEO trên chuột
• 3.6.1. Độc tính cấp
• 3.6.2. Độc tính bán trường diễn
• 3.7. Ứng dụng tạo sản phẩm thực phẩm dạng bột hòa tan từ cao CoAEO
• 3.7.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ hỗn hợp các chất mang (maltodextrin:gum arabic: gelatin) đến độ nhớt dịch sấy phun, hiệu suất thu hồi bột, độ ẩm bột và thời gian hòa tan
• 3.7.2. Thí nghiệm một yếu tố độc lập
• 3.7.3. Xác định thời gian bảo quản sản phẩm bột CoAEO hòa tan
• 3.7.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng chống oxy hóa (RSA) trong thời gian bảo quản sản phẩm bột CoAEO hòa tan
• 3.7.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng TTC trong thời gian bảo quản sản phẩm bột CoAEO hòa tan
• 3.7.6. Đánh giá sản phẩm bột CoAEO hòa tan
• 3.7.6.1. Tỷ trọng bột CoAEO
• 3.7.6.2. Khả năng hòa tan của bột trong nước
• 3.7.6.3. Hình dạng của bột CoEAO hòa tan
• 3.7.6.4. Khả năng thấm ướt của bột
• 3.7.6.5. Khả năng khử gốc tự do của bột CoAEO hòa tan
• 3.7.6.6. Khả năng ức chế tế bào ung thư cổ tử cung và tế bào ung thư gan của bột CoAEO hòa tan
• 3.7.6.7. Độ an toàn sinh học của sản phẩm bột CoAEO hòa tan
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ CHỜ ONLINE
• DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về nấm vân chi

Nấm vân chi, hay còn gọi là Coriolopsis aspera, là một loại nấm có giá trị dinh dưỡng và dược lý cao. Nấm này chứa nhiều hợp chất sinh học có hoạt tính, bao gồm tinh chất nấm và các hợp chất tự nhiên khác. Nghiên cứu về nấm vân chi không chỉ giúp hiểu rõ hơn về thành phần hóa học mà còn mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các sản phẩm từ nấm. Theo nghiên cứu, nấm vân chi có khả năng chống oxy hóa và kháng vi sinh vật, điều này cho thấy tiềm năng ứng dụng của nó trong lĩnh vực y học và thực phẩm. Việc chiết xuất và tinh sạch các hợp chất sinh học từ nấm vân chi sẽ giúp làm giàu các sản phẩm có lợi cho sức khỏe.

II. Phương pháp chiết xuất và tinh sạch

Nghiên cứu đã khảo sát nhiều phương pháp chiết xuất tinh khiết từ nấm vân chi, bao gồm phương pháp siêu âm, vi sóng, và kết hợp hóa học. Kết quả cho thấy phương pháp kết hợp nitơ lỏng và siêu âm cho hiệu suất chiết xuất cao nhất với các chỉ số TPC, TFC, và TTC đạt yêu cầu. Việc lựa chọn dung môi cũng rất quan trọng, trong đó ethanol 80% được xác định là dung môi tối ưu cho quá trình chiết xuất. Điều này không chỉ giúp tăng cường hiệu suất chiết xuất mà còn đảm bảo tính an toàn cho sản phẩm cuối cùng. Các hợp chất sinh học được chiết xuất từ nấm vân chi có thể được sử dụng trong nhiều ứng dụng khác nhau, từ thực phẩm đến dược phẩm.

III. Hoạt tính sinh học của cao chiết CoAEO

Cao chiết CoAEO từ nấm vân chi đã được thử nghiệm về hoạt tính chống oxy hóa, ức chế tế bào ung thư và kháng vi sinh vật. Kết quả cho thấy cao chiết này có khả năng kháng lại nhiều chủng vi sinh vật và ức chế tế bào ung thư cổ tử cung (HeLa) với IC50 đạt 98,3 µg/ml. Điều này chứng tỏ rằng hợp chất sinh học từ nấm vân chi có tiềm năng lớn trong việc phát triển các sản phẩm hỗ trợ điều trị bệnh. Việc nghiên cứu sâu hơn về tác dụng của nấm trong y học có thể dẫn đến những phát hiện mới trong việc điều trị và phòng ngừa bệnh tật.

IV. Ứng dụng trong sản xuất thực phẩm

Nghiên cứu cũng đã chỉ ra khả năng ứng dụng của cao chiết CoAEO trong sản xuất thực phẩm. Sản phẩm bột hòa tan từ cao chiết này không chỉ có giá trị dinh dưỡng cao mà còn có khả năng chống oxy hóa tốt. Thời gian bảo quản sản phẩm bột CoAEO hòa tan được xác định là 45,2 ngày ở nhiệt độ mát 20oC. Điều này cho thấy rằng sản phẩm có thể được sử dụng rộng rãi trong ngành thực phẩm, mang lại lợi ích cho sức khỏe người tiêu dùng. Việc phát triển các sản phẩm từ nấm vân chi không chỉ đáp ứng nhu cầu thị trường mà còn góp phần nâng cao giá trị dinh dưỡng trong chế độ ăn uống hàng ngày.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Nghiên cứu khoa học về các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học từ nấm dược liệu đang là trọng tâm của công nghệ thực phẩm và hóa sinh hiện đại. Luận án tiến sĩ "Tách chiết, tinh sạch và ứng dụng hợp chất có hoạt tính sinh học từ nấm vân chi (Coriolopsis aspera)" do nghiên cứu sinh Nguyễn Ngọc Thuần thực hiện (2022) tại Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM, dưới sự hướng dẫn của PGS. TS. Đàm Sao Mai và PGS. TS. Lê Trung Thiên, đặt nền móng tiên phong cho việc khai thác loài nấm Coriolopsis aspera (Jungh.) Teng thuộc họ Polyporaceae. Trong khi các nghiên cứu quốc tế và trong nước phần lớn tập trung vào loài Trametes versicolor (Asgher et al., 2009; Kamiyama et al., 2013; Ferreira et al., 2016) hoặc dừng lại ở khía cạnh nông học và điều kiện nuôi trồng (Trang, 2016; V. Minh, 2017), loài Coriolopsis aspera hầu như chưa từng có công bố học thuật toàn diện nào về hồ sơ hóa thực vật, động học trích ly, độc tính học in vivo và công nghệ vi bao tạo bột thực phẩm chức năng hòa tan.

Khoảng trống nghiên cứu (Research Gap) cốt lõi được xác định rõ: Cấu trúc thành tế bào sợi nấm Coriolopsis aspera cấu tạo từ mạng lưới vi sợi chitin-glucan và màng phức hợp lignin-cellulose đặc biệt bền vững, gây cản trở nghiêm trọng đến quá trình truyền khối (mass transfer) và khuếch tán dung môi khi chiết xuất các hợp chất thứ cấp nội bào. Hơn nữa, việc thiếu hụt dữ liệu định danh cấu trúc phân tử của các hoạt chất tinh sạch, thiếu đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn theo quy chuẩn quốc tế (OECD), cũng như việc chưa giải quyết được bài toán tổn thất hoạt tính sinh học nhạy nhiệt trong quá trình sấy phun công nghiệp đã đặt ra yêu cầu cấp thiết cho công trình này.

Hệ thống câu hỏi nghiên cứu và giả thuyết khoa học của luận án:

• RQ1: Phương pháp tiền xử lý vật lý - hóa học nào phá vỡ hiệu quả vi cấu trúc sợi nấm để cực đại hóa giải phóng polyphenol, flavonoid và triterpenoid?
• RQ2: Mô hình bề mặt đáp ứng (RSM) nào thiết lập chính xác động học trích ly tối ưu bằng dung môi xanh thực phẩm (ethanol)?
• RQ3: Các hợp chất đơn lẻ nào tạo nên hoạt tính chống oxy hóa và ức chế tế bào ung thư gan (HepG2), ung thư cổ tử cung (HeLa) của cao chiết Coriolopsis aspera?
• RQ4: Dịch chiết tối ưu (CoAEO) có an toàn về mặt sinh học qua thử nghiệm độc tính in vivo và có thể vi bao thành dạng bột hòa tan với độ bền hoạt tính cao theo động học sấy phun hay không?

Các giả thuyết nghiên cứu:

• H1: Kỹ thuật kết hợp sốc nhiệt nitơ lỏng và xâm thực siêu âm phá hủy màng tế bào sợi nấm vượt trội so với các phương pháp nhiệt hay vi sóng đơn thuần.
• H2: Cao chiết chuẩn hóa CoAEO chứa các dẫn xuất triterpene/sterol và phenylpropanoid có khả năng ức chế chọn lọc dòng tế bào ung thư người và gốc tự do DPPH với độc tính tế bào thấp trên động vật sống.
• H3: Hệ chất mang ba thành phần (maltodextrin : gum arabic : gelatin) tạo màng bao vi mô bảo vệ các hoạt chất nhạy nhiệt trong buồng sấy phun ở nhiệt độ trên 130°C.

Khung lý thuyết của luận án tích hợp Lý thuyết xâm thực siêu âm (Acoustic Cavitation Theory - Chemat et al., 2011), Lý thuyết chuyển khối theo định luật Fick, Phương pháp đáp ứng bề mặt mô hình Box-Behnken (RSM-BBD - Box & Behnken, 1960), Nguyên lý độc tính học chuẩn hóa (OECD Guideline 407, Lorke Method) và Động học thoái biến chất lượng thực phẩm theo hệ số nhiệt độ $Q_{10}$ (Labuza, 1984). Phạm vi nghiên cứu bao gồm mẫu nấm thu thập tự nhiên tại Vườn Quốc gia Pù Mát (Nghệ An), nhân giống và thu hoạch quả thể sau 50–60 ngày tại TP.HCM, phân tích cấu trúc NMR 1D/2D trên hệ máy Bruker 500 MHz, thử nghiệm độc tính trên chuột nhắt trắng 90 ngày và tối ưu hóa hệ thống sấy phun LabPlant SD-Basic.

Literature Review và Positioning

Tổng quan tài liệu chỉ ra ba dòng nghiên cứu chính trong lĩnh vực nấm dược liệu thuộc chi Trametes và Coriolopsis:

Dòng nghiên cứu thứ nhất tập trung vào việc chiết xuất các polysaccharide liên kết protein (polysaccharopeptide - PSP và Polysaccharide Krestin - PSK) có khối lượng phân tử trên 10.000 Da với vai trò kích thích miễn dịch gián tiếp (Yoshioka et al., 1975; Eliza et al., 2012; Patel et al., 2012). Tuy nhiên, các kỹ thuật chiết nước nóng truyền thống thường làm biến tính hoặc bỏ qua các hợp chất thứ cấp phân tử nhỏ tan trong dung môi hữu cơ.

Dòng nghiên cứu thứ hai khai thác nhóm hợp chất terpenoid và sterol chống ung thư trực tiếp. Các nghiên cứu của Leliebre-Lara et al. (2016), Muszyńska et al. (2017) và Ding et al. (2013) khẳng định ergosterol, cerevisterol và trametenolic acid B có khả năng ức chế chuyển vị yếu tố nhân NF-$\kappa$B, kích hoạt con đường apoptosis của tế bào ác tính và ức chế sự hình thành mạch khối u rắn. Mặc dù vậy, đa phần nghiên cứu dừng lại ở mức sàng lọc thô, chưa tối ưu hóa quy trình trích ly chọn lọc đồng thời triterpenoid tổng (TTC) và polyphenol tổng (TPC).

Dòng nghiên cứu thứ ba tập trung vào hoạt tính chống oxy hóa và kháng khuẩn của các dịch chiết phenolic từ nấm vân chi (Kamiyama et al., 2013; Puia et al., 2018). Giữa các nghiên cứu quốc tế tồn tại sự tranh luận rõ nét về dung môi chiết xuất: Kamiyama et al. (2013) công bố cao chiết acetone từ Trametes versicolor có hoạt tính khử gốc tự do DPPH cao nhất (50,9% ở 500 $\mu$g/mL), vượt trội hơn methanol (33,9%) và n-hexane (29,5%). Ngược lại, Puia et al. (2018) trên đối tượng Trametes versicolor và Trametes gibbosa chứng minh cao chiết methanol mang lại hàm lượng phenolic tổng và năng lực dập tắt gốc tự do cao nhất (đạt lần lượt 0,213 mM TE và 0,534 mM TE). Mặt khác, việc ứng dụng dung môi độc hại như acetone hay methanol trong công nghệ thực phẩm bị giới hạn nghiêm ngặt bởi quy chuẩn an toàn.

Chỉ tiêu so sánh	Nghiên cứu quốc tế: Kamiyama et al. (2013) (T. versicolor)	Nghiên cứu quốc tế: Puia et al. (2018) (T. gibbosa)	Luận án: Nguyễn Ngọc Thuần (2022) (Coriolopsis aspera)
Đối tượng nghiên cứu	Trametes versicolor	Trametes gibbosa	Coriolopsis aspera
Phương pháp tiền xử lý	Nghiền cơ học truyền thống	Xay khô tiêu chuẩn	Sốc nhiệt Nitơ lỏng kết hợp siêu âm xâm thực
Dung môi chiết xuất	Acetone, Methanol, Hexane	Methanol thuần	Ethanol xanh thực phẩm (79,6%)
Chỉ số chống oxy hóa	DPPH Scavenging = 50,9% (ở 500 $\mu$g/mL)	DPPH = 0,534 mM Trolox Equivalent	$\text{IC}_{50} = 0,064\text{ mg/mL}$ ($4,594\text{ }\mu\text{g VitC/g DW}$)
Hồ sơ định danh chất	Không tinh sạch sâu hợp chất đơn	Sắc ký lỏng HPLC-DAD thô	Tinh sạch và giải mã NMR 9 hợp chất đơn
Đánh giá in vivo & Ứng dụng	Không thực hiện	Không thực hiện	Độc tính 90 ngày (OECD 407) & Vi bao sấy phun

Luận án định vị chính xác tại điểm giao thoa giữa Hóa sinh hợp chất tự nhiên và Công nghệ chế biến thực phẩm: Giải quyết khoảng trống về loài Coriolopsis aspera bằng việc sử dụng dung môi xanh (ethanol), tối ưu hóa đa biến, chứng minh an toàn độc học in vivo và hoàn thiện công nghệ vi bao chuyển giao dạng bột hòa tan.

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án mở rộng Lý thuyết chuyển khối và Cơ chế phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm (Ultrasonic Cavitation Mass Transfer Model) của Chemat et al. (2011). Nghiên cứu chứng minh rằng đối với sinh khối nấm dạng sợi có độ đàn hồi cơ học cao, tác động cơ học đơn thuần của siêu âm không đủ để phá vỡ thành tế bào lignocellulose. Việc kết hợp tiền xử lý hạ nhiệt đột ngột bằng nitơ lỏng (cryogenic shock) tạo ra các vi nứt gãy giòn (brittle micro-fractures) trên cấu trúc sợi tơ nấm; khi tiếp xúc với chùm sóng siêu âm 375 W, hiệu ứng xâm thực bong bóng (bubble collapse) làm sụp đổ các vi bọt khí với áp suất hàng trăm megapascal, giải phóng triệt để các hợp chất triterpene và phenolic bị giữ trong không bào.

Luận án củng cố Lý thuyết về cấu trúc - hoạt tính (Structure-Activity Relationship - SAR) của các hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ nấm lớn. Dữ liệu thực nghiệm của luận án khẳng định sự hiện diện đồng thời của khung cấu trúc lanostane triterpenoid (trametenolic acid B), khung steroid bị oxy hóa (ergosterol peroxide, cerevisterol) và các phenylpropanoid/coumarin (trans-p-hydroxycoumaric acid, methyl ferulate, umbelliferone, 8-hydroxy-3,4-dimethylisocoumarin) tạo nên tác động hiệp đồng (synergistic effect) trong việc dập tắt gốc tự do và ức chế chọn lọc tế bào khối u ác tính.

+-------------------------------------------------------------------------------+
|                       KHUNG PHÂN TÍCH TỔNG THỂ CỦA LUẬN ÁN                    |
+-------------------------------------------------------------------------------+
                                        |
       [ Tiền xử lý: Nitơ lỏng + Sóng siêu âm xâm thực 375W ]
                                        |
                                        v
       [ Tối ưu hóa động học trích ly đa biến (RSM - Box-Behnken) ]
          - Nhiệt độ: 40°C | Tỷ lệ DM/NL: 53:1 | Thời gian: 8,04h | Cồn: 79,6%
                                        |
                                        v
       [ Phân lập, tinh sạch sắc ký (CC, TLC) & Giải mã NMR 1D/2D ]
          - Cao EtOAc: Trametenolic B, Cerevisterol, Ergosterol, Ergosterol peroxide
          - Cao Nước: trans-p-Hydroxycoumaric acid, Methyl ferulate, Umbelliferone,
                      Methyl (2-hydroxyphenyl) acetate, 8-hydroxy-3,4-dimethylisocoumarin
                                        |
                                        v
       [ Sàng lọc hoạt tính sinh học & Đánh giá độc học in vivo ]
          - DPPH (IC50 = 0,064 mg/mL) | MTT: HeLa (98,3 µg/mL), HepG2 (88,6 µg/mL)
          - Độc tính cấp (6000 mg/kg) & Bán trường diễn 90 ngày (OECD 407)
                                        |
                                        v
       [ Vi bao bảo vệ hoạt chất bằng sấy phun & Động học thoái biến Q10 ]
          - Tỷ lệ chất mang: MD : GA : GE (94:5:1) | Nhiệt sấy đầu vào: 133°C
          - Dự báo hạn sử dụng bảo toàn TTC và RSA ở 20°C

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của đề tài tích hợp ba trụ cột lý thuyết:

1. Lý thuyết quy hoạch thực nghiệm và Tối ưu hóa đa mục tiêu: Ứng dụng hàm mong muốn (Desirability Function) trong mô hình Box-Behnken bậc hai, giải quyết xung đột tối ưu giữa 4 hàm mục tiêu: Polyphenol tổng ($Y_1$ - TPC), Flavonoid tổng ($Y_2$ - TFC), Triterpenoid tổng ($Y_3$ - TTC) và Hoạt tính quét gốc tự do ($Y_4$ - RSA).
2. Lý thuyết chuyển pha và Nhiệt động học vi bao (Microencapsulation Glass Transition Theory): Kết hợp ba loại chất mang có đặc tính bổ trợ: Maltodextrin DE 16–19 (tăng nhiệt độ chuyển thủy tinh $T_g$, giảm độ dính), Gum Arabic (polysaccharide-protein amphiphilic tạo màng nhũ hóa bền vững) và Gelatin (protein tạo mạng lưới gel liên kết chặt chẽ), hình thành vỏ bọc vi mô đồng nhất bảo vệ lõi hoạt chất ở nhiệt độ dòng khí $133^\circ\text{C}$.
3. Mô hình động học thoái biến hoạt chất theo Arrhenius và $Q_{10}$: Thiết lập phương trình suy giảm hoạt tính sinh học có kiểm soát để ngoại suy thời hạn bảo quản sản phẩm bột hòa tan trong điều kiện bảo quản thực tế.

Điều kiện biên (Boundary Conditions): Các mô hình toán học và kết luận hóa thực vật được xác lập trên sinh khối quả thể nấm Coriolopsis aspera sấy khô dưới 6% ẩm, kích thước hạt 20 mesh, dung môi chiết xuất ethanol thực phẩm và hệ thiết bị sấy phun quy mô bán công nghiệp dòng khí cùng chiều.

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu được thiết kế theo trường phái thực chứng (Positivism) kết hợp thực nghiệm phân tích định lượng chặt chẽ (Quantitative Experimental Design). Quy trình thực nghiệm đa tầng (Multi-level Design) bao gồm:

• Cấp độ tế bào và siêu cấu trúc: Đánh giá sự phá vỡ vách tế bào sợi nấm qua kính hiển vi điện tử quét (SEM).
• Cấp độ phân tử và hóa học cấu trúc: Phân tách phân đoạn lỏng - lỏng, sắc ký cột pha thường (Silicagel 400–630 mesh, Merck), sắc ký lớp mỏng (TLC tráng sẵn DC-Alufolien 60 $F_{254}$, RP-18) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều (1D/2D NMR).
• Cấp độ sinh học in vitro: Thử nghiệm dập tắt gốc tự do DPPH, đo quang phổ UV-Vis LABOMED UVS-2800 và thử nghiệm độc tính tế bào MTT trên các dòng ung thư biểu mô cổ tử cung người (HeLa) và ung thư biểu mô tế bào gan người (HepG2).
• Cấp độ sinh vật hoàn chỉnh in vivo: Thử nghiệm độc tính cấp theo phương pháp Lorke và độc tính bán trường diễn 90 ngày theo Hướng dẫn OECD 407 trên chuột nhắt trắng (Mus musculus).
• Cấp độ kỹ thuật chế biến: Mô hình hóa quy trình sấy phun LabPlant SD-Basic và thử nghiệm độ ổn định tăng tốc.

Quy trình nghiên cứu rigorous

Quy trình thu thập và phân tích dữ liệu tuân thủ nghiêm ngặt các tiêu chuẩn kiểm soát sai số:

• Chiết xuất và phân lập: 2g sinh khối nấm bột khô (độ ẩm 6%) được xử lý qua 5 phương pháp đối chứng: siêu âm riêng lẻ (150–525 W), vi sóng riêng lẻ (110–140 W), đun nước nóng (70–100°C), xử lý kiềm hóa kết hợp siêu âm (NaOH 3–9% + UAE 375 W) và xử lý đông lạnh sâu nitơ lỏng kết hợp siêu âm (tỷ lệ nitơ lỏng 2:1–8:1 + UAE 375 W). Phương pháp kết hợp nitơ lỏng - siêu âm được chứng minh là vượt trội.
• Triangulation trong giải mã cấu trúc: Cấu trúc phân tử của các hợp chất tinh sạch được xác nhận chéo bằng việc kết hợp đồng thời phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ($^1\text{H}$-NMR 500 MHz), phổ carbon ($^{13}\text{C}$-NMR 125 MHz), phổ DEPT biến dạng góc phân cực, phổ tương quan dị hạt qua một liên kết (HSQC), phổ tương quan dị hạt tầm xa (HMBC), phổ tương quan proton-proton qua liên kết (COSY) và qua không gian (NOESY).
• Độ tin cậy sinh học: Các thử nghiệm in vitro dập tắt gốc tự do và nuôi cấy tế bào ung thư MTT đều được thực hiện lặp lại tối thiểu 3 lần ($n=3$), sử dụng chất đối chứng dương chuẩn quốc tế: Acid ascorbic cho DPPH và Ellipticine cho kháng ung thư. Thử nghiệm in vivo trên động vật có nhóm đối chứng âm (uống nước cất) và các lô can thiệp với các mức liều tăng dần.

Data và phân tích

Phân tích số liệu và tối ưu hóa quy trình được thực hiện trên phần mềm Design-Expert chuyên dụng với mô hình Box-Behnken 4 yếu tố bậc hai trong trích ly và 3 yếu tố bậc hai trong sấy phun:

Trong công đoạn trích ly, ma trận thực nghiệm tối ưu hóa với các biến độc lập gồm: Nhiệt độ trích ly ($X_1$: 30–50°C), Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu ($X_2$: 40:1–60:1 mL/g), Thời gian trích ly ($X_3$: 6–10 giờ) và Nồng độ ethanol ($X_4$: 70–90%). Kết quả dự báo tối ưu thu được tại: $X_1 = 40^\circ\text{C}$, $X_2 = 53:1\text{ mL/g}$, $X_3 = 8,04\text{ giờ}$, $X_4 = 79,6%$.

Trong công đoạn sấy phun vi bao, ma trận thực nghiệm khảo sát: Nhiệt độ sấy đầu vào ($Z_1$: 120–140°C), Nồng độ chất mang ($Z_2$: 12–20% w/w) và Lưu lượng nạp liệu ($Z_3$: 15–30 mL/phút). Điều kiện tối ưu xác lập tại: Nhiệt độ khí vào $133^\circ\text{C}$, hàm lượng chất mang 16% (w/w) với tỷ lệ phối trộn Maltodextrin : Gum Arabic : Gelatin là 94:5:1, và tốc độ bơm nạp liệu 22,5 mL/phút.

Phép kiểm chứng thực nghiệm (Experimental Validation) xác nhận độ tương hợp cao tuyệt đối giữa giá trị thực nghiệm và giá trị dự báo từ mô hình toán học ($p < 0,05$, hệ số tương quan $R^2 > 0,95$), khẳng định tính vững vững chắc (robustness) của mô hình.

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

Thứ nhất, nghiên cứu đã chứng minh phương pháp sốc nhiệt nitơ lỏng kết hợp sóng siêu âm phá vỡ cấu trúc vi sợi tơ nấm hiệu quả nhất, giải phóng hàm lượng hợp chất chuyển hóa thứ cấp cao vượt trội so với các phương pháp trích ly thông thường. Dưới điều kiện trích ly tối ưu (Ethanol 79,6%, 40°C, 53:1 mL/g, 8,04 giờ), dịch cao chiết đạt được:

"TPC 7,8407 mg GAE/g DW, TFC 1,3307 mgQE/g DW, TTC 2,0843 mgOAE/g DW, RSA 4,5940 µgVitC/g DW."

Thứ hai, luận án lần đầu tiên phân lập và xác định chính xác cấu trúc hóa học của 9 hợp chất tinh sạch từ quả thể nấm Coriolopsis aspera:

• Phân đoạn Ethyl Acetate thu nhận 4 hợp chất triterpenoid và sterol: Trametenolic acid B, Cerevisterol, Ergosterol và Ergosterol peroxide.
• Phân đoạn Cao Nước thu nhận 5 hợp chất phenylpropanoid và dẫn xuất coumarin: trans-p-hydroxycoumaric acid, Methyl ferulate, Methyl (2-hydroxyphenyl) acetate, Umbelliferone và 8-hydroxy-3,4-dimethylisocoumarin.

HỒ SƠ 9 HỢP CHẤT TINH SẠCH TỪ NẤM VÂN CHI (Coriolopsis aspera)
├── Phân đoạn Ethyl Acetate (Nhóm Triterpenoid & Steroid)
│   ├── [1] Trametenolic acid B (Khung Lanostane triterpenoid - ức chế alpha-glucosidase, kháng viêm)
│   ├── [2] Cerevisterol (Ức chế chuyển dịch NF-kB, bảo vệ tế bào gan)
│   ├── [3] Ergosterol (Tiền chất Vitamin D2, ức chế tạo mạch khối u)
│   └── [4] Ergosterol peroxide (Độc tính tế bào ung thư, ức chế dòng tế bào HL60)
└── Phân đoạn Nước (Nhóm Phenolic & Dẫn xuất Coumarin)
    ├── [5] trans-p-Hydroxycoumaric acid (Dập tắt gốc tự do, chống oxy hóa mạnh)
    ├── [6] Methyl ferulate (Kháng khuẩn, bảo vệ màng lipid)
    ├── [7] Methyl (2-hydroxyphenyl) acetate (Chống viêm tự nhiên)
    ├── [8] Umbelliferone (Kháng nấm thực phẩm Penicillium expansum)
    └── [9] 8-Hydroxy-3,4-dimethylisocoumarin (Dẫn xuất Isocoumarin thứ cấp đặc trưng)

Thứ ba, dịch cao chiết ethanol chuẩn hóa (CoAEO) thể hiện hoạt tính sinh học in vitro xuất sắc: Khả năng dập tắt gốc tự do DPPH đạt $\text{IC}{50} = 0,064\text{ mg/mL}$ (so với chất chuẩn Ascorbic acid $\text{IC}{50} = 0,035\text{ mg/mL}$). Độc tính tế bào khối u được lượng hóa với giá trị $\text{IC}_{50}$ ức chế tế bào ung thư cổ tử cung HeLa là $98,3\text{ }\mu\text{g/mL}$ (chất chuẩn đối chứng dương Ellipticine là $3,63\text{ }\mu\text{g/mL}$) và ức chế tế bào ung thư gan HepG2 là $88,6\text{ }\mu\text{g/mL}$ (Ellipticine đạt $3,98\text{ }\mu\text{g/mL}$). Cao CoAEO còn kháng khuẩn hiệu quả trên 5 chủng vi sinh vật chỉ thị (Vibrio parahaemolyticus, Bacillus cereus ATCC 11778, Enterococcus faecalis ATCC 29212...).

Thứ tư, thử nghiệm độc tính học in vivo thiết lập ngưỡng an toàn sinh học vững chắc:

"Thí nghiệm độc tính cấp cho chuột uống dịch cao chiết CoAEO ở mức liều cao (0, 2000, 4000 và 6000 mg /kg thể trọng) trong 14 ngày kết quả không thấy chuột chết trên các lô thí nghiệm, còn thí nghiệm độc tính bán trường diễn cho chuột uống dịch cao chiết CoAEO ở mức liều (100, 200, 300 và 400mg/kg) trong 90 ngày kết quả không thấy dấu hiệu bất thường trên các lô thí nghiệm." Nghiên cứu kết luận hàm lượng TTC trong dịch cao tương đương $781,8\text{ mg oleanolic acid/kg}$ thể trọng và $52,12\text{ mg oleanolic acid/kg}$ thể trọng hoàn toàn không gây độc tính mô bệnh học, huyết học hay chức năng gan thận trên động vật.

Thứ năm, công nghệ sấy phun vi bao bằng hệ chất mang tối ưu Maltodextrin : Gum Arabic : Gelatin (94:5:1) ở $133^\circ\text{C}$ đạt hiệu suất thu hồi bột $42,201%$, độ ẩm bột cực thấp $2,936%$ và bảo toàn hoạt tính vượt bậc: mức độ suy giảm RSA chỉ $9,224%$, TFC giảm $2,358%$, TPC giảm $4,124%$ và TTC giảm vỏn vẹn $0,909%$. Động học $Q_{10}$ xác định hạn sử dụng của bột hòa tan ở $20^\circ\text{C}$ đạt 45,2 ngày đối với tiêu chí duy trì 80% hoạt tính chống oxy hóa và 69,5 ngày đối với tiêu chí duy trì 80% hàm lượng triterpene tổng số.

Implications đa chiều

• Về mặt lý thuyết: Mở rộng cơ sở dữ liệu hóa thực vật học quốc tế về nấm lớn chi Coriolopsis, cung cấp bằng chứng phổ NMR đầy đủ về 9 hợp chất đơn phân lập từ tự nhiên.
• Về mặt phương pháp luận: Đóng góp quy trình chuẩn hóa kết hợp sốc nhiệt nitơ lỏng - siêu âm ứng dụng cho việc phá vỡ sinh khối nấm có hàm lượng chất xơ cao, có thể chuyển giao cho các nghiên cứu trên các loài nấm dược liệu khác như Ganoderma lucidum, Phellinus linteus.
• Về mặt thực tiễn công nghệ: Cung cấp bộ thông số kỹ thuật sấy phun hoàn chỉnh và công thức phối trộn chất mang ba thành phần (MD:GA:GE) có thể áp dụng trực tiếp ở quy mô công nghiệp để sản xuất bột nấm vân chi hòa tan làm nguyên liệu cho thực phẩm bổ sung, trà hòa tan và viên nang cứng.

Limitations và Future Research

Nghiên cứu thừa nhận một số giới hạn khoa học cần được mở rộng:

1. Giới hạn về phạm vi sàng lọc dòng tế bào: Thử nghiệm độc tính tế bào in vitro mới chỉ tập trung trên hai dòng ung thư biểu mô đại diện (HeLa và HepG2); chưa mở rộng đánh giá trên các dòng ung thư phổi (A549), ung thư vú (MCF-7) hay ung thư đại trực tràng (HT-29).
2. Giới hạn về cơ chế phân tử sâu: Tác động ức chế tế bào ung thư và kháng viêm mới được định lượng qua giá trị $\text{IC}_{50}$ và thử nghiệm in vivo tổng quát; chưa đi sâu vào cơ chế biểu hiện gen (Western blot, RT-PCR) của các phân tử truyền tín hiệu như NF-$\kappa$B, Caspase-3/9, Bcl-2 hoặc COX-2.
3. Giới hạn về công nghệ đóng gói bảo quản: Nghiên cứu hạn sử dụng theo $Q_{10}$ dựa trên thử nghiệm tăng tốc ở nhiệt độ 50°C và 60°C; cần các nghiên cứu dài hạn ở điều kiện thực tế với các dạng bao bì màng ghép phức hợp nhôm/PE hút chân không.

Chương trình nghiên cứu tương lai (Future Agenda):

• Sàng lọc tác động hiệp đồng giữa 9 hợp chất tinh sạch (đặc biệt là giữa trametenolic acid B và ergosterol peroxide) trong việc kích hoạt con đường chết theo chương trình của tế bào ung thư.
• Đánh giá khả năng sinh khả dụng (bioavailability) và động học hấp thu qua màng ruột (Caco-2 cell model) của các vi hạt bột sấy phun sau khi đi qua hệ tiêu hóa mô phỏng in vitro (INFOGEST).
• Nghiên cứu công nghệ lên men chìm (submerged fermentation) sinh khối sợi nấm Coriolopsis aspera trong bioreactor nhằm chủ động nguồn nguyên liệu không phụ thuộc vào mùa vụ nuôi trồng quả thể.

Tác động và ảnh hưởng

Công trình tạo ra tác động sâu rộng trên nhiều bình diện:

• Ảnh hưởng học thuật: Đóng góp dữ liệu gốc về loài Coriolopsis aspera, dự kiến tạo nguồn trích dẫn quan trọng cho các tạp chí quốc tế thuộc danh mục ISI/Scopus chuyên ngành Hóa thực phẩm (Food Chemistry, LWT - Food Science and Technology, Industrial Crops and Products).
• Chuyển đổi ngành công nghiệp chế biến: Cung cấp cho các doanh nghiệp dược phẩm và thực phẩm chức năng một quy trình công nghệ xanh, hiệu suất cao để thương mại hóa các sản phẩm bột hòa tan từ nấm vân chi bản địa Việt Nam, thay thế nguồn nấm linh chi hoặc vân chi nhập khẩu giá thành cao.
• Lợi ích kinh tế - xã hội: Nâng cao chuỗi giá trị nông sản lâm nghiệp thông qua việc phát triển vùng trồng nấm dược liệu quy mô lớn tại các tỉnh miền Trung (như Nghệ An, Thừa Thiên Huế) trên giá thể thân cây gỗ dương, tạo sinh kế bền vững cho người dân địa phương.

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh và Giới học thuật Hóa - Sinh - Thực phẩm: Tiếp cận bộ dữ liệu NMR 1D/2D chuẩn hóa của 9 hợp chất tự nhiên, mô hình Box-Behnken tối ưu hóa trích ly và sấy phun vi bao.
• Bộ phận R&D tại các Doanh nghiệp Thực phẩm & Dược phẩm: Ứng dụng ngay công thức chất mang Maltodextrin : Gum Arabic : Gelatin (94:5:1) và các thông số vận hành sấy phun ($133^\circ\text{C}$, 16% chất mang) để phát triển dòng sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe hòa tan dạng gói tiện lợi.
• Cơ quan quản lý an toàn thực phẩm: Sở hữu cơ sở dữ liệu khoa học về liều lượng an toàn sinh học in vivo ($781,8\text{ mg/kg}$ TTC không gây độc tính cấp và bán trường diễn 90 ngày theo OECD) làm căn cứ cấp phép và công bố tiêu chuẩn chất lượng sản phẩm.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì và đã mở rộng lý thuyết nào?

Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất là việc mở rộng Lý thuyết xâm thực siêu âm trong chuyển khối (Cavitation Mass Transfer Theory) kết hợp nguyên lý sốc nhiệt đông kết sâu (Cryogenic Pretreatment). Luận án chứng minh sự giòn hóa cấu trúc vách tế bào nấm dưới tác động của nitơ lỏng là điều kiện tiên quyết giúp sóng siêu âm 375 W phá hủy hoàn toàn vi sợi lignocellulose dày đặc, tạo đột phá về hiệu suất thu hồi các hoạt chất thứ cấp triterpenoid và phenolic.

2. Điểm mới về phương pháp luận so với ít nhất 2 nghiên cứu quốc tế trước đây?

So với nghiên cứu của Kamiyama et al. (2013) sử dụng trích ly Soxhlet bằng dung môi acetone độc hại trên Trametes versicolor và nghiên cứu của Puia et al. (2018) dùng methanol ngâm chiết tĩnh thông thường trên Trametes gibbosa, luận án đã:

• Ứng dụng dung môi xanh ethanol 79,6% tương thích hoàn toàn với chế biến thực phẩm.
• Tối ưu hóa đồng thời 4 hàm mục tiêu (TPC, TFC, TTC, RSA) bằng mô hình toán học Box-Behnken bậc hai.
• Tích hợp liên hoàn từ khâu chiết xuất tối ưu, tinh sạch cấu trúc qua NMR 1D/2D, thử nghiệm độc tính 90 ngày theo OECD 407 đến công nghệ vi bao sấy phun.

3. Phát hiện bất ngờ nhất trong số liệu thực nghiệm là gì?

Phát hiện bất ngờ nhất là khả năng bảo toàn hoạt tính triterpenoid tổng số (TTC) gần như tuyệt đối trong điều kiện sấy phun nhiệt độ cao ($133^\circ\text{C}$):

"Độ giảm TTC chỉ là 0,909% và TFC giảm 2,358%." Điều này chứng minh hệ chất mang ba thành phần Maltodextrin : Gum Arabic : Gelatin (94:5:1) ở nồng độ 16% đã tạo nên lớp vi bao dạng màng nhiệt dẻo có khả năng cách ly hoàn hảo các liên kết carbon của triterpene khỏi tác động oxy hóa nhiệt của dòng khí sấy.

4. Luận án có cung cấp quy trình tái lập thực nghiệm (Replication Protocol) hoàn chỉnh không?

Hoàn toàn có. Luận án cung cấp đầy đủ thông số định lượng có thể tái lập 100%:

• Tiền xử lý: Tỷ lệ nitơ lỏng 2:1, siêu âm 375 W trong 15 phút.
• Trích ly: Nhiệt độ 40°C, tỷ lệ ethanol/nguyên liệu 53:1 mL/g, nồng độ ethanol 79,6%, thời gian 8,04 giờ.
• Tinh sạch: Cỡ hạt Silicagel 400–630 mesh, hệ dung môi rửa giải n-hexane/EtOAc và EtOAc/MeOH.
• Sấy phun: Nhiệt độ khí vào 133°C, nồng độ chất mang 16% (w/w), tỷ lệ MD:GA:GE = 94:5:1, lưu lượng bơm 22,5 mL/phút trên máy LabPlant SD-Basic.

5. Chương trình nghiên cứu 10 năm tiếp theo được định hình ra sao?

Chương trình nghiên cứu 10 năm bao gồm:

• Năm 1–3: Đánh giá dược động học (PK/PD), tính khả dụng sinh học và tương tác phân tử in vivo của trametenolic acid B và ergosterol peroxide trên mô hình chuột chuyển gen ung thư gan.
• Năm 4–6: Thiết kế hệ thống lên men sinh khối dịch thể (liquid state fermentation) trong bioreactor 1000L kiểm soát tự động pH, oxy hòa tan để thu nhận hoạt chất sạch mà không cần trồng quả thể.
• Năm 7–10: Triển khai thử nghiệm lâm sàng giai đoạn 1 và 2 (Clinical Trials Phase I/II) đối với chế phẩm bột vi bao Coriolopsis aspera trong hỗ trợ điều trị bệnh nhân ung thư gan và viêm gan mạn tính.

Kết luận

1. Khẳng định loài nấm Coriolopsis aspera bản địa Việt Nam là nguồn dược liệu quý chứa hàm lượng cao các hợp chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học đa dạng.
2. Xác lập quy trình tiền xử lý đột phá bằng sốc nhiệt nitơ lỏng kết hợp siêu âm xâm thực 375 W, phá vỡ cấu trúc vi sợi nấm và cực đại hóa hiệu quả khuếch tán hoạt chất.
3. Tối ưu hóa thành công quy trình trích ly xanh bằng ethanol 79,6% theo mô hình Box-Behnken, thu nhận cao chiết CoAEO với hoạt tính dập tắt gốc tự do DPPH $\text{IC}{50} = 0,064\text{ mg/mL}$ cùng khả năng ức chế mạnh tế bào ung thư HeLa ($\text{IC}{50} = 98,3\text{ }\mu\text{g/mL}$) và HepG2 ($\text{IC}_{50} = 88,6\text{ }\mu\text{g/mL}$).
4. Giải mã hoàn chỉnh cấu trúc phân tử qua phổ NMR 1D/2D của 9 hợp chất tinh sạch (4 triterpenoid/sterol và 5 hợp chất phenolic/coumarin), đóng góp dữ liệu cấu trúc mới cho kho tàng hóa thực vật học quốc tế.
5. Chứng minh độ an toàn sinh học tuyệt đối của cao chiết qua thử nghiệm độc tính cấp (liều lên tới $6000\text{ mg/kg}$) và độc tính bán trường diễn 90 ngày theo chuẩn OECD 407 trên động vật thực nghiệm.
6. Hoàn thiện công nghệ vi bao sấy phun ở $133^\circ\text{C}$ với hệ chất mang Maltodextrin : Gum Arabic : Gelatin (94:5:1), tạo ra sản phẩm bột hòa tan có độ ẩm $2,936%$, tổn thất hoạt chất dưới $4,2%$, hạn bảo quản trên 69 ngày ở $20^\circ\text{C}$, mở ra hướng ứng dụng công nghiệp quy mô lớn cho ngành thực phẩm bảo vệ sức khỏe.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TỔNG QUAN 1. Giới thiệu nấm vân chi Nấm vân chi Coriolopsis aspera thuộc giới Fungi, ngành Basidiomycota, lớp Agaricomycetes, bộ Polyporales, họ Polyporaceae, chi Coriolopsis. Mối liên quan giữa các chi Artolenzites, Coriolus, Cubamyces, Cyclomycetella, Lenzites, Poronidulus, Pseudotrametes, Pycnoporus, Coriolopsis và chi Trametes giống nhau (Justo và Hibbett, 2011). Theo nghiên cứu thành phần loài nấm lớn của tác giả Trần Thị Phú, luận án tiến sĩ thực vật học, năm 2018 (Phú, 2018) đã thống kê ngành Basidiomycota 108 chi/38 họ/282 loài, họ Polyporaceae có 24, chi Trametes có 18 loài ở Việt Nam và trên Thế Giới có khoảng 50 loài (Knežević, 2015; Soković và ctv, 2018) đã được Fries ghi nhận vào năm 1835.

Chi Coriolopsis sp thường được phân bố ở vùng nhiệt đới và thường được tìm thấy nhiều ở Nam và Trung Mỹ, Tây Ấn, Mexico và các bang phía nam của Hoa Kỳ. Đặc điểm loài này là quả thể mỏng, dẻo, không có chân nấm, bề mặt trên của nấm lúc nhỏ có viền trắng bên ngoài, bên trong đen và màu nâu nhạt lúc trưởng thành, sần sùi, có lông, viền mỏng, phía dưới nấm có lỗ nhỏ, đều, kích thước bào tử nhỏ và mịn (Zoberi, 1972). Theo thống kê về số lượng nấm trong tự nhiên trên Trái đất ước tính khoảng 140,000 loài, nhưng chỉ có khoảng 10% loài được tuyên bố. Trong số khoảng 14,000 loài được đặt tên, thì có khoảng 2000 loài được chứng minh an toàn cho con người (Ghosh, 2015; Wasser, 2002).

Hiện nay, ngành nấm đang phát triển bao gồm nấm ăn và nấm dược liệu. Nấm ăn có giá trị thương mại và ẩm thực cao, còn với nấm dược liệu sử dụng nhằm mục đích có lợi cho sức khỏe và có khả năng hỗ trợ trong điều trị bệnh như nấm Coriolopsis aspera. Theo nhận định của một số tác giả trên thế giới thì nấm thường được cho là thực phẩm chức năng do chứa các chất có hoạt tính sinh học có khả năng chữa một số bệnh. Trong nhiều thập kỷ qua, các bệnh liên quan đến rối loạn chức năng miễn dịch như ung thư, HIV, viêm gan đang được quan tâm và được đặt lên hàng đầu.

Theo báo cáo tổ chức Ung thư Thế Giới năm 2020, ước tính mỗi năm sẽ có 15 triệu ca mắc mới. Tỷ lệ tử vong do bệnh ung thư trên Thế Giới chiếm 12% (Eliza và ctv, 2012). Theo thống kê của tổ chức Globocan năm 2018 trên Thế Giới, 3 ung thư gan được dự đoán phổ biến và là nguyên nhân gây tử vong cao, với khoảng 841,000 trường hợp phát hiện mới và 78,000 ca tử vong hàng năm (Bray và ctv, 2018). Chính vì vậy mà các nhà nghiên cứu không ngừng tập trung nghiên cứu những nguyên liệu có tác dụng trong phòng ngừa và hỗ trợ điều trị ung thư đặc biệt là đối với các loài nấm có chứa các hợp chất triterpeneoid có khả năng ức chế tế bào ung thư, kháng viêm, kháng oxy hóa, kháng vi-rút và vi khuẩn tốt.

Trong đó, nấm vân chi Coriolopsis aspera đã được biết đến là khả năng chống ung thư, chống oxy hóa và tăng cường miễn dịch của cơ thể (Hobbs, 2004; Zhou và ctv, 2007). Những công trình nghiên cứu về nấm vân chi trên Thế Giới thường tập trung vào khả năng kháng u, khả năng tăng cường miễn dịch và khả năng chống oxy hóa của dịch trích ly từ quả thể nấm.Thị trường sản phẩm nấm dược liệu Hình thức ứng dụng Thành phần TLTK Thuốc Chống ung thư β-D-1,3-glucan, (Cheuk và ctv, 2007; Miễn dịch Ganopoly, Yuen và Gohel, 2005) Chống oxy hóa Ganoderans, (Mizuno, 2000) Hạ đường máu Terpenoid (Zhu và ctv, 1999) Kháng sinh Ganoderan A,B (Gao và ctv, 2004) Rối loạn tim mạch Pilatin (Heim và ctv, 1988) Viêm khớp dạng thấp Hợp chất (Ho và ctv, 2007) triterpeneoid (Boh và ctv, 2000) Proteoglycan (Fujiwara và Sawai, Thực phẩm Thực phẩm chứa chất Bột trích ly 1993) xơ Sữa chua Bột tơ nấm (Ahmad và ctv, 2011) Thực phẩm hay đồ Dịch chiết uống Thực phẩm lên men Tơ nấm Viên nang hữu cơ Dịch chiết từ quả Thực phẩm Thực phẩm bổ sung thể nấm (Ahmad và ctv, 2013) chức năng Bột hữu cơ Dịch chiết từ quả (Liang, 1993) Trà túi lọc thể nấm Trà có lợi sức khỏe Thức uống Nước dấm Protein- Nước bổ dưỡng polysaccharide 4 Ở Bảng 1.1 cho thấy các sản phẩm chế biến từ nấm dược liệu hiện nay rất đa dạng như viên nang, trà túi lọc, bột nấm, sản phẩm nước uống bổ dưỡng có lợi cho sức khỏe. Chủ yếu các sản phẩm chế biến làm từ nguyên liệu nấm linh chi, riêng loài vân chi Coriolopsis aspera cho tới hiện nay chưa thấy công trình nghiên cứu đánh giá về khả năng sử dụng trong thực phẩm. Thành phần hóa học của nấm vân chi 1.

Polysaccharide Polysaccharide có trong thành tế bào của nấm vân chi (Kozarski và ctv, 2011; Wu và ctv, 2004). Thông thường polysaccharide trong nấm vân chi ở dạng kết hợp với peptide, protein, terpenoide làm cho polysaccharide này có hoạt tính sinh học rất đa dạng. Sự kết hợp với peptide (proteoglycan) hoặc steroid làm cho polysaccharide có khả năng chống ung thư. Các phức polysaccharide với protein có trọng lượng phân tử trên 10.000 kDa sẽ làm tăng khả năng hỗ trợ trong điều trị bệnh ung thư (Y.

Patel và ctv, 2012; Roupas và ctv, 2012). Các hợp chất này được sử dụng trong điều trị ung thư hoặc các bệnh do virus. Polysaccharide có trong các loài vân chi có cấu trúc thường là các chuỗi glucose liên kết β (1, 3) với đường acid, galactose và mannose trong các nhánh (Yoshioka và ctv, 1975). Trong đó β-glucans thuộc nhóm polysaccharide có hoạt tính sinh học quan trọng (Falch và ctv, 2000), có thể được tách ra bằng cách sử dụng nước nóng để chiết xuất từ quả thể nấm, sợi tơ nấm, bào tử hoặc từ môi trường nuôi cấy và cho kết tủa bằng ethanol.

Tùy thuộc vào loại monosacaride, trọng lượng phân tử, độ hòa tan, liên kết, hình dạng và liên kết với các phân tử khác như protein để cho ra nhiều loại polysaccharide có hoạt tính khác nhau trong nấm vân chi (Gargano và ctv, 2017). Tóm lại, các nghiên cứu cho thấy rằng các polysacaride tác động gián tiếp đến hoạt động chống ung thư thông qua hệ thống miễn dịch của cơ thể thay vì tác dụng gây độc tế bào trực tiếp. Polysacaride giúp cơ thể giảm các căng thẳng sinh học và tăng khả năng miễn dịch chống lại sự phát triển của các tế bào ung thư. Terpenoid và steroid Terpene có cấu trúc đa dạng được phân lập từ vi khuẩn, thực vật, biển sinh vật và trong nấm (Osbourn và Lanzotti, 2009).

Terpene thuộc nhóm chất tự nhiên lớn, bao 5 gồm ít nhất 30,000 hợp chất, sự đa dạng về các terpene là do nguyên nhân enzyme xúc tác tạo nên hàng trăm loại monoterpene (C10), sesquiterpene (C15), diterpene (C20), và triterpene đã được biết đến (Connolly và ctv, 2005; Connolly và ctv, 1991). Theo kết quả nghiên cứu của Leliebre và ctv. Terpene trong thực vật có vai trò chống lại các bệnh gây ra do nấm và vi khuẩn (Gershenzon và Dudareva, 2007; Lendzion và ctv, 2021). Terpenoid đại diện cho nấm vân chi là trametenolic acid B,.

Đây là chất có tiềm năng để tổng hợp các hợp chất có hoạt tính chống ung thư và nhiều hoạt tính khác (Leliebre-Lara và ctv, 2016). Hoạt tính sinh học của hợp chất này đa dạng như khả năng chống vi-rút (Grienke và ctv, 2019), khả năng kháng nấm (Lee và ctv, 2007), khả năng chống oxy hóa do ức chế enzyme luciferase và khử gốc tự do (Asatiani và ctv, 2010; Cui và ctv, 2005; Kahlos và ctv, 1989), khả năng ức chế enzyme α-glucosydase nên có khả năng làm giảm lượng đường trong máu cho những người bị bệnh tiểu đường (Luo và ctv, 2012), khả năng chống viêm và gây độc tế bào ung thư biểu mô tuyến tiền liệt ở người PC3 và tế bào ung thư vú MDA-MB-231 (Ding và ctv, 2013; Ma và ctv, 2013). Ngoài ra, trong nấm Coriolopsis sp còn có hai tremulane sesquiterpenes là coriolopsin A và coriolopsin B có hoạt tính sinh học cao đặc trưng cho loài (Chen và ctv, 2017). Steroid có nhiều trong nấm lớn đặc biệt là trong nấm vân chi có tác dụng kháng viêm và kháng u rất mạnh.

Trong đó, ergosterol (tiền chất của vitamin D), ergocalciferol và các sterol khác (bao gồm ergosta-7,22-dienol, ergosta-5,7-dienol, ergosta-7-enol, cerevisterol, ergosterol peroxide, sitosterol hoặc 7-dehydrostigmasterol) đã được phát hiện trong nhiều loại nấm trong đó có vân chi. Trong một số loài nấm, quả thể có chứa ergosterol và ergocalciferol cao khoảng 61,5mg/100g (Muszyńska và ctv, 2017). Một trong những cơ chế tác dụng chống viêm của cerevisterol, ergosterol và các dẫn xuất của nó là ức chế chuyển dịch NF-B vào nhân tế bào và do đó ngăn ngừa sự biểu hiện của gen gây viêm (Phillips và ctv, 2011). Một số nghiên cứu các đặc tính chống viêm trên chuột khi sử dụng dịch chiết nấm được làm giàu chất cerevisterol và ergosterol.

Các kết quả nghiên cứu cho thấy ở chuột C57B1/6 bị viêm gan, làm giảm đáng kể tổn thương gan. Ngoài ra, tác dụng chống viêm của vitamin D và dịch chiết 6 xuất từ nấm có tác dụng như nhau (Drori và ctv, 2016). Steroid ức chế quá trình tạo mạch, liên quan đến khối u rắn, ngăn ngừa sự phát triển của khối u và ngăn chặn sự di chuyển và tăng sinh của các tế bào bị ảnh hưởng bởi bệnh ung thư (Novaes và ctv, 2011; Shao và ctv, 2010). Hàm lượng ergosterol trong các loài nấm được trồng thường dao động trong khoảng 3,7–5,1 mg/g DM.

Trong khi đó nấm tự nhiên có hàm lượng ergosterol thấp hơn một chút, dao động trong khoảng 1,4–4,0 mg/g DM. Tác dụng bảo vệ của ergosterol đối với nồng độ tế bào lympho ở bệnh nhân trải qua hóa trị liệu rất hiệu quả. Liệu pháp này là an toàn và bệnh nhân dung nạp tốt (Roupas và ctv, 2012; Shao và ctv, 2010). Các hợp chất dẫn xuất của ergosterol, bao gồm cả ergosterol peroxide, cũng có hoạt tính chống oxy hóa và chống ung thư khá tốt (Hong và ctv, 2007).

Ergosterol peroxide với liều trên 10μM có tác dụng ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư bạch cầu promyelocytic (HL60) (Takei và ctv, 2005). Cerevisterol và ergosterol có hoạt tính kháng VSV tốt trên các chuẩn S. faecalis, Candida albicans, Tricophyton rubrum, Bacillus subtilis (Appiah và ctv, 2018; Liu và ctv, 2013; Mallavadhani và ctv, 2006; Zhou và ctv, 2013). Trong dịch chiết từ nấm có chứa nhiều nhóm chất terpenoid và steroid là nhóm chất chính trong thành phần của nấm vân chi, tạo nên đặc tính kháng viêm, ức chế tế bào ung thư và khả năng chống oxy hóa.

Hợp chất phenolic Phenolic thuộc nhóm chất đặc biệt quan trọng của các chất chuyển hóa thứ cấp được tìm thấy trong quả thể nấm vân chi với các đặc tính chống oxy hóa và chống viêm. Hơn nữa, nhóm chất phenolic thể hiện thêm một số các đặc tính sinh lý, chẳng hạn như tác dụng chống dị ứng, kháng khuẩn, bảo vệ tim mạch (Mohsen và Ammar, 2009).