Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu ứng dụng công nghệ crispr cas9 chỉnh sửa promoter ossweet14 nhằm nâng cao tính kháng bệnh bạc lá ở giống lúa bt7

Nghiên cứu ứng dụng CRISPR Cas9 chỉnh sửa promoter OsSWEET14 giúp tăng khả năng kháng bệnh bạc lá ở giống lúa BT7, mở ra hướng phát triển nông nghiệp bền vững.

• Tác giả: Vũ Hoài Sâm
• Người hướng dẫn: PTS. Phạm Xuân Hội
• Trường học: Viện Khoa Học Nông Nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Ứng Dụng Công Nghệ CRISPR/Cas9 Chỉnh Sửa Promoter OsSWEET14 Nhằm Nâng Cao Tính Kháng Bệnh Bạc Lá Ở Giống Lúa BT7
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. MỞ ĐẦU
• 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU VỀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
• 2.1. Giới thiệu về công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9
• 2.1.1. Giới thiệu chung về công nghệ chỉnh sửa gen
• 2.1.2. Cấu trúc và cơ chế chỉnh sửa của công nghệ CRISPR/Cas9
• 2.1.3. Ứng dụng hệ thống CRISPR/Cas9 trong khoa học cây trồng
• 2.2. Giới thiệu về bệnh bạc lá ở lúa và vi khuẩn gây bệnh
• 2.2.1. Vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa
• 2.2.2. Gen OsSWEET14 và mối liên hệ với vi khuẩn Xoo gây bệnh bạc lá lúa
• 2.2.3. Tình hình nghiên cứu tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá
• 2.2.3.1. Nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá dựa trên gen kháng
• 2.2.3.2. Nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bạc lá dựa trên gen “nhiễm”
• 2.3. Giống lúa BT7 và các nghiên cứu cải tiến giống lúa BT7
• 2.3.1. Giới thiệu chung về giống lúa BT7
• 2.3.2. Bệnh bạc lá trên giống lúa BT7
• 2.3.3. Nghiên cứu cải tiến di truyền giống lúa BT7
• 2.4. Chuyển gen vào lúa thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
• 2.4.1. Vai trò của chuyển gen nhờ A. tumefaciens đối với CRISPR/Cas9
• 2.4.2. Hiệu quả chuyển gen lúa nhờ A.
• 2.4.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen vào IE lúa
• 2.4.4. Nghiên cứu chuyển gen vào giống lúa BT7 nhờ A.
• 2.5. NGUYÊN LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.5.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.5.2. Vật liệu nghiên cứu
• 2.5.3. Nội dung nghiên cứu
• 2.5.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5.4.1. Các kĩ thuật chung trong nghiên cứu sinh học phân tử
• 2.5.4.2. Tối ưu quy trình chuyển gen vào giống lúa BT7 sử dụng IE
• 2.5.4.3. Đánh giá sự tương tác giữa vi khuẩn Xoo và OsSWEET14 trên BT7
• 2.5.4.4. Thiết kế cấu trúc T-DNA chỉnh sửa SW14-BT
• 2.5.4.5. Tạo dòng lúa BT7 chỉnh sửa SW14-BT
• 2.5.4.6. Đánh giá đặc điểm của dòng lúa BT7 chỉnh sửa SW14-BT
• 2.5.5. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen vào IE giống lúa BT7
• 3.1.1. Tối ưu hệ thống tái sinh in vitro từ IE cho giống lúa BT7
• 3.1.2. Tối ưu quy trình chuyển gen vào IE lúa BT7 qua A.
• 3.1.3. Quy trình chuyển gen vào IE giống lúa BT7 thông qua A.
• 3.2. Thiết kế cấu trúc T-DNA chỉnh sửa SW14-BT
• 3.2.1. Nghiên cứu sự tương tác giữa VXO và OsSWEET14 ở giống lúa BT7
• 3.2.2. Thiết kế cấu trúc T-DNA chỉnh sửa SW14-BT
• 3.2.3. Tạo dòng lúa BT7 chỉnh sửa SW14-BT
• 3.2.4. tumefaciens mang cấu trúc T-DNA chỉnh sửa SW14-BT
• 3.2.5. Chuyển cấu trúc T-DNA chỉnh sửa SW14-BT vào lúa BT7
• 3.2.6. Sàng lọc kiểu gen và kiểu hình của dòng lúa BT7 tái sinh
• 3.2.7. Sàng lọc kiểu gen và kiểu hình của dòng lúa BT7 chỉnh sửa gen T1
• 3.3. Đánh giá đặc điểm của lúa BT7 chỉnh sửa SW14-BT
• 3.3.1. Đánh giá đặc điểm nông sinh học dòng lúa BT7 chỉnh sửa SW14-BT
• 3.3.2. Nghiên cứu biểu hiện OsSWEET14 trong dòng lúa chỉnh sửa SW14-BT
• 3.3.3. Đánh giá khả năng kháng bạc lá của lúa BT7 chỉnh sửa SW14-BT
• 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về công nghệ CRISPR Cas9

Công nghệ CRISPR/Cas9 đã trở thành một công cụ mạnh mẽ trong lĩnh vực chỉnh sửa gene. Hệ thống này cho phép tạo ra những đứt gãy DNA sợi đôi tại vị trí xác định trong hệ gen, từ đó kích thích cơ chế tự sửa chữa của tế bào. Việc ứng dụng CRISPR/Cas9 trong nông nghiệp, đặc biệt là trong việc cải thiện tính kháng bệnh cho cây trồng, đã mở ra nhiều cơ hội mới. Đặc biệt, nghiên cứu này tập trung vào việc chỉnh sửa promoter OsSWEET14, một gen quan trọng liên quan đến khả năng kháng bệnh bạc lá ở giống lúa BT7. Việc chỉnh sửa này không chỉ giúp tăng cường khả năng kháng bệnh mà còn giữ lại các đặc tính nông sinh học quý giá của giống lúa gốc.

1.1. Cấu trúc và cơ chế hoạt động của CRISPR Cas9

Cấu trúc của hệ thống CRISPR/Cas9 bao gồm hai thành phần chính: Cas9 và RNA dẫn đường (gRNA). Cas9 là một enzyme có khả năng cắt DNA, trong khi gRNA giúp định hướng enzyme đến vị trí cần chỉnh sửa. Khi gRNA liên kết với DNA mục tiêu, Cas9 sẽ tạo ra đứt gãy tại vị trí đó. Quá trình này cho phép các nhà nghiên cứu tạo ra những đột biến có chủ đích, từ đó cải thiện tính kháng bệnh cho cây trồng. Việc ứng dụng công nghệ này trong nghiên cứu lúa BT7 nhằm mục đích tạo ra những giống lúa có khả năng kháng bệnh bạc lá hiệu quả hơn.

II. Bệnh bạc lá và gen OsSWEET14

Bệnh bạc lá lúa, do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) gây ra, là một trong những bệnh hại nghiêm trọng nhất đối với sản xuất lúa gạo. Gen OsSWEET14 đã được xác định là một gen 'nhiễm', có vai trò quan trọng trong việc cung cấp dinh dưỡng cho vi khuẩn phát triển. Khi gen này được kích hoạt bởi các protein TAL từ vi khuẩn, nó sẽ tăng cường vận chuyển đường đến gian bào, tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của Xoo. Nghiên cứu này nhằm mục đích chỉnh sửa promoter của OsSWEET14 để làm giảm khả năng liên kết của protein TAL, từ đó nâng cao khả năng kháng bệnh cho giống lúa BT7.

2.1. Tình hình nghiên cứu về bệnh bạc lá

Nghiên cứu về bệnh bạc lá đã chỉ ra rằng việc sử dụng giống lúa kháng bệnh là phương pháp hiệu quả nhất để kiểm soát bệnh này. Giống lúa BT7, mặc dù có nhiều ưu điểm, nhưng lại rất nhạy cảm với bệnh bạc lá. Do đó, việc cải tiến giống lúa này thông qua công nghệ CRISPR/Cas9 để tạo ra những dòng lúa kháng bệnh là rất cần thiết. Nghiên cứu này không chỉ giúp bảo vệ sản xuất lúa gạo mà còn góp phần vào sự phát triển bền vững của ngành nông nghiệp Việt Nam.

III. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu này sử dụng phương pháp chuyển gen vào phôi non của giống lúa BT7 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Quy trình này bao gồm việc tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy và chuyển gen để đạt hiệu suất cao nhất. Các yếu tố như nồng độ vi khuẩn, thời gian đồng nuôi cấy và điều kiện ánh sáng đều được kiểm soát chặt chẽ. Sau khi chuyển gen thành công, các dòng lúa BT7 chỉnh sửa sẽ được sàng lọc để đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá. Phương pháp này không chỉ giúp tạo ra những giống lúa kháng bệnh mà còn đảm bảo các đặc tính nông sinh học của giống lúa gốc.

3.1. Quy trình chuyển gen

Quy trình chuyển gen vào giống lúa BT7 được thực hiện qua nhiều bước, bao gồm chuẩn bị phôi non, nuôi cấy mô và chuyển gen. Việc tối ưu hóa quy trình này là rất quan trọng để đảm bảo hiệu quả chuyển gen cao. Kết quả cho thấy quy trình chuyển gen đạt hiệu suất 20,68%, cho phép tạo ra các dòng lúa BT7 chỉnh sửa với khả năng kháng bệnh tốt hơn. Điều này mở ra cơ hội mới cho việc phát triển giống lúa kháng bệnh bạc lá tại Việt Nam.

IV. Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy các dòng lúa BT7 chỉnh sửa gen mang đột biến trên promoter OsSWEET14 có khả năng kháng hoàn toàn với chủng vi khuẩn VXO_11. Các đặc điểm nông sinh học của dòng lúa này không khác biệt so với giống lúa gốc, cho thấy tính khả thi của việc ứng dụng công nghệ CRISPR/Cas9 trong cải tạo giống lúa. Nghiên cứu này không chỉ có ý nghĩa trong việc nâng cao năng suất và chất lượng lúa mà còn góp phần vào việc phát triển bền vững ngành nông nghiệp Việt Nam.

4.1. Đánh giá khả năng kháng bệnh

Đánh giá khả năng kháng bệnh của các dòng lúa BT7 chỉnh sửa cho thấy sự khác biệt rõ rệt so với giống lúa đối chứng. Các dòng lúa này không chỉ kháng lại bệnh bạc lá mà còn duy trì được các đặc tính nông sinh học quý giá. Điều này chứng tỏ rằng việc chỉnh sửa promoter OsSWEET14 đã thành công trong việc tạo ra những giống lúa có khả năng kháng bệnh tốt hơn, mở ra hướng đi mới cho nghiên cứu và phát triển giống lúa tại Việt Nam.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) gây ra là một trong những bệnh hại nghiêm trọng nhất đối với cây lúa, ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất và chất lượng lúa gạo tại Việt Nam và nhiều quốc gia trên thế giới. Theo số liệu của Cục Bảo vệ Thực vật, diện tích lúa nhiễm bệnh bạc lá tại Việt Nam đã tăng từ 72.343 ha năm 2013 lên 149.551 ha năm 2016, với mức tăng 129% so với năm trước đó. Giống lúa Bắc thơm 7 (BT7), một giống lúa chủ lực ở miền Bắc với chất lượng gạo thơm ngon và năng suất cao, lại rất mẫn cảm với bệnh bạc lá, gây thiệt hại năng suất lên đến 60% tại một số vùng như Hải Dương năm 2017.

Mục tiêu nghiên cứu của luận văn là ứng dụng công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 để chỉnh sửa promoter gen OsSWEET14 nhằm nâng cao tính kháng bệnh bạc lá cho giống lúa BT7. Nghiên cứu tập trung tối ưu quy trình chuyển gen vào phôi non (immature embryo – IE) của BT7 qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, thiết kế cấu trúc T-DNA biểu hiện phức hệ CRISPR/Cas9 chỉnh sửa promoter OsSWEET14 (SW14-BT), tạo dòng lúa BT7 mang đột biến chính xác trên SW14-BT và đánh giá tính kháng bệnh bạc lá của các dòng chỉnh sửa.

Phạm vi nghiên cứu được thực hiện từ năm 2017 đến 2021 tại Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam, bao gồm các thí nghiệm sinh học phân tử, nuôi cấy mô, chuyển gen và đánh giá tính kháng bệnh trong nhà lưới an toàn sinh học. Nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển giống lúa BT7 kháng bệnh bạc lá, góp phần nâng cao hiệu quả sản xuất lúa gạo tại miền Bắc Việt Nam, đồng thời mở rộng ứng dụng công nghệ chỉnh sửa gen trong chọn tạo giống cây trồng chủ lực.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên hai lý thuyết chính: (1) Công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9, một hệ thống miễn dịch thích ứng của vi khuẩn, cho phép tạo đứt gãy DNA sợi đôi tại vị trí xác định và sửa chữa theo cơ chế ghép nối tận cùng không tương đồng (NHEJ) hoặc tái tổ hợp tương đồng (HDR). CRISPR/Cas9 có ưu điểm về độ đặc hiệu cao, dễ thiết kế và hiệu quả chỉnh sửa đa gen. (2) Cơ chế tương tác phân tử giữa vi khuẩn Xoo và cây lúa qua protein TAL (Transcription activator-like effector) của Xoo liên kết với vùng promoter gen “nhiễm” OsSWEET14, kích hoạt biểu hiện gen vận chuyển đường SWEET, cung cấp dinh dưỡng cho vi khuẩn phát triển và gây bệnh bạc lá.

Ba khái niệm chính được sử dụng gồm:

• Gen “nhiễm” (susceptibility gene – S gene): gen thực vật bị vi khuẩn lợi dụng để gây bệnh, trong đó OsSWEET14 là gen S quan trọng.
• Effector binding element (EBE): vùng trình tự trên promoter gen S mà protein TAL của Xoo liên kết để kích hoạt biểu hiện gen.
• Phức hệ CRISPR/Cas9: bao gồm nuclease Cas9 và RNA dẫn đường (sgRNA) để tạo đứt gãy DNA tại vị trí EBE trên promoter OsSWEET14, phá vỡ liên kết protein TAL và gen S, từ đó tạo tính kháng bệnh.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu chính bao gồm mẫu phôi non (IE) giống lúa BT7, chủng vi khuẩn Xoo thu thập tại Việt Nam, và các vector biểu hiện phức hệ CRISPR/Cas9 được thiết kế đặc hiệu cho promoter OsSWEET14. Phương pháp phân tích gồm:

• Tối ưu quy trình chuyển gen vào IE BT7 qua Agrobacterium tumefaciens với các yếu tố như mật độ vi khuẩn, thời gian đồng nuôi cấy, nồng độ acetosyringone (AS), tuổi phôi non.
• Thiết kế cấu trúc T-DNA mang phức hệ CRISPR/Cas9 chỉnh sửa promoter OsSWEET14 (SW14-BT) dựa trên trình tự EBE chính AvrXa7 và Tal5.
• Tạo dòng lúa BT7 chỉnh sửa gen bằng phương pháp chuyển gen ổn định, sàng lọc kiểu gen đột biến bằng PCR, enzyme T7E1 và giải trình tự.
• Đánh giá đặc điểm nông sinh học và tính kháng bệnh bạc lá của các dòng chỉnh sửa trong nhà lưới bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo vi khuẩn Xoo chủng VXO_11.
• Thời gian nghiên cứu kéo dài từ 2017 đến 2021, với cỡ mẫu khoảng hàng trăm phôi non cho chuyển gen và hàng chục dòng lúa tái sinh được sàng lọc.

Phương pháp xử lý số liệu sử dụng phần mềm SPSS để phân tích thống kê, đánh giá hiệu quả chuyển gen, tỉ lệ đột biến và so sánh các chỉ tiêu nông học giữa dòng chỉnh sửa và đối chứng.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Tối ưu quy trình chuyển gen vào IE giống lúa BT7:

   • Mật độ vi khuẩn A. tumefaciens 0,5 OD, thời gian đồng nuôi cấy 3 ngày và nồng độ AS 200 µM cho hiệu suất chuyển gen cao nhất, đạt khoảng 20,68%.
   • Phôi non 12 ngày tuổi cho khả năng tái sinh và chuyển gen tốt nhất, với tỉ lệ tái sinh chồi đạt trên 70%.

2. Thiết kế và chuyển cấu trúc T-DNA chỉnh sửa SW14-BT:

   • Vector pCas9/gRNA-SW14 được thiết kế thành công với 2 sgRNA nhắm vào vùng EBE AvrXa7 và Tal5 trên promoter OsSWEET14.
   • Chuyển gen vào BT7 thành công, thu được 8 dòng lúa chỉnh sửa gen mang đột biến đồng hợp trên SW14-BT, không chứa cấu trúc T-DNA.

3. Đánh giá kiểu gen và kiểu hình dòng lúa chỉnh sửa:

   • Các dòng chỉnh sửa có kiểu gen đột biến mất hoặc chèn nucleotide tại vị trí EBE, làm phá vỡ liên kết protein TAL với promoter OsSWEET14.
   • Đặc điểm nông sinh học như chiều cao cây, số nhánh, trọng lượng 1000 hạt của các dòng chỉnh sửa tương đương với giống BT7 đối chứng, không có sự khác biệt đáng kể (p > 0,05).

4. Khả năng kháng bệnh bạc lá của dòng lúa chỉnh sửa:

   • Hai dòng lúa chỉnh sửa SW14-BT thể hiện tính kháng hoàn toàn với chủng vi khuẩn VXO_11, với diện tích lá nhiễm bệnh giảm xuống dưới 5% so với trên 70% ở dòng BT7 không chỉnh sửa.
   • Các dòng khác có mức kháng bệnh cải thiện rõ rệt, giảm từ 50% đến 80% diện tích lá nhiễm bệnh so với đối chứng.

Thảo luận kết quả

Hiệu suất chuyển gen 20,68% đạt được là mức cao so với các nghiên cứu chuyển gen lúa indica trước đây, nhờ tối ưu các yếu tố vật lý và hóa học trong quá trình đồng nuôi cấy. Việc sử dụng phôi non 12 ngày tuổi làm vật liệu khởi đầu giúp tăng khả năng tái sinh và chuyển gen ổn định.

Đột biến chính xác tại vùng EBE AvrXa7 và Tal5 trên promoter OsSWEET14 đã làm gián đoạn liên kết protein TAL của vi khuẩn Xoo, ngăn cản sự kích hoạt gen vận chuyển đường, từ đó làm giảm nguồn dinh dưỡng cho vi khuẩn và tăng cường tính kháng bệnh bạc lá. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu quốc tế đã công bố về vai trò của các EBE này trong cơ chế gây bệnh bạc lá.

Việc các dòng chỉnh sửa không có sự khác biệt về đặc điểm nông sinh học so với giống gốc chứng tỏ công nghệ CRISPR/Cas9 có thể tạo ra các giống lúa kháng bệnh mà không làm mất các tính trạng quý của giống BT7. Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ cột so sánh tỉ lệ diện tích lá nhiễm bệnh giữa các dòng chỉnh sửa và đối chứng, cũng như bảng thống kê các chỉ tiêu nông học.

Kết quả nghiên cứu mở ra hướng đi mới cho công tác chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá tại Việt Nam, góp phần nâng cao năng suất và chất lượng lúa gạo, đồng thời giảm thiểu sử dụng thuốc bảo vệ thực vật.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Triển khai nhân rộng quy trình chuyển gen tối ưu:

   • Động từ hành động: Áp dụng, nhân rộng.
   • Target metric: Tăng hiệu suất chuyển gen trên 20%.
   • Timeline: 1-2 năm.
   • Chủ thể thực hiện: Các viện nghiên cứu, trung tâm giống cây trồng.

2. Phát triển và khảo nghiệm các dòng lúa BT7 chỉnh sửa SW14-BT trên đồng ruộng:

   • Động từ hành động: Thử nghiệm, đánh giá.
   • Target metric: Đánh giá tính kháng bệnh và năng suất thực tế.
   • Timeline: 2-3 vụ mùa.
   • Chủ thể thực hiện: Trung tâm nghiên cứu nông nghiệp, nông dân hợp tác.

3. Mở rộng nghiên cứu chỉnh sửa gen OsSWEET14 cho các giống lúa chủ lực khác:

   • Động từ hành động: Nghiên cứu, áp dụng.
   • Target metric: Tạo dòng lúa kháng bệnh bạc lá đa dạng.
   • Timeline: 3-5 năm.
   • Chủ thể thực hiện: Viện Di truyền Nông nghiệp, các trường đại học.

4. Xây dựng hệ thống giám sát và đánh giá đa dạng chủng vi khuẩn Xoo:

   • Động từ hành động: Giám sát, phân tích.
   • Target metric: Cập nhật biến động quần thể vi khuẩn để điều chỉnh chiến lược chọn giống.
   • Timeline: Liên tục hàng năm.
   • Chủ thể thực hiện: Cục Bảo vệ Thực vật, viện nghiên cứu.

5. Tăng cường đào tạo và chuyển giao công nghệ CRISPR/Cas9 cho cán bộ nghiên cứu và kỹ thuật viên:

   • Động từ hành động: Đào tạo, chuyển giao.
   • Target metric: Nâng cao năng lực nghiên cứu và ứng dụng công nghệ.
   • Timeline: 1-2 năm.
   • Chủ thể thực hiện: Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, các trường đại học.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và chuyên gia công nghệ sinh học nông nghiệp:

   • Lợi ích: Cập nhật kiến thức về ứng dụng CRISPR/Cas9 trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh.
   • Use case: Phát triển các dự án nghiên cứu chỉnh sửa gen cây trồng.

2. Nhà quản lý và hoạch định chính sách nông nghiệp:

   • Lợi ích: Hiểu rõ tiềm năng và hiệu quả của công nghệ gen trong nâng cao năng suất và bền vững sản xuất lúa gạo.
   • Use case: Xây dựng chính sách hỗ trợ nghiên cứu và ứng dụng công nghệ sinh học.

3. Các trung tâm giống cây trồng và doanh nghiệp sản xuất giống:

   • Lợi ích: Áp dụng quy trình chuyển gen và tạo dòng giống lúa kháng bệnh bạc lá chất lượng cao.
   • Use case: Phát triển sản phẩm giống mới đáp ứng nhu cầu thị trường.

4. Sinh viên và học viên cao học, tiến sĩ chuyên ngành công nghệ sinh học, nông nghiệp:

   • Lợi ích: Tham khảo phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật chuyển gen và chỉnh sửa gen hiện đại.
   • Use case: Nâng cao kỹ năng nghiên cứu và hoàn thiện luận văn, luận án.

Câu hỏi thường gặp

1. Công nghệ CRISPR/Cas9 có ưu điểm gì so với các phương pháp chỉnh sửa gen khác?
   CRISPR/Cas9 có độ đặc hiệu cao, dễ thiết kế, chi phí thấp và khả năng chỉnh sửa đa gen đồng thời, giúp tiết kiệm thời gian và tăng hiệu quả so với các công nghệ như TALEN hay ZFN.

2. Tại sao chọn gen OsSWEET14 làm mục tiêu chỉnh sửa để tăng tính kháng bệnh bạc lá?
   OsSWEET14 là gen “nhiễm” quan trọng bị protein TAL của vi khuẩn Xoo liên kết và kích hoạt, cung cấp dinh dưỡng cho vi khuẩn phát triển. Chỉnh sửa promoter gen này làm gián đoạn liên kết, giúp cây lúa kháng bệnh.

3. Hiệu suất chuyển gen vào giống lúa BT7 đạt được trong nghiên cứu là bao nhiêu?
   Hiệu suất chuyển gen tối ưu đạt khoảng 20,68%, cao hơn nhiều so với các nghiên cứu trước đây trên giống lúa indica nhờ tối ưu các điều kiện nuôi cấy và đồng nuôi cấy.

4. Các dòng lúa BT7 chỉnh sửa gen có giữ được các đặc điểm nông sinh học như giống gốc không?
   Có, các dòng chỉnh sửa gen SW14-BT có đặc điểm nông sinh học tương đương giống BT7 đối chứng, không có sự khác biệt đáng kể về chiều cao cây, số nhánh hay trọng lượng hạt.

5. Dòng lúa BT7 chỉnh sửa gen có khả năng kháng bệnh bạc lá phổ rộng không?
   Hai dòng lúa chỉnh sửa thể hiện kháng hoàn toàn với chủng vi khuẩn VXO_11, một chủng phổ biến tại Việt Nam. Các dòng khác cũng có mức kháng bệnh cải thiện rõ rệt, cho thấy tiềm năng kháng bệnh phổ rộng.

Kết luận

• Nghiên cứu đã tối ưu thành công quy trình chuyển gen vào phôi non giống lúa BT7 qua Agrobacterium tumefaciens với hiệu suất chuyển gen đạt 20,68%.
• Thiết kế và chuyển thành công cấu trúc T-DNA biểu hiện phức hệ CRISPR/Cas9 chỉnh sửa promoter OsSWEET14 (SW14-BT) nhằm phá vỡ liên kết protein TAL với gen “nhiễm”.
• Tạo được 8 dòng lúa BT7 chỉnh sửa gen mang đột biến đồng hợp trên SW14-BT, không chứa cấu trúc T-DNA, giữ nguyên các đặc điểm nông sinh học quan trọng.
• Hai dòng lúa chỉnh sửa thể hiện tính kháng hoàn toàn với chủng vi khuẩn Xoo phổ biến tại Việt Nam, giảm thiệt hại do bệnh bạc lá.
• Nghiên cứu mở ra hướng đi mới cho chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá tại Việt Nam, đồng thời đề xuất các giải pháp nhân rộng và ứng dụng công nghệ chỉnh sửa gen trong sản xuất nông nghiệp.

Khuyến nghị các nhà nghiên cứu, trung tâm giống và cơ quan quản lý phối hợp triển khai nhân rộng, đánh giá thực địa và phát triển các dòng lúa BT7 chỉnh sửa gen nhằm nâng cao năng suất và bền vững sản xuất lúa gạo.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU VỀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu về công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 1.1 Giới thiệu chung về công nghệ chỉnh sửa gen Chỉnh sửa gen (hay còn được gọi là chỉnh sửa hệ gen) là một tập hợp các công cụ giúp các nhà khoa học thay đổi DNA của sinh vật. Phương pháp này lợi dụng hệ thống sửa chữa DNA của tế bào để tạo ra những thay đổi nhỏ trong trình tự DNA đích, thông qua việc sử dụng các nuclease tổng hợp để tạo ra đột biến đứt gãy sợi đôi (double-stranded breaks - DSB) tại vị trí xác định trong hệ gen. Đột biến xảy ra trên phân tử DNA thường là: (1) ghép nối trực tiếp và (2) mất/chèn đoạn hoặc trao đổi chéo hoặc chuyển đoạn (Hình 1.1: Cơ chế chỉnh sửa gen Ghi chú: Các mức độ khác nhau của tái tổ hợp, có sự tương đồng và không tương đồng.

Tái tổ hợp không tương đồng: Con đường tạo ra cNHEJ sửa chữa bảo Luận văn thạc sỹ Quản lý Kinh tế 6 tồn theo nguyên tắc bổ sung; con đường cắt bỏ sai hỏng tạo ra đột biến mới altNHEJ/MMEJ (mất hoặc chèn dưới 3 nucleotide) và ghép sợi đơn (SSA) xảy ra khi có đoạn trình tự tương đồng tồn tại ở đâu đó trong hệ gen. Cả 3 loại sửa chữa này đều khác với tái tổ hợp tương đồng (HDR), ở đó, sau khi cắt bỏ đoạn sai hỏng, phần nhô ra của sợi đơn này sẽ trao đổi chéo với phần tương đồng không bị hư hại (một phần) của sợi đơn phân tử khác và ghép sợi đôi (liên kết bổ sung - SDSA), gây ra sự đảo ngược hoặc hoán vị gen alen. Ngoài ra, các cấu trúc tái tổ hợp (đường nối Holiday) trung gian có thể được hình thành bởi sự trao đổi đoạn sợi đôi giữa phân tử khuôn và phân tử lỗi hỏng. Dựa vào phân tử khuôn, sự trao đổi đoạn sợi đôi tạo ra nhiễm sắc tử chị em (SCE), trao đổi chéo trong giảm phân hoặc các dạng sắp xếp lại khác [118].

Đặc điểm chính của các công nghệ chỉnh sửa gen Đặc điểm Meganuclease ZFN TALEN CRISPR/Cas9 SV nhân sơ SV nhân sơ và SV Sinh vật nhân Vi khuẩn Nguồn gốc (Streptococus nhân thực thực Xanthomonas pyogenes) Mô-đun liên kết DNA – Protein DNA - Protein DNA - Protein DNA – RNA Cặp Protein Cặp Protein Mô-đun cắt Protein đơn Cas9 + gRNA (FokI) (FokI) Chiều dài trình tự 12 – 40 bp 18 – 24 bp 24 – 59 bp 20 bp đích Tần suất điểm cắt 1/1.000 bp 1/140 bp 1 tiểu đơn vị/1 bp 1/13 bp (PAM) Độ đặc hiệu Trung bình Trung bình Trung bình Cao Phức tạp, đắt đỏ Khả năng thí Đắt đỏ, cần thời Nhanh, đơn giản, Nhanh, đơn giản, cần chuyên môn nghiệm gian dài chi phí thấp giá rẻ cao và kinh nghiệm Nghiên cứu chỉnh sửa gen với sự phát triển của bốn công cụ dựa trên bốn loại nuclease khác nhau, bao gồm Meganuclease, ZFN (Zinc-Finger Nuclease), TALEN (Transcription Activator-Like Effector nuclease) và CRISPR/Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated protein) đã gặt hái nhiều thành công trong gần ba thập kỉ qua. Công nghệ Meganuclease và ZFN là hai công nghệ thế hệ thứ nhất, có nhược điểm là khá đắt đỏ và khó thiết kế nên khó có thể áp dụng để nghiên cứu chỉnh sửa gen. TALEN và CRISPR/Cas là hai công Luận văn thạc sỹ Quản lý Kinh tế 7 nghệ chỉnh sửa gen thế hệ thứ hai; đã được cải tiến và hoàn thiện hơn, vì vậy, dễ sử dụng và linh hoạt hơn nhiều. Tất cả các hệ thống chỉnh sửa gen đều có có đặc điểm chung là được cấu tạo bởi 2 thành phần chính: (1) thành phần nhận biết và liên kết với DNA đích (yếu tố gắn DNA) và (2) thành phần cắt DNA đích (yếu tố cắt DNA).

Tuy nhiên, mỗi hệ thống có những đặc điểm đặc trưng riêng khiến cho chúng được sử dụng với các mục đích khác nhau (Bảng 1. Do có kích thước hệ gen tương đối nhỏ, nguồn đa dạng gen di truyền sẵn có, hiệu quả chuyển gen cao, dữ liệu đã công bố về hệ gen nhiều hơn so với các loại ngũ cốc khác, vì vậy, cây lúa được xem như một trong các hệ thống mô hình tuyệt vời nhất để nghiên cứu chức năng hệ gen, đặc biệt là các nghiên cứu ứng dụng công nghệ chỉnh sửa gen. Ngày càng có nhiều các công bố khoa học (Phụ lục 1) đã chứng minh cho thấy thành công của việc ứng dụng các công nghệ chỉnh sửa gen khác nhau vào cây lúa nhằm phát hiện vai trò của các gen chức năng và khả năng cải tiến các tính trạng quý như cải thiện chất lượng và năng suất hạt, nâng cao sức sống của cây, nâng cao hàm lượng các chất dinh dưỡng, cải thiện stress phi sinh học và stress sinh học…[103].2 Cấu trúc và cơ chế chỉnh sửa của công nghệ CRISPR/Cas9 1. Cấu trúc và chức năng sinh học của công nghệ CRISPR/Cas9 Các nhà khoa học đã chứng minh CRISPR cùng với các gen Cas tạo nên đáp ứng miễn dịch thích ứng ở vi khuẩn và vi khuẩn cổ đại để chống lại virus và phage [73, 112].

Các locus CRISPR này đã được phát hiện trong hệ gen của vi khuẩn và tảo từ lâu; tuy nhiên, các nhà khoa học phải mất hơn 20 năm nghiên cứu mới tìm ra chức năng sinh học của hệ thống CRISPR trong vi khuẩn, vi khuẩn cổ đại và tảo [73, 112]. Một hệ thống CRISPR/Cas tự nhiên bao gồm: các gen Cas mã hóa bởi các đơn vị lặp đối xứng nghịch đảo tương đồng, các endonuclease hoạt động qua trung gian RNA, các RNA ngắn (được gọi là “spacer”) sinh ra bởi sự xuất hiện của các trình tự DNA ngắn di động (được gọi là “protospacer”). Protospacer có trình tự bổ sung với các spacer di chuyển xung quanh vị trí trình tự lặp đối xứng nghịch đảo tương đồng khi tế bào vi khuẩn bị tấn công. Các spacer này có vai trò phát hiện sự xuất hiện của DNA ngoại lai khi tế bào bị xâm nhiễm và cho phép hệ thống CRISPR/Cas cắt DNA ngoại lai.

Cơ chế hoạt động của hệ thống miễn dịch qua trung gian CRISPR/Cas bao Luận văn thạc sỹ Quản lý Kinh tế 8 gồm ba bước: thu nhận, biểu hiện và can thiệp. Ở bước thu nhận, một spacer mới (trình tự của DNA ngoại lai) được thu nhận và chèn vào cấu trúc tuần tự trên locus CRISPR. Tiền chất CRISPR-RNA (pre-crRNA) và protein Cas được sinh tổng hợp ở bước biểu hiện. Nhờ RNase III, pre-crRNA bị cắt ra thành các phân tử crRNA trưởng thành; crRNA sẽ kết hợp với protein Cas ở bước can thiệp để cắt các DNA ngoại lai.

Motif CRISPR gắn liền với mỗi protospacer và nằm sát với trình tự DNA đích được đặt tên là trình tự liền kề protospacer (protospacer adjacent motif – PAM). Trình tự PAM nằm trên hệ gen của virus và phage nhưng không xuất hiện trên locus CRISPR trong hệ gen vi khuẩn [112]. Các phân tích tin sinh học đã chỉ ra rằng Cas9 là một protein kích thước lớn đa chức năng, gồm hai phần: (i) thành phần nhận biết có vai trò phát hiện DNA đích và tương tác với sgRNA; (ii) thành phần nuclease chứa 2 domain RuvC-like và HNH, trong đó RuvC cắt sợi DNA đích không bổ sung với gRNA và HNH cắt sợi DNA bổ sung với gRNA. Nuclease Cas9 phát hiện DNA đích trong hệ gen có chứa trình tự dài 20 bp tương đồng với trình tự lõi hay trình tự dẫn đường trên phân tử sgRNA.

Cơ chế hoạt động này tạo nên tính đặc hiệu của Cas9 [112]. Trình tự PAM chứa 2 nucleotide bảo thủ nằm phía trước vị trí liên kết với crRNA để protein Cas nhận biết trình tự đích. Protein Cas không thể phát hiện và cắt hiệu quả DNA nếu thiếu bước nhận biết trình tự PAM. Trong hệ thống miễn dịch tự nhiên của vi khuẩn, trình tự PAM có ý nghĩa đặc biệt quan trọng giúp phân biệt DNA vi khuẩn và DNA ngoại lai xâm nhiễm.

Đặc điểm này giúp vi khuẩn bảo vệ DNA của mình khỏi sự tác động của nuclease. Trình tự PAM được phức hệ Cas9:sgRNA phát hiện và Cas9 endonuclease sẽ cắt tạo đứt gãy DNA tại vị trí cách trình tự PAM 3 bp. Ở một vài hệ thống CRISPR, trình tự PAM đặc biệt quan trọng đối với hoạt động chức năng của protein Cas, ví dụ như trình tự PAM 5’-NNNNGATT được nhận biết bởi protein Cas của Neissseria meningiditis. Tương tự, protein Cas của S.

thermophiles phát hiện trình tự PAM 5’-NGGNG hay 5’-NNAGAA, protein Cas của S. pyogenes phát hiện trình tự PAM 5’-NGG [73, 112]. Có thể thấy, phức hợp CRISPR/Cas9 có cấu trúc không phức tạp, dễ tùy biến để bám đặc hiệu DNA và đặc biệt là có thể thiết kế và thao tác không cần sử dụng DNA hay plasmid. Điều đó giúp giảm thiểu lo ngại tương tự trong trường hợp của Luận văn thạc sỹ Quản lý Kinh tế 9 sinh vật biến đổi gen [69, 75].

Do lợi thế về kĩ thuật không quá phức tạp trong thiết kế cấu trúc, tính hiệu quả cao, chi phí vừa phải… nên công nghệ chỉnh sửa hệ gen sử dụng CRISPR/CAS9 được ứng dụng phổ biến không chỉ trong lĩnh vực y tế mà còn cả trong lĩnh vực sinh học nông nghiệp để phục vụ nhiều mục đích nghiên cứu khác nhau như nghiên cứu chức năng gen, cải tạo giống cây trồng…. Cơ chế chỉnh sửa gen đích của hệ thống CRISPR/Cas9 Năm 2012, lần đầu tiên công nghệ CRISPR/Cas9 được áp dụng để chỉnh sửa gen sinh vật trong công trình nghiên cứu của Jinek et al. tại trường đại học California. Các tác giả này đã đưa vào tế bào một phức hệ bao gồm nuclease Cas9 và RNA dẫn đường (guide RNA - gRNA) tự thiết kế để cắt đoạn DNA tại những vị trí mong muốn [68].2: Hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 Ghi chú: Hệ thống CRISPR/Cas9 bao gồm gRNA (A) và Cas9: sgRNA (B).

(C) Nuclease Cas9 phát hiện vị trí đích trong hệ gen (màu xanh) Trình tự PAM đặc hiệu (màu đỏ) được phức hệ Cas9:sgRNA phát hiện. [73, 112] Hiện nay, hệ thống miễn dịch của S. pyogenes (CRISPR/Cas9) được sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu chỉnh sửa gen bằng công cụ CRISPR/Cas. Hệ thống CRISPR/Cas9 này đã được cải biến chỉ chứa hai thành phần: (i) phân tử sgRNA Luận văn thạc sỹ Quản lý Kinh tế 10 (single-guide RNA) không mã hóa protein chứa trình tự dẫn đường được tạo ra bằng cách kết hợp protospacer với crRNA và tracrRNA; và (ii) enonuclease Cas9 kết hợp với sgRNA để tạo thành phức hệ CRISPR/Cas9 để cắt DNA sợi đôi (dsDNA).

Protein Cas9 được dẫn đường bởi sgRNA và nhận biết DNA đích nhờ sự có mặt của trình tự “lõi” trong sgRNA và trình tự PAM 5’-NGG’-3’ nằm gần trình tự đích (Hình 1.