Luận văn: Nghiên cứu vi khuẩn biofilm và khả năng chuyển hóa nitơ tại Việt Nam

Luận văn nghiên cứu đặc điểm sinh học, khả năng sử dụng nitơ của vi khuẩn biofilm. Khám phá các chủng vi khuẩn phân lập tại Việt Nam và ứng dụng.

• Tác giả: Nguyễn Thị Giang
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Quang Huy
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu đặc điểm sinh học, khả năng sử dụng nitơ của một số chủng vi khuẩn tạo biofilm phân lập tại Việt Nam
• Loại tài liệu: Luận văn Thạc sĩ Khoa học
• Năm xuất bản: 2012
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Khái niệm và đặc điểm của Vi khuẩn Biofilm

Vi khuẩn biofilm là các tập hợp vi khuẩn sống trong một ma trận ngoại bào được gọi là EPS (Extracellular Polymeric Substances). Đây là một cơ chế sinh tồn quan trọng giúp vi khuẩn thích nghi với môi trường khắc nghiệt. Biofilm có thể hình thành trong tự nhiên, trên các thiết bị nhân tạo, và trong cơ thể sinh vật sống. Các đặc điểm của biofilm bao gồm khả năng bảo vệ tế bào khỏi các điều kiện bất lợi, tăng cường khả năng trao đổi chất và di truyền giữa các loài vi khuẩn. Cấu trúc này tạo thành một cộng đồng vi sinh vật phức tạp với các giai đoạn phát triển rõ rệt.

1.1. Thành phần và cấu trúc của Biofilm

Thành phần chính của biofilm bao gồm EPS chứa các hợp chất polysaccharide, protein và các phân tử dính như lông, roi và tiêm mao. Cấu trúc biofilm bao gồm tế bào vi khuẩn nhúng trong ma trận ngoại bào, tạo thành một hệ thống ba chiều phức tạp. Các hợp chất trong EPS đóng vai trò quan trọng trong bảo vệ và cấp dưỡng cho cộng đồng vi khuẩn.

1.2. Quá trình hình thành Biofilm

Hình thành biofilm trải qua các giai đoạn: bám dính ban đầu, proliferation, và hoặc lập cấu trúc 3D. Các yếu tố như nhiệt độ, pH và dinh dưỡng ảnh hưởng đến quá trình này. Quá trình tạo màng sinh vật giúp vi khuẩn tận dụng nguồn dinh dưỡng và phát triển trong môi trường khó khăn.

II. Khả năng sử dụng Nitơ của Vi khuẩn Biofilm

Khả năng chuyển hóa nitơ là một đặc tính quan trọng của vi khuẩn biofilm, đặc biệt trong xử lý nước thải và bảo vệ môi trường. Vi khuẩn có thể chuyển hóa amoni thành nitrit và nitrat thông qua quá trình nitrat hóa, hoặc chuyển hóa nitrit thành các hợp chất nitơ khác. Nghiên cứu trên các chủng vi khuẩn phân lập tại Việt Nam cho thấy khả năng sử dụng nitơ khác nhau tùy thuộc vào từng chủng. Điều này có ý nghĩa lớn trong xử lý nước thải chăn nuôi và bảo vệ nguồn nước sạch.

2.1. Khả năng chuyển hóa Amoni

Các vi khuẩn nitrosomonas và nitrobacter trong biofilm có khả năng chuyển hóa amoni thành nitrit. Quá trình này là giai đoạn đầu tiên của nitrat hóa trong chu trình nitơ. Vi khuẩn sử dụng amoni như một nguồn năng lượng và tạo nên biofilm bề mặt hoặc màng nổi để tối ưu hóa quá trình này.

2.2. Khả năng chuyển hóa Nitrit

Chuyển hóa nitrit là giai đoạn thứ hai trong nitrat hóa, trong đó nitrit được chuyển đổi thành nitrat. Vi khuẩn biofilm có khả năng tích lũy nitrit và chuyển hóa hiệu quả. Khả năng này quan trọng trong xử lý nước thải và giảm thiểu ô nhiễm nitơ vào môi trường nước.

III. Ứng dụng Vi khuẩn Biofilm trong Xử lý Nước Thải

Vi khuẩn biofilm đóng vai trò thiết yếu trong xử lý nước thải chăn nuôi một cách sinh học. Các phương pháp xử lý hiện đại sử dụng biofilm để loại bỏ nitơ và các chất ô nhiễm khác. Biofilm bề mặt trên các vật liệu nhựa polyethylen (PE) và polyvinyl chloride (PVC) tạo ra môi trường lý tưởng cho vi khuẩn phát triển và chuyển hóa chất thải. Việc nghiên cứu các chủng vi khuẩn phân lập tại Việt Nam từ các trại nuôi lợn, vịt và hệ thống thoát nước cho thấy tiềm năng ứng dụng thực tiễn. Điều kiện như nhiệt độ và pH được điều chỉnh để tối ưu hóa khả năng biofilm phát triển và xử lý chất thải hiệu quả.

3.1. Phương pháp Sinh học trong Xử lý Nước Thải

Phương pháp sinh học sử dụng vi khuẩn biofilm để loại bỏ ô nhiễm từ nước thải chăn nuôi. Các hệ thống biofilm bề mặt và màng nổi hoạt động dựa trên khả năng chuyển hóa nitơ của vi khuẩn. Quá trình phản nitrat hóa giúp chuyển đổi nitrat thành nitơ khí, giảm tải ô nhiễm.

3.2. Ảnh hưởng của Điều kiện Môi trường

Nhiệt độ và pH ảnh hưởng lớn đến khả năng hình thành biofilm và chuyển hóa nitơ. Các nghiên cứu cho thấy biofilm phát triển tối ưu ở các khoảng nhiệt độ và pH nhất định. Việc kiểm soát các yếu tố này trong hệ thống xử lý nước thải giúp tăng hiệu quả loại bỏ chất ô nhiễm.

IV. Phân loại và Phương pháp Nghiên cứu Vi khuẩn Biofilm

Phân loại vi khuẩn biofilm dựa trên phân tích gen 16S rRNA là phương pháp tiên tiến để xác định các chủng vi khuẩn. Các phương pháp nghiên cứu bao gồm chụp ảnh hiển vi điện tử quét (SEM) để quan sát hình dạng và cấu trúc biofilm chi tiết. Nhuộm Gram được sử dụng để phân biệt các loại vi khuẩn Gram dương và Gram âm. Các chủng phân lập từ các địa điểm khác nhau như trại nuôi lợn, vịt và hệ thống thoát nước cho thấy đa dạng bằng cách tiếp cận đa phương pháp này. Các phương pháp thống kê sinh học được áp dụng để phân tích mối quan hệ giữa khả năng tạo biofilm và khả năng chuyển hóa nitơ của các chủng.

4.1. Kỹ thuật Phân loại Gen 16S rRNA

Phân tích gen 16S rRNA cho phép xác định chính xác loại và chủng vi khuẩn trong biofilm. Phương pháp này giúp nhận dạng các chủng vi khuẩn phân lập từ các nguồn khác nhau. Dữ liệu di truyền cung cấp thông tin về khả năng chuyển hóa nitơ và các đặc tính sinh học khác của vi khuẩn.

4.2. Phương pháp Quan sát Hình thái Học

Chụp ảnh hiển vi điện tử quét cho phép quan sát cấu trúc ba chiều của biofilm và hình dạng vi khuẩn. Nhuộm Gram phân biệt vi khuẩn dựa trên thành phần dịch mỡ tế bào. Các phương pháp này giúp liên hệ hình thái với khả năng chuyển hóa nitơ của từng chủng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Nƣớc thải có hàm lƣợng nitơ cao quá mức cho phép khi đƣợc thải ra sông, hồ sẽ gây ra hiện tƣợng phú dƣỡng làm nƣớc có màu, mùi khó chịu ảnh hƣởng đến môi trƣờng sinh thái cũng nhƣ sức khoẻ cộng đồng. Do vậy, việc phải loại bỏ nitơ đến mức tối thiểu từ các nguồn nƣớc ô nhiễm trƣớc khi đƣa ra môi trƣờng là cần thiết. Trong số các loại nƣớc thải ô nhiễm, nƣớc thải chăn nuôi là một trong những loại nƣớc thải có hàm lƣợng nitơ cao, có khả năng g y ô nhiễm môi trƣờng và là sinh sống phát triển của nhiều nhóm sinh vật gây bệnh và cũng là loại nƣớc thải ô nhiễm khó xử lý. Có nhiều phƣơng pháp xử lý nitơ khác nhau nhƣ áp dụng các phƣơng pháp hoá học, vật lý nhƣng phƣơng pháp xử lý mang tính bền vững, thân thiện với môi trƣờng vẫn là các phƣơng pháp sinh học với sự tham gia của các nhóm vi sinh vật trong tự nhiên.

Trong tự nhiên, hầu hết các tế bào vi sinh vật thƣờng liên kết với nhau tạo thành một cộng đồng và bám dính trên các bề mặt giá thể thông qua mạng lƣới các hợp chất ngoại bào, hình thành cấu trúc màng sinh vật (biofilm). Biofilm giúp cho vi sinh vật tồn tại và quan hệ hợp tác giữa các loài khác nhau trong hệ thống màng sinh vật, có thể tận dụng đƣợc nhiều nguồn dinh dƣỡng. Việc nghiên cứu khả năng phát triển và tạo màng sinh vật của các chủng vi sinh vật phân giải nitơ trong nƣớc thải nói chung và nƣớc thải chăn nuôi nói riêng là một hƣớng đi mới nhằm nâng cao hiệu quả trong xử lý ô nhiễm môi trƣờng cũng nhƣ góp phần tìm hiểu sự đa dạng sinh học trong tự nhiên. Xuất phát từ thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm sinh học, khả năng sử dụng nitơ của một số chủng vi khuẩn tạo biofilm phân lập tại Việt Nam.” 1 Luận văn Thạc sỹ Sinh Nguyễn Thị CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ BIOFILM 1.

Giới thiệu chung về Biofilm Khái niệm màng sinh vật đƣợc hiểu là tập hợp các quần xã vi sinh vật bám dính và phát triển trên bề mặt các môi trƣờng khác nhau thông qua mạng lƣới chất ngoại bào do chính chúng tạo ra [32], [57]. Màng sinh vật có thể hình thành trên bề mặt môi trƣờng vô sinh hay hữu sinh và là một hiện tƣợng phổ biến xuất hiện trong tự nhiên, trong đời sống hay trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau. Các tế bào vi sinh vật trong một màng sinh vật khác biệt với các tế bào sống trôi nổi tự do bởi việc tổng hợp các chất ngoại bào giúp các tế bào bám dính với nhau trên bề mặt, sự giảm tỷ lệ tăng trƣởng, và sự điều hòa tăng hoặc giảm của các gen đặc biệt nào đó. Khả năng bám d nh của vi sinh vật là một quá trình phức tạp đƣợc điều hòa bởi các đặc điểm khác nhau về môi trƣờng nuôi cấy, chất nền ngoại bào và bề mặt tế bào [56].

Vi khu n bắt đầu quá trình tạo màng sinh vật để đáp ứng với những tác động cụ thể từ môi trƣờng sống nhƣ nguồn chất dinh dƣỡng và oxy. Quá trình tạo thành màng sinh vật cũng trải qua các biến đổi động học trong việc chuyển từ đời sống tự do sang dạng sống bám dính trong cấu trúc màng sinh vật, bao gồm cả việc sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp và gia tăng các chất chống lại các tác nhân vật lý, hóa học và sinh học gây hại [82]. Sự hình thành màng sinh vật đƣợc coi là một trong số những cơ chế tồn tại của vi sinh vật, tại đó vi khu n tận dụng đƣợc các nguồn dinh dƣỡng và nhận đƣợc sự bảo vệ trong các điều kiện bất lợi nhƣ khô hạn, bức xạ cực tím hoặc những chất độc hại. Mặt khác có thể coi hệ thống màng sinh vật là một mạng lƣới nhiều gen, tại đó các vật liệu di truyền có thể dễ dàng đƣợc trao đổi qua lại giữa các tế bào vi sinh vật [65].

Biofilm có thể đƣợc hình thành bởi tập hợp các tế bào của một hoặc nhiều loài vi sinh vật khác nhƣ nấm, tảo, xạ khu n, vi khu n. Trong biofilm các tế bào tập hợp thành các đơn vị cấu trúc là các vi khu n lạc. Thành phần này đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành biofilm đặc biệt là ở giai đoạn đầu bởi nó quy định đặc tính hình thành biofilm cho từng loài vi sinh vật, đảm nhiệm chức năng tiết các hợp chất ngoại bào cũng nhƣ có chứa các yếu tố phụ trợ tế bào nhƣ lông roi, lông nhung hỗ trợ cho việc bám dính của các tế bào khác lên bề mặt giá thể. 2 Luận văn Thạc sỹ Sinh Nguyễn Thị 1.

Các dạng tồn tại của biofilm Biofilm là một dạng tồn tại của sinh vật không chỉ xuất hiện ở trong phòng thí nghiệm mà còn có ở nhiều nơi khác nhau. Biofilm thƣờng đƣợc tìm thấy trên bề mặt các vật liệu rắn (đất, đá, các vật liệu dạng rắn…) nơi ngập nƣớc hoặc bề mặt nơi tiếp xúc với dung dịch nƣớc. Biofilm có thể h nh thành tƣơng tự nhƣ mảng nổi trên bề mặt chất lỏng và trên bề mặt của lá, đặc biệt là ở nơi có độ m cao. Với đầy đủ các nguồn dinh dƣỡng cho quá tr nh sinh trƣởng, một biofilm sẽ nhanh chóng phát triển đạt k ch thƣớc lớn (có thể quan sát phát hiện thấy bằng mắt thƣờng).

Biofilm có thể đƣợc tạo thành bao gồm chỉ một loài vi sinh vật hoặc cũng có thể gồm nhiều loài vi sinh vật khác nhau, nhƣ vi khu n, nấm và tảo; mỗi nhóm thực hiện chức năng trao đổi chất ri ng, nhƣng có quan hệ chặt chẽ với nhau. Do vậy trong thực tế có thể bắt gặp nhiều dạng biofilm đƣợc tạo thành từ các vi sinh vật khác nhau [54]. Trong tự nhiên Biofilm có thể tồn tại ở khắp nơi. Chúng thƣờng đƣợc thấy ở những sinh cảnh có nƣớc, chất dinh dƣỡng và bề mặt.

Từ những sa mạc băng ở Nam Cực đến những khe đá s u hàng ngàn kilomet dƣới lòng đất cũng có sự xuất hiện của màng sinh vật [67]. Các rừng mƣa nhiệt đới, nơi có độ m cao là điều kiện thuận lợi cho sự phát triển phong phú của màng sinh vật, nhƣ r u và những cặn bám dƣới đáy ao, hồ, hay những mảng r u, địa y bám trên thân cây, hay những váng nổi trên bề mặt ao, hồ… [67]. Màng sinh vật còn có thể đƣợc tìm thấy ở sa mạc. Một trong những hình thức phổ biến của dạng màng sinh vật sa mạc đƣợc gọi là vec-ni sa mạc (varnish desert), một thuật ngữ mô tả hiện tƣợng những hòn đá, vách núi có màng sinh vật phát triển xuất hiện những vết màu [67].

Đối với thực vật, một số loài thực vật cộng sinh với vi khu n có trong màng sinh vật bám ở rễ cây. Màng sinh vật đƣợc tạo ra bởi vi khu n cố định nitơ Rhizobium trong rễ cây có thể giúp ngăn ngừa bệnh cho cây trồng [82]. 3 Luận văn Thạc sỹ Sinh Nguyễn Thị 1. Trong hệ thống thiết bị nhân tạo Trong các thiết bị nhân tạo, màng sinh vật thƣờng xuất hiện ở các dụng cụ dẫn nƣớc và chứa nƣớc gây tắc nghẽn đƣờng ống, rò rỉ nƣớc hay ô nhiễm môi trƣờng.

Biofilm làm giảm nhiệt trong hệ thống làm mát hoặc hệ thống sƣởi nƣớc [21]. Biofilm trong hệ thống kỹ thuật biển, chẳng hạn nhƣ ống dẫn dầu ngoài khơi, ống dẫn ga công nghiệp có thể dẫn đến sự ăn mòn đáng kể. Ăn mòn chủ yếu là do các yếu tố vô sinh. Tuy nhiên, ít nhất 20% nguy n nh n g y ra ăn mòn là do các vi sinh vật đã bám vào bề mặt kim loại [72].

Trong cơ thể sinh vật Màng sinh vật có trong rất nhiều bệnh nhiễm trùng của cơ thể, ƣớc tính khoảng 80% các bệnh nhiễm trùng [61]. Các quá trình truyền nhiễm có li n quan đến biofilm nhƣ nhiễm trùng đƣờng tiết niệu, nhiễm trùng ống thông, nhiễm trùng tai giữa, hình thành các mảng bám răng, vi m nƣớu, nhiễm trùng trong bệnh xơ nang. Một số nghiên cứu ghi nhận rằng màng sinh vật có thể giúp chữa lành vết thƣơng ở da và giảm tại chỗ hiệu quả kháng khu n trong chữa bệnh hoặc điều trị nhiễm trùng vết thƣơng da [28]. Màng sinh vật cũng có thể xuất hiện trên các bề mặt của các thiết bị cấy ghép nhƣ các ống thông, van tim nhân tạo…[52].

Thành phần và cấu trúc của biofilm 1. Thành phần của biofilm Về cơ bản màng sinh vật đƣợc cấu tạo gồm rất nhiều tế bào của cùng một loài hay từ các loài vi sinh vật khác, khối lƣợng tế bào vi sinh vật chiếm 2-5% tổng khối lƣợng biofilm, 97% là nƣớc, 3-6% còn lại là các hợp chất polymer ngoại bào (EPS) và ion [13]. Các hợp chất ngoại bào Các hợp chất ngoại bào thƣờng có ở vi khu n và vi khu n cổ, tảo và nấm [79]. Đƣợc tiết ra bởi các vi sinh vật trong suốt quá tr nh sinh trƣởng hoặc ph n giải tế bào, EPS gồm có các hợp chất hữu cơ nhƣ polysaccharide, protein, axit nucleic, lipid, axit uronic và các đại phân tử sinh học khác [18], [79].

Sau nƣớc, 4 Luận văn Thạc sỹ Sinh Nguyễn Thị polysaccharide và protein là các thành phần chính của EPS và rất khác nhau về thành phần, cấu trúc, tính chất [35]. Phần lớn các polysaccharide của EPS là polyanion bởi sự có mặt của cả axit uronic (v dụ nhƣ D - glucuronic, D - galacturonic, và axit mannuronic)và liên kết ceton của pyruvate [74]. Ở những protein ngoại bào, nhiều axit amin khác nhau mang điện t ch m. Có nhiều nhóm chức hóa học nhƣ carboxyl, phosphate, sulfate trong các axit amin [79].

T nh chất này rất quan trọng bởi nó cho ph p các ph n tử polysaccarit ngoại bào li n kết đƣợc với các ion dƣơng hóa trị II nhƣ Ca2+ và Mg2+. Từ đó h nh thành li n kết ch o giữa các sợi polymer và tạo ra lực li n kết lớn hơn trong cấu trúc màng sinh vật. Trong trƣờng hợp của một số vi khu n gram dƣơng nhƣ Staphylococcus, thành phần hóa học của mạng lƣới ngoại bào có thể hoàn toàn khác nhau và gồm chủ yếu là các ion dƣơng. Sutherland đã ghi nhận hai thuộc t nh quan trọng của mạng lƣới ngoại bào.

Thứ nhất, thành phần và cấu trúc của các polysaccarit xác định cấu tạo ch nh của mạng lƣới ngoại bào.