Luận văn thạc sĩ phương pháp sắc ký lỏng khối phổ lc ms ms xác định dư lượng một số kháng sinh nhóm sulfonamides trong thịt gia súc gia cầm

Luận văn thạc sĩ trình bày phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS để xác định dư lượng kháng sinh sulfonamides trong thịt gia súc, gia cầm.

• Tác giả: Vũ Thị Trang
• Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Xuân Trung
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Hóa phân tích
• Đề tài: Xác định dư lượng kháng sinh sulfonamides trong thịt
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2012
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Giới thiệu về kháng sinh nhóm sulfonamid (SAs)
• 1.2. Lịch sử phát hiện
• 1.3. Phân loại SAs
• 1.4. Cấu tạo của SAs
• 1.5. Tác dụng của SAs
• 1.6. Tình hình sử dụng kháng sinh Sulfonamid
• 2. CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tƣợng và mục tiêu nghiên cứu
• 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
• 2.3. Nguyên tắc chung của sắc ký lỏng
• 2.4. Detector khối phổ
• 2.5. Phân tích định tính và định lƣợng bằng LC/MS
• 2.6. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng trong nghiên cứu
• 2.6.1. Thiết bị và dụng cụ
• 2.6.2. Hóa chất, chất chuẩn
• 3. CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Tối ƣu điều kiện tách và xác định Sulfonamid trên thiết bị LC/MS/MS
• 3.1.1. Tối ƣu các điều kiện của detector khối phổ (MS)
• 3.1.2. Lựa chọn cột tách
• 3.1.3. Khảo sát chƣơng trình gradient
• 3.1.4. Khảo sát tốc độ pha động
• 3.1.5. Khảo sát thành phần acid formic trong pha động
• 3.2. Tối ƣu quá trình xử lý mẫu phân tích các SAs
• 3.2.1. Khảo sát qui trình chiết
• 3.2.2. Khảo sát nồng độ acid acetic trong dung môi chiết
• 3.2.3. Khảo sát thành phần MeOH trong dung môi chiết
• 3.2.4. Khảo sát khối lƣợng pha rắn PSA
• 3.3. Đánh giá phƣơng pháp phân tích
• 3.3.1. Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đƣờng chuẩn
• 3.3.2. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lƣợng (LOQ) của phƣơng pháp
• 3.3.3. Đánh giá độ chụm (độ lặp lại) và độ đúng (độ thu hồi)
• 3.4. Phân tích mẫu thực
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• Phụ lục 1: Sắc đồ khảo sát nồng độ acid formic trong pha động
• Phụ lục 2: Kết quả khảo sát qui trình chiết mẫu
• Phụ lục 3: Kết quả khảo sát nồng độ acid acetic trong dung môi chiết
• Phụ lục 4: Kết quả khảo sát nồng độ MeOH trong dung môi chiết và khối lƣợng PSA
• Phụ lục 5: Sắc đồ thẩm định phƣơng pháp (độ lặp lại, độ thu hồi)
• Phụ lục 6: Một số sắc đồ phân tích mẫu thực tế

Tóm tắt

I. Tổng quan về xác định dư lượng kháng sinh sulfonamides trong thịt

Xác định dư lượng kháng sinh sulfonamides trong thịt là một vấn đề quan trọng trong an toàn thực phẩm. Kháng sinh sulfonamides được sử dụng rộng rãi trong chăn nuôi để ngăn ngừa và điều trị bệnh. Tuy nhiên, việc tồn dư của chúng trong thực phẩm có thể gây ra nhiều nguy cơ cho sức khỏe con người. Do đó, việc nghiên cứu và phát triển các phương pháp xác định chính xác dư lượng kháng sinh này là cần thiết.

1.1. Kháng sinh sulfonamides và tác động của chúng

Kháng sinh sulfonamides là nhóm thuốc có tác dụng kháng khuẩn mạnh mẽ. Chúng hoạt động bằng cách ức chế sự tổng hợp acid folic trong vi khuẩn. Việc sử dụng chúng trong chăn nuôi giúp tăng trưởng nhanh chóng cho vật nuôi, nhưng cũng dẫn đến nguy cơ tồn dư trong thịt. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, sulfonamides có thể gây ra các tác dụng phụ nghiêm trọng cho sức khỏe con người, bao gồm cả nguy cơ kháng thuốc.

1.2. Tình hình sử dụng kháng sinh sulfonamides trong chăn nuôi

Tại Việt Nam, kháng sinh sulfonamides được sử dụng phổ biến trong chăn nuôi để phòng và điều trị bệnh. Tuy nhiên, việc kiểm soát dư lượng kháng sinh trong thực phẩm vẫn còn nhiều hạn chế. Các nghiên cứu cho thấy rằng, nhiều mẫu thịt gia súc gia cầm vẫn có dư lượng kháng sinh vượt mức cho phép, gây lo ngại cho sức khỏe cộng đồng.

II. Vấn đề tồn dư kháng sinh sulfonamides trong thịt

Tồn dư kháng sinh sulfonamides trong thịt gia súc gia cầm là một vấn đề nghiêm trọng. Việc sử dụng kháng sinh không đúng cách có thể dẫn đến sự tích tụ của chúng trong cơ thể vật nuôi. Điều này không chỉ ảnh hưởng đến sức khỏe của vật nuôi mà còn gây ra nguy cơ cho người tiêu dùng. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, tồn dư kháng sinh có thể gây ra các bệnh lý nghiêm trọng cho con người.

2.1. Nguy cơ sức khỏe từ dư lượng kháng sinh

Dư lượng kháng sinh sulfonamides trong thực phẩm có thể gây ra nhiều vấn đề sức khỏe, bao gồm dị ứng, rối loạn tiêu hóa và nguy cơ kháng thuốc. Việc tiêu thụ thực phẩm chứa dư lượng kháng sinh có thể dẫn đến sự phát triển của các vi khuẩn kháng thuốc, làm giảm hiệu quả của các phương pháp điều trị bệnh.

2.2. Tiêu chuẩn an toàn thực phẩm liên quan đến kháng sinh

Các tiêu chuẩn an toàn thực phẩm quy định mức tối đa cho phép của dư lượng kháng sinh sulfonamides trong thịt. Việc tuân thủ các tiêu chuẩn này là rất quan trọng để đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng. Các cơ quan chức năng cần thực hiện kiểm tra thường xuyên để phát hiện và xử lý kịp thời các trường hợp vi phạm.

III. Phương pháp xác định dư lượng kháng sinh sulfonamides

Có nhiều phương pháp được sử dụng để xác định dư lượng kháng sinh sulfonamides trong thịt. Một trong những phương pháp hiện đại và hiệu quả nhất là sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS). Phương pháp này cho phép phát hiện và định lượng chính xác các hợp chất kháng sinh trong mẫu thực phẩm.

3.1. Sắc ký lỏng khối phổ LC MS MS và ứng dụng

Sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) là một phương pháp phân tích mạnh mẽ, cho phép tách biệt và xác định các hợp chất hóa học trong mẫu. Phương pháp này có độ nhạy cao và khả năng phát hiện các dư lượng kháng sinh ở nồng độ rất thấp, giúp đảm bảo an toàn thực phẩm.

3.2. Quy trình thực hiện phân tích mẫu

Quy trình phân tích mẫu bằng LC-MS/MS bao gồm các bước chuẩn bị mẫu, tách chiết và phân tích. Mỗi bước đều cần được thực hiện cẩn thận để đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy của kết quả. Việc tối ưu hóa các điều kiện phân tích cũng rất quan trọng để đạt được kết quả tốt nhất.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu về xác định dư lượng kháng sinh sulfonamides trong thịt đã cho thấy nhiều kết quả khả quan. Các mẫu thịt được phân tích cho thấy một số mẫu có dư lượng kháng sinh vượt mức cho phép. Kết quả này cho thấy sự cần thiết phải kiểm soát chặt chẽ việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi.

4.1. Kết quả phân tích mẫu thực tế

Kết quả phân tích cho thấy một số mẫu thịt gia súc gia cầm có dư lượng kháng sinh sulfonamides vượt mức cho phép. Điều này cho thấy sự cần thiết phải có các biện pháp kiểm soát và giám sát chặt chẽ hơn trong việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi.

4.2. Ứng dụng kết quả nghiên cứu vào thực tiễn

Kết quả nghiên cứu có thể được ứng dụng trong việc xây dựng các quy định và tiêu chuẩn an toàn thực phẩm. Đồng thời, các phương pháp xác định dư lượng kháng sinh cũng có thể được áp dụng trong các cơ sở sản xuất thực phẩm để đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng.

V. Kết luận và triển vọng tương lai

Việc xác định dư lượng kháng sinh sulfonamides trong thịt là một vấn đề quan trọng trong an toàn thực phẩm. Các nghiên cứu hiện tại đã chỉ ra rằng, việc kiểm soát dư lượng kháng sinh là cần thiết để bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu và phát triển các phương pháp phân tích mới để nâng cao độ chính xác và độ nhạy trong việc phát hiện dư lượng kháng sinh.

5.1. Tầm quan trọng của việc kiểm soát dư lượng kháng sinh

Kiểm soát dư lượng kháng sinh trong thực phẩm không chỉ bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng mà còn đảm bảo an toàn cho ngành chăn nuôi. Việc thực hiện các biện pháp kiểm soát hiệu quả sẽ giúp giảm thiểu nguy cơ kháng thuốc và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

5.2. Hướng nghiên cứu trong tương lai

Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu để phát triển các phương pháp phân tích mới, cải thiện độ nhạy và độ chính xác. Đồng thời, cần có các chính sách và quy định chặt chẽ hơn về việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi để đảm bảo an toàn thực phẩm.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

An toàn thực phẩm, đặc biệt là trong sản phẩm chăn nuôi như thịt gia súc, gia cầm, đang là mối quan tâm cấp thiết của xã hội hiện nay. Theo báo cáo của ngành, việc tồn dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm có thể gây ra ngộ độc tích lũy, mãn tính, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe người tiêu dùng. Kháng sinh nhóm sulfonamides (SAs) là một trong những nhóm thuốc được sử dụng phổ biến trong chăn nuôi nhằm kích thích tăng trưởng và phòng trị bệnh. Tuy nhiên, việc sử dụng không kiểm soát dẫn đến tồn dư SAs vượt ngưỡng cho phép trong thịt, gây nguy cơ kháng thuốc và các tác hại sức khỏe như ung thư tuyến giáp, sốc phản vệ.

Mục tiêu nghiên cứu là phát triển và tối ưu phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) để xác định dư lượng một số kháng sinh nhóm sulfonamides trong thịt gia súc, gia cầm. Nghiên cứu được thực hiện trên mẫu thịt lợn, gà, bò và phủ tạng lấy từ các chợ nội thành Hà Nội trong năm 2012. Phương pháp này hướng tới độ nhạy cao, chính xác và nhanh chóng, phục vụ công tác kiểm tra, giám sát an toàn thực phẩm, góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng và nâng cao chất lượng sản phẩm chăn nuôi trên thị trường.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Cơ chế tác động của sulfonamides (SAs): SAs là hợp chất có nhóm SO2NH2, cạnh tranh với acid p-aminobenzoic (PABA) trong vi khuẩn, ức chế tổng hợp acid folic, từ đó kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn. SAs có tác dụng kháng khuẩn trên vi khuẩn Gram dương, Gram âm và một số protozoa.

• Phân loại SAs theo thời gian tác dụng: Bao gồm nhóm tác động nhanh (3-6 giờ), nửa chậm (6-10 giờ), chậm (10-12 giờ), kháng khuẩn đường ruột, tác động tại chỗ và trị cầu trùng.

• Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS): Kỹ thuật hiện đại, kết hợp sắc ký lỏng với khối phổ tứ cực kép, cho phép phân tích định tính và định lượng chính xác các hợp chất sulfonamides trong mẫu phức tạp. Ion hóa phun điện tử (ESI) được sử dụng để chuyển đổi phân tử sang dạng ion trong pha khí, tăng độ nhạy và chọn lọc.

• Khái niệm về giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ thu hồi và độ lặp lại: Các chỉ số quan trọng đánh giá hiệu quả và độ tin cậy của phương pháp phân tích.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Mẫu thịt lợn, gà, bò và phủ tạng được lấy ngẫu nhiên tại các chợ nội thành Hà Nội, khối lượng mẫu từ 100-500g, bảo quản ở 0-2°C và xử lý trong vòng 24 giờ.

• Phương pháp phân tích: Sử dụng hệ thống LC-MS/MS gồm HPLC Shimadzu 20 AXL và khối phổ ABI 5500 QQQ. Cột sắc ký Agilent C18 (150mm × 2,1mm × 3,5µm) với pha động gồm acid formic 0,1% trong nước (kênh A) và acetonitril (kênh B) theo chương trình gradient. Ion hóa phun điện tử (ESI) ở chế độ dương.

• Quy trình xử lý mẫu: Áp dụng kỹ thuật chiết pha rắn phân tán (QuEChERS) với dung môi acetonitril acid hóa, làm sạch bằng chất hấp phụ PSA để loại bỏ tạp chất, tăng độ chính xác và giảm thiểu ảnh hưởng nền mẫu.

• Timeline nghiên cứu: Tối ưu điều kiện sắc ký và khối phổ trong 3 tháng đầu, khảo sát xử lý mẫu trong 2 tháng tiếp theo, phân tích mẫu thực tế và đánh giá kết quả trong 3 tháng cuối năm 2012.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Tối ưu điều kiện LC-MS/MS:

   • Thế phun điện tử 4,5 kV, nhiệt độ đầu phun 500°C, nhiệt độ mao quản 350°C, khí màn 35 psi, khí va chạm 9 eV.
   • Tốc độ dòng pha động 0,4 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 10 µl.
   • Chương trình gradient pha động giúp tách đồng thời 10 sulfonamides trong vòng 18 phút với sắc ký đồ sắc nét, thời gian lưu từ 6 đến 15 phút.
   • Nồng độ acid formic 0,1% trong pha động tối ưu cho tín hiệu ion hóa, tăng diện tích pic lên đến 2-3 lần so với không có acid.

2. Hiệu quả xử lý mẫu:

   • Phương pháp QuEChERS với dung môi acetonitril acid hóa và chất hấp phụ PSA cho hiệu suất thu hồi các SAs từ 86% đến 106%, độ lệch chuẩn tương đối (RSD) dưới 15%.
   • Giới hạn phát hiện (LOD) đạt khoảng 0,025 ppb, giới hạn định lượng (LOQ) từ 0,05 đến 0,1 ppb, đáp ứng yêu cầu kiểm soát dư lượng theo tiêu chuẩn quốc tế.

3. Phân tích mẫu thực tế:

   • Trong 100 mẫu thịt và phủ tạng thu thập tại Hà Nội, có khoảng 12% mẫu phát hiện tồn dư sulfonamides vượt mức cho phép 100 µg/kg.
   • Sulfamethazine là hợp chất có hàm lượng cao nhất, lên tới 774,9 µg/kg trong một số mẫu thịt bò.
   • Các mẫu thịt lợn và gà cũng phát hiện sulfadiazine và sulfadimidine với hàm lượng dao động từ 4 đến 123 ppb.

Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy phương pháp LC-MS/MS được tối ưu có độ nhạy và độ chính xác cao, phù hợp để phát hiện dư lượng sulfonamides trong thịt gia súc, gia cầm. Việc lựa chọn cột C18 với kích thước hạt 3,5 µm và chương trình gradient pha động acid formic 0,1% giúp tách sắc nét các hợp chất có cấu trúc tương tự, giảm thiểu hiện tượng kéo đuôi và chẻ pic.

Phương pháp xử lý mẫu QuEChERS vừa đơn giản, nhanh chóng, vừa giảm thiểu sử dụng dung môi độc hại, phù hợp với xu hướng hóa học xanh. Hiệu suất thu hồi cao và độ lặp lại tốt chứng tỏ quy trình xử lý mẫu ổn định, đáng tin cậy.

So sánh với các nghiên cứu quốc tế, kết quả hàm lượng sulfonamides trong mẫu thực tế tại Hà Nội tương đương hoặc cao hơn một số khu vực, phản ánh thực trạng sử dụng kháng sinh chưa kiểm soát chặt chẽ trong chăn nuôi. Dữ liệu này có thể được trình bày qua biểu đồ cột thể hiện tỷ lệ mẫu vi phạm và mức dư lượng từng loại sulfonamide, hoặc bảng tổng hợp các chỉ số LOD, LOQ, độ thu hồi.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Tăng cường kiểm soát và giám sát dư lượng kháng sinh trong chăn nuôi:

   • Áp dụng phương pháp LC-MS/MS đã tối ưu để kiểm tra định kỳ tại các cơ sở giết mổ, chợ đầu mối.
   • Mục tiêu giảm tỷ lệ mẫu vi phạm xuống dưới 5% trong vòng 2 năm tới.
   • Chủ thể thực hiện: Cục Quản lý chất lượng nông lâm thủy sản, các trung tâm kiểm nghiệm.

2. Đào tạo và nâng cao nhận thức cho người chăn nuôi:

   • Tổ chức các khóa tập huấn về sử dụng kháng sinh hợp lý, tuân thủ thời gian ngưng sử dụng trước thu hoạch.
   • Mục tiêu giảm thiểu sử dụng kháng sinh không cần thiết, hạn chế tồn dư trong sản phẩm.
   • Chủ thể thực hiện: Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, các tổ chức hội nghề nghiệp.

3. Xây dựng và hoàn thiện quy định pháp luật về giới hạn tồn dư kháng sinh:

   • Cập nhật mức giới hạn tồn dư tối đa (MRL) phù hợp với tiêu chuẩn quốc tế và đặc điểm tiêu dùng trong nước.
   • Thời gian thực hiện: 1-2 năm.
   • Chủ thể thực hiện: Bộ Y tế, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn.

4. Phát triển hệ thống phòng thí nghiệm hiện đại:

   • Đầu tư trang thiết bị LC-MS/MS tại các trung tâm kiểm nghiệm trọng điểm.
   • Đào tạo nhân lực chuyên môn cao để vận hành và phân tích mẫu.
   • Mục tiêu nâng cao năng lực phân tích, rút ngắn thời gian trả kết quả.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Cơ quan quản lý nhà nước về an toàn thực phẩm và nông nghiệp:

   • Sử dụng kết quả nghiên cứu để xây dựng chính sách, quy chuẩn kiểm soát dư lượng kháng sinh trong thực phẩm.

2. Các trung tâm kiểm nghiệm và phòng thí nghiệm phân tích:

   • Áp dụng phương pháp LC-MS/MS tối ưu để nâng cao hiệu quả kiểm tra, giám sát chất lượng sản phẩm chăn nuôi.

3. Người chăn nuôi và doanh nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi:

   • Hiểu rõ tác động của việc sử dụng kháng sinh nhóm sulfonamides, từ đó điều chỉnh quy trình chăn nuôi, sử dụng thuốc hợp lý.

4. Các nhà nghiên cứu và sinh viên chuyên ngành hóa phân tích, an toàn thực phẩm:

   • Tham khảo kỹ thuật phân tích hiện đại, quy trình xử lý mẫu và tối ưu điều kiện sắc ký khối phổ trong nghiên cứu dư lượng thuốc thú y.

Câu hỏi thường gặp

1. Phương pháp LC-MS/MS có ưu điểm gì so với các phương pháp khác trong xác định sulfonamides?
   LC-MS/MS có độ nhạy và độ chọn lọc cao, cho phép xác định đồng thời nhiều hợp chất trong mẫu phức tạp với giới hạn phát hiện rất thấp (khoảng 0,025 ppb). Phương pháp này cũng cung cấp thông tin định tính chính xác nhờ phổ phân mảnh đặc trưng.

2. Tại sao cần tối ưu nồng độ acid formic trong pha động?
   Acid formic giúp cải thiện ion hóa các sulfonamides trong nguồn ion ESI, tăng cường tín hiệu và độ nhạy. Tuy nhiên, nồng độ quá cao có thể gây cạnh tranh ion, làm giảm tín hiệu. Nồng độ 0,1% được xác định là tối ưu trong nghiên cứu.

3. Kỹ thuật QuEChERS có lợi ích gì trong xử lý mẫu?
   QuEChERS nhanh, đơn giản, sử dụng ít dung môi độc hại, hiệu quả trong việc loại bỏ tạp chất, giúp tăng độ chính xác và độ lặp lại của phân tích. Phương pháp này phù hợp với xu hướng hóa học xanh và phân tích đa dư lượng.

4. Giới hạn tồn dư tối đa (MRL) của sulfonamides trong thịt là bao nhiêu?
   Theo quy định của Liên minh Châu Âu và Việt Nam, MRL đối với sulfonamides trong thịt, gan, thận là khoảng 100 µg/kg. Việc tuân thủ MRL giúp đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng và đáp ứng yêu cầu xuất khẩu.

5. Tại sao tồn dư sulfonamides trong thịt lại gây nguy hiểm cho sức khỏe?
   Tồn dư sulfonamides có thể gây kháng thuốc ở vi khuẩn, làm giảm hiệu quả điều trị bệnh. Ngoài ra, chúng có thể tích tụ trong cơ thể người, gây các phản ứng dị ứng, rối loạn chuyển hóa, thậm chí ung thư tuyến giáp và các tác hại mãn tính khác.

Kết luận

• Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS được tối ưu thành công để xác định dư lượng 10 sulfonamides trong thịt gia súc, gia cầm với độ nhạy cao, giới hạn phát hiện khoảng 0,025 ppb và độ thu hồi trên 86%.
• Kỹ thuật xử lý mẫu QuEChERS giúp đơn giản hóa quy trình, giảm thiểu dung môi độc hại, đồng thời nâng cao độ chính xác và độ lặp lại của phân tích.
• Phân tích mẫu thực tế tại Hà Nội cho thấy khoảng 12% mẫu thịt có tồn dư sulfonamides vượt mức cho phép, phản ánh thực trạng sử dụng kháng sinh chưa kiểm soát chặt chẽ.
• Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học cho công tác kiểm tra, giám sát an toàn thực phẩm và xây dựng chính sách quản lý kháng sinh trong chăn nuôi.
• Đề xuất triển khai áp dụng phương pháp LC-MS/MS trong hệ thống kiểm nghiệm quốc gia, đồng thời tăng cường đào tạo và nâng cao nhận thức cho người chăn nuôi nhằm giảm thiểu tồn dư kháng sinh.

Các cơ quan quản lý và phòng thí nghiệm nên phối hợp triển khai áp dụng phương pháp này để nâng cao hiệu quả kiểm soát an toàn thực phẩm, bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU An toàn thực phẩm đang là mối quan tâm hàng đầu của toàn xã hội. An toàn thực phẩm trong sản phẩm chăn nuôi không chỉ đơn thuần là sản phẩm (thịt, trứng, sữa) không nhiễm bẩn, ôi thiu, nhiễm khuẩn (yếu tố gây ngộ độc cấp tính), mà còn ở chỗ sản phẩm chứa các chất gây ra ngộ độc tích luỹ, mãn tính hay trƣờng diễn (hocmon, kháng sinh, độc chất). Trong vô số các nguyên nhân dẫn đế n viê ̣c mấ t an toàn vê ̣ sinh thƣ̣c phẩ m , thì vấn đề về dƣ lƣợng thuốc kháng sinh và tồn dƣ chất kích thí ch tăng tro ̣ng trong thịt gia súc gia cầm cũng là thực trạng nan giải và đáng báo động. Với mô ̣t lƣơ ̣ng thƣ̣c phẩ m khổ ng lồ tƣ̀ đô ̣ng vâ ̣t đang đƣơ ̣c tiêu thu ̣ trên thi ̣trƣờng , ít ai nghĩ đến viê ̣c mỗi ngày trong cơ thể chúng ta đa ng phải dần tić h lũy dƣ lƣơ ̣ng chấ t kić h thić h tăng tro ̣ng và thuố c kháng sinh.

Nguyên nhân do ngƣời dân sƣ̉ du ̣ng rấ t tùy tiê ̣n các loại thức ăn tăng trọng và thuốc kháng sinh nhằm ngăn ngừa , trị bệnh và giúp vật nuôi mau ăn chó ng lớn. Hâ ̣u quả là dƣ lƣơ ̣ng chấ t kích thích và thuố c kháng sinh trong thiṭ gia súc, gia cầ m vƣơ ̣t ngƣỡng cho phép gấ p nhiề u lầ n , tuy không gây ngô ̣ đô ̣c cấ p tiń h tƣ́c thời, nhƣng sẽ gây nguy ha ̣i về lâu dài cho sƣ́c khỏe của ngƣờ i tiêu dùng. Sulfonamid (SAs) là một nhóm thuốc kháng sinh tổng hợp đóng một vai trò quan trọng và hiệu quả trong việc hạn chế sự nhiễm trùng do vi khuẩn và vi sinh vật trong hệ thống tiêu hóa của vật nuôi. Vì vậy, chúng đƣợc sử dụng trong thức ăn chăn nuôi nhằm kích thích tăng trƣởng, ngăn chặn và điều trị một loạt các bệnh ở gia súc gia cầm nhƣ các bệnh về tiêu hóa hay hô hấp.

Song hệ quả không thể tránh khỏi khi sử dụng nhóm các chất kháng sinh này là tồn dƣ của chúng trên thịt gia súc gia cầm, gây nguy cơ kháng thuốc kháng sinh của vi sinh vật, làm giảm sức đề kháng của vật nuôi, và gây hại cho sức khỏe con ngƣời nhƣ: ung thƣ tuyến giáp, sốc phản vệ và kháng thuốc [1]. Ngộ độc thực phẩm thƣờng xảy ra do thiếu sót trong công tác kiểm tra, thanh tra từ nguyên liệu dùng để chế biến thực phẩm, do sơ xuất trong nấu nƣớng, vệ sinh. 10 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Việc nghiên cứu xác định dƣ lƣợng SAs trong thịt gia súc gia cầm đã đƣợc nhiều tác giả trên thế giới quan tâm. Tuy nhiên, ở Việt Nam, vấn đề này vẫn chƣa đƣợc nghiên cứu sâu.

Việc nghiên cứu và đƣa ra phƣơng pháp xác định nhanh, chính xác SAs giúp cho công tác thanh tra kiểm tra đƣợc chặt chẽ, đảm bảo an toàn cho ngƣời tiêu dùng. Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ là phƣơng pháp hiện đại, có độ nhạy cao, cho phép xác định nhanh và chính xác. Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ(LC-MS/MS) xác đinh dư lượng một số kháng sinh nhóm Sulfonamid trong thịt gia súc gia cầm ”. Với nội dung nghiên cứu nhƣ sau: - Tối ƣu các điều kiện chạy máy LC-MS/MS để tách và xác định các SAs - Tối ƣu quá trình xử lý mẫu.

- Ứng dụng phân tích trên một số mẫu thực tế. 11 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Giới thiệu về kháng sinh nhóm sulfonamid (SAs) 1.1 Lịch sử phát hiện [6] Năm 1935 ngƣời ta thấy chất màu prontosil đƣợc chuyển hóa invitro thành hoạt chất sulfanilamide, một dẫn xuất ngăn ngừa đƣợc nhiễm liên cầu ở chuột. Sau đó các sulfonamid khác đƣợc tổng hợp, là những chất chuyển hóa của sulfanilamide với các vị trí thế N1 và N4.

Trong đó sulfanilamide và sulfadiazine đƣợc cấp phép vào năm 1939 và 1941. Theo các nhà Dƣợc học phân loại thì Sulfonamid là một nhóm thuốc có tác động tĩnh khuẩn miễn dịch giữ vai trò chủ yếu trong việc loại bỏ tận gốc sự nhiễm trùng. Do đó, các sulfonamid trở thành những tác nhân hóa trị liệu đầu tiên đƣợc dùng để ngăn ngừa và điều trị nhiễm khuẩn toàn thân ở ngƣời. Từ đó tới nay, một loạt sulfonamid khác đƣợc cấp phép, mặc dù hiện nay, hiếm khi chúng đƣợc dùng đơn độc mà thƣờng hay kết hợp với một vài chất khác.

Phân loại SAs Các SAs đƣợc phân loại theo khả năng hấp thu và thời gian bài thải chúng ra khỏi cơ thể, đa số bài thải qua đƣờng thận bằng cách khuếch tán thụ động. Tuy nhiên, có một số bị tái hấp thụ ở ống thận làm cho chúng duy trì lâu hơn trong cơ thể [8]. Dựa vào thời gian tác dụng có thể chia SAs thành 4 nhóm nhƣ sau: - SAs tác động toàn thân, bao gồm: + SAs tác động nhanh (3-6 giờ), bài thải nhanh: sulfamerazin, sulfadimidin, sulfathiazole. + SAs nửa chậm (6-10 giờ): sulfapyridin, sulfamethoxazol, sulfadiazine.

12 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] +SAs bài thải chậm (10-12 giờ): sulfamethoxypyridazin, sulfadimethoxin, sulfadoxin. - SAs kháng khuẩn đƣờng ruột: sulfaguanidin,phtalylsulfathiazon. - SAs tác động tại chỗ (thuốc nhỏ mắt): sulfacetamid,sulfadiazine bạc. - SAs trị cầu trùng (thƣờng kết hợp với nhóm diaminopyrimidin): sulfadimidin, solfaquinoxalin, sulfadimethoxin,sulfadoxin.3 Cấu tạo của SAs Thay thế các gốc R1, R2, R3 khác nhau, sẽ cho các SAs khác nhau Bảng 1.1: Cấu trúc hoá học của một số SAs đƣợc xác định trong đề tài Khối SAs Công thức lƣợng STT pKa Công thức cấu tạo phân tử phân tử (g/mol) Sulfisomidine (SIM) 1 C12H14N4O2S 278,331 7,35 4-amino-N-(2,6- dimethylpyrimidin-4-yl) benzenesulfonamid Sulfadiazine (SD) 2 C10H10N4O2S 250,278 6,5 4-amino-N-pyrimidin- 2-yl-benzenesulfonamid Sulfathiazole 3 C9H9N3O2S2 255,319 7,24 (STZ) 13 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] 4-amino-N-(1,3-thiazol- 2-yl)benzenesulfonamid Sulfapyridine (SP) 4 C11H11N3O2S 249,29 8,54 (4-amino-N-pyridin-2- ylbenzenesulfonamid) Sulfamerazine (SM) 5 C11H12N4O2S 264,305 6,98 4-amino-N-(4- methylpyrimidin-2-yl) benzenesulfonamid Sulfamonomethoxine (SMM) 4-Amino-N-(6- 6 C11H12N4O3S 280,30 6,05 methoxy-4- pyrimidinyl)benzenesulf onamid Sulfachloropyridazine (SCP) 7 C10H9ClN4O2S 284,72 5,90 N’-(6-Chloro-3- pyridazinyl)sulfanilamid e Sulfamethoxazole (SMX) 8 C10H11N3O3S 253,279 5,81 4-amino-N-(5- methylisoxazol-3-yl)- benzenesulfonamid 14 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Sulfisoxazole (SSA) 9 C11H13N3O3S 267,30 4,83 4-amino-N-(3,4- dimethyl-1,2-oxazol-5- yl)benzenesulfonamid Sulfadimethoxine (SDM) 4-amino-N-(2,6- 10 dimethoxypyrimidin-4- C12H14N4O4S 310,33 6,21 yl) benzenesulfonamid đồng vị của SDM: trong phân tử có Sulfadimethoxine-d4 C12H10D4N4O4 bốn nguyên tử hidro 1H bị thay thế 11 314 6,21 (IS) S bởi bốn nguyên tử deuteri 2H, đƣợc dùng làm nội chuẩn 1.4 Tác dụng của SAs  Cơ chế tác động: SAs là một hợp chất hữu cơ có chứa các gốc SO2NH2 (amid của acid sulfonic).

Cấu trúc phân tử của nó tƣơng tự nhƣ p-aminobenzoic acid (PABA) là cần thiết trong các vi khuẩn sinh vật, nhƣ một chất nền của enzym dihydropteroat cho sự tổng hợp của acid tetrahydrofolic (THF). Cơ chế tác dụng kìm khuẩn của SAs là do nó cạnh tranh với acid PABA trong tế bào vi khuẩn, làm cho việc tổng hợp và vận chuyển acid folic (động vật có vú dùng acid folic có trong thực phẩm còn vi khuẩn phải tổng hợp folic) thành nucleoprotein cần cho mọi tế bào sống của vi khuẩn bị ngƣng trệ, gây rối loạn sự sinh sản và phát triển của vi khuẩn. PABA kết hợp với pteroic acid hoặc glutamic để tạo pteroylglutamic acid (PGA), chất này nhƣ một coenzyme trong sự tổng hợp purin và timin. PGA cũng là một phần của phân tử B12 có liên quan tới sự biến dƣỡng acid amin và purin.

Do đó khi thiếu 15 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] PABA sẽ gây thiếu purin, acid nucleic. Điều này cũng giải thích tại sao các vi khuẩn tự tổng hợp đƣợc PABA thì đề kháng với SAs và tại sao thymin, purin, methionin, và một số amin khác lại đối kháng hiệu quả với SAs. Do đó vi khuẩn bị tiêu diệt trƣớc sức đề kháng của cơ thể hoặc nhờ tác dụng của thuốc. Chúng đƣợc sử dụng trong phòng và điều trị nhiễm trùng do vi khuẩn, đái tháo đƣờng, phù, tăng huyết áp, và bệnh gút… Các sulfonamid có tác dụng kháng khuẩn cho hệ miễn dịch giữ vai trò chủ yếu trong loại trừ tận gốc sự nhiễm trùng.

Sulfonamid có hiệu quả cao trong giai đoạn đầu của nhiễm trùng cấp tính vì giai đoạn này vi khuẩn có mức biến dƣỡng cao, dễ kết hợp với Sulfonamid, thêm vào đó khả năng thực bào còn mạnh và sự khuếch tán của thuốc chƣa bị cản trở bởi quá trình xơ hóa trong viêm mãn tính. Chúng có khả năng kháng khuẩn trên vi khuẩn Gram dƣơng, Gram âm, Protozoa [9].  Tác dụng phụ của SAs: Các loại SAs đƣợc các nhà sản xuất đƣa vào trong thức ăn gia súc, gia cầm, các thuốc chống mốc, thuốc chống oxy hóa giúp sinh vật tăng sức đề kháng, phòng trị nhiễm khuẩn đồng thời giống nhƣ một chất kích thích tăng trƣởng đem lại lợi ích cho ngƣời chăn nuôi. Tuy nhiên những năm gần đây xảy ra hiện tƣợng kháng kháng sinh và tồn dƣ kháng sinh trong thịt, cá, tôm…do ngƣời nông dân sử dụng không đúng cách và quá nhiều thuốc kháng sinh và không đảm bảo thời gian ngƣng sử dụng trƣớc khi thu hoạch, làm cho kháng sinh tích tụ trong thịt.

Khi ngƣời tiêu dùng sử dụng thực phẩm có chứa dƣ lƣợng kháng sinh SAs trong thịt, tôm, cá, trứng, sữa.sau một thời gian dài sử dụng chúng sẽ tích lũy trong cơ thể, có thể gây hiện tƣợng kháng kháng sinh ở ngƣời, làm mất đi cả vi khuẩn có lợi, ngoài ra SAs dễ bị acetyl hóa ở gan thành N4- acetyl sulfonamid khó tan trong nƣớc, đồng thời từ quản cầu thận tới ống dẫn tiểu, SA đƣợc làm đậm đặc 50 lần, sự bài tiết H+ vào ống thận làm nƣớc tiểu càng acid hơn, giảm tính tan của sulfonamid từ đó trở thành tinh thể trong ống thận, gây hiện tƣợng kết tinh ở đƣờng tiết niệu gây viêm thận và sỏi thận, tiểu ra máu. Sulfonamid có khả năng gây ra một loạt các phản ứng bất lợi, bao gồm cả rối loạn đƣờng tiết niệu, rối loạn tạo máu , rối loạn chuyển hóa porphyrin, và 16 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] phản ứng quá mẫn cảm. Khi sử dụng với liều lƣợng lớn, chúng có thể gây ra phản ứng dị ứng mạnh mẽ. Hai hội chứng nghiêm trọng nhất là hội chứng Stevens- Johnson và hoại tử biểu bì độc hại (cũng đƣợc gọi là hội chứng Lyell).

SAs hấp thu tốt qua đƣờng tiêu hóa, ngoại trừ các SAs có tác động tại chỗ.5 Tình hình sử dụng kháng sinh Sulfonamid SAs là một trong những nhóm chất lâu đời nhất của các hợp chất kháng khuẩn. Chúng đƣợc sử dụng lâm sàng trong 50 năm và lần đầu tiên đƣợc đăng ký tại Úc năm 1940.