Tổng quan luận án

Bệnh bạc lá lúa (Bacterial Leaf Blight - BLB) do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae (viết tắt là Xoo) gây ra là một trong những bệnh hại nguy hiểm hàng đầu đối với sản xuất lúa gạo tại Việt Nam và trên thế giới. Theo thống kê của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc (FAO), bệnh bạc lá làm suy giảm nghiêm trọng cường độ quang hợp, tăng cường hô hấp và kéo dài thời gian trỗ, dẫn đến tỷ lệ hạt lép cao, làm sụt giảm 20% đến 50%, thậm chí lên đến 100% năng suất thu hoạch ở các vùng dịch hại. Tại Việt Nam, bệnh phát sinh mạnh ở các vụ lúa Mùa tại các tỉnh phía Bắc và khu vực đồng bằng sông Cửu Long.

Giống lúa Bắc Thơm 7 (BT7) là giống lúa thuần thuộc loài phụ indica, được công nhận sản xuất kinh doanh theo Quyết định số 74/2004/QĐ-BNN ngày 16/12/2004. BT7 sở hữu nhiều đặc tính nông sinh học giá trị: thời gian sinh trưởng ngắn (125–130 ngày trong vụ Xuân; 105–110 ngày trong vụ Mùa), chiều cao cây 100–105 cm, năng suất trung bình 50–55 tạ/ha, khối lượng 1000 hạt đạt 18,5–19,5 g, hàm lượng amylose đạt 13–19%, chất lượng gạo thơm ngon, cơm mềm. Tại một số địa phương như Nam Định, diện tích gieo trồng BT7 năm 2021 chiếm tới 63,03% (45.250,5 ha). Tuy nhiên, BT7 rất mẫn cảm với vi khuẩn Xoo (điểm nhiễm bệnh thường từ 5 đến 9), gây thiệt hại nặng nề đến sản lượng lúa thu hoạch.

Các biện pháp phòng trừ hóa học và canh tác truyền thống ít mang lại hiệu quả bền vững đối với bệnh bạc lá. Trong khi đó, vi khuẩn Xoo xâm nhiễm và gây bệnh thông qua hệ thống tiết loại III (Type III secretion system - T3SS), tiết các protein giống yếu tố hoạt hóa phiên mã (Transcription activator-like effector - TAL) gắn đặc hiệu vào các yếu tố liên kết thụ thể (Effector binding element - EBE) nằm trên vùng promoter của các gen gây nhiễm (Susceptibility gene - gen S) thuộc họ vận chuyển đường OsSWEET, đặc biệt là OsSWEET14. Đột biến có chủ đích tại vùng EBE trên promoter OsSWEET14 có thể phá vỡ liên kết với protein TAL, giúp cây lúa kháng lại sự xâm nhiễm của Xoo mà vẫn giữ nguyên nền di truyền của giống gốc.

Xuất phát từ thực tiễn trên, tác giả Vũ Hoài Sâm đã thực hiện luận án tiến sĩ nông nghiệp với đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ CRISPR/Cas9 chỉnh sửa promoter OsSWEET14 nhằm nâng cao tính kháng bệnh bạc lá ở giống lúa Bắc Thơm 7”, thuộc chuyên ngành Công nghệ Sinh học (Mã số: 9420201), dưới sự hướng dẫn của GS. Phạm Xuân Hội và TS. Nguyễn Duy Phương tại Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam. Nghiên cứu được hỗ trợ kinh phí từ Đề tài cấp Quốc gia: “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ chỉnh sửa hệ gen để cải tạo tính trạng mùi thơm và kháng bạc lá trên một số giống lúa chủ lực của Việt Nam” (giai đoạn 2017–2020).

Mục tiêu chung của luận án là ứng dụng công nghệ CRISPR/Cas9 để tăng cường tính kháng bệnh bạc lá cho giống lúa BT7 thông qua chỉnh sửa promoter OsSWEET14.

Mục tiêu cụ thể gồm 4 nội dung:

  1. Tối ưu quy trình chuyển gen vào phôi non (Immature embryo – IE) giống lúa BT7 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
  2. Thiết kế cấu trúc T-DNA biểu hiện phức hệ CRISPR/Cas9 chỉnh sửa promoter OsSWEET14 của giống lúa BT7 (ký hiệu: SW14-BT).
  3. Tạo dòng lúa BT7 mang đột biến chính xác trên SW14-BT bằng hệ thống CRISPR/Cas9.
  4. Sàng lọc dòng lúa BT7 chỉnh sửa SW14-BT tăng cường tính kháng với vi khuẩn Xoo thu thập tại Việt Nam (VXO).

Phạm vi nghiên cứu:

  • Không gian: Các thí nghiệm vi sinh vật, nuôi cấy mô và sinh học phân tử được thực hiện tại Bộ môn Bệnh học Phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp. Các thí nghiệm nông học, gieo trồng và đánh giá tính kháng bệnh được triển khai tại nhà lưới an toàn sinh học của Viện Di truyền Nông nghiệp (số 1 đường Phạm Văn Đồng, quận Bắc Từ Liêm, Hà Nội).
  • Thời gian thực hiện: Từ tháng 08/2017 đến tháng 12/2021.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu của luận án tập hợp hệ thống các nghiên cứu về công nghệ chỉnh sửa gen, cơ chế bệnh học phân tử của vi khuẩn Xoo và các chiến lược chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá:

  1. Sự phát triển của các công nghệ chỉnh sửa hệ gen: Luận án hệ thống hóa 4 thế hệ công cụ nuclease nhân tạo gồm Meganuclease, Zinc-Finger Nuclease (ZFN), TALEN và CRISPR/Cas9. Năm 2012, Jinek và cộng sự đã công bố cơ chế cắt DNA đặc hiệu in vitro của phức hệ Cas9 kết hợp RNA dẫn đường đơn (sgRNA) từ Streptococcus pyogenes. Phức hệ Cas9:sgRNA nhận biết trình tự đích dài 20 nucleotide liền kề với motif PAM (5'-NGG-3') và tạo vết đứt gãy sợi đôi (DSB), kích hoạt hai cơ chế sửa chữa nội bào: ghép nối tận cùng không tương đồng (NHEJ/altNHEJ) gây đột biến mất/chèn nucleotide nhỏ (indels), hoặc tái tổ hợp tương đồng (HDR) giúp sửa chữa chính xác khi có mặt trình tự khuôn.
Đặc điểm Meganuclease ZFN TALEN CRISPR/Cas9
Nguồn gốc Sinh vật nhân thực Sinh vật nhân sơ và nhân thực Vi khuẩn Xanthomonas Streptococcus pyogenes
Mô-đun liên kết DNA – Protein DNA – Protein DNA – Protein DNA – RNA
Mô-đun cắt Cặp Protein Cặp Protein (FokI) Cặp Protein (FokI) Protein đơn Cas9 + gRNA
Chiều dài trình tự đích 12 – 40 bp 18 – 24 bp 24 – 59 bp 20 bp
Tần suất điểm cắt 1/1.000 bp 1/140 bp 1 tiểu đơn vị/1 bp 1/13 bp (PAM)
Độ đặc hiệu Trung bình Trung bình Trung bình Cao
Khả năng thí nghiệm Đắt đỏ, tốn thời gian Phức tạp, đắt đỏ, cần kỹ thuật cao Nhanh, đơn giản, chi phí thấp Nhanh, đơn giản, giá rẻ

  1. Cơ chế phân tử gây bệnh bạc lá của vi khuẩn Xoo: Xoo tiết các protein TAL qua hệ thống T3SS vào nhân tế bào lúa. Protein TAL có cấu trúc bảo thủ ở hai đầu N và C, vùng lặp lại gồm 33–35 acid amin với các vị trí siêu biến đổi (RVD) ở acid amin 12 và 13 (ví dụ: NI liên kết A, HD liên kết C, NG liên kết T, NN liên kết G/A). Các protein TAL bám vào vùng EBE trên promoter của các gen vận chuyển đường họ OsSWEET (OsSWEET11, OsSWEET12, OsSWEET13, OsSWEET14, OsSWEET15) để kích hoạt biểu hiện gen, bơm đường ra gian bào nuôi dưỡng vi khuẩn (Chen et al., 2010; Yang et al., 2006). Gen OsSWEET14 (NST số 11) là đích tấn công hội tụ của 4 protein TAL khác nhau: AvrXa7 (từ chủng PXO86), PthXo3 (chủng PXO61), Tal5/TalF (chủng MAL1) và TalC (chủng BAI3) (Antony et al., 2010; Streubel et al., 2013; Blanvillain-Baufumé et al., 2017).

  2. Tình hình chọn tạo giống lúa kháng bạc lá:

    • Dựa trên gen kháng (R gene): Có 45 gen kháng tự nhiên đã được phát hiện (Xa1 đến Xa45), bao gồm gen trội và gen lặn (xa5, xa13, xa25, xa41(t)). Tuy nhiên, các giống mang đơn gen kháng thường bị bẻ gãy tính kháng nhanh chóng do quần thể vi khuẩn Xoo biến đổi liên tục (Nguyễn Thị Thơ và cs., 2022). Việc lai quy tụ đa gen kháng (như các dòng IRBB50, IRBB56, IRBB66) đòi hỏi nhiều thời gian và quần thể phân ly lớn.
    • Dựa trên đột biến gen nhiễm (S gene): Blanvillain-Baufumé và cộng sự (2017) đã dùng dTALEN chỉnh sửa promoter OsSWEET14 tạo tính kháng phổ rộng; Oliva và cộng sự (2019) dùng CRISPR/Cas9 chỉnh sửa đồng thời OsSWEET11, OsSWEET13 và OsSWEET14 trên các giống Kitaake, IR64, Ciherang-Sub1; Zafar và cộng sự (2020) chỉnh sửa 4 EBE trên OsSWEET14 ở giống lúa Basmati.

  3. Khoảng trống nghiên cứu: Tại Việt Nam, trước thời điểm nghiên cứu, các công trình cải tiến giống BT7 chủ yếu sử dụng lai hồi giao kết hợp chỉ thị phân tử (MAS) để đưa các gen kháng Xa21, xa5 (Lưu Văn Quyết và cs., 2014; Phạm Thiên Thành và cs., 2019) hoặc gen chống chịu ngập, mặn Sub1, Saltol (Chu Đức Hà và cs., 2019). Chưa có công trình nào ứng dụng công nghệ CRISPR/Cas9 để chỉnh sửa vùng promoter gen nhiễm OsSWEET14 nhằm tạo tính kháng bệnh bạc lá cho giống lúa BT7.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án kết hợp giữa lý thuyết sinh học phân tử hiện đại (cơ chế chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9, tương tác TALE-EBE, cơ chế biểu hiện gen nhiễm) và kỹ thuật thực nghiệm công nghệ sinh học thực vật.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

  • Vật liệu sinh học: Giống lúa Bắc Thơm 7 (BT7); các chủng vi khuẩn Xoo phân lập tại Việt Nam (VXO_11, VXO_60, VXO_96); chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang cấu trúc chuyển gen; các vector dòng hóa (pGEM-T Easy, pENTR4-gRNA, pCas9-GW).
  • Kỹ thuật nuôi cấy mô và chuyển gen: Tách phôi non (IE) từ hạt lúa BT7 sau thụ phấn (DAP), khử trùng bằng NaOCl 1,0%, nuôi cấy tạo mô sẹo trong điều kiện tối/sáng, tối ưu hóa nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật (2,4-D, NAA, Kinetin, BAP), nước dừa, mật độ vi khuẩn A. tumefaciens, thời gian đồng nuôi cấy và nồng độ Acetosyringone (AS).
  • Kỹ thuật sinh học phân tử: Tách chiết DNA tổng số bằng phương pháp CTAB; tách chiết RNA tổng số và phân tích RT-PCR đánh giá mức độ biểu hiện gen; khuếch đại gen bằng PCR; dòng hóa phân tử; thiết kế sgRNA dựa trên phần mềm tin sinh học; sàng lọc đột biến bằng enzyme cắt lệch bắt cặp T7 Endonuclease I (T7E1); giải trình tự nucleotide theo phương pháp Sanger.
  • Phương pháp lây nhiễm nhân tạo và đánh giá tính kháng bệnh: Lây nhiễm vi khuẩn Xoo trên lá lúa ở giai đoạn làm đòng - trỗ bông bằng phương pháp cắt mép lá (leaf clipping method), đo chiều dài vết bệnh và đánh giá theo thang điểm chuẩn đánh giá tính kháng bệnh bạc lá của IRRI.
  • Phương pháp đánh giá nông sinh học: Đánh giá các chỉ tiêu sinh trưởng, phát triển, chiều cao cây, số nhánh hữu hiệu, tỷ lệ hạt chắc, khối lượng 1000 hạt của các dòng lúa chuyển gen T0, T1 trồng trong nhà lưới an toàn sinh học.
  • Phương pháp xử lý số liệu: Thu thập và phân tích dữ liệu thống kê sinh học bằng phần mềm SPSS, tính toán giá trị trung bình và độ lệch chuẩn (SD).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu về nội dung nghiên cứu

Chương 1 tổng hợp có hệ thống cơ sở lý luận và các công bố khoa học trong và ngoài nước liên quan đến đề tài:

  • Trình bày lịch sử phát hiện, cấu trúc và cơ chế phân tử của hệ thống CRISPR/Cas9. Phân tích chi tiết vai trò của endonuclease Cas9, cấu trúc sgRNA và trình tự PAM (5'-NGG-3').
  • Tổng hợp các ứng dụng tiêu biểu của CRISPR/Cas9 trên cây lúa nhằm cải thiện năng suất (OsGS3, OsGW2, OsGN1a, OsPIN5b), chất lượng gạo (OsAAP10, OsGBSS1), tính kháng stress phi sinh học (OsDST, OsSRL1, OsRP22) và stress sinh học (OsSWEET11, OsSWEET13, OsSWEET14).
Mục tiêu Gen đích Loại đột biến Vị trí đột biến Tính trạng cải tiến
Cải thiện năng suất OsLOLG5 Mất nucleotide Exon (dịch khung) Tăng số hạt và trọng lượng hạt
OsPIN5b Mất nucleotide Exon 1 (dịch khung) Tăng số nhánh và chiều dài bông
OsGS3, OsGW2, OsGN1a Mất nucleotide Exon 2, Exon 1, Exon 4 Tăng chiều dài, chiều rộng và số hạt
Cải thiện chất lượng OsAAP10 Thêm/Mất nucleotide Exon 1 (dịch khung) Gạo dẻo, cơm ngon (ECQ)
OsGBSS1 Thêm/Mất nucleotide Promoter và 5'UTR Hàm lượng amylose thấp
Kháng stress sinh học SWEET11, 13, 14 Thêm/Mất nucleotide Vùng promoter Kháng bệnh bạc lá (Xoo)
Kháng stress phi sinh học OsSRL1, OsSRL2 Mất nucleotide Exon (dịch khung) Chịu hạn
OsRP22 Mất nucleotide Exon 1 (dịch khung) Chịu mặn
OsDST Mất nucleotide Exon (dịch khung) Chịu hạn, chịu mặn
Kháng thuốc diệt cỏ OsAL1 Thay thế nucleotide Exon (bất hoạt) Chịu bispyribacsodium
  • Phân tích dịch tễ, triệu chứng, đường xâm nhiễm và đặc điểm sinh học của vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae. Trình bày cơ chế tương tác giữa protein TAL và promoter các gen SWEET, vị trí của các vùng EBE (AvrXa7, PthXo3, Tal5/TalF, TalC) trên promoter OsSWEET14.
  • Đánh giá hiện trạng sản xuất giống lúa BT7, mức độ mẫn cảm với bệnh bạc lá và kết quả các nghiên cứu cải tiến di truyền BT7 trước đây.
  • Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens vào phôi non và mô sẹo của các giống lúa thuộc loài phụ indica và japonica.
Giống lúa Loài phụ Chủng A. tumefaciens Hiệu quả biến nạp (%)
Kasalath Indica EHA 105 66,9
Pusa Basmati Indica EHA 105 26,0
MR219 Indica LBA4404 35,0
Handao 297 Japonica ALG1 20,0
Zhenshan 97 Indica EHA 105 85,2
IR64 Indica LBA4404 12,0
IR36 Indica EHA 105 99,05
Zhonghua 11 Japonica EHA 105 66,7
Samba Mahsuri Indica LBA4404 30,0
JK1044R Indica EHA 105 30,0
Nipponbare Japonica EHA 105 41,2
Chành Trụi Japonica EHA 105 25,0
Taichung 65 Japonica EHA 105 90,0

Chương 2: Nguyên liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết đối tượng, vật liệu, quy trình bố trí thí nghiệm và các kỹ thuật thực nghiệm:

  • Nguyên liệu: Hạt non của giống lúa BT7 làm nguồn thu nhận phôi non (IE); các chủng vi khuẩn Xoo phân lập tại Việt Nam (VXO_11, VXO_60, VXO_96); các chủng Escherichia coli DH5α, Agrobacterium tumefaciens (EHA105); các vector plasmid pGEM-T Easy, pENTR4-gRNA, pCas9-GW mang gen chỉ thị kháng hygromycin (hpt).
  • Quy trình tối ưu hóa chuyển gen vào IE: Thử nghiệm ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùng NaOCl (1,0%), thời gian khử trùng; ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng/tối đến quá trình tăng sinh và chất lượng mô sẹo; tối ưu môi trường tái sinh chồi từ mô sẹo kết hợp chất điều hòa sinh trưởng và nước dừa; khảo sát mật độ vi khuẩn A. tumefaciens ($\text{OD}_{600}$), thời gian đồng nuôi cấy, tuổi phôi non (ngày sau thụ phấn - DAP) và nồng độ chất kích hoạt Acetosyringone (AS).
  • Quy trình thiết kế cấu trúc CRISPR/Cas9: Phân lập và giải trình tự đoạn promoter OsSWEET14 từ giống lúa BT7 (SW14-BT); phân tích vị trí các hộp EBE; thiết kế các đoạn crRNA dẫn đường đặc hiệu; lắp ráp cassette biểu hiện sgRNA dưới sự điều khiển của promoter U6 hoặc U3 vào vector pENTR4-gRNA; thực hiện phản ứng tái tổ hợp Gateway chuyển cassette sgRNA vào vector biểu hiện nhị phân pCas9-GW; biến nạp vector tái tổ hợp vào A. tumefaciens.
  • Phương pháp phân tích thể đột biến và đánh giá tính kháng: Tách chiết DNA/RNA từ lá lúa tái sinh T0 và các thế hệ phân ly T1; PCR kiểm tra sự có mặt của cấu trúc chuyển gen T-DNA (sử dụng mồi đặc hiệu gen cas9 và hpt); sàng lọc đột biến bằng enzyme T7E1; giải trình tự Sanger để xác định chính xác kiểu đột biến (mất đoạn, chèn đoạn); phân tích RT-PCR đánh giá mức độ cảm ứng phiên mã OsSWEET14 sau khi lây nhiễm vi khuẩn; lây nhiễm nhân tạo vi khuẩn VXO_11, VXO_60, VXO_96 bằng phương pháp cắt mép lá; theo dõi sự phát triển của vết bệnh sau 14–21 ngày; ghi nhận các chỉ tiêu nông sinh học trong điều kiện nhà lưới.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được của luận án, chia thành 4 phần chính:

1. Xây dựng quy trình chuyển gen vào phôi non (IE) giống lúa BT7

  • Khử trùng hạt non lúa BT7 bằng NaOCl 1,0% trong thời gian tối ưu cho tỷ lệ mẫu sạch và tỷ lệ tạo mô sẹo phát sinh cao.
  • Điều kiện nuôi cấy tối hoàn toàn thúc đẩy tỷ lệ tăng sinh và chất lượng mô sẹo phôi non vượt trội so với điều kiện chiếu sáng.
  • Bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thích hợp kết hợp nước dừa giúp tối ưu hóa hiệu suất tái sinh chồi từ mô sẹo.
  • Xác định các thông số tối ưu cho quá trình biến nạp thông qua vi khuẩn A. tumefaciens: tuổi phôi non thích hợp (tính theo số ngày sau thụ phấn - DAP), mật độ quang học của dịch khuẩn ($\text{OD}_{600}$), thời gian đồng nuôi cấy và nồng độ Acetosyringone (AS) bổ sung. Quy trình chuyển gen tối ưu đạt hiệu suất 20,68%.

2. Thiết kế cấu trúc T-DNA chỉnh sửa SW14-BT

  • Khảo sát độc tính của các chủng vi khuẩn Xoo Việt Nam (VXO_11, VXO_60, VXO_96) trên giống lúa BT7; phân tích biểu hiện của gen OsSWEET14 qua RT-PCR cho thấy OsSWEET14 bị kích hoạt biểu hiện mạnh mẽ sau khi lây nhiễm vi khuẩn, khẳng định vai trò là gen gây nhiễm quan trọng ở BT7.
  • Phân lập thành công đoạn promoter OsSWEET14 từ giống lúa BT7 (SW14-BT) dài khoảng 1,1 kb, dòng hóa vào vector pGEM-T Easy và xác định trình tự nucleotide.
  • Phân tích tin sinh học phát hiện các vùng EBE bảo thủ trên SW14-BT tương tác với các protein TAL của Xoo. Thiết kế và sàng lọc các ứng viên crRNA đặc hiệu hướng tới vùng EBE AvrXa7/PthXo3/Tal5/TalF trên SW14-BT.
  • Lắp ráp thành công cassette sgRNA vào vector trung gian pENTR4-gRNA, sau đó tái tổ hợp vào vector nhị phân pCas9-GW tạo cấu trúc hoàn chỉnh pCas9/gRNA-SW14. Kiểm tra cấu trúc bằng PCR trực tiếp khuẩn lạc và giải trình tự khẳng định độ chính xác.

3. Tạo dòng lúa BT7 chỉnh sửa SW14-BT

  • Biến nạp cấu trúc pCas9/gRNA-SW14 vào mô sẹo phôi non BT7 thông qua A. tumefaciens, chọn lọc trên môi trường chứa hygromycin và tái sinh cây chuyển gen thế hệ T0.
  • Sàng lọc kiểu gen các cá thể T0: Kiểm tra sự có mặt của T-DNA bằng PCR với mồi khuếch đại gen cas9 và hpt; phát hiện các cá thể mang đột biến tại vị trí đích bằng enzyme cắt T7E1; giải trình tự Sanger để xác định chi tiết các dạng đột biến (chủ yếu là mất vài nucleotide hoặc chèn nucleotide đơn).
  • Theo dõi sự sinh trưởng, khả năng tạo hạt của các cây lúa T0 trong điều kiện nhà lưới.
  • Thu hạt và gieo trồng thế hệ T1; phân tích sự phân ly di truyền của T-DNA và phân ly đột biến SW14-BT ở thế hệ T1. Luận án đã sàng lọc và thu nhận được 8 dòng lúa BT7 T1 mang đột biến SW14-BT ở trạng thái đồng hợp tử và hoàn toàn không chứa cấu trúc ngoại lai T-DNA (T-DNA-free).

4. Đánh giá đặc điểm của dòng lúa BT7 chỉnh sửa SW14-BT

  • Đặc điểm nông sinh học: Đánh giá các chỉ tiêu kiểu hình chính của các dòng BT7 T1 chỉnh sửa gen (chiều cao cây, số nhánh hữu hiệu, hình thái bông, tỷ lệ kết hạt, khối lượng 1000 hạt) cho thấy các dòng này phát triển bình thường, không có sự sai khác mang tính tiêu cực so với giống lúa đối chứng BT7 ban đầu.
  • Mức độ biểu hiện OsSWEET14: Phân tích RT-PCR trên các dòng chỉnh sửa gen sau khi lây nhiễm vi khuẩn Xoo cho thấy gen OsSWEET14 không còn bị kích hoạt biểu hiện bất thường như ở cây đối chứng mẫn cảm.
  • Khả năng kháng bệnh bạc lá: Đánh giá tính kháng khi lây nhiễm nhân tạo với các chủng vi khuẩn VXO:
    • Thu nhận được 2 dòng lúa BT7 chỉnh sửa SW14-BT có khả năng kháng hoàn toàn với chủng vi khuẩn VXO_11 (vết bệnh tiêu biến hoặc giới hạn rất ngắn, đạt tiêu chuẩn dòng kháng).
    • Đối với các chủng VXO_60 và VXO_96, các dòng chỉnh sửa SW14-BT biểu hiện phản ứng khác nhau, cho thấy độc tính của các chủng này phụ thuộc vào nhiều protein TAL khác tác động lên các gen SWEET khác ngoài OsSWEET14.

Kết quả và những đóng góp mới

Kết quả và đóng góp mới của luận án

  1. Xây dựng quy trình chuyển gen hiệu suất cao: Tối ưu hóa thành công các điều kiện lý hóa và sinh học để chuyển gen vào phôi non (IE) của giống lúa indica Bắc Thơm 7 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, đạt hiệu suất chuyển gen là 20,68%.
  2. Làm sáng tỏ cơ chế bệnh học phân tử: Xác định được gen OsSWEET14 đóng vai trò là một gen gây nhiễm then chốt đối với bệnh bạc lá ở giống lúa BT7 khi bị tấn công bởi các chủng vi khuẩn Xoo Việt Nam.
  3. Thiết kế thành công hệ thống vector chỉnh sửa gen: Thiết kế và hoàn thiện cấu trúc vector chuyển gen mang hệ thống CRISPR/Cas9 nhắm trúng đích vùng promoter OsSWEET14 của giống lúa BT7 (SW14-BT).
  4. Tạo vật liệu di truyền sạch T-DNA: Ứng dụng thành công CRISPR/Cas9 để tạo ra 8 dòng lúa BT7 thế hệ T1 mang đột biến chỉnh sửa promoter OsSWEET14 ở trạng thái đồng hợp tử, đã đào thải hoàn toàn cấu trúc T-DNA ngoại lai qua phân ly di truyền và duy trì được các đặc tính nông sinh học chính tương tự giống gốc.
  5. Tạo dòng lúa kháng bệnh bạc lá: Chọn lọc được 2 dòng lúa BT7 đột biến SW14-BT biểu hiện tính kháng hoàn toàn đối với chủng vi khuẩn Xoo Việt Nam mang mã số VXO_11.
  6. Bổ sung dẫn liệu về tính đa dạng của quần thể Xoo: Luận án xác định chủng VXO_11 gây bệnh trên BT7 thông qua một protein TAL độc duy nhất gắn với vị trí EBE AvrXa7/PthXo3/TalF; trong khi độc tính của hai chủng VXO_60 và VXO_96 phụ thuộc vào ít nhất 2 protein TAL khác nhau.

Kiến nghị và đề xuất

  • Sử dụng các dòng lúa BT7 chỉnh sửa SW14-BT (đồng hợp tử, không mang T-DNA) làm nguồn vật liệu khởi đầu cho các chương trình chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá tiếp theo.
  • Tiếp tục ứng dụng các cấu trúc vector chỉnh sửa promoter OsSWEET14 đã thiết kế để nghiên cứu cải tạo tính kháng bạc lá trên các giống lúa thuần chất lượng cao khác của Việt Nam.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế

  • Các thí nghiệm đánh giá kiểu hình nông sinh học và phản ứng kháng bệnh bạc lá của các dòng lúa chỉnh sửa gen mới chỉ được thực hiện trong phạm vi nhà lưới an toàn sinh học của Viện Di truyền Nông nghiệp, chưa được khảo nghiệm trên diện rộng tại các vùng sinh thái ngoài đồng ruộng.
  • Nghiên cứu chỉ tập trung chỉnh sửa đơn gen OsSWEET14, do đó các dòng tạo ra mới chỉ kháng hoàn toàn với chủng VXO_11 (phụ thuộc vào EBE trên OsSWEET14), chưa kháng triệt để đối với các chủng Xoo phức tạp khác (như VXO_60, VXO_96) vốn có thể sử dụng đồng thời nhiều protein TAL để kích hoạt các gen SWEET khác (OsSWEET11, OsSWEET13).

Hướng nghiên cứu tiếp

  • Tiếp tục nhân dòng và mở rộng khảo nghiệm các dòng lúa BT7 đột biến đồng hợp sạch T-DNA ở các điều kiện sinh thái khác nhau để đánh giá tính ổn định về năng suất, chất lượng hạt gạo và tính kháng bệnh trong điều kiện sản xuất.
  • Ứng dụng chiến lược chỉnh sửa đa gen (multiplex CRISPR/Cas9) để can thiệp đồng thời vào promoter của các gen OsSWEET11, OsSWEET13 và OsSWEET14, nhằm tạo ra các dòng lúa BT7 có khả năng kháng phổ rộng với toàn bộ các nhóm nòi vi khuẩn Xoo tại Việt Nam.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo khoa học có giá trị chuyên môn cao đối với nhiều nhóm đối tượng:

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên ngành Công nghệ Sinh học, Di truyền học, Bảo vệ Thực vật: Cung cấp tài liệu tham khảo chi tiết về quy trình kỹ thuật chuyển gen trên đối tượng lúa indica, phương pháp thiết kế sgRNA, quy trình tạo vector nhị phân Cas9 và các phương pháp sàng lọc đột biến (T7E1, Sanger sequencing, RT-PCR).
  • Các nhà chọn tạo giống cây trồng và viện nghiên cứu nông nghiệp: Cung cấp quy trình công nghệ và nguồn vật liệu di truyền dòng lúa BT7 chỉnh sửa gen sạch T-DNA có khả năng kháng bệnh bạc lá; mở ra phương pháp chọn giống chính xác dựa trên can thiệp gen nhiễm (S gene) thay vì chỉ phụ thuộc vào gen kháng tự nhiên (R gene).
  • Cơ quan quản lý và hoạch định chính sách nông nghiệp: Bổ sung cơ sở dữ liệu khoa học thực chứng về tính an toàn sinh học của sản phẩm chỉnh sửa gen không chứa T-DNA (T-DNA-free), phục vụ công tác xây dựng khung pháp lý và định hướng phát triển cây trồng chỉnh sửa gen tại Việt Nam.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao luận án lựa chọn gen OsSWEET14 làm đích chỉnh sửa thay vì các gen SWEET khác?

Gen OsSWEET14 (nằm trên nhiễm sắc thể số 11) là một gen gây nhiễm quan trọng đóng vai trò hội tụ tiến hóa, là đích tác động đồng thời của 4 protein TAL từ các chủng Xoo khác nhau (AvrXa7, PthXo3, Tal5/TalF và TalC). Các nghiên cứu quốc tế đã chứng minh đột biến tại vùng EBE của OsSWEET14 mang lại tính kháng phổ rộng đối với nhiều chủng vi khuẩn bạc lá châu Á và châu Phi hơn so với đột biến đơn lẻ trên OsSWEET11 hay OsSWEET13.

2. Hiệu suất chuyển gen vào phôi non giống lúa BT7 đạt được là bao nhiêu và phụ thuộc vào những yếu tố nào?

Quy trình chuyển gen vào phôi non (IE) giống lúa BT7 thông qua Agrobacterium tumefaciens đạt hiệu suất tối ưu là 20,68%. Hiệu suất này phụ thuộc vào: nồng độ chất khử trùng NaOCl (1,0%), điều kiện nuôi cấy tối để kích thích phát sinh mô sẹo, tuổi của phôi non (tính theo số ngày sau thụ phấn - DAP), mật độ vi khuẩn ($\text{OD}_{600}$), thời gian đồng nuôi cấy và nồng độ chất kích hoạt Acetosyringone (AS).

3. Làm thế nào luận án thu nhận được các dòng lúa chỉnh sửa gen không chứa T-DNA (T-DNA-free)?

Sau khi tạo được các cây chuyển gen thế hệ T0 mang đột biến tại vùng đích và mang cấu trúc T-DNA (chứa gen cas9 và gen kháng kháng sinh hpt), tác giả cho tự thụ phấn để thu thế hệ T1. Ở thế hệ T1, dựa trên quy luật phân ly độc lập trong di truyền học, tác giả sử dụng phản ứng PCR để sàng lọc và loại bỏ các cá thể còn mang cấu trúc T-DNA, đồng thời giải trình tự DNA để chọn lọc các cá thể mang đột biến SW14-BT ở trạng thái đồng hợp tử. Kết quả đã thu được 8 dòng lúa T1 đồng hợp tử sạch T-DNA.

4. Kết quả đánh giá tính kháng bệnh của các dòng BT7 chỉnh sửa gen đối với các chủng vi khuẩn Xoo Việt Nam như thế nào?

Luận án đã tạo được 2 dòng lúa BT7 chỉnh sửa SW14-BT thể hiện tính kháng hoàn toàn với chủng vi khuẩn VXO_11. Đối với hai chủng VXO_60 và VXO_96, các dòng chỉnh sửa gen chưa kháng hoàn toàn, do cơ chế gây bệnh của hai chủng này phụ thuộc vào ít nhất 2 protein TAL khác nhau tác động lên các gen đích khác trong hệ gen lúa.

Kết luận

Luận án của tác giả Vũ Hoài Sâm đã ứng dụng thành công công nghệ chỉnh sửa hệ gen CRISPR/Cas9 để can thiệp chính xác vào vùng promoter của gen gây nhiễm OsSWEET14 trên giống lúa thuần chất lượng cao Bắc Thơm 7. Công trình đã tối ưu hóa quy trình chuyển gen vào phôi non đạt hiệu suất 20,68%, thiết kế hệ thống vector Cas9 chuyên biệt và tạo ra 8 dòng lúa thế hệ T1 mang đột biến đồng hợp sạch cấu trúc chuyển gen T-DNA. Trong đó, 2 dòng lúa đã chứng minh được tính kháng hoàn toàn đối với chủng vi khuẩn bạc lá Xoo VXO_11 mà vẫn duy trì các đặc tính nông sinh học tương đương giống gốc BT7. Kết quả này bổ sung cơ sở khoa học về cơ chế tương tác TALE-gen nhiễm của vi khuẩn Xoo tại Việt Nam và tạo nguồn vật liệu giá trị cho công tác chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá.