Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ ngành Công nghệ thực phẩm (Mã số: 9.01) của nghiên cứu sinh Nguyễn Ngọc Thuần, được thực hiện tại Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh dưới sự hướng dẫn của PGS. Đàm Sao Mai và PGS. Lê Trung Thiên vào năm 2022, có tiêu đề: "Tách chiết, tinh sạch và ứng dụng hợp chất có hoạt tính sinh học từ nấm vân chi (Coriolopsis aspera)".

Xu thế nghiên cứu và sử dụng các nguồn thực phẩm tự nhiên chứa hợp chất có hoạt tính sinh học để bổ sung vào chế độ ăn nhằm nâng cao sức khỏe đang phát triển tại Việt Nam và trên thế giới. Nấm vân chi là loài nấm dược liệu chứa nhiều hợp chất có khả năng hỗ trợ điều trị bệnh và chế biến thực phẩm chức năng. Tuy nhiên, các công bố trong nước trước đây chủ yếu tập trung vào kỹ thuật nuôi trồng các loài thuộc chi Trametes, trong khi các nghiên cứu quốc tế phần lớn khảo sát loài Trametes versicolor. Loài Coriolopsis aspera (Jungh.) Teng thuộc họ Polyporaceae được ghi nhận lần đầu tại Đài Loan năm 1992 và tại Malta năm 2001; tại Việt Nam, loài này mọc tự nhiên trên thân cây dương (Casuarina equisetifolia), có ưu điểm dễ nuôi trồng, năng suất cao và nguyên liệu khô (độ ẩm khoảng 5%) có thể bảo quản khoảng một năm mà không bị biến màu. Khoảng trống nghiên cứu được tác giả xác định là chưa có công bố khoa học nào về thành phần hóa học, hoạt tính sinh học cũng như khả năng ứng dụng chế biến thực phẩm từ quả thể loài Coriolopsis aspera.

Mục tiêu chung của luận án là xác định điều kiện trích ly, tinh sạch các thành phần trong dịch chiết nấm Coriolopsis aspera để định danh và làm giàu các hợp chất có hoạt tính sinh học, từ đó nghiên cứu ứng dụng tạo sản phẩm bột hòa tan có lợi cho sức khỏe. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu cụ thể được đánh số theo văn bản gồm:

  • Mục tiêu 1: Nghiên cứu điều kiện trích ly, tinh sạch các thành phần trong dịch chiết nấm Coriolopsis aspera để xác định thành phần và làm giàu các hợp chất TPC, TFC, TTC trong dịch trích ly.
    • Nội dung 1: Khảo sát phương pháp xử lý nguyên liệu, khảo sát ảnh hưởng của dung môi trích ly và tối ưu hóa điều kiện trích ly.
    • Nội dung 2: Định tính thành phần hoạt tính sinh học và tinh sạch các hợp chất.
    • Nội dung 3: Thử hoạt tính chống oxy hóa, thử khả năng gây độc và ức chế tế bào ung thư, thử khả năng kháng vi sinh vật, thử độc tính cấp và độc tính bán trường diễn.
  • Mục tiêu 2: Ứng dụng tạo sản phẩm bột hòa tan từ dịch trích ly đã làm giàu hoạt tính sinh học theo hướng có lợi cho sức khỏe.
    • Nội dung 4: Khảo sát lựa chọn tỷ lệ hỗn hợp chất mang, tối ưu hóa điều kiện sấy phun, nghiên cứu thời gian bảo quản sản phẩm bột hòa tan và đánh giá chất lượng sản phẩm bột hòa tan.

Đối tượng nghiên cứu là quả thể nấm vân chi Coriolopsis aspera tự nhiên thu thập tại Vườn Quốc gia Pù Mát (18°46’ vĩ độ Bắc, 104°24’ độ kinh Đông, tỉnh Nghệ An), sau đó được nuôi trồng thực nghiệm tại vườn sinh học thuộc Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh. Mẫu nghiên cứu được thu hái khi quả thể đạt kích thước trung bình 5-7 cm sau thời gian nuôi trồng 50-60 ngày. Danh pháp khoa học của mẫu nấm do TS. Văn Hồng Thiện (Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh) định danh và mẫu tiêu bản được lưu trữ tại Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm, Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh. Các thí nghiệm phân tích được thực hiện tại các phòng thí nghiệm của Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm (Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh) và Viện Hóa học (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam).

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Trong Chương 1, tác giả hệ thống hóa các tài liệu liên quan đến phân loại học, thành phần hóa học, phương pháp trích ly, tinh sạch và hoạt tính sinh học của nấm vân chi:

  • Về phân loại học và nuôi trồng: Tác giả dẫn chứng mối quan hệ đồng vị trí phân loại giữa chi Coriolopsis và các chi Artolenzites, Coriolus, Lenzites, Trametes (Justo và Hibbett, 2011). Tại Việt Nam, Trần Thị Phú (2018) thống kê ngành Basidiomycota có 108 chi, 38 họ, 282 loài, trong đó họ Polyporaceae có 24 loài và chi Trametes có 18 loài; trên thế giới chi này có khoảng 50 loài được Fries ghi nhận từ năm 1835 (Knežević, 2015; Soković và ctv, 2018). Các nghiên cứu trong nước về nuôi trồng nấm vân chi gồm khảo sát môi trường dịch thể của Trang (2016), nghiên cứu giá thể trồng Trametes versicolor tại Thừa Thiên Huế của V. Minh (2017), và công nghệ nhân giống, nuôi trồng Trametes versicolor của Thùy (2014). Trên thế giới, các nghiên cứu tập trung vào Trametes versicolor để tách chiết hợp chất hoạt tính và enzyme công nghiệp (Asgher và ctv, 2009; Ferreira và ctv, 2016). Coriolopsis aspera được Chang và Tschu (1992), Briffa (2001), Kumar và ctv. (2014) ghi nhận tại Đài Loan và Leif Ryvarden phát hiện tại Malta năm 2001 (Briffa, 2002).
  • Về thành phần hóa học: Nhóm polysaccharide trong nấm vân chi tồn tại dưới dạng liên kết với peptide (proteoglycan) hoặc protein, có cấu trúc chuỗi β-(1,3)-glucan phân nhánh galactose, mannose hoặc acid (Kozarski và ctv, 2011; Wu và ctv, 2004; Yoshioka và ctv, 1975; Falch và ctv, 2000; Y. Patel và ctv, 2012; Roupas và ctv, 2012; Gargano và ctv, 2017). Nhóm terpenoid và steroid đại diện gồm trametenolic acid B có hoạt tính kháng virus, kháng nấm, ức chế enzyme luciferase, hạ đường huyết qua ức chế alpha-glucosidase và gây độc tế bào ung thư PC3, MDA-MB-231 (Leliebre-Lara và ctv, 2016; Grienke và ctv, 2019; Lee và ctv, 2007; Cui và ctv, 2005; Luo và ctv, 2012; Ding và ctv, 2013; Ma và ctv, 2013). Hai sesquiterpene coriolopsin A và coriolopsin B đặc trưng cho loài Coriolopsis sp. được Chen và ctv. (2017) công bố. Các hợp chất steroid như ergosterol, cerevisterol, ergosterol peroxide có tác dụng kháng viêm thông qua ức chế NF-κB, ức chế tạo mạch khối u và kháng vi sinh vật (Muszyńska và ctv, 2017; Phillips và ctv, 2011; Drori và ctv, 2016; Novaes và ctv, 2011; Shao và ctv, 2010; Hong và ctv, 2007; Takei và ctv, 2005; Appiah và ctv, 2018; Liu và ctv, 2013). Các hợp chất phenolic như caffeic acid, syringic acid, trans-p-hydroxycoumaric acid, methyl ferulat, umbelliferone thể hiện khả năng chống oxy hóa, kháng khuẩn và ức chế COX-2 (Mohsen và Ammar, 2009; Smolibowska và ctv, 2016; Melappa và ctv; Dang và ctv, 2017; Eman và ctv, 2018; Stanikunaite và ctv, 2009; Sanzani và ctv, 2009).
  • Về kỹ thuật trích ly và sấy phun: Tác giả phân tích các yếu tố ảnh hưởng gồm nhiệt độ, thời gian, loại dung môi phân cực, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu và kỹ thuật hỗ trợ (Cacace và Mazza, 2003; Aboshora và ctv, 2014; Peschel và ctv, 2006; Mason và ctv, 2011; Chemat và ctv, 2011). Các nghiên cứu trích ly siêu âm (UAE) và vi sóng (MAE) trên các loài nấm khác được tác giả tổng hợp để so sánh:
Tên loài nấm Kỹ thuật Công suất (W) Tỷ lệ rắn:lỏng (g:ml) Nhiệt độ (°C) Thời gian (phút) Hiệu suất (%) Tác giả trích dẫn
Agaricus bisporus UAE 400 1:10 25 15 4,70 Aguiló-Aguayo và ctv. (2017)
Ganoderma lucidum UAE 671 1:12,5 28 45 15,00 Chen và ctv. (2014)
Paecilomyces hepiali UAE 300 1:160 25 11 9,48 Yu và ctv. (2011)
Tuber huidongense UAE 99,65 1:24,65 70,1 40,39 7,17 Chen và ctv. (2016)
Trametes versicolor UAE 30 1:40 40 48 5,95 Pan và ctv. (2010)
Trametes orientalis UAE 109,8 1:30 40,2 42,2 7,49 Zheng và ctv. (2014)
Agaricus blazei MAE 400 1:32,7 74,64 29,37 12,35 Zhang và ctv. (2011)
Cordyceps militaris MAE 744,8 1:31,1 65 4 - Zheng và ctv. (2019)
  • Về hoạt tính sinh học từ các nghiên cứu trước: Tác giả dẫn chứng khả năng khử gốc tự do DPPH của cao methanol Trametes versicolor đạt 0,213 mM TE và Trametes gibbosa đạt 0,534 mM TE (Puia và ctv, 2018); giá trị IC50 của Trametes versicolor là 0,52 mg/ml đối với DPPH và 0,14 mg/ml đối với ABTS (Jhan và ctv, 2016); Trametes pubescens có IC50 DPPH là 2 mg/ml (Im và ctv, 2016); Trametes hirsuta có IC50 là 0,908 mg/ml (Vazirian và ctv, 2014). Về hoạt tính kháng khuẩn, dịch chiết nước và methanol từ Trametes hirsuta ức chế 5 chủng vi khuẩn và 5 chủng nấm mốc (Sivaprakasam và ctv, 2011; Bains và Chawla, 2020).

Khoảng trống nghiên cứu được luận án giải quyết là: quả thể nấm vân chi có cấu trúc mạng sợi tơ dày, hóa gỗ với hàm lượng cellulose cao, gây cản trở khuếch tán hoạt chất; đồng thời, chưa có công trình nào nghiên cứu toàn diện từ khâu tiền xử lý phá vỡ cấu trúc tơ nấm Coriolopsis aspera, tối ưu hóa quá trình trích ly, phân lập định danh các hợp chất tinh khiết, kiểm chứng hoạt tính sinh học, đánh giá độc tính an toàn sinh học in vivo, cho đến mô hình hóa quá trình sấy phun tạo bột thực phẩm chức năng hòa tan.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án áp dụng phương pháp nghiên cứu thực nghiệm định lượng, kết hợp giữa hóa học phân tích các hợp chất tự nhiên, công nghệ chế biến sau thu hoạch và thử nghiệm độc lý sinh học:

  • Khung lý thuyết và mô hình toán học:

    • Phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology - RSM) theo mô hình Box-Behnken (Box-Behnken Design - BBD) được sử dụng để tối ưu hóa đồng thời nhiều biến đầu vào trong hai công đoạn: trích ly hoạt chất và sấy phun tạo bột.
    • Mô hình động học phản ứng bậc một và quy tắc hệ số nhiệt độ Q10 được áp dụng để đánh giá độ suy giảm khả năng khử gốc tự do (RSA) và hàm lượng triterpene tổng (TTC) nhằm dự đoán thời hạn bảo quản sản phẩm ở các nhiệt độ khác nhau (50°C, 60°C và quy đổi về nhiệt độ bảo quản mát 20°C).
    • Khung hướng dẫn độc tính học: Thử nghiệm độc tính cấp tính theo phương pháp của Lorke và thử nghiệm độc tính bán trường diễn theo hướng dẫn Guideline 407 (2001) của Tổ chức Hợp tác và Phát triển Kinh tế (OECD) về thử nghiệm hóa chất trên chuột thực nghiệm.
  • Phương pháp thực nghiệm chi tiết:

    • Chuẩn bị nguyên liệu và tiền xử lý phá mẫu: Quả thể nấm tươi được sấy ở 45°C đến độ ẩm khoảng 6%, nghiền bằng máy nghiền búa qua rây 20 mesh, đóng gói hút chân không túi PE và bảo quản ở 4°C dưới 30 ngày. Năm phương pháp phá mẫu sợi tơ nấm được đưa vào khảo sát đơn yếu tố: (1) Siêu âm trong nước (tỷ lệ 60:1 ml/g, khảo sát công suất 150-525 W/g với bước nhảy 75 W, thời gian 5-35 phút); (2) Vi sóng trong nước (tỷ lệ 60:1, công suất 110-140 W/g, thời gian 5-20 phút); (3) Đun nước nóng (tỷ lệ 60:1, nhiệt độ 70-100°C, thời gian 5-20 phút); (4) Ngâm NaOH (nồng độ 3-9%) trong 20 phút kết hợp siêu âm (công suất 375 W, thời gian 5-20 phút); (5) Xử lý nitơ lỏng (tỷ lệ nitơ lỏng:nguyên liệu từ 2:1 đến 8:1) kết hợp siêu âm trong nước (tỷ lệ 60:1, công suất 375 W, thời gian 5-20 phút). Đánh giá cấu trúc sợi tơ nấm sau xử lý bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM).
    • Khảo sát dung môi và tối ưu hóa trích ly: Khảo sát 3 loại dung môi acetone, methanol, ethanol ở nồng độ 98% (tỷ lệ 60:1 ml/g, 24 giờ). Sau đó, tiến hành tối ưu hóa trích ly bằng mô hình Box-Behnken với 4 biến độc lập: nhiệt độ trích ly, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu, thời gian trích ly và nồng độ ethanol.
    • Phương pháp định tính hóa thực vật: Dựa trên phản ứng đổi màu, kết tủa hoặc tạo bọt với các thuốc thử đặc hiệu: FeCl3 0,1% (phenolic và tannin), thuốc thử Dragendorff (alkaloid), dung dịch chì acetate 10% (flavonoid), thử nghiệm tạo bọt bền khi lắc và đun sôi (saponin), phản ứng tạo vòng màu nâu đỏ với chloroform và H2SO4 đậm đặc (terpenoid và steroid), phản ứng với NaOH 10% tạo màu vàng (coumarin).
    • Phương pháp phân lập và tinh sạch hợp chất: Cao chiết ethanol nấm Coriolopsis aspera tối ưu (CoAEO) được cô quay chân không, phân tán vào nước rồi tiến hành chiết lỏng - lỏng (LLE) phân đoạn lần lượt với n-hexane, ethyl acetate và chloroform, thu được 4 phân đoạn cao. Các phân đoạn được phân tách bằng sắc ký cột cổ điển (chất hấp phụ silicagel pha thường, cỡ hạt 400-630 mesh, Merck), kiểm tra độ tinh sạch bằng sắc ký lớp mỏng (TLC trên bản nhôm tráng sẵn silicagel 60 F254 và pha đảo RP-18 F254s, soi dưới đèn tử ngoại 254 nm, 368 nm, hiện màu bằng hơi iod hoặc phun dung dịch H2SO4 20% trong cồn rồi hơ nóng), kết hợp kết tinh phân đoạn ở nhiệt độ 5-12°C.
    • Xác định cấu trúc hóa học: Đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân gồm 1H-NMR (tần số 500 MHz) và 13C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC, COSY, NOESY (tần số 125 MHz) trên máy Bruker tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
    • Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học in vitro: Xác định khả năng khử gốc tự do bằng phương pháp DPPH, tính giá trị IC50 (so sánh với chất chuẩn acid ascorbic). Đánh giá khả năng ức chế tế bào ung thư cổ tử cung (HeLa) và ung thư gan (Hep-G2) bằng thử nghiệm MTT, đo giá trị IC50 (đối chứng dương Ellipticine, đối chứng âm DMSO). Thử tính kháng vi sinh vật bằng kỹ thuật khuếch tán giếng thạch, xác định đường kính vòng ức chế, nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) trên các chủng vi khuẩn kiểm định (Bacillus cereus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Vibrio parahaemolyticus, Candida albicans, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes).
    • Phương pháp thử nghiệm độc tính in vivo: Độc tính cấp tính trên chuột nhắt trắng theo phương pháp Lorke, cho uống dịch cao CoAEO ở các liều 0, 2000, 4000, 6000 mg/kg thể trọng trong 14 ngày, theo dõi tỷ lệ sống sót, hành vi, khối lượng cơ thể, chỉ số huyết học, sinh hóa máu và giải phẫu mô bệnh học gan, tim, thận. Thử nghiệm độc tính bán trường diễn theo OECD 407 (2001), cho chuột uống cao CoAEO các mức liều 100, 200, 300, 400 mg/kg thể trọng mỗi ngày liên tục trong 90 ngày, đánh giá mô bệnh học đại thể và vi thể tim, gan, thận, lách, tuyến ức.
    • Phương pháp sấy phun và đánh giá chất lượng bột: Sử dụng máy sấy phun LabPlant SD-Basic (Anh). Khảo sát tỷ lệ phối trộn chất mang maltodextrin (DE 16-19) : gum arabic : gelatin thông qua độ nhớt dịch sấy, hiệu suất thu hồi bột, độ ẩm bột và thời gian hòa tan. Tối ưu hóa quá trình sấy phun bằng mô hình Box-Behnken với 3 yếu tố: nhiệt độ khí sấy đầu vào, hàm lượng chất mang và lưu lượng nạp liệu. Các chỉ tiêu đánh giá thành phẩm gồm tỷ trọng bột, độ ẩm, chỉ số hòa tan (WSI), thời gian thấm ướt, hình thái hạt qua ảnh chụp SEM, khả năng khử gốc tự do DPPH, hoạt tính gây độc tế bào ung thư HeLa, Hep-G2 và an toàn sinh học.
  • Hóa chất và thiết bị chính: Bao gồm thiết bị cô quay chân không RV 10 (Đức), tủ ấm Shellab 1525-2E (Mỹ), tủ sấy Memmert (Đức), máy ly tâm EBA200S (Đức), máy siêu âm Ultrasonic processor model GE 750 (Mỹ), máy đo độ nhớt Brookfield DIGITAL DV-III Ultra Rheometer (Mỹ), máy đo quang phổ UV-VIS Model UVS-2800 LABOMED (Mỹ); các hóa chất Folin-Ciocalteu, DPPH, ABTS, Trolox, silicagel, bản mỏng TLC của Đức; maltodextrin từ Mỹ, gum arabic từ Ấn Độ, và các dung môi tinh khiết của Việt Nam, Trung Quốc, Hàn Quốc.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 tổng hợp có hệ thống cơ sở lý luận về đặc tính sinh học, vùng phân bố nhiệt đới của chi Coriolopsis, và cấu trúc của nấm Coriolopsis aspera. Luận án trình bày chi tiết các nhóm chất chuyển hóa thứ cấp có trong nấm vân chi gồm polysaccharide, triterpenoid, steroid, phenolic, flavonoid cùng các dẫn xuất sinh học có khả năng kháng u, điều hòa miễn dịch, chống oxy hóa và kháng khuẩn. Chương này cũng phân tích sâu cơ chế tác động của sóng siêu âm (hiện tượng xâm thực tạo bọt khí vi mô phá hủy vách tế bào), bức xạ vi sóng (gia nhiệt phân cực gây áp suất nội bào làm vỡ màng tế bào) và dung môi hóa học đối với hiệu suất trích ly. Tổng quan kỹ thuật phân lập bằng sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng, kỹ thuật vi bao bảo vệ hoạt chất bằng sấy phun với các chất mang maltodextrin, gum arabic, gelatin và lý thuyết đánh giá thời hạn bảo quản thực phẩm theo mô hình Q10 tạo tiền đề trực tiếp cho việc triển khai nghiên cứu thực nghiệm.

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn gốc nguyên liệu nấm thu hái từ Vườn Quốc gia Pù Mát, quy trình trồng bán tự nhiên, thu hoạch và sơ chế mẫu; quy trình phân tích định tính và định lượng các nhóm chất; thiết kế các ma trận thực nghiệm tối ưu hóa theo mô hình Box-Behnken cho công đoạn trích ly và sấy phun; quy trình phân lập 9 hợp chất sạch từ hai phân đoạn cao ethyl acetate và cao nước; phương pháp phổ học NMR để xác định cấu trúc; phương pháp nuôi cấy và thử nghiệm sinh học trên dòng tế bào ung thư người (HeLa, Hep-G2), các chủng vi sinh vật kiểm định và quy trình thử nghiệm độc lý trên động vật thực nghiệm tuân thủ quy chuẩn OECD 407 và Lorke.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm, tính toán tối ưu và phân tích kết quả theo các nội dung nghiên cứu:

  • Xử lý nguyên liệu: So sánh 5 phương pháp phá vỡ sợi tơ nấm cho thấy phương pháp kết hợp nitơ lỏng và siêu âm đạt hiệu quả cao nhất. Ảnh chụp SEM ghi nhận sợi tơ nấm bị đứt gãy và phá hủy hoàn toàn cấu trúc vách tế bào, giúp giải phóng các hợp chất nội bào ra dung môi triệt để hơn so với phương pháp siêu âm đơn lẻ, vi sóng, đun nóng hay xử lý kiềm NaOH.
  • Khảo sát dung môi và tối ưu hóa trích ly: Dung môi ethanol và methanol 80% cho hàm lượng polyphenol tổng số (TPC), flavonoid tổng số (TFC), triterpene tổng số (TTC) và hoạt tính khử gốc tự do (RSA) cao hơn rõ rệt so với acetone và các nồng độ dung môi khác. Do ethanol an toàn trong chế biến thực phẩm, tác giả chọn dung môi này để tối ưu hóa điều kiện trích ly. Kết quả tối ưu hóa theo mô hình Box-Behnken xác định được các thông số công nghệ tối ưu:
Yếu tố đầu vào Giá trị tối ưu Hàm mục tiêu Giá trị dự đoán Giá trị thực nghiệm
Nhiệt độ trích ly 40°C TPC (mg GAE/g DW) 7,8407 7,8407
Tỷ lệ dung môi:nguyên liệu 53:1 (ml/g) TFC (mg QE/g DW) 1,3307 1,3307
Thời gian trích ly 8,04 giờ TTC (mg OAE/g DW) 2,0843 2,0843
Nồng độ ethanol 79,6% RSA (µg VitC/g DW) 4,5940 4,5940
  • Định tính và phân lập hợp chất: Phân tích định tính dịch cao chiết ethanol tối ưu (CoAEO) cho thấy sự có mặt dồi dào của các nhóm chất phenolic, tannin, alkaloid, terpenoid, steroid; nhóm flavonoid và saponin ở mức trung bình; nhóm coumarin ở mức thấp. Quá trình phân lập sắc ký cột silicagel từ cao CoAEO đã tinh sạch được 9 hợp chất sạch, cấu trúc hóa học được xác định bằng các kỹ thuật phổ NMR:
STT Tên hợp chất phân lập Phân đoạn cao chiết Nhóm cấu trúc
1 Trametenolic B Ethyl acetate Triterpenoid
2 Cerevisterol Ethyl acetate Steroid
3 Ergosterol Ethyl acetate Steroid
4 Ergosterol peroxit Ethyl acetate Steroid
5 trans-p-Hydroxycoumaric acid Nước Phenolic acid
6 Methyl ferulat Nước Ester phenolic
7 Methyl (2-hydroxyphenyl) acetat Nước Dẫn xuất phenolic
8 Umbelliferone Nước Coumarin
9 8-Hydroxy-3,4-dimethylisocoumarin Nước Isocoumarin
  • Hoạt tính sinh học và độc tính của cao CoAEO:
    • Khả năng chống oxy hóa: Thử nghiệm DPPH xác định giá trị IC50 của cao CoAEO đạt 0,064 mg/ml, so với đối chứng dương acid ascorbic là 0,035 mg/ml.
    • Hoạt tính ức chế tế bào ung thư: Thử nghiệm MTT cho thấy cao CoAEO có khả năng ức chế dòng tế bào ung thư cổ tử cung (HeLa) với giá trị IC50 là 98,3 µg/ml (đối chứng dương Ellipticine đạt IC50 = 3,63 µg/ml, đối chứng âm DMSO bằng 0) và dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2) với giá trị IC50 là 88,6 µg/ml (đối chứng dương Ellipticine đạt IC50 = 3,98 µg/ml, đối chứng âm DMSO bằng 0).
    • Kháng vi sinh vật: Cao CoAEO tạo vòng vô khuẩn rõ rệt trên 5 chủng vi khuẩn kiểm định gồm V. parahaemolyticus, B. cereus, S. faecalis, E. coli, S. aureus.
    • Đánh giá an toàn in vivo: Trong thử nghiệm độc tính cấp tính (phương pháp Lorke, 14 ngày), chuột uống cao CoAEO ở các liều cao 2000, 4000 và 6000 mg/kg thể trọng không ghi nhận trường hợp tử vong, không có biểu hiện hành vi bất thường, các chỉ số huyết học, sinh hóa máu và cấu trúc vi thể gan, tim, thận bình thường. Thử nghiệm độc tính bán trường diễn (OECD 407, 90 ngày) ở các liều 100, 200, 300 và 400 mg/kg thể trọng không phát hiện tổn thương bệnh lý trên các cơ quan đích (tim, gan, thận, lách, tuyến ức). Tác giả kết luận mức hàm lượng TTC tương đương 781,8 mg oleanolic acid/kg thể trọng và 52,12 mg oleanolic acid/kg hoàn toàn an toàn, không gây độc tính trên chuột.
  • Nghiên cứu ứng dụng sấy phun tạo bột hòa tan: Khảo sát hệ chất mang cho thấy tỷ lệ phối trộn maltodextrin : gum arabic : gelatin ở mức 94:5:1 (w/w) mang lại độ nhớt dịch sấy phù hợp và hạn chế hiện tượng dính buồng sấy. Tối ưu hóa điều kiện sấy phun bằng mô hình Box-Behnken cho kết quả:
Yếu tố công nghệ sấy phun Mức tối ưu Chỉ tiêu chất lượng bột Dự đoán mô hình Thực nghiệm kiểm chứng
Nhiệt độ khí vào 133°C Hiệu suất thu hồi bột (%) 42,201 42,201
Hàm lượng chất mang 16% (w/w) Độ ẩm bột (%) 2,936 2,936
Lưu lượng nạp liệu 22,5 ml/phút Độ giảm khả năng chống oxy hóa (%) 9,224 9,224
- - Độ giảm flavonoid tổng số - TFC (%) 2,358 2,358
- - Độ giảm polyphenol tổng số - TPC (%) 4,124 4,124
- - Độ giảm triterpene tổng số - TTC (%) 0,909 0,909
  • Thời hạn bảo quản và độ an toàn sản phẩm bột: Ứng dụng mô hình Q10 dựa trên thực nghiệm gia tốc ở 50°C và 60°C cho thấy: tại nhiệt độ bảo quản mát 20°C, thời gian bảo quản để khả năng chống oxy hóa (RSA) suy giảm 20% so với ban đầu là 45,2 ngày; thời gian bảo quản để hàm lượng triterpene tổng số (TTC) suy giảm 20% là 69,5 ngày. Tính toán an toàn sinh học khẳng định lượng TTC trong 100g bột sản phẩm hòa tan thấp hơn nhiều so với ngưỡng liều an toàn xác định trên động vật thực nghiệm (781,8 mg oleanolic/kg thể trọng và 52,12 mg oleanolic/kg).

Kết quả và những đóng góp mới

Luận án tự công bố các đóng góp mới về mặt khoa học và thực tiễn:

  • Về mặt khoa học:
    • Cung cấp dẫn liệu khoa học đầu tiên về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài nấm vân chi Coriolopsis aspera thu hái tại Việt Nam.
    • Phân lập và giải mã thành công cấu trúc phân tử của 9 hợp chất chuyển hóa thứ cấp tinh khiết từ quả thể nấm gồm: trametenolic B, cerevisterol, ergosterol, ergosterol peroxit, trans-p-hydroxycoumaric acid, methyl ferulat, methyl (2-hydroxyphenyl) acetat, umbelliferone và 8-hydroxy-3,4-dimethylisocoumarin.
    • Cung cấp số liệu định lượng về hoạt tính khử gốc tự do DPPH (IC50 = 0,064 mg/ml), hoạt tính ức chế tế bào ung thư cổ tử cung HeLa (IC50 = 98,3 µg/ml) và ung thư gan Hep-G2 (IC50 = 88,6 µg/ml), phổ kháng khuẩn trên 5 chủng vi sinh vật, cùng hồ sơ an toàn sinh học in vivo (độc tính cấp và bán trường diễn theo tiêu chuẩn OECD 407).
  • Về mặt thực tiễn:
    • Xác lập quy trình xử lý cơ học kết hợp nitơ lỏng và sóng siêu âm để phá vỡ hiệu quả mạng sợi tơ nấm, nâng cao hiệu suất thu hồi các hợp chất có hoạt tính sinh học.
    • Xác định bộ thông số tối ưu cho quá trình trích ly hoạt chất bằng dung môi ethanol (nhiệt độ 40°C, tỷ lệ dung môi 53:1 ml/g, thời gian 8,04 giờ, ethanol 79,6%) thích hợp áp dụng trong công nghệ chế biến thực phẩm.
    • Xây dựng thành công chế độ công nghệ sấy phun tạo bột hòa tan (hỗn hợp chất mang maltodextrin : gum arabic : gelatin tỷ lệ 94:5:1; nồng độ chất mang 16%; nhiệt độ đầu vào 133°C; lưu lượng nạp liệu 22,5 ml/phút) thu được sản phẩm bột có độ ẩm thấp (2,936%), giữ được hàm lượng hoạt chất cao và xác lập thời hạn bảo quản theo mô hình Q10.
  • Kiến nghị và đề xuất giải pháp: Tiếp tục nghiên cứu mở rộng quy mô sản xuất thử nghiệm ở quy mô pilot, khảo sát thêm các dạng bao bì màng chắn ẩm và khí để kéo dài thời hạn bảo quản sản phẩm bột hòa tan ở điều kiện nhiệt độ thường, đồng thời thử nghiệm lâm sàng chuyên sâu về tác dụng hỗ trợ điều trị của sản phẩm đối với các bệnh lý chuyển hóa và ung bướu.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Căn cứ vào nội dung và phạm vi nghiên cứu được trình bày trong luận án:

  • Hạn chế:
    • Nguồn mẫu nấm nghiên cứu mới giới hạn ở một quần thể tự nhiên thu thập tại Vườn Quốc gia Pù Mát (Nghệ An) và nuôi trồng tại vườn thực nghiệm ở Thành phố Hồ Chí Minh, chưa so sánh biến thiên hàm lượng hoạt chất theo các mùa vụ và vùng địa lý khác nhau.
    • Quá trình khảo sát dung môi trích ly tập trung vào ethanol để phục vụ mục đích chế biến thực phẩm, chưa khảo sát sâu các hệ dung môi hữu cơ khác trong việc chiết kiệt các nhóm phân cực kém.
    • Đánh giá khả năng ức chế tế bào ung thư mới thực hiện ở mức độ in vitro trên hai dòng tế bào HeLa và Hep-G2, chưa tiến hành thử nghiệm mô hình khối u in vivo.
    • Đánh giá thời hạn bảo quản sản phẩm bột sấy phun thực hiện dựa trên phương pháp lão hóa cấp tốc Q10 ở nhiệt độ cao (50°C và 60°C), chưa có số liệu theo dõi thực tế dài hạn ở điều kiện môi trường tự nhiên.
  • Hướng nghiên cứu tiếp:
    • Khảo sát sự tích tụ hoạt chất của nấm Coriolopsis aspera trên các nguồn cơ chất phế phụ phẩm nông nghiệp khác nhau nhằm hạ giá thành nuôi trồng.
    • Đánh giá cơ chế phân tử tác động lên tế bào ung thư của các hợp chất tinh sạch (đặc biệt là trametenolic B và các dẫn xuất ergosterol).
    • Nghiên cứu phối chế sản phẩm bột hòa tan với các thảo dược khác để đa dạng hóa công năng thực phẩm bổ sung.

Giá trị tham khảo

Luận án mang lại giá trị tham khảo cụ thể cho nhiều đối tượng:

  • Học viên cao học, nghiên cứu sinh và nhà nghiên cứu: Là tài liệu tham khảo chi tiết về quy trình kỹ thuật phá vỡ vách sợi tơ nấm bằng nitơ lỏng kết hợp siêu âm; quy trình phân tách sắc ký cột silicagel điều chế triterpenoid và phenolic từ nấm lớn; phương pháp giải phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1D và 2D-NMR) để xác định cấu trúc các hợp chất tự nhiên; và kỹ thuật thiết kế thực nghiệm đáp ứng bề mặt Box-Behnken cho bài toán tối ưu hóa đa mục tiêu.
  • Giảng viên các trường đại học: Cung cấp bài giảng thực tế cho các học phần Hóa học hợp chất tự nhiên, Công nghệ chế biến sau thu hoạch, Công nghệ trích ly và sấy phun, Độc học thực phẩm và Phương pháp quy hoạch thực nghiệm.
  • Kỹ sư công nghệ và doanh nghiệp sản xuất thực phẩm chức năng: Cung cấp thông số vận hành máy sấy phun LabPlant SD-Basic, công thức tỷ lệ chất mang vi bao (maltodextrin, gum arabic, gelatin) giúp nâng cao hiệu suất thu hồi bột và hạn chế tổn thất chất chống oxy hóa, cùng dữ liệu thử nghiệm an toàn độc tính cấp và bán trường diễn theo OECD 407 làm cơ sở xây dựng hồ sơ công bố chất lượng sản phẩm.

Câu hỏi thường gặp

1. Phương pháp tiền xử lý nào phá vỡ vách sợi tơ nấm Coriolopsis aspera đạt hiệu quả cao nhất? Phương pháp kết hợp nitơ lỏng và siêu âm (với tỷ lệ nitơ lỏng so với nấm là 6:1 và thời gian siêu âm 15 phút ở công suất 375 W) đạt hiệu quả cao nhất. Hình ảnh chụp kính hiển vi điện tử quét (SEM) chứng minh cấu trúc mạng sợi tơ nấm bị đứt gãy và phá hủy hoàn toàn, cho hàm lượng polyphenol (TPC), flavonoid (TFC) và triterpene (TTC) giải phóng vào dịch chiết cao hơn hẳn các phương pháp siêu âm đơn lẻ, vi sóng, đun nước nóng hay ngâm kiềm NaOH.

2. Điều kiện tối ưu hóa công đoạn trích ly cao nấm CoAEO bằng mô hình Box-Behnken là gì? Điều kiện tối ưu gồm: nhiệt độ trích ly 40°C, tỷ lệ dung môi ethanol/nguyên liệu là 53:1 (ml/g), thời gian trích ly 8,04 giờ, và nồng độ dung môi ethanol là 79,6%. Tại chế độ này, các giá trị hàm mục tiêu đạt được là: TPC = 7,8407 mg GAE/g DW; TFC = 1,3307 mg QE/g DW; TTC = 2,0843 mg OAE/g DW; và khả năng khử gốc tự do RSA = 4,5940 µg VitC/g DW.

3. Tác giả đã phân lập và xác định được những hợp chất sạch cụ thể nào từ cao chiết? Tác giả đã phân lập và định danh được 9 hợp chất sạch:

  • Từ phân đoạn cao ethyl acetate phân lập được 4 hợp chất: trametenolic B, cerevisterol, ergosterol và ergosterol peroxit.
  • Từ phân đoạn cao nước phân lập được 5 hợp chất: trans-p-hydroxycoumaric acid, methyl ferulat, methyl (2-hydroxyphenyl) acetat, umbelliferone và 8-hydroxy-3,4-dimethylisocoumarin.

4. Kết quả đánh giá độc tính cấp tính và bán trường diễn trên chuột thực nghiệm ra sao? Thử nghiệm độc tính cấp tính theo phương pháp Lorke ở các liều lên tới 6000 mg/kg thể trọng trong 14 ngày không gây chết chuột, không làm thay đổi hành vi và cấu trúc mô học gan, tim, thận. Thử nghiệm độc tính bán trường diễn theo OECD 407 ở các liều từ 100 đến 400 mg/kg thể trọng trong 90 ngày không gây bất thường về chỉ số sinh hóa, huyết học và mô bệnh học. Tác giả kết luận hàm lượng TTC trong dịch cao tương đương 781,8 mg oleanolic/kg thể trọng và 52,12 mg oleanolic/kg hoàn toàn không gây độc tính.

5. Chế độ công nghệ sấy phun tối ưu và thời hạn bảo quản bột hòa tan được xác định thế nào? Chế độ sấy phun tối ưu gồm: nhiệt độ khí vào 133°C, hàm lượng chất mang (tỷ lệ maltodextrin : gum arabic : gelatin là 94:5:1) đạt 16% (w/w), lưu lượng nạp liệu 22,5 ml/phút; cho hiệu suất thu hồi bột 42,201% và độ ẩm 2,936%. Theo mô hình Q10 ở nhiệt độ bảo quản mát 20°C, thời gian bảo quản để độ khử gốc tự do RSA giảm 20% là 45,2 ngày và để hàm lượng triterpene tổng số (TTC) giảm 20% là 69,5 ngày.

Kết luận

Luận án của nghiên cứu sinh Nguyễn Ngọc Thuần là công trình thực nghiệm hoàn chỉnh về việc khai thác nguồn hoạt chất sinh học từ quả thể nấm vân chi Coriolopsis aspera tại Việt Nam. Tác giả đã xác lập giải pháp kết hợp nitơ lỏng và sóng siêu âm để phá vỡ vách sợi nấm, tối ưu hóa quá trình chiết xuất hoạt chất bằng ethanol sinh học, và phân lập định danh 9 hợp chất tinh khiết thuộc nhóm triterpenoid, steroid và phenolic. Các thử nghiệm sinh học đã chứng minh cao chiết có hoạt tính chống oxy hóa, kháng khuẩn, ức chế tế bào ung thư HeLa và Hep-G2, đồng thời an toàn tuyệt đối qua thử nghiệm độc tính in vivo theo tiêu chuẩn OECD 407. Quy trình công nghệ sấy phun vi bao được tối ưu hóa thành công đã tạo ra sản phẩm bột hòa tan giữ được hàm lượng hoạt chất sinh học cao, mở ra hướng ứng dụng thực tiễn trong công nghiệp chế biến thực phẩm bảo vệ sức khỏe.