Luận văn thạc sĩ xác định đồng thời một số kháng sinh quinolon trong tôm và nước nuôi tôm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao hplc

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu phương pháp xác định kháng sinh quinolon trong tôm và nước nuôi tôm bằng HPLC, đảm bảo an toàn thực phẩm.

• Tác giả: Đào Thị Vân Khánh
• Người hướng dẫn: PGS. TS Lê Thị Hồng Hảo
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Hóa phân tích
• Đề tài: Xác định kháng sinh quinolon trong tôm và nước nuôi
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
• 1.1. Tổng quan về kháng sinh nhóm quinolon
• 1.1.1. Cấu tạo của kháng sinh nhóm quinolon
• 1.1.2. Cơ chế tác dụng và độc tính
• 1.1.3. Tình hình sử dụng và tồn dư kháng sinh nhóm quinolon
• 1.1.3.1. Tình hình sử dụng và tồn dư kháng sinh nhóm quinolon trong nước
• 1.1.3.2. Tình hình sử dụng và tồn dư kháng sinh nhóm quinolon trên thế giới
• 1.1.4. Các phương pháp xác định hàm lượng các chất nhóm quinolon
• 1.1.4.1. Phương pháp miễn dịch enzym (ELISA)
• 1.1.4.2. Phương pháp vi sinh vật
• 1.1.4.3. Phương pháp hóa lý
• 1.2. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 1.2.2. Đối tượng và nội dung nghiên cứu
• 1.2.3. Nội dung nghiên cứu
• 1.3. Phương pháp nghiên cứu
• 1.3.1. Khảo sát quy trình tối ưu phân tích đồng thời 7 quinolon
• 1.3.2. Phương pháp lấy mẫu
• 1.3.3. Xử lý số liệu
• 1.3.4. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng trong nghiên cứu
• 1.3.4.1. Thiết bị và dụng cụ
• 1.3.4.2. Hóa chất, chất chuẩn
• 2. CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 2.1. Tối ưu các điều kiện trên thiết bị HPLC
• 2.1.1. Khảo sát bước sóng kích thích và phát xạ của các chất
• 2.1.2. Khảo sát pha động
• 2.1.3. Khảo sát khoảng tuyến tính của các chất chuẩn
• 2.2. Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu phân tích
• 2.2.1. Giai đoạn làm sạch mẫu sử dụng cột chiết pha rắn (SPE)
• 2.2.2. Khảo sát giai đoạn chiết mẫu
• 2.2.3. Thẩm định phương pháp
• 2.2.3.1. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
• 2.2.3.2. Độ lặp lại, độ thu hồi
• 2.3. Kết quả phân tích đánh giá dư lượng kháng sinh
• 2.3.1. Thu thập mẫu tôm nuôi và nước nuôi tôm
• 2.3.2. Kết quả phân tích mẫu
• 3. CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về kháng sinh quinolon trong tôm và nước nuôi

Kháng sinh quinolon là một nhóm kháng sinh có tác dụng diệt khuẩn mạnh, được sử dụng rộng rãi trong ngành nuôi trồng thủy sản. Việc xác định sự hiện diện của chúng trong tôm và nước nuôi là rất quan trọng để đảm bảo an toàn thực phẩm và sức khỏe cộng đồng. Nghiên cứu này sẽ cung cấp cái nhìn tổng quan về kháng sinh quinolon, cấu trúc hóa học, cơ chế tác dụng và tình hình sử dụng của chúng trong nuôi trồng thủy sản.

1.1. Cấu tạo và cơ chế tác dụng của kháng sinh quinolon

Kháng sinh quinolon có cấu trúc vòng thơm chứa nitơ, với nhóm keton và carboxylic. Chúng hoạt động bằng cách ức chế enzym DNA gyrase, ngăn chặn sự tổng hợp DNA của vi khuẩn, từ đó tiêu diệt chúng. Điều này giúp kháng sinh quinolon trở thành một lựa chọn hiệu quả trong điều trị nhiễm khuẩn.

1.2. Tình hình sử dụng kháng sinh quinolon trong nuôi trồng thủy sản

Việc sử dụng kháng sinh quinolon trong nuôi trồng thủy sản đang gia tăng, dẫn đến nguy cơ tồn dư trong sản phẩm. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, mặc dù có quy định nghiêm ngặt, nhưng kháng sinh này vẫn được sử dụng phổ biến, gây ra những lo ngại về an toàn thực phẩm.

II. Vấn đề tồn dư kháng sinh quinolon trong tôm và nước nuôi

Tồn dư kháng sinh trong thực phẩm là một vấn đề nghiêm trọng, ảnh hưởng đến sức khỏe con người và môi trường. Việc phát hiện và kiểm soát tồn dư kháng sinh quinolon trong tôm và nước nuôi là cần thiết để bảo vệ sức khỏe cộng đồng và đảm bảo an toàn thực phẩm.

2.1. Nguyên nhân gây ra tồn dư kháng sinh trong tôm

Tồn dư kháng sinh trong tôm chủ yếu do việc sử dụng kháng sinh không đúng cách trong quá trình nuôi trồng. Người nuôi thường không tuân thủ thời gian cách ly, dẫn đến việc kháng sinh còn lại trong sản phẩm khi thu hoạch.

2.2. Tác động của tồn dư kháng sinh đến sức khỏe con người

Tồn dư kháng sinh trong thực phẩm có thể gây ra nhiều vấn đề sức khỏe, bao gồm kháng thuốc, dị ứng, và các rối loạn nội tiết. Điều này đã được nhiều nghiên cứu chỉ ra, nhấn mạnh tầm quan trọng của việc kiểm soát chất lượng thực phẩm.

III. Phương pháp xác định kháng sinh quinolon trong tôm và nước nuôi

Có nhiều phương pháp để xác định kháng sinh quinolon trong tôm và nước nuôi, trong đó phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được sử dụng phổ biến nhất. Phương pháp này cho phép phát hiện chính xác và nhanh chóng các loại kháng sinh trong mẫu.

3.1. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

HPLC là một kỹ thuật phân tích mạnh mẽ, cho phép tách và xác định các hợp chất trong mẫu. Phương pháp này có độ nhạy cao và có thể phát hiện được nồng độ kháng sinh rất thấp trong tôm và nước nuôi.

3.2. Các phương pháp khác trong xác định kháng sinh

Ngoài HPLC, còn có các phương pháp khác như ELISA và phương pháp vi sinh vật. Mỗi phương pháp có ưu điểm và nhược điểm riêng, nhưng HPLC vẫn là lựa chọn hàng đầu do độ chính xác và độ nhạy cao.

IV. Kết quả nghiên cứu về kháng sinh quinolon trong tôm và nước nuôi

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng nhiều mẫu tôm và nước nuôi có chứa tồn dư kháng sinh quinolon. Kết quả này cho thấy sự cần thiết phải kiểm soát chặt chẽ việc sử dụng kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản.

4.1. Kết quả phân tích mẫu tôm

Kết quả phân tích cho thấy một tỷ lệ đáng kể mẫu tôm có chứa kháng sinh quinolon, với nồng độ vượt ngưỡng cho phép. Điều này cho thấy sự lạm dụng kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản vẫn còn phổ biến.

4.2. Kết quả phân tích mẫu nước nuôi

Mẫu nước nuôi cũng cho thấy sự hiện diện của kháng sinh quinolon, điều này có thể ảnh hưởng đến chất lượng nước và sức khỏe của các sinh vật thủy sinh khác.

V. Kết luận và hướng phát triển trong nghiên cứu kháng sinh quinolon

Việc xác định kháng sinh quinolon trong tôm và nước nuôi là rất quan trọng để đảm bảo an toàn thực phẩm. Cần có các biện pháp quản lý chặt chẽ hơn để giảm thiểu tồn dư kháng sinh trong sản phẩm thủy sản.

5.1. Tầm quan trọng của việc kiểm soát kháng sinh

Kiểm soát kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản không chỉ bảo vệ sức khỏe con người mà còn bảo vệ môi trường. Cần có các quy định nghiêm ngặt hơn để đảm bảo an toàn thực phẩm.

5.2. Hướng phát triển nghiên cứu trong tương lai

Nghiên cứu cần tiếp tục phát triển các phương pháp phân tích mới, cải thiện độ nhạy và độ chính xác trong việc phát hiện kháng sinh. Đồng thời, cần tăng cường giáo dục cho người nuôi trồng về việc sử dụng kháng sinh an toàn.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Kháng sinh nhóm quinolon, đặc biệt là fluoroquinolon, được sử dụng rộng rãi trong y tế và ngành chăn nuôi thủy sản do phổ tác dụng diệt khuẩn rộng và hiệu quả cao. Tuy nhiên, việc sử dụng không kiểm soát dẫn đến tồn dư kháng sinh trong thực phẩm và môi trường, gây ra nhiều hệ lụy nghiêm trọng như kháng thuốc, dị ứng, rối loạn nội tiết và nguy cơ ung thư. Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), Việt Nam nằm trong nhóm các quốc gia có tỷ lệ sử dụng kháng sinh cao nhất thế giới, trong đó kháng sinh quinolon được sử dụng phổ biến trong nuôi trồng thủy sản. Nhiều nghiên cứu trong nước và quốc tế đã phát hiện tồn dư kháng sinh quinolon trong tôm, cá và nước nuôi với hàm lượng vượt ngưỡng cho phép, ví dụ như 7,7% mẫu tôm tại một số tỉnh Việt Nam phát hiện nhiễm enrofloxacin với hàm lượng từ 12 đến 77 ppb.

Mục tiêu nghiên cứu là xây dựng quy trình xác định đồng thời 7 kháng sinh quinolon gồm ciprofloxacin, danofloxacin, enrofloxacin, sarafloxacin, difloxacin, oxolinic acid và flumequine trong mẫu tôm và nước nuôi tôm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng detector huỳnh quang. Nghiên cứu được thực hiện trên mẫu thu thập tại 20 hồ nuôi tôm quanh thành phố Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa trong giai đoạn từ tháng 5 đến tháng 9 năm 2015. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc giám sát tồn dư kháng sinh trong thủy sản, góp phần nâng cao chất lượng an toàn thực phẩm và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Kháng sinh nhóm quinolon là hợp chất vòng thơm chứa nitơ, với nhóm keton ở vị trí 4 và nhóm carboxylic ở vị trí 3, mang tính acid. Dựa trên giá trị pKa, quinolon được chia thành hai nhóm chính: acidic quinolon (AQ) với pKa khoảng 6,0–6,9 và piperazinyl quinolon (PQ) với hai pKa lần lượt khoảng 5,5–6,6 và 7,2–8,9. Cơ chế tác dụng của nhóm này là ức chế enzym DNA gyrase, ngăn cản tổng hợp acid nucleic của vi khuẩn, hiệu quả trên cả vi khuẩn gram dương và gram âm. Tuy nhiên, nhóm quinolon có nguy cơ gây đột biến gen và độc tính trên động vật, do đó bị hạn chế sử dụng trong một số trường hợp.

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với detector huỳnh quang được lựa chọn do độ nhạy cao, khả năng tách đồng thời nhiều chất và độ đặc hiệu tốt. Các kháng sinh quinolon có khả năng phát huỳnh quang khi kích thích ở bước sóng phù hợp, giúp tăng độ nhạy trong phát hiện lượng vết.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu gồm mẫu tôm và nước nuôi tôm được lấy ngẫu nhiên tại 20 hồ nuôi quanh thành phố Nha Trang, Khánh Hòa, trong khoảng thời gian từ tháng 5 đến tháng 9 năm 2015, với khoảng cách giữa hai lần lấy mẫu từ 20 đến 28 ngày. Cỡ mẫu được lựa chọn nhằm đảm bảo tính đại diện và độ tin cậy của kết quả.

Phương pháp phân tích bao gồm các bước: tối ưu hóa điều kiện sắc ký HPLC (cột C18, pha động MeCN và đệm acetat 50mM pH=4, chương trình gradient), xác định bước sóng kích thích/phát xạ cho detector huỳnh quang, xử lý mẫu bằng chiết pha rắn (SPE) với cột HLB để làm sạch và làm giàu mẫu, sau đó phân tích trên hệ thống HPLC Agilent 1260 Infinity với detector huỳnh quang G1321B. Phần mềm ChemStation Rev.03(16) và Excel được sử dụng để xử lý số liệu, đánh giá độ chính xác, độ lặp lại, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) theo hướng dẫn của FDA.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Tối ưu điều kiện sắc ký HPLC:

   • Bước sóng kích thích/phát xạ tối ưu cho nhóm fluoroquinolon (CPFX, DNFX, ERFX, SRFX, DFLX) là 295/445 nm, cho nhóm quinolon (OA, FMQ) là 260/365 nm.
   • Chương trình gradient pha động MeCN và đệm acetat 50mM pH=4 giúp tách đồng thời 7 chất với thời gian lưu từ 6 đến 23 phút, đảm bảo độ phân giải >1,5.
   • Tốc độ dòng pha động 2 mL/phút tối ưu, giảm thời gian phân tích mà vẫn giữ áp suất hệ thống ổn định (167 bar).

2. Xử lý mẫu và làm sạch:

   • Cột chiết pha rắn HLB cho độ thu hồi cao hơn đáng kể so với cột C18, đặc biệt với các chất DNFX (38,5%), ERFX (23,5%) và OA (37,9%).
   • Thể tích dung môi rửa giải 5 mL MeCN đủ để rửa giải hoàn toàn các chất phân tích.
   • Thể tích mẫu nước 200 mL phù hợp để đảm bảo độ thu hồi cao (>90%) cho tất cả các chất, trong khi thể tích 500 mL gây giảm độ thu hồi một số chất do hiện tượng rửa giải ngược.

3. Độ tuyến tính và giới hạn phát hiện:

   • Các chất phân tích có khoảng tuyến tính rộng từ 5 ppb đến 750 ppb với hệ số tương quan R² > 0,999.
   • Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) đạt mức thấp, đáp ứng yêu cầu phân tích lượng vết trong mẫu tôm và nước nuôi.

4. Phân tích mẫu thực tế:

   • Mẫu tôm và nước nuôi tôm tại Khánh Hòa có phát hiện tồn dư một số kháng sinh quinolon, tuy nhiên hàm lượng nằm trong giới hạn cho phép theo quy định của Bộ Y tế và Bộ Nông nghiệp.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp HPLC với detector huỳnh quang là công cụ hiệu quả để xác định đồng thời tồn dư 7 kháng sinh quinolon trong mẫu tôm và nước nuôi. Việc lựa chọn cột HLB trong xử lý mẫu giúp loại bỏ tạp chất hiệu quả, tăng độ thu hồi và độ nhạy của phương pháp. So với các nghiên cứu trước đây sử dụng detector UV hoặc MS, phương pháp này có ưu điểm về chi phí và độ nhạy phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm trong nước.

Phân tích mẫu thực tế phản ánh tình trạng sử dụng kháng sinh quinolon trong nuôi tôm tại địa phương, phù hợp với các báo cáo trước đó về tồn dư kháng sinh trong thủy sản Việt Nam. Việc phát hiện tồn dư dù ở mức thấp cũng cảnh báo nguy cơ kháng thuốc và ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng, đòi hỏi cần có biện pháp quản lý chặt chẽ hơn.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ sắc ký thể hiện sự tách biệt rõ ràng của 7 chất, bảng so sánh độ thu hồi giữa các loại cột SPE, biểu đồ thể tích dung môi rửa giải và thể tích mẫu ảnh hưởng đến độ thu hồi, cũng như bảng đường chuẩn với hệ số tương quan cao.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Tăng cường giám sát tồn dư kháng sinh trong thủy sản

   • Thực hiện kiểm tra định kỳ mẫu tôm và nước nuôi tại các vùng nuôi trọng điểm nhằm phát hiện sớm tồn dư kháng sinh quinolon.
   • Thời gian: hàng quý; Chủ thể: Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, Chi cục Thú y.

2. Áp dụng quy trình phân tích HPLC-FLD trong các phòng kiểm nghiệm

   • Đào tạo kỹ thuật viên và trang bị thiết bị HPLC với detector huỳnh quang để nâng cao năng lực phân tích tồn dư kháng sinh.
   • Thời gian: 6-12 tháng; Chủ thể: Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm, các trung tâm kiểm nghiệm khu vực.

3. Tuyên truyền, hướng dẫn người nuôi tôm sử dụng kháng sinh hợp lý

   • Tổ chức các khóa tập huấn về sử dụng kháng sinh đúng liều lượng, thời gian cách ly trước thu hoạch nhằm giảm tồn dư kháng sinh trong sản phẩm.
   • Thời gian: liên tục; Chủ thể: Trung tâm Khuyến nông, Hội Nuôi trồng Thủy sản địa phương.

4. Xây dựng và hoàn thiện chính sách quản lý kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản

   • Ban hành các quy định nghiêm ngặt về danh mục kháng sinh được phép sử dụng, mức tồn dư tối đa và xử lý vi phạm.
   • Thời gian: 1-2 năm; Chủ thể: Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, Bộ Y tế.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Các nhà quản lý ngành thủy sản và an toàn thực phẩm

   • Lợi ích: Cơ sở khoa học để xây dựng chính sách quản lý tồn dư kháng sinh, nâng cao chất lượng sản phẩm xuất khẩu.
   • Use case: Thiết kế chương trình giám sát và kiểm soát chất lượng thủy sản.

2. Phòng thí nghiệm kiểm nghiệm và các chuyên gia phân tích hóa học

   • Lợi ích: Hướng dẫn kỹ thuật phân tích tồn dư kháng sinh quinolon bằng HPLC-FLD với quy trình tối ưu.
   • Use case: Áp dụng quy trình phân tích trong kiểm nghiệm mẫu thực tế.

3. Người nuôi trồng thủy sản và các tổ chức khuyến nông

   • Lợi ích: Hiểu rõ tác động của tồn dư kháng sinh, từ đó áp dụng biện pháp sử dụng thuốc hợp lý, an toàn.
   • Use case: Tổ chức tập huấn, nâng cao nhận thức về an toàn sử dụng kháng sinh.

4. Các nhà nghiên cứu và sinh viên chuyên ngành hóa phân tích, công nghệ thực phẩm

   • Lợi ích: Tài liệu tham khảo về phương pháp phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao và ứng dụng trong giám sát tồn dư kháng sinh.
   • Use case: Phát triển nghiên cứu tiếp theo hoặc ứng dụng kỹ thuật phân tích trong các đề tài liên quan.

Câu hỏi thường gặp

1. Phương pháp HPLC với detector huỳnh quang có ưu điểm gì so với các detector khác?
   Phương pháp này có độ nhạy và độ chọn lọc cao nhờ khả năng phát huỳnh quang đặc trưng của quinolon, giúp phát hiện lượng vết trong mẫu phức tạp như tôm và nước nuôi. So với detector UV, nó giảm nhiễu nền và tăng độ chính xác.

2. Tại sao lại chọn cột chiết pha rắn HLB thay vì C18 trong xử lý mẫu?
   Cột HLB có khả năng giữ và làm sạch các chất phân tích tốt hơn, đặc biệt với các hợp chất có tính phân cực khác nhau, giúp tăng độ thu hồi và giảm tạp chất gây nhiễu trong quá trình phân tích.

3. Giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp này là bao nhiêu?
   Phương pháp đạt LOD ở mức ppb, cụ thể các chất quinolon có thể phát hiện ở nồng độ thấp hơn 1 ppb, đáp ứng yêu cầu phân tích lượng vết tồn dư trong mẫu thực phẩm và môi trường.

4. Có thể áp dụng phương pháp này cho các loại thủy sản khác ngoài tôm không?
   Có thể, vì nguyên lý phân tích và xử lý mẫu tương tự, tuy nhiên cần tối ưu lại quy trình chiết và làm sạch mẫu phù hợp với từng loại thủy sản để đảm bảo độ chính xác.

5. Làm thế nào để giảm thiểu tồn dư kháng sinh quinolon trong nuôi tôm?
   Áp dụng các biện pháp quản lý sử dụng kháng sinh hợp lý, tuân thủ thời gian cách ly trước thu hoạch, sử dụng các biện pháp phòng bệnh thay thế như vaccine, cải thiện điều kiện nuôi và vệ sinh môi trường.

Kết luận

• Đã xây dựng thành công quy trình xác định đồng thời 7 kháng sinh quinolon trong tôm và nước nuôi tôm bằng phương pháp HPLC với detector huỳnh quang, đạt độ nhạy và độ chính xác cao.
• Quy trình xử lý mẫu sử dụng cột chiết pha rắn HLB giúp làm sạch và làm giàu mẫu hiệu quả, nâng cao độ thu hồi các chất phân tích.
• Phương pháp có khoảng tuyến tính rộng, giới hạn phát hiện thấp, phù hợp để giám sát tồn dư kháng sinh trong thủy sản và môi trường nuôi.
• Kết quả phân tích mẫu thực tế tại Khánh Hòa cho thấy tồn dư kháng sinh quinolon có mặt nhưng trong giới hạn cho phép, phản ánh thực trạng sử dụng kháng sinh trong nuôi tôm.
• Đề xuất áp dụng quy trình phân tích trong giám sát an toàn thực phẩm, đồng thời tăng cường quản lý và tuyên truyền sử dụng kháng sinh hợp lý trong nuôi trồng thủy sản.

Next steps: Triển khai đào tạo kỹ thuật viên, mở rộng khảo sát tại các vùng nuôi khác, phối hợp với cơ quan quản lý để xây dựng chính sách kiểm soát tồn dư kháng sinh.

Các cơ quan chức năng và phòng thí nghiệm kiểm nghiệm nên áp dụng quy trình này để nâng cao hiệu quả giám sát an toàn thực phẩm thủy sản, bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Vệ sinh an toàn thực phẩm luôn là vấn đề được quan tâm của toàn xã hội, của mọi quốc gia trên toàn thế giới. Thực phẩm không đảm bảo vệ sinh không những ảnh hưởng đến sức khỏe con người mà còn liên quan chặt chẽ đến năng suất lao động, hiệu quả phát triển kinh tế, thương mại, du lịch và an sinh xã hội. Trong những năm gần đây sự xuất hiện dư lượng kháng sinh trong thủy hải sản và thịt gia súc, gia cầm đã ít nhiều ảnh hưởng đến sức khỏe của người dân. Tác hại của thực phẩm có tồn dư kháng sinh đối với sức khỏe con người đã được nhiều nghiên cứu chỉ ra như: tạo ra vi khuẩn kháng kháng sinh, gây dị ứng, gây quái thai, gây rối loạn nội tiết và gây ung thư ở người.

Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), Việt Nam nằm trong danh sách các nước có có tỷ lệ sử dụng kháng sinh cao nhất thế giới hiện nay, không chỉ sử dụng cho con người, các chất kháng sinh còn được sử dụng rộng rãi trong ngành chăn nuôi. Quinolon (hay còn được gọi là fluoroquinolone) là một họ kháng sinh có phổ tác dụng diệt khuẩn rộng, hiệu quả cao nên chúng được sử dụng rộng rãi không chỉ để chữa bệnh cho người mà còn được dùng để chữa bệnh cho gia cầm và thủy sản trong công nghiệp. Hậu quả là giảm hiệu quả của các kháng sinh quinolon đối với các chủng vi khuẩn gây khó khăn và tốn kém trong điều trị cho người bệnh. Theo thông báo của WHO năm 1999 có tới 11.000 người bị nhiễm khuẩn Campylobacter đã kháng quinolon do ăn thịt gà có chứa quinolon (năm 1998 là 8.

Có nhiều phương pháp để xác định tồn dư kháng sinh nhóm quinolon như: phương pháp miễn dịch enzym (ELISA); phương pháp vi sinh vật (test vi sinh vật), phương pháp lý hóa. Phương pháp lý hóa sử dụng nhiều kỹ thuật khác nhau như sắc ký lỏng, điện hóa hòa tan, điện di mao quản, các phương pháp đều có độ chính xác, độ chọn lọc cao, phát hiện được một lượng nhỏ kháng sinh tồn dư trong thực phẩm. Phương pháp được sử dụng nhiều nhất là phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng các loại detector như detector UV, detector huỳnh quang (FLD) và detector khối phổ (MS). Việc ứng dụng phương pháp HPLC phân tích nhóm quinlon trong các mẫu 1 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] môi trường và thực phẩm đã được làm nhiều trên thế giới nhưng ở Việt Nam sử dụng phương pháp HPLC với detector huỳnh quang vẫn còn hạn chế đặc biệt là tách đồng thời nhiều chất với Việt Nam hiện nay chưa có quy trình chính thống nào.

Xuất phát từ tình hình thực tế, trên cơ sở các nghiên cứu khoa học trong và ngoài nước đã được công bố, với mục đích gia tăng số lượng chất xác định, sử dụng thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector huỳnh quang chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Xác định đồng thời một số kháng sinh nhóm quinolon trong tôm và nước nuôi tôm bằng phương pháp sắc lỏng hiệu năng cao”. 2 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Chƣơng I. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1. 1 Tổng quan về kháng sinh nhóm quinolon 1.1 Cấu tạo của kháng sinh nhóm quinolon Công thức cấu tạo chung của nhóm quinolon là hợp chất vòng thơm có chứa nitơ, vị trí thứ 4 có gắn nhóm keton, vị trí thứ 3 có gắn nhóm carboxylic.

Các dẫn xuất của quinolon gồm những hợp chất ở các vị trí 1, 2, 6, 8 được gắn thêm các nhóm thế. Vị trí 1: có thể gắn thêm nhóm alkyl hoặc aryl; Vị trí 6: có thể gắn thêm F; Vị trí 2, 6, 8 có thể gắn thêm một nguyên tử N [38, 39, 47, 52, 54].1: Công thức cấu tạo chung của quinolon Do có nhóm carboxylic ở vị trí số 3 nên các chất nhóm quinolon mang tính acid. Một số quinolon có thêm nhóm amin khác nên có thêm tính base. Chúng tan trong lipid và thấm được qua màng tế bào.

Có thể chia nhóm quinolon thành hai loại dựa trên pKa: acidic quinolon (AQ) và piperazinyl quinolon (PQ) - Acidic quinolon: chỉ có một giá trị pKa trong khoảng 6,0 đến 6,9. Trong nước chúng tồn tại ở dạng trung hòa hoặc dạng anion. Thường AQ gồm những quinolon thuộc thế hệ thứ nhất. - Piperazinyl quinolon: có hai giá trị pKa, pKa1 khoảng 5,5–6,6 và pKa2 khoảng 7,2–8,9.

Trong nước chúng có thể tồn tại ở ba dạng khác nhau: dạng cation, dạng trung hòa và dạng anion; một số PQ là danofloxacin, difloxacin, norfloxacin, ofloxacin, benofloxacin, marbofloxacin, acid pipemidic.2: Cân bằng acid - base của nhóm acidic quinolon 3 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.3: Cân bằng acid base của nhóm piperazinyl quinolon Bảng 1.1: Công thức cấu tạo và pKa của các chất STT Tên chất Công thức cấu tạo pKa 1 Ciprofloxacin pKa1: 6,09 pKa2: 8,62 2 Danofloxacin pKa1: 6,20 pKa2: 9,40 3 Erofloxacin pKa1: 6,1 pKa2: 7,7 4 Sarafloxacin pKa1: 5,6 pKa2: 8,2 5 Difloxacin pKa1: 5,7 – 6,1 pKa2: 7,2 – 7.6 6 Oxolinic acid pKa: 6,9 7 Flumequine pKa: 6,5 4 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.2 Cơ chế tác dụng và độc tính Kháng sinh nhóm này phân bố đồng đều cả trong dịch nội và ngoại bào, phân bố hầu hết các cơ quan: phổi, gan, mật, xương, tiền liệt tuyến, tử cung, dịch não tủy. và qua được hàng rào nhau thai. Fluoroquinolon đào thải chủ yếu qua đường tiết niệu ở dạng còn nguyên hoạt chất và tái hấp thu thụ động ở thận [16, 52]. Cơ chế tác động của fluoroquinolon lên vi khuẩn là ức chế tổng hợp acid nucleic.

Sự nhân đôi DNA bắt đầu bằng phản ứng tách chuỗi DNA ra làm hai, mỗi bên là một khuôn để gắn nucleotid thích hợp theo nguyên tắc bổ sung. Enzym DNA polymeras xúc tác sự tổng hợp các liên kết giữa các nucleotid; enzym DNA gyrase nối các DNA trong quá trình tổng hợp và tạo thành các vòng xoắn. Các quinolon (nalidixic acid và các fluoroquinolon) ức chế mạnh sự tổng hợp DNA trong giai đoạn nhân đôi do ức chế enzym DNA gyrase. Cơ chế tác động này hiệu quả trên cả vi khuẩn gram dương và gram âm.

Nhưng cũng có thể do cơ chế ức chế tổng hợp acid nucleic này mà kháng sinh nhóm fluoroquinolon được cho là có nguy cơ gây đột biến gen, gây sẩy thai khi sử dụng cho động vật mang thai do đó khuyến cáo là không nên sử dụng kháng sinh nhóm fluoroquinolon cho động vật mang thai, động vật sinh sản và làm giống. Ngoài ra các nghiên cứu trên động vật còn non cho thấy các kháng sinh thuộc nhóm này gây hủy hoại các khớp sụn [34, 54] do đó các kháng sinh nhóm quinolon không được sử dụng trong điều trị bệnh cho trẻ em.3 Giới hạn cho phép kháng sinh nhóm quinolon Ngày 26/6/1990 Uỷ ban An toàn thực phẩm Châu Âu chính thức ban hành Quyết định 2377/1990[26] trong đó qui định mức giới hạn tối đa các chất kháng sinh trong thực phẩm có nguồn gốc động vật trong đó giới hạn nhóm quinolon trong các sản phẩm có nguồn gốc động vật bao gồm: 5 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.2: Giới hạn cho phép kháng sinh nhóm quinolon theo EEC No.2377/1990 Tên kháng sinh Lợn (ppb) Bò, dê, cừu(ppb) Gà(ppb) Danofloxacin 100 200 200 Difloxacin 400 400 300 Enrofloxacin 100 100 100 Flumequin 200 200 400 Marbofloxacin 150 150 Oxolinic acid (*) 100 100 (*) Giới hạn cho phép trong cá 100ppb Tại Việt Nam, Thông tư số 08/VBHN-BNNPTNT ngày 25 tháng 02năm 2014 quy định Danh mục các loại kháng sinh cấm sử dụng và hạn chế sử dụng [1], theo đó các kháng sinh fluoroquinolon bị cấm sử trong sản xuất, kinh doanh thuỷ sản xuất khẩu vào thị trường Mỹ và Bắc Mỹ, ciproxacin và ofloxacin bị cấm sử dụng trong chăn nuôi thú y, các chất nằm trong danh mục hạn chế sử dụng bao gồm: Bảng 1.3: Giới hạn hàm lượng kháng sinh quinolon theo Thông tư 08/VBHN-BNNPTNT Tên kháng sinh MRL (ppb) Tên kháng sinh MRL (ppb) Danofloxacin 100 Ciprofloxacin 100 Difloxacin 300 Oxolinic Acid 100 Flumequin 600 Sarafloxacin 30 Hiện nay, theo Quyết định số 46/2007/QĐ-BYT ngày 19 tháng 12 năm 2007 về quy định mức giới hạn ô nhiễm hóa học và vi sinh vật trong thực phẩm, Bộ Y tế cũng đã đưa ra mức giới hạn của 4 kháng sinh nhóm quinolon là danofloxacin, enrofloxacin, flumequine, sarafloxacin.4: Giới hạn hàm lượng kháng sinh quinolon theo Quyết định số 46/2007/QĐ-BYT Tên kháng sinh ADI (μg/kg thể trọng/ngày) MRL (μg/kg) Danofloxacin 0 - 20 50 (gan lợn); 100 (thịt) Enrofloxacin 0-3 100 Flumequine 0 - 30 500 (thịt, gan, cá) Sarafloxacin 0 - 0,3 10 (thịt); 80 (gan, thận) 1.2 Tình hình sử dụng và tồn dƣ kháng sinh nhóm quinolon 1.1 Tình hình sử dụng và tồn dư kháng sinh nhóm quinolon trong nước Mặc dù các kháng sinh nhóm quinolon đã được các cơ quan chức năng quản lý chặt nhưng nhiều nghiên cứu đã chỉ ra thực phẩm trong nước và ngay cả thực 6 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] phẩm xuất khẩu vẫn bị phát hiện có chứa tồn dư loại kháng sinh này. Việc tồn dư kháng sinh ở hàm lượng cao cho thấy thực trạng sử dụng kháng sinh trong thời gian dài với hàm lượng lớn đồng thời người chăn nuôi không đảm bảo thời gian cách ly hợp lý đối với vật nuôi trước khi thu hoạch. Nhiều nghiên cứu trong nước đã khảo sát tình hình sử dụng các loại kháng sinh trong chăn nuôi, hầu hết các nghiên cứu đều cho thấy sự lạm dụng kháng sinh là rất phổ biến và tồn dư trong thực phẩm (kể cả đối với những chất đã bị cấm sử dụng) vẫn chiếm tỷ lệ đáng kể [4, 5, 6, 8, 9].

Người chăn nuôi sử dụng nó dưới nhiều hình thức khác nhau hoặc phối trộn trực tiếp vào trong thành phần của thức ăn hoặc đưa vào môi trường nuôi như một hình thức phòng bệnh. Theo nghiên cứu của Takahiro Yamaguchi đối với các mẫu lợn, bò, gà, tôm và cá nuôi thu thập tại các tỉnh Thái Bình, Hà Nội, Khánh Hòa, TP. HCM năm 2012-2013 của cho thấy có tới 7,7% số mẫu được kiểm nghiệm phát hiện nhiễm enrofloxacin (ERFX) với hàm lượng từ 12–77ppb điều này cho thấy mặc dù đã bị cấm nhưng bằng con đường nào đó các kháng sinh này vẫn đi vào mẫu thực phẩm để đến với người tiêu dùng [57]. Theo báo cáo của chính phủ Úc năm 2008, thủy sản nhập khẩu của Việt Nam vào thị trường nước này được giám sát rất chặt chẽ và đã phát hiện những lô hàng nhiễm kháng sinh quinolon bao gồm ERFX và ciprofloxacin (CPFX) với mức nhiễm lần lượt là 8,5 – 35 và 2,0 – 33ppb [12].