Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Theo công bố của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), dược liệu tự nhiên đóng vai trò nền tảng trong hệ thống chăm sóc sức khỏe ban đầu của cộng đồng. Trên phạm vi toàn cầu, trong khoảng 500.000 loài thực vật bậc cao hiện hữu, mới chỉ có khoảng 6% số loài được sàng lọc hoạt tính sinh học và khoảng 15% được tiến hành nghiên cứu sâu về thành phần hóa học. Việt Nam là quốc gia có nguồn tài nguyên thực vật phong phú với hơn 4.000 loài cây thuốc được ứng dụng trong y học cổ truyền. Việc nghiên cứu thành phần hóa học và hiện đại hóa thuốc từ dược liệu là yêu cầu cấp thiết nhằm thiết lập cơ sở dữ liệu khoa học, đảm bảo tính an toàn và hiệu quả trong việc sử dụng cây thuốc.

Cây Tiêu lốt có tên khoa học là Piper longum L., thuộc họ Hồ tiêu (Piperaceae). Loài này phân bố tự nhiên chủ yếu tại các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới châu Á như Ấn Độ, vùng Nam Trung Hoa, Lào, Campuchia, Malaysia, Philippines và Việt Nam. Tại Việt Nam, Tiêu lốt mọc tương đối phổ biến ở các tỉnh vùng cao nguyên, đặc biệt tại các vùng núi đá vôi ẩm ướt. Trong y học cổ truyền phương Đông, Tiêu lốt có tính nóng, vị cay, thường được chỉ định để điều trị các chứng bệnh về đường tiêu hóa (đau bụng lạnh, nôn mửa, tiêu chảy, khó tiêu) và các bệnh về đường hô hấp (viêm xoang, ho, cảm lạnh).

Các công trình khoa học quốc tế đã ghi nhận quả Piper longum L. chứa nhiều nhóm hoạt chất có giá trị sinh học cao như alkaloid, lignan, ester, acid hữu cơ và tinh dầu, thể hiện đa dạng các hoạt tính dược lý gồm ức chế tế bào ung thư, điều hòa hệ miễn dịch, chống viêm, giảm đau, bảo vệ gan, kháng khuẩn và kháng nấm. Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu trên thế giới, nhưng tại thời điểm thực hiện đề tài, chưa có báo cáo khoa học nào công bố về thành phần hóa học của cây Tiêu lốt sinh trưởng và thu hái tại Việt Nam. Do đó, khóa luận tốt nghiệp được triển khai nhằm cung cấp những dẫn liệu khoa học đầu tiên về hóa thực vật của loài này ở trong nước, nằm trong khuôn khổ hỗ trợ của đề tài Nghị định thư Việt - Hàn mang mã số NĐT.KR/20 ("Nghiên cứu hoạt tính kháng ung thư và điều hòa miễn dịch của một số cây thuốc Việt Nam").

Mục tiêu nghiên cứu của khóa luận được xác định cụ thể gồm hai nhiệm vụ:

  1. Chiết xuất, phân lập được 2 hợp chất từ quả Tiêu lốt (Piper longum L.).
  2. Xác định được cấu trúc hóa học của 2 hợp chất phân lập được từ quả Tiêu lốt.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Quả của cây Tiêu lốt (Piper longum L.).
  • Phạm vi không gian: Mẫu dược liệu được thu hái tại huyện Chư Sê, tỉnh Gia Lai và huyện Đắk Song, tỉnh Đắk Nông.
  • Phạm vi thời gian: Thời điểm thu hái mẫu vào ngày 12 tháng 09 năm 2020; các nội dung thực nghiệm chiết xuất, phân lập và phân tích phổ được tiến hành tại Khoa Hóa Thực vật – Viện Dược liệu và hoàn thành khóa luận vào năm 2022.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung phân loại thực vật xác định cây Tiêu lốt (Piper longum L.) thuộc chi Piper, họ Hồ tiêu (Piperaceae), bộ Hồ tiêu (Piperales), lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta), giới Thực vật (Plantae). Mẫu nghiên cứu thu thập tại thực địa đã được giám định tên khoa học chính xác bởi các chuyên gia thực vật học thuộc Khoa Tài nguyên Dược liệu – Viện Dược liệu (PGS. Phạm Thanh Huyền và ThS. Nguyễn Văn Hiếu), lưu trữ với mã tiêu bản thực vật N12-PL.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm hóa thực vật được xây dựng theo quy trình chiết xuất hồi lưu kết hợp chiết phân bố lỏng - lỏng, sắc ký hấp phụ và phân tích quang phổ cấu trúc:

  1. Phương pháp chiết xuất và phân đoạn:

    • Chiết nóng hồi lưu: Quả Tiêu lốt khô sau khi nghiền nhỏ được chiết hồi lưu với dung môi ethanol 70% ở nhiệt độ 80°C (chiết 3 lần, mỗi lần 3 giờ) theo tỷ lệ dược liệu/dung môi là 1:5 (kg/l). Gộp toàn bộ dịch chiết và tiến hành cất thu hồi ethanol dưới áp suất giảm trên hệ thống cô quay chân không để thu nhận cắn chiết ethanol 70% tổng số.
    • Chiết phân bố lỏng - lỏng: Cao tổng ethanol 70% được phân tán đồng nhất trong nước nóng, sau đó chuyển vào bình gạn và chiết phân bố lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần gồm n-hexan và ethyl acetat (EtOAc). Dịch chiết của từng phân đoạn được thu hồi dung môi dưới áp suất giảm để thu các cao phân đoạn tương ứng: cao n-hexan, cao EtOAc và phần cắn nước còn lại.

  2. Phương pháp phân lập hợp chất:

    • Áp dụng kỹ thuật sắc ký cột cổ điển (Column Chromatography - CC) với các pha tĩnh khác nhau: sắc ký cột pha thường sử dụng silica gel có kích thước hạt 0,040 - 0,063 mm (Merck) và sắc ký cột pha đảo sử dụng hạt silica gel RP-18 kích thước hạt 75 µm (YMC Co.).
    • Quá trình phân tách được kiểm tra và theo dõi liên tục bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) trên bản mỏng tráng sẵn silica gel pha thuận DC-Alufolien 60G F254 và pha đảo RP-18F254 (Merck).
    • Phát hiện các vết chất trên bản mỏng bằng phương pháp soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng ngắn 254 nm và bước sóng dài 366 nm (sử dụng đèn tử ngoại VL-6.LC, Vilber), kết hợp phun thuốc thử hiện màu dung dịch H2SO4 10% pha trong cồn 96% rồi tiến hành hơ nóng.

  3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học:

    • Phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI-MS): Đo trên hệ thống sắc ký lỏng siêu hiệu năng ghép nối detector khối phổ tứ cực chập ba LC-MS/MS và detector chuỗi đi-ốt (DAD) của hãng Shimadzu (Nhật Bản), nhằm xác định các ion giả phân tử [M+H]+ và khối lượng phân tử của hợp chất.
    • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Đo phổ cộng hưởng từ proton (1H-NMR) và phổ cộng hưởng từ cacbon (13C-NMR) trên thiết bị Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer (Hoa Kỳ) với dung môi hòa tan mẫu là chloroform pha đơ-tơ-ri (CDCl3).
    • Đối chiếu và so sánh trực tiếp các giá trị độ dịch chuyển hóa học (chemical shift δ), hình dạng pic và hằng số tương tác spin (J) với các tài liệu tham khảo khoa học quốc tế đã công bố.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa toàn diện các tài liệu khoa học về chi Piper và loài Piper longum L.:

  • Tổng quan về chi Piper: Chi Piper gồm hơn 700 loài phân bố rộng khắp các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Về hóa học, hơn 592 hợp chất đã được phân lập từ chi này, trong đó nhóm alkaloid và amid chiếm ưu thế lớn nhất với 145 hợp chất, tiếp đến là neolignan (70 hợp chất), terpen (89 hợp chất), lignan (47 hợp chất), cùng các dẫn chất propenylphenol, steroid, chalcon và flavanon.
  • Vị trí phân loại, hình thái thực vật và phân bố của Piper longum: Tiêu lốt là cây thân thảo sống nhiều năm, thân dưới mọc bò, các cành mang hoa đứng thẳng cao từ 2 đến 4 m. Lá mọc so le, phiến hình trứng thuôn dài (6 - 7,5 cm x 3 - 5 cm), gốc hình tim hơi lệch, mặt dưới có lông tơ nhỏ tại các gân. Hoa đơn tính mọc thành cụm; cụm hoa đực dài khoảng 3,5 cm, cụm hoa cái dài khoảng 1,5 cm. Cụm quả hình trụ hơi cong tạo thành từ nhiều quả mọng nhỏ hợp lại, dài 1,5 - 3,5 cm, đường kính 0,3 - 0,5 cm, mặt ngoài có màu nâu đen khi chín, vị cay nồng và thơm hăng. Cây mọc hoang và được trồng tại nhiều tỉnh vùng núi, cao nguyên Việt Nam.
  • Thành phần hóa học của quả Piper longum: Quả chứa lượng lớn alkaloid và amid, điển hình là piperin, pipernonalin, piperundecalidin, piperlongumin, dihydropiperlongumin, pipercid, guineensin, các dẫn chất N-isobutyl-dienamid; nhóm lignan (sesamin, pluviatilol, fargesin); các ester (tridecyl-dihydro-p-coumarat, eicosanyl-(E)-p-coumarat); cùng tinh dầu dễ bay hơi (caryophyllen 17,8%, pentadecan 17,8%, bisabolin 11%, bisabolen, β-caryophyllen oxid, α-zingiberen).
  • Tác dụng dược lý thực nghiệm: Văn bản trích dẫn các nghiên cứu quốc tế chứng minh các tác dụng sinh học của quả Tiêu lốt và các hợp chất tách chiết:
    • Kháng ung thư: Piperin ức chế 95,2% sự hình thành điểm khối u hắc tố B16F-10 di căn trên phổi chuột C57BL/6; giảm nồng độ hydroxyprolin, acid uric và hexosamin trong mô phổi; pipernonalin gây chết theo chương trình qua trung gian các gốc oxy hóa phản ứng (ROS) trên tế bào ung thư tiền liệt tuyến PC-3 của người.
    • Tác dụng điều hòa miễn dịch và chống viêm: Cao chiết làm giảm số lượng tế bào lympho CD4+ và CD8+ phụ thuộc liều trên chuột Balb/C; nước sắc quả ức chế phù chân chuột gây bởi carrageenin; bột rễ thể hiện hoạt tính giảm đau ngoại biên mạnh theo cơ chế tương tự thuốc chống viêm không steroid (NSAIDs).
    • Bảo vệ gan và chống loét tiêu hóa: Cao chiết và hợp chất piperin làm giảm tổn thương xơ hóa gan do CCl4 và peroxy hóa lipid gây bởi tert-butyl hydroperoxid, giảm sự rò rỉ enzym GPT và AP; bảo vệ niêm mạc dạ dày chống lại các vết loét thực nghiệm do stress (CRS), aspirin (ASP) và thắt môn vị (PL).
    • Các tác dụng khác: Hoạt tính hạ đường huyết trên chuột tiểu đường thực nghiệm do alloxan; ức chế ngưng tập tiểu cầu thỏ do collagen, acid arachidonic và PAF; tác dụng diệt côn trùng, kháng khuẩn, kháng nấm thực vật (Pyricularia oryzae, Rhizoctonia solani); và tác dụng gia tăng sinh khả dụng của các thuốc dùng kèm (như làm tăng mạnh nồng độ hấp thu và sinh khả dụng của curcumin).
  • Ứng dụng trong y học cổ truyền: Quả Tiêu lốt có vị cay, tính nóng, quy kinh tỳ vị, công năng ôn trung tán hàn, hạ khí chỉ thống. Liều dùng thông thường từ 1,5 đến 3 g/ngày trị đau bụng lạnh, nôn thổ, ỉa chảy, tích trệ tiêu hóa; phối hợp với các vị thuốc khác dùng trị đau răng, chảy nước mũi, đau ngực hoặc thống kinh ở phụ nữ. Rễ Tiêu lốt có tính ấm, dùng 2 - 3 g/ngày sắc uống trị cảm lạnh, chướng bụng, khó tiêu.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn gốc nguyên liệu thực nghiệm và hệ thống trang thiết bị, hóa chất được sử dụng:

  • Chuẩn bị mẫu: 3 kg quả Tiêu lốt thu hái vào tháng 09/2020 tại Gia Lai và Đắk Nông được sấy khô bằng tủ sấy ở nhiệt độ 50°C, để nguội và bảo quản trong túi nilon kín khí trước khi nghiền nhỏ để chiết xuất.
  • Hóa chất và dung môi: Ethanol 70%, n-hexan, ethyl acetat (EtOAc), methanol (MeOH), dichloromethan (DCM), aceton và nước cất công nghiệp; silica gel pha thường (0,040 - 0,063 mm, Merck); silica gel pha đảo YMC (75 µm); CDCl3 dùng cho đo phổ NMR; dung dịch H2SO4 10% trong ethanol 96%.
  • Thiết bị nghiên cứu: Bể siêu âm Vevor Ultrasonic Cleaner 10L; các hệ thống cô quay chân không Buchi gồm Rotavapor R-124, Rotavapor R-210 và Rotavapor R-220 Pro dung tích 20L; tủ sấy Binder FD 115 và Memmert UF110; cân kỹ thuật Ohaus PA2102, cân phân tích Precisa XT 220A; máy LC-MS/MS Shimadzu; máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer.
  • Mô tả quy trình thực nghiệm: Quy trình chiết nóng 3 lần với ethanol 70% ở 80°C, cô ngưng tụ thu cao tổng, phân bố lỏng - lỏng phân tách các phân đoạn dung môi, quy trình đóng cột sắc ký silica gel, nạp mẫu cao khô trộn silica gel, kỹ thuật rửa giải gradient và thu thập các phân đoạn dựa trên đối chiếu bản mỏng TLC.

Chương 3: Kết quả

Chương 3 trình bày các số liệu thực nghiệm định lượng về thu hồi cao phân đoạn và quá trình phân lập, giải mã cấu trúc:

  1. Kết quả chiết xuất và phân bố lỏng - lỏng: Từ 3 kg quả Tiêu lốt khô ban đầu, hiệu suất phân đoạn thu được các khối lượng cao chiết cụ thể:
  • Cao tổng ethanol 70%: 600,33 g.
  • Cao phân đoạn n-hexan: 99,83 g.
  • Cao phân đoạn ethyl acetat (EtOAc): 192,32 g.
  • Phần cắn nước: 233,94 g.
  1. Kết quả phân lập từ cao phân đoạn EtOAc:
  • Toàn bộ 192,32 g cao EtOAc được đưa vào sắc ký cột silica gel pha thường, sử dụng hệ dung môi rửa giải gradient n-hexan – EtOAc từ tỷ lệ 100:0 đến 0:100 (v/v), thu được 10 phân đoạn ký hiệu từ 1A đến 1K.
  • Phân đoạn 1H được cô đặc dưới áp suất giảm thấy xuất hiện kết tủa. Lọc lấy tủa và rửa sạch bằng dung môi n-hexan thu được một lượng lớn hợp chất ký hiệu PL-16A1 với khối lượng 24,75 g.
  • Phân đoạn 1I có khối lượng 5,02 g tiếp tục được tinh chế bằng sắc ký cột pha đảo RP-18 YMC với hệ dung môi rửa giải MeOH – H2O tỷ lệ 4:1 (v/v), thu được 9 phân đoạn nhỏ ký hiệu từ 2A đến 2I. Phân đoạn 2E sau khi cô đặc tạo kết tủa, tiến hành lọc và rửa tủa thu được hợp chất thứ hai ký hiệu PL-I6 với khối lượng 0,86 g.
  1. Kết quả xác định cấu trúc hóa học:

  • Hợp chất PL-16A1:

    • Dạng cảm quan: Bột màu vàng nhạt.
    • Phổ ESI-MS: Xuất hiện pic ion giả phân tử tại m/z 286,2 [M+H]+, xác định khối lượng phân tử là 285 và công thức phân tử là C17H19NO3.
    • Phổ 1H-NMR (600 MHz, CDCl3): Tín hiệu của vòng thơm thế 1,3,4 (hệ ABX) tại δH 6,98 (1H, d, J = 1,8 Hz, H-2'), 6,78 (1H, d, J = 7,8 Hz, H-5') và 6,89 (1H, dd, J = 1,8; 7,8 Hz, H-6'); tín hiệu nhóm methylenedioxy (-OCH2O-) đặc trưng tại δH 5,97 (2H, s); 2 liên kết đôi liên hợp cấu hình trans tại δH 6,44 (1H, d, J = 15,0 Hz, H-2), 7,40 (1H, m, H-3) và 6,73 (2H, m, H-4, H-5); cùng các tín hiệu của vòng piperidin ở vùng trường cao từ 1,58 đến 3,58 ppm (tích phân 10H).
    • Phổ 13C-NMR (150 MHz, CDCl3): Xuất hiện 17 tín hiệu carbon gồm 1 carbon carbonyl của liên kết amid tại δC 165,5 ppm (C-1); 4 carbon olefinic của 2 liên kết đôi liên hợp tại δC 120,1 (C-2), 142,5 (C-3), 125,4 (C-4), 138,2 (C-5); 6 carbon vòng thơm tại δC 131,1 (C-1'), 105,7 (C-2'), 148,2 (C-3'), 148,1 (C-4'), 108,5 (C-5'), 122,5 (C-6'); 1 carbon nhóm -OCH2O- tại δC 101,3 ppm; và 5 carbon no của dị vòng piperidin tại δC 43,3 (C-2"), 26,7 (C-3"), 24,7 (C-4"), 25,6 (C-5"), 46,9 (C-6").
    • Kết luận: Hợp chất PL-16A1 được xác định chính xác là piperin.

  • Hợp chất PL-I6:

    • Dạng cảm quan: Bột màu trắng.
    • Phổ ESI-MS: Cho pic ion giả phân tử tại m/z 343,3 [M+H]+, tương ứng công thức phân tử C21H27NO3 (khối lượng phân tử 342, lớn hơn hợp chất PL-16A1 đúng 56 đvC, tương ứng với sự gia tăng của 4 nhóm -CH2-).
    • Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): Sự hiện diện của 4 nhóm methylen no thể hiện qua các tín hiệu tại δH 1,67 (4H, m) và 2,20 (4H, m), tương ứng với các tín hiệu carbon tại δC 29,0 (C-5), 29,7 (C-6), 32,4 (C-7) và 32,7 (C-4). Khác với piperin, 2 liên kết đôi cấu hình trans không tạo thành hệ liên hợp mà phân tách về hai phía của mạch: một liên kết đôi tiếp hợp với nhóm amid thể hiện qua tín hiệu tại δH 6,22 (1H, d, J = 15,0 Hz, H-2) và 6,82 (1H, dt, J = 7,0; 15,0 Hz, H-3); liên kết đôi còn lại gắn trực tiếp với vòng thơm thể hiện qua tín hiệu tại δH 6,02 (1H, m, H-8) và 6,27 (1H, d, J = 15,5 Hz, H-9). Tín hiệu carbon amid xuất hiện tại δC 165,6 ppm (C-1), carbon nhóm -OCH2O- tại δC 100,9 ppm cùng các carbon đặc trưng của vòng thơm thế và vòng piperidin.
    • Kết luận: Hợp chất PL-I6 được xác định là pipernonalin.

Chương 4: Bàn luận

Tác giả thảo luận về ý nghĩa của kết quả thực nghiệm đạt được:

  • Sự tương đồng với các nghiên cứu quốc tế: Việc phân lập thành công hai hợp chất alkaloid piperin và pipernonalin từ quả Tiêu lốt Việt Nam hoàn toàn trùng khớp với các công bố hóa thực vật kinh điển trên thế giới về loài Piper longum, khẳng định tính đồng nhất về thành phần hợp chất chính của dược liệu dù sinh trưởng ở các vùng sinh thái khác nhau.
  • Về hàm lượng và hiệu suất phân lập: Khối lượng tinh sạch của hai hợp chất thu nhận được trong nghiên cứu rất đáng kể (24,75 g piperin và 0,86 g pipernonalin từ 3 kg quả khô). Đây là những chất chiếm tỷ lệ cao trong phân đoạn ethyl acetat.
  • Hoạt tính sinh học của piperin: Piperin là alkaloid kinh điển mang lại vị cay đặc trưng của chi Piper. Các tài liệu quốc tế ghi nhận hợp chất này có tác dụng kích thích enzym tiêu hóa, tăng tiết nước bọt và dịch vị, tăng cường tính thấm màng tế bào ruột non giúp gia tăng sinh khả dụng của nhiều nhóm dược chất và khoáng chất. Piperin còn có khả năng kháng tế bào ung thư, hạ lipid máu và chống oxy hóa mạnh.
  • Hoạt tính sinh học của pipernonalin: Pipernonalin thể hiện hoạt tính dược lý nổi bật trong việc chống ung thư, đặc biệt là ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư tiền liệt tuyến dòng PC-3 ở người thông qua việc kích hoạt chu trình chết tế bào tự nhiên qua trung gian ROS. Hợp chất này cũng có tác dụng ức chế kết tập tiểu cầu thỏ, diệt côn trùng, kháng ấu trùng muỗi Aedes aegypti truyền bệnh và thể hiện hoạt tính kháng nấm phytopathogenic mạnh (Pyricularia oryzae đạt mức ức chế 91% ở nồng độ 0,5 mg/ml và 80% ở nồng độ 0,25 mg/ml).
  • Tiềm năng ứng dụng làm chất chỉ thị chất lượng: Dựa trên các tiêu chí khoa học của một chất đối chiếu kiểm nghiệm (tính đại diện cho loài, hàm lượng lớn trong dược liệu và gắn liền với các tác dụng dược lý đặc trưng), tác giả nhận định piperin và pipernonalin hoàn toàn đủ tiêu chuẩn để lựa chọn làm chất chuẩn/chất chỉ thị hóa học phục vụ xây dựng tiêu chuẩn cơ sở, kiểm tra và định lượng đánh giá chất lượng quả Tiêu lốt và các chế phẩm chiết xuất từ Tiêu lốt tại Việt Nam.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu mang lại các kết quả thực nghiệm định lượng rõ ràng về hiệu suất chiết xuất phân đoạn và phân lập hợp chất:

Phân đoạn / Hợp chất Khối lượng thu nhận Tỷ lệ / Tính chất cảm quan Công thức phân tử Nhận dạng cấu trúc
Cao tổng ethanol 70% 600,33 g Từ 3 kg dược liệu khô - -
Cao phân đoạn n-hexan 99,83 g Chiết phân bố lỏng - lỏng - -
Cao phân đoạn EtOAc 192,32 g Chiết phân bố lỏng - lỏng - -
Cắn nước 233,94 g Phần dịch hòa tan trong nước - -
Hợp chất PL-16A1 24,75 g Bột màu vàng nhạt C17H19NO3 (m/z 286,2) Piperin
Hợp chất PL-I6 0,86 g Bột màu trắng C21H27NO3 (m/z 343,3) Pipernonalin

Đóng góp khoa học và ứng dụng thực tiễn của đề tài:

  • Lần đầu tiên cung cấp dẫn liệu thực nghiệm có hệ thống về quy trình chiết xuất, phân lập và cấu trúc hóa học của các alkaloid chính từ quả Tiêu lốt (Piper longum L.) được thu hái tại các tỉnh Tây Nguyên, Việt Nam (Gia Lai và Đắk Nông).
  • Thiết lập quy trình phân lập hiệu quả, cho phép thu nhận piperin với khối lượng lớn (24,75 g) từ phân đoạn ethyl acetat bằng kỹ thuật sắc ký cột silica gel pha thường và pipernonalin (0,86 g) qua sắc ký cột pha đảo RP-18 YMC.
  • Cung cấp đầy đủ bộ dữ liệu phổ khối ESI-MS cùng các thông số cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR độ phân giải cao của piperin và pipernonalin, đóng góp vào cơ sở dữ liệu hóa thực vật quốc gia cho chi Piper.
  • Đề xuất cơ sở khoa học cho việc lựa chọn piperin và pipernonalin làm chất chuẩn chỉ thị để kiểm nghiệm và tiêu chuẩn hóa dược liệu quả Tiêu lốt trong tương lai.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận còn một số hạn chế gắn liền với phạm vi và thời gian nghiên cứu thực nghiệm:

  • Nghiên cứu mới chỉ tập trung phân lập các hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat (EtOAc); các phân đoạn chiết có khối lượng lớn khác là cao phân đoạn n-hexan (99,83 g) và phần cắn nước (233,94 g), cũng như nhiều phân đoạn nhỏ còn lại từ cột sắc ký cao EtOAc (như các phân đoạn 1A - 1G, 1K) vẫn chưa được tiến hành khảo sát và tinh chế.
  • Khóa luận dừng lại ở giai đoạn chiết xuất, phân lập và làm sáng tỏ cấu trúc hóa học, chưa tiến hành thử nghiệm hoạt tính sinh học trực tiếp (in vitro hoặc in vivo) trên các chất tinh khiết đã phân lập từ mẫu Tiêu lốt Việt Nam.

Hướng nghiên cứu tiếp theo do tác giả đề xuất:

  • Tiếp tục mở rộng phân lập các hợp chất tự nhiên từ cao tổng ethanol 70%, cao phân đoạn n-hexan, cắn nước và các phân đoạn nhỏ còn lại từ cao phân đoạn ethyl acetat của quả Tiêu lốt.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là nguồn tài liệu chuyên khảo có giá trị chuyên môn cao đối với:

  • Giảng viên, học viên sau đại học và sinh viên thuộc các chuyên ngành Dược học, Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Hóa dược và Dược liệu học đang nghiên cứu về các loài thuộc họ Hồ tiêu (Piperaceae).
  • Các nhà nghiên cứu và kỹ thuật viên kiểm nghiệm dược liệu cần tham khảo quy trình phân lập điều chế piperin và pipernonalin quy mô phòng thí nghiệm, cũng như sử dụng bộ số liệu phổ chuẩn 1H-NMR và 13C-NMR (đo trong CDCl3) để làm căn cứ đối chiếu, nhận dạng cấu trúc các hợp chất alkaloid amid mạch hở.
  • Phần tổng quan tài liệu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của quả Tiêu lốt cung cấp hệ thống tài liệu tham khảo phong phú cho các công trình nghiên cứu phát triển chế phẩm thuốc cổ truyền hoặc thực phẩm bảo vệ sức khỏe từ dược liệu này.

Câu hỏi thường gặp

1. Mẫu quả Tiêu lốt sử dụng trong nghiên cứu có xuất xứ từ đâu và được ai giám định tên khoa học? Mẫu nghiên cứu được thu hái vào ngày 12/09/2020 tại huyện Chư Sê (tỉnh Gia Lai) và huyện Đắk Song (tỉnh Đắk Nông). Mẫu do PGS. Phạm Thanh Huyền và ThS. Nguyễn Văn Hiếu thuộc Khoa Tài nguyên Dược liệu – Viện Dược liệu giám định tên khoa học là Piper longum L., thuộc họ Hồ tiêu (Piperaceae), được lưu trữ dưới mã số tiêu bản N12-PL.

2. Quy trình chiết xuất và phân bố lỏng - lỏng từ 3 kg quả Tiêu lốt khô thu được những phân đoạn nào với khối lượng bao nhiêu? Từ 3 kg quả nghiền nhỏ, chiết hồi lưu bằng ethanol 70% ở 80°C thu được 600,33 g cao tổng ethanol. Phân bố lỏng - lỏng cao tổng này thu được: 99,83 g cao phân đoạn n-hexan; 192,32 g cao phân đoạn ethyl acetat (EtOAc) và 233,94 g cắn nước.

3. Hai hợp chất được phân lập từ phân đoạn EtOAc là những chất nào và có khối lượng bao nhiêu? Hai hợp chất phân lập được là PL-16A1 và PL-I6. Bằng các phương pháp phổ ESI-MS, 1H-NMR và 13C-NMR, hợp chất PL-16A1 được xác định là piperin với khối lượng thu nhận 24,75 g; hợp chất PL-I6 được xác định là pipernonalin với khối lượng thu nhận 0,86 g.

4. Cấu trúc hóa học của pipernonalin khác biệt như thế nào so với piperin qua dữ liệu phổ? Phổ ESI-MS cho thấy pipernonalin (PL-I6) có pic ion giả phân tử tại m/z 343,3 [M+H]+ (công thức C21H27NO3), lớn hơn phân tử lượng của piperin (PL-16A1, m/z 286,2 [M+H]+, C17H19NO3) là 56 đvC, tương ứng với sự có mặt thêm 4 nhóm methylen (-CH2-). Trên phổ NMR, pipernonalin có mạch hydrocacbon no gồm 4 nhóm methylen (δC từ 29,0 đến 32,7 ppm) ngăn cách 2 liên kết đôi trans, trong khi ở piperin hai liên kết đôi này liên hợp trực tiếp với nhau.

5. Tác giả đề xuất ứng dụng thực tiễn gì đối với các hợp chất phân lập được? Do piperin và pipernonalin thu được với khối lượng lớn, có hoạt tính sinh học đại diện cho quả Tiêu lốt, tác giả đề xuất lựa chọn các hợp chất này làm chất chuẩn chỉ thị để phục vụ việc kiểm tra, định lượng và kiểm soát chất lượng dược liệu quả Tiêu lốt cũng như các sản phẩm bào chế từ dược liệu này trong tương lai.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Thị Mỹ Linh đã thực hiện thành công việc chiết xuất hồi lưu và phân đoạn cao chiết từ 3 kg quả Tiêu lốt (Piper longum L.) thu hái tại Gia Lai và Đắk Nông. Bằng kỹ thuật sắc ký cột silica gel pha thường và pha đảo, nghiên cứu đã phân lập được 24,75 g piperin và 0,86 g pipernonalin từ phân đoạn ethyl acetat. Cấu trúc hóa học của hai hợp chất alkaloid này được làm sáng tỏ và chứng minh đầy đủ thông qua các phương pháp phổ khối ESI-MS và phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D-NMR. Kết quả nghiên cứu cung cấp dữ liệu khoa học thực nghiệm quan trọng, làm cơ sở khoa học cho việc định chuẩn và phát triển các ứng dụng dược dụng từ cây Tiêu lốt tại Việt Nam.