MỞ ĐẦU Ung thƣ là một trong những căn bệnh nguy hiểm gây tử vong hàng đầu trên thế giới. Có nhiều nguyên nhân dẫn đến bệnh ung thƣ nhƣ: yếu tố di truyền, tác nhân hóa học, tác nhân vật lý, lây nhiễm virus … Một trong số những bệnh ung thƣ có liên quan tới nhiễm virus đƣợc nghiên cứu nhiều nhất là ung thƣ vòm mũi họng (UTVMH). Nguyên nhân gây ra UTVMH cho tới nay chƣa đƣợc xác định rõ ràng, tuy vậy có rất nhiều giả thuyết, trong đó giả thuyết đƣợc đề cập nhiều nhất là do Epstein Barr virus (EBV) và Human Papilloma virus (HPV). Nhiều nghiên cứu của các tác giả trên thế giới cho thấy UTVMH có liên quan đến sự có mặt của virus EBV, HPV trong máu hoặc niêm mạc họng [4, 27, 36].
Để phát hiện sự có mặt của EBV và HPV ở các bệnh nhân nghi UTVMH, kỹ thuật sinh học phân tử đƣợc áp dụng vì độ chính xác và đặc hiệu cao cho phép định tính, định lƣợng số lƣợng virus trong các mô UTVMH [6, 34]. Việc tách chiết DNA từ mô ngƣời là bƣớc đầu tiên không thể thiếu để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo nhƣ PCR và real time PCR phát hiện EBV, HPV, giải trình tự, xác định đột biến hay chẩn đoán ung thƣ, bệnh học. Hiện nay, các mẫu mô cố định bằng formalin và đúc trong thể vùi parafin (Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue- FFPE Tissue; mô FFPE) đƣợc lƣu trữ rất nhiều tại các khoa bệnh học của bệnh viện cho mục đích chẩn đoán, nghiên cứu hồi cứu về mô bệnh học và di truyền phân tử. Do ƣu điểm bảo quản đƣợc toàn vẹn cấu trúc mô trong thời gian dài từ vài năm đến hàng chục năm, các mẫu mô FFPE là giải pháp đƣợc nhiều bệnh viện, phòng xét nghiệm lựa chọn để giữ lại các mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân ung thƣ, trong đó có UTVMH [8].
Tuy nhiên, việc sử dụng formalin, các tác nhân vùi nhƣ nhiệt độ làm xuất hiện các liên kết chéo giữa nucleic acid với protein và giữa các nucleic acid với nhau gây khó khăn cho quá trình tách chiết đồng thời DNA tách chiết đƣợc bị đứt gãy rất nhiều [23, 30, 38]. Hiện nay, các hãng nổi tiếng về sinh học phân tử trên thế giới nhƣ Thermo Scientific và Promega đã phát triển và thƣơng mại hóa các kit tách 1 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com chiết DNA từ mô FFPE sử dụng cột màng silica hoặc hạt micro từ tính bọc silica đi cùng với các bộ đệm. Theo nguyên lý của Boom và cộng sự, DNA đƣợc bám trên bề mặt của màng silica hoặc hạt micro từ tính thông qua cầu nối Na+ để liên kết với silica và giữ lại bởi nam châm, còn các tạp chất khác đƣợc loại bỏ [9-11, 28]. Hiện nay chƣa có nhóm nghiên cứu nào trong nƣớc phát triển một bộ kit tách chiết DNA từ mô FFPE sử dụng màng/cột silica hay hạt từ tính bọc silica, vì thế hầu hết các bệnh viện và phòng thí nghiệm đều sử dụng kit ngoại nhập với giá thành cao.
Trong các công bố gần đây của nhóm nghiên cứu thuộc phòng Sinh học Nano và Ứng dụng, PTNTĐ Công nghệ Enzym và Protein phối hợp với Trung tâm Nano và Năng lƣợng, hạt oxit sắt từ tính bọc silica (Fe3O4@SiO2) kích thƣớc nano đƣợc chế tạo và thử nghiệm cho việc tách chiết DNA từ virus, tế bào máu, mô tƣơi vì ƣu điểm có tổng diện tích bề mặt tƣơng tác với DNA lớn nên có khả năng gắn kết hiệu quả với DNA hơn dạng cột/màng silica hay hạt micro từ tính bọc silica [5, 35, 40]. Xuất phát từ thực tế nhu cầu sử dụng kit tách chiết DNA từ mô FFPE cho phát hiện các tác nhân virus gây bệnh ung thƣ, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Chế tạo và thử nghiệm bộ kit tách chiết DNA từ các mẫu tiêu bản mô ung thư sử dụng hạt nano từ bọc silica và bộ đệm phù hợp để phát hiện một số virus gây bệnh” với các mục tiêu sau: Chế tạo bộ kit tách DNA từ mô FFPE sử dụng hạt từ bọc silica. Thử nghiệm khả năng tách DNA từ mô FFPE của bộ kit trên các mẫu mô FFPE ở bệnh nhân UTVMH để phát hiện EBV-DNA và HPV-DNA. 2 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com CHƢƠNG 1.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. UNG THƢ VÒM HỌNG (UTVMH) VÀ VIRUS GÂY UTVMH 1. Giới thiệu chung về UTVMH Ung thƣ vòm mũi họng (UTVMH) là một dạng ung thƣ xuất phát từ các tế bào biểu mô ở vùng vòm mũi họng (phần cao nhất của họng, có hình vòm). UTVMH thƣờng gặp ở nam giới và để lại nhiều hậu quả nhƣ đau đớn và khó khăn trong quá trình ăn uống với hầu hết bệnh nhân, tỉ lệ tử vong vì căn bệnh này cao.
UTVMH có thể gặp ở mọi lứa tuổi nhƣng đặc biệt hay mắc phải là ở nam giới, tuổi từ 40 đến 60. UTVMH là thể ung thƣ thƣờng gặp nhất trong số các ung thƣ ở vùng đầu cổ và là một trong mƣời ung thƣ phổ biến nhất tại Việt Nam. Những ngƣời hay uống rƣợu, hút thuốc, có tiền sử gia đình bị bệnh… cũng có nguy cơ mắc UTVMH. Nhƣng các triệu chứng lại không điển hình, hầu hết là các triệu chứng của các cơ quan lân cận nhƣ: tai, mũi, thần kinh, hạch…do đó việc chẩn đoán gặp nhiều khó khăn.
Vẫn chƣa có một thống kê đầy đủ, chính xác nhƣng theo thống kê của Bệnh viện K - Hà Nội (1998) thì UTVMH đứng hàng thứ 5 sau ung thƣ phổi, tử cung, buồng trứng, vú, ung thƣ gan và là bệnh đứng đầu trong các ung thƣ vùng đầu, cổ với tỷ lệ: 9 - 10 bệnh nhân/100. Nguyên nhân gây ra UTVMH cho tới nay chƣa đƣợc xác định rõ ràng tuy vậy có rất nhiều giả thuyết, trong đó giả thuyết đƣợc đề cập nhiều nhất là do EBV và HPV. Nhiều nghiên cứu của các tác giả trên thế giới cho thấy UTVMH có liên quan đến sự có mặt của virus EBV, HPV trong máu hoặc niêm mạc họng [7, 8]. Tuy nhiên, tỷ lệ phát hiện về sự liên quan giữa EBV, HPV và UTVMH còn là vấn đề gây tranh cãi.
Bằng kĩ thuật PCR, Hording phát hiện ra sự có mặt của HPV trong nhiều mẫu UTVMH mà các mẫu này hoàn toàn âm tính với EBV [27]. Trong khi đó, cũng bằng kĩ thuật này Rassekh phát hiện tỷ lệ các mẫu mô tƣơi UTVMH có HPV là 88% và tỷ lệ có chứa EBV là 53% [36]; Du- Bois và cs nghiên cứu trên mẫu mô FFPE UTVMH chỉ phát hiện đƣợc tỷ lệ mẫu dƣơng tính với EBV là 25% và 19,4% với HPV[20]. Một số nghiên cứu khác cho thấy kháng thể chống virus EBV, HPV cao ở các bệnh nhân UTVMH loại biểu mô không biệt hoá [18, 41]. 3 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.1: Ảnh chụp vòm họng của bênh nhân ung thƣ vòm họng [44] 1.
Epstein-Barr virus (EBV) tác nhân gây UTVMH Biếu mô vùng vòm mũi họng là vị trí chủ yếu cho EBV tìm kiếm tế bào thích ứng thực hiện sự nhân lên tạo ra nhiều thể virus hoàn chỉnh mới. Ngoài ra, vùng mũi họng còn có hệ thống dẫn lƣu bạch huyết rất phong phú, nên trong UTVMH các hạch vùng cổ thƣờng bị di căn rất sớm. UTVMH đƣợc xếp vào các khối u đƣờng tiêu hóa và hô hấp trên. Về mặt lâm sàng, UTVMH có triệu chứng khá phong phú, dễ bị chẩn đoán nhầm với các bệnh thông thƣờng khác trong tai mũi họng.
Do vậy, các bệnh nhân thƣờng đến khám và đƣợc chuẩn đoán ở các giai đoạn muộn của bệnh, điều này làm ảnh hƣởng tới kết quả điều trị bệnh [19]. Tại Việt Nam, đã có nhiều nhóm nghiên cứu mối liên quan của EBV và UTVMH. Tác giả Phạm Huy Tần và cộng sự thuộc Trƣờng ĐH Y Hà Nội đã nghiên cứu phát hiện nồng độ DNA của EBV trong huyêt tƣơng ở 74 bệnh nhân UTVMH giai đoạn I và II-IVB và phát hiện thấy tỷ lệ EBV dƣơng tính lên tới khoảng 63- 67%. Nhóm tác giả cũng chỉ ra có mối tƣơng quan giữa nồng độ EBV với tình trạng di căn hạch và giai đoạn ung thƣ (giai đoạn II đến IV) của bệnh nhân [4].
Tác giả Nghiêm Đức Thuận tại Học Viện Quân Y cũng đã công bố về nghiên cứu phát hiện DNA của biểu mô sống không sừng hóa là 55%. Tác giả Phạm Thị Trà, tại phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym & Protein đã công bố về phát hiện EBV trong mẫu huyết thanh của bệnh nhân nghi có triệu chứng của bệnh UTVMH với tỷ lệ mẫu dƣơng tính phát hiện chỉ là 9% [5]. 4 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail. Giới thiệu chung về EBV Nhóm tác giả Epstein, Barr và Pulvertafl phân lập đƣợc loại virus ở dòng lymphoblast trong khối u LB (Lympho’s Burkitt) bằng kính hiển vi điện tử [21] từ năm 1964 và từ đó, virus này đƣợc mang tên là Epstein Barr virus.
Tác giả Nadol và cộng sự phân lập đƣợc các hạt (virion) của EBV trong tế bào biểu mô ung thƣ vòm bằng kính hiển vi điện tử. Đây là lần đầu ngƣời ta quan sát đƣợc các thể virus thuộc họ Herpesviridae trong tế bào ung thƣ ở ngƣời, do đó EBV bị nghi ngờ là nguyên nhân gây ung thƣ ở ngƣời [1].2: Hình ảnh Epstein Barr Virus dƣới kính hiển vi điện tử [44] EBV thuộc họ virus Herpesviridae, có hệ gen thuộc loại DNA sợi đôi xoắn kép mạch hở, kích thƣớc hệ gen khoảng 184 kb nếu tính cả phần lặp lại ở hai đầu. Hệ gen EBV có tổ hợp 6 gen mã hóa cho các loại protein kháng nguyên nhân (Epstein Barr virus nuclear antigen), đƣợc ký hiệu là: EBNA-1, EBNA-2, EBNA- 3A, EBNA-3B, EBNA-3C, EBNA-LB và 3 gen mã hóa cho protein màng tiềm tàng (latent membral protein), đƣợc ký hiệu là: LMP-1, LMP-2A, LMP-2B [16]. Vai trò của 6 protein EBNA có liên quan đến quá trình nhân lên của EBV trong tế bào lympho B ở giai đoạn đầu xâm nhiễm còn 3 loại protein LMP có liên quan đến chu kỳ nhân lên của EBV trong tế bào lympho B.
Gen mã hóa cho protein EBNA-2 là một phân đoạn cơ bản trong gen EBNA của hệ gen EBV. EBNA-2 có vai trò biệt hóa tế bào lympho B thành tế bào mầm non hóa để EBV thực hiện quá trình gây ung thƣ. Hơn nữa, gen EBNA-2 là gen 5 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com đƣợc sao chép sớm nhất do vai trò của nó trong quá trình điều tiết sự nhân lên của tế bào bị nhiễm. EBNA-2 điều hòa quá trình sao chép gen và tổng hợp protein của cả virus và tế bào bị nhiễm EBV, protein EBNA-2 đƣợc coi là yếu tố quan trọng trong cảm ứng tăng sinh dòng tế bào lympho B [35].
Toàn bộ hệ gen của EBV đƣợc chứa trong một vỏ capsid.