Luận văn: Thiết kế vector chuyển gen biểu hiện kháng nguyên vi rút tai xanh (PRRS)

Luận văn nghiên cứu thiết kế vector chuyển gen biểu hiện kháng nguyên vi rút PRRS (tai xanh) trong tế bào thực vật, một hướng mới cho vắcxin.

• Tác giả: Lê Thị Thanh
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Tường Vân
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Thiết Kế Vector Chuyển Gen Biểu Hiện Kháng Nguyên Vi Rút PRRS Trong Tế Bào Thực Vật
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2013
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Bệnh PRRS và Tầm Quan Trọng của Vắcxin Thực Vật

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS) là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm do vi rút gây ra, có khả năng lây lan nhanh và gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi. Ở Việt Nam, bệnh còn được gọi là "lợn tai xanh" do các triệu chứng xung huyết tai đặc trưng. Bệnh được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1997 tại Việt Nam và từ 2007 đã lây lan khắp 17 tỉnh thành. Thiệt hại kinh tế hàng năm lên đến hàng triệu USD. Vắcxin thực vật hay vắcxin ăn được là giải pháp công nghệ sinh học hiện đại, có nhiều ưu điểm vượt trội so với vắcxin truyền thống như dễ bảo quản, có thể dùng qua đường miệng và kích thích hệ thống miễn dịch hiệu quả hơn.

1.1. Đặc điểm của Vi Rút PRRS

Vi rút PRRS có khả năng gây sẩy thai ở lợn nái đang chửa và gây các triệu chứng bệnh về đường hô hấp, đặc biệt ở lợn con cai sữa. Bệnh xuất hiện lần đầu tiên ở Hoa Kỳ năm 1987 và nhanh chóng lan rộng đến Canada, Nhật Bản, châu Âu và châu Á. Ở Mỹ, thiệt hại kinh tế do bệnh gây ra khoảng 560 triệu USD hàng năm. Vi rút có đặc tính khó kiểm soát do tập quán chăn nuôi phức tạp, dẫn đến sự lây lan ngày càng rộng hơn.

1.2. Hạn Chế của Vắcxin Truyền Thống

Các vắcxin bất hoạt và nhược độc hiện có có nhiều nhược điểm: vắcxin bất hoạt có hiệu quả bảo vệ miễn dịch thấp, trong khi vắcxin nhược độc có nguy cơ phát triển độc tính trở lại. Vắcxin trên thị trường Việt Nam giá thành cao, hiệu quả thấp và chỉ điều trị triệu chứng mà không bảo vệ động vật miễn nhiễm với vi rút. Do đó, cần phát triển các giải pháp vắcxin mới hiệu quả hơn.

II. Vector Chuyển Gen và Thiết Kế Để Biểu Hiện Kháng Nguyên PRRS

Vector chuyển gen là công cụ sinh học quan trọng để đưa các gen mã hóa kháng nguyên vào tế bào thực vật. Thiết kế vector nhằm mục đích biểu hiện kháng nguyên vi rút PRRS, đặc biệt là Glycoprotein vỏ (GP5), trong tế bào thực vật như thuốc lá và đậu tương. Quá trình thiết kế vector phải đảm bảo sự ổn định và hiệu quả biểu hiện gen trong suốt quá trình phát triển của thực vật. Kháng nguyên biểu hiện trong thực vật ổn định ở nhiệt độ phòng, dễ bảo quản và sử dụng. Điều này tạo nền tảng cho sản xuất vắcxin thực vật an toàn, hiệu quả và có giá thành thấp hơn các phương pháp truyền thống.

2.1. Nguyên Tắc Thiết Kế Vector Chuyển Gen

Vector chuyển gen phải chứa các thành phần cốt lõi bao gồm: promoter mạnh để điều khiển biểu hiện gen, gen mã hóa kháng nguyên PRRS (như GP5), và các dãy kỹ thuật để ổn định vector. Promoter được chọn phải đảm bảo biểu hiện cao trong tế bào thực vật. Gen đánh dấu cũng được bao gồm để theo dõi quá trình chuyển gen. Thiết kế phải xem xét các yếu tố như độc tính, ổn định và hiệu quả chuyển gen để tối ưu hóa sản xuất kháng nguyên trong mô thực vật.

2.2. Lựa Chọn Loài Thực Vật Chủ

Thuốc lá (BY-2) và đậu tương được chọn làm loài thực vật chủ vì những ưu điểm đặc biệt. Thuốc lá BY-2 là dòng tế bào hoàn toàn phù hợp cho các nghiên cứu biểu hiện gen với tốc độ phân chia nhanh. Đậu tương có năng suất sinh khối cao và dễ sản xuất quy mô lớn. Cả hai loài đều dễ biến đổi di truyền và có khả năng biểu hiện protein kháng nguyên ổn định, phù hợp cho sản xuất vắcxin ăn được.

III. Ưu Điểm của Vắcxin Thực Vật So với Phương Pháp Truyền Thống

Vắcxin thực vật hay vắcxin ăn được mang lại những lợi thế vượt trội trong sản xuất và sử dụng. So với các hệ thống sản xuất vắcxin truyền thống như nuôi cấy tế bào động vật hoặc phương pháp sinh học phân tử thông thường, vắcxin thực vật dễ dàng tăng quy mô sản xuất và thu sinh khối. Kháng nguyên biểu hiện trong thực vật ổn định ở nhiệt độ phòng, không cần lạnh đặc biệt, giảm chi phí bảo quản. Có thể dùng qua đường miệng như ăn tươi hoặc nấu chín, tăng sự tuân thủ từ phía người sử dụng. Đặc biệt, vắcxin ăn được kích thích sản xuất kháng thể của hệ thống niêm mạc ruột hiệu quả hơn vắcxin tiêm, cung cấp bảo vệ miễn dịch tốt hơn.

3.1. Lợi Ích về Chi Phí và Bảo Quản

Vắcxin thực vật có chi phí sản xuất thấp vì không cần những thiết bị phức tạp như các nhà máy nuôi cấy tế bào động vật. Quá trình canh tác thực vật đơn giản hơn và có thể thực hiện ở quy mô nông trại. Không cần lạnh để bảo quản kháng nguyên, giảm chi phí cơ sở hạ tầng lạnh chuỗi. Vắcxin có thể lưu trữ ở nhiệt độ phòng trong thời gian dài, rất phù hợp cho các vùng khó khăn không có điều kiện lạnh.

3.2. Hiệu Quả Miễn Dịch và An Toàn

Vắcxin ăn được kích thích miễn dịch niêm mạc mạnh hơn vắcxin tiêm vì tương tác trực tiếp với các tế bào miễn dịch ruột. Tạo kháng thể IgA tại chỗ, cung cấp bảo vệ toàn diện. An toàn cao vì không có nguy cơ phát triển độc tính trở lại như vắcxin nhược độc. Quá trình sản xuất trong thực vật thân thiện với môi trường, không sử dụng hóa chất độc hại.

IV. Mục Tiêu và Hướng Phát Triển Của Đề Tài Nghiên Cứu

Đề tài "Thiết kế vector chuyển gen biểu hiện kháng nguyên vi rút PRRS trong tế bào thực vật" được thực hiện tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam, được tài trợ từ dự án hợp tác quốc tế giữa Việt Nam và Vương Quốc Bỉ giai đoạn 2011-2013. Đề tài hướng tới hai mục tiêu chính: (i) Thiết kế vector chuyển gen mã hóa cho các kháng nguyên của vi rút PRRS vào tế bào thực vật, (ii) Đánh giá hiệu quả sử dụng của các vector thông qua phân tích biểu hiện kháng nguyên trong tế bào thuốc lá BY-2. Kết quả nghiên cứu hứa hẹn phát triển vắcxin thực vật hiệu quả chống bệnh lợn tai xanh, góp phần giải quyết bài toán phòng chống bệnh nguy hiểm này tại Việt Nam và các nước khác.

4.1. Mục Tiêu Chính của Đề Tài

Mục tiêu thứ nhất là thiết kế vector chuyển gen chứa các gen mã hóa kháng nguyên PRRS, đặc biệt là Glycoprotein vỏ (GP5), với promoter mạnh và các yếu tố điều khiển biểu hiện hiệu quả. Mục tiêu thứ hai là đánh giá hiệu quả vector trong tế bào thuốc lá BY-2 bằng phân tích biểu hiện protein, xác nhận mức độ biểu hiện kháng nguyên. Cả hai mục tiêu này tạo cơ sở khoa học vững chắc cho phát triển vắcxin thực vật trong tương lai.

4.2. Hướng Ứng Dụng Thực Tiễn

Kết quả đề tài sẽ tạo nền tảng cho sản xuất vắcxin thực vật chống bệnh lợn tai xanh, với khả năng giảm giá thành vắcxin từ 50-70% so với vắcxin truyền thống. Vắcxin có thể được sử dụng như một giải pháp phòng chống bệnh PRRS ở Việt Nam, đặc biệt hiệu quả ở các vùng nông thôn. Ngoài ra, công nghệ này có thể mở rộng để phát triển vắcxin thực vật cho các bệnh truyền nhiễm khác ở động vật, mang lại giá trị kinh tế và xã hội lớn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS) là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm do vi rút gây ra, có khả năng lây lan nhanh gây thiệt hại nặng nề cho ngành kinh tế. Ở Việt Nam bệnh còn đƣợc gọi là bệnh “lợn tai xanh” do lợn mắc bệnh thƣờng bị xung huyết ở tai, lúc đầu đỏ sẫm sau đó tím xanh. Đặc trƣng của bệnh là hiện tƣợng sẩy thai ở lợn nái đang chửa hoặc các triệu chứng bệnh về đƣờng hô hấp, đặc biệt là ở lợn con cai sữa. Bệnh đƣợc phát hiện lần đầu tiên ở Hoa Kỳ năm 1987.

Sau đó xuất hiện ở nhiều nƣớc chăn nuôi lợn theo phƣơng thức công nghiệp: Canada (1987); Nhật Bản (1989); Đức (1990); Hà Lan, Tây Ban Nha, Anh, Pháp (1991); Đan Mạch (1992)…. Từ năm 1992, bệnh đã gây ra các ổ dịch lớn ở nhiều nƣớc khác thuộc Bắc Mỹ, châu Âu và châu Á, gây tổn thất lớn cho nghề chăn nuôi lợn trên thế giới. Ở Mỹ, thiệt hại kinh tế (trực tiếp và gián tiếp) của bệnh lợn tai xanh trong những năm gần đây là lớn nhất so với thiệt hại do các bệnh khác gây ra ở lợn. Ƣớc tính hàng năm nƣớc Mỹ phải gánh chịu những tổn tất do bệnh gây ra khoảng 560 triệu USD do việc tiêu huỷ lợn chết và lợn ốm, chi phí chống dịch và xử lý môi trƣờng.

Ở Việt Nam, bệnh đƣợc phát hiện lần đầu tiên vào năm 1997 trên đàn lợn nhập từ Mỹ vào các tỉnh phía Nam. Tuy nhiên các dịch bệnh nặng chỉ đƣợc thông báo vào đầu năm 2007, lây lan khắp 17 tỉnh thành, gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi. Đến nay bệnh đã trở nên khó có thể kiểm soát và lây lan ngày càng đƣơc rộng hơn do tập quán và hệ thống chăn nuôi heo phức tạp ở Việt Nam. Để phòng chống bệnh lợn tai xanh, biện pháp vẫn đƣợc sử dụng là tiêm phòng vắcxin kết hợp các biện pháp thú y.

Gần đây chỉ có một số lƣợng hạn chế các vắcxin bất hoạt và nhƣợc độc cho bệnh lợn tai xanh sử dụng các chủng của châu Mỹ hoặc châu Âu. Tuy nhiên vắcxin dạng này có một số nhƣợc điểm nhƣ vắcxin bất hoạt hiệu quả bảo vệ miễn dịch thƣờng khô ng cao, còn vắcxin nhƣợc độc tao ra mức độ bảo vệ tốt đối với các chủng tƣơng đồng nhƣng lại có nguy cơ phát triển độc tính trở lại. Hiện nay trên thị trƣờng Việt Nam cũng có hai loại vắcxin chống Luận văn thạc sĩ 2011 – 3 Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm PRRSV dạng này nhƣng giá thành khá cao, hiệu quả lại thấp và chỉ có khả năng điều trị các các triệu chứng lâm sàng mà không bảo vệ động vật miễn nhiễm với vi rút. Vắcxin thực vật hay còn goi là vắcxin ăn đƣ ợc (edible vaccine) là một trong những sản phẩm của công nghệ sinh học hiện đại.

Thực chất vắcxin thực vật là vắcxin tiểu đơn vị đƣợc sản xuất dựa trên hệ thống thực vật để thu protein kháng nguyên mong muốn. So với các hệ thống sản xuất vắcxin truyền thống, vắcxin thực vật có nhiều ƣu điểm nhƣ: dễ dàng tăng quy mô sản xuất và thu sinh khối; các kháng nguyên biểu hiện trong thực vật ổn định ở nhiệt độ phòng nên dễ bảo quản và sử dụng; có thể dùng qua đƣờng miệng nhƣ ăn tƣơi (quả, lá) hoặc nấu chín (hạt, củ; an toàn; đặc biệt vắcxin ăn đƣợc kích thích sản xuất kháng thể của hệ thống niêm mạc ruột hiệu quả hơn vắcxin tiêm. Từ những cơ sở lý luận về khoa học và thực tiễn nói trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Thiết kế vector chuyển gen biểu hiện kháng nguyên vi rút PRRS trong tế bào thực vật”, đƣợc tài trợ từ dự án hợp tác quốc tế về KH&CN theo nghị định thƣ giữa hai nƣớc Việt Nam – Vƣơng Quốc Bỉ: “Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa Glycoprotein vỏ (GP5) của virus gây bệnh lợn tai xanh trong thuốc lá và đậu tương” giai đoạn 2011-2013. Đề tài đƣợc tiến hành tại Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam với mục tiêu: i) Thiết kế vector chuyển gen mã hóa cho một số kháng nguyên của vi rút PRRS vào tế bào thực vật và ii) Đánh giá hiệu quả sử dụng của các vector thông qua việc phân tích sự biểu hiện của các kháng nguyên trong tế bào thuốc lá BY-2.

Luận văn thạc sĩ 2011 – 4 Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN (PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME, PRRS) 1. Giới thiệu chung Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS) là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm do vi rút gây ra, có lan khả năng lây nhanh và có thể ghép với các loại mầm bệnh khác do đó làm ốm và chết hàng loạt lợn nhiễm bệnh gây thiệt hại nặng nề cho ngành kinh tế [54, 59]. Ở Việt Nam bệnh còn đƣợc gọi là bệnh “lợn tai xanh” do lợn mắc bệnh thƣờng bị xung huyết ở tai, lúc đầu đỏ sẫm sau đó tím xanh.

Đặc trƣng của bệnh là hiện tƣợng sẩy thai ở lợn nái đang chửa hoặc các triệu chứng bệnh về đƣờng hô hấp, đặc biệt là ở lợn con cai sữa [61]. Bệnh đƣợc mô tả lần đầu tiên ở Bắc Mỹ vào năm 1987 và ở châu Âu vào những năm 1990, đầu tiên là Đức, Pháp và Anh sau đó lan tràn khắp châu Âu. Năm 1998, bệnh đƣợc phát hiện ở châu Á (Hàn Quốc, Nhật Bản, Trung Quốc …) [7, 59]. Thời gian đầu do chƣa xác định đƣợc nguyên nhân nên bệnh có nhiều tên gọi khác nhau [59, 60]:  Bệnh bí hiểm ở lợn (Mystery Swine Disease, MDS)  Bệnh tai xanh (Blue Ear Disease, BED)  Hội chứng hô hấp và sẩy thai ở lợn (Porcine Endemic Abortion & Respiratory Syndrome, PEARS)  Hội chứng hô hấp và vô sinh ở lợn (Swine Infertility & Respiratory Syndrome, SIRS) Năm 1992, trong hội nghị quốc tế về sức khỏe gia súc, Tổ chức Thú y thế giới (OIE) đã nhất trí đăṭ tên cho căn bêṇ h này là “H ội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn” (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS) [7].

Kể từ đó, tên này đã trở thành tên gọi chính thức của bệnh. Luận văn thạc sĩ 2011 – 5 Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm Ở Việt Nam, bệnh đƣợc phát hiện vào năm 1997 trên đàn lợn nhập từ Mỹ. Đến nay, bệnh đã bùng phát và lây lan khắp các tỉnh thành trên cả nƣớc [28]. Triệu chứng bệnh Bệnh có thể xảy ra ở tất cả các lứa tuổi và thƣờng biểu hiện ở hai trạng thái: sinh sản và hô hấp [28, 61, 62]:  Rối loạn sinh sản: tăng số lƣợng lợn con sinh ra bi ̣ch ết hoặc chết trong bào thai (25-35%), lợn con sinh non chiếm 10% đồng thời chứng biếng ăn, tắt sữa ở lợn nái nuôi con làm tăng thêm tỉ lê ̣•lợn con chết trƣớc cai sữa.

 Rối loạn hô hấp: lợn thở dốc, thở dồn dập, khi kiểm tra mô phổi cho thấy viêm phổi, hoại tử phổi rất nặng. VI RÖT GÂY BỆNH LỢN TAI XANH Năm 1991 Viện Thú y Lelystad, Hà Lan đã phân lập đƣợc vi rút gây bệnh lợn tai xanh, sau đó là Mỹ, Đức [59, 61]. Đến nay, các thông tin về loại vi rút này đã đƣợc nghiên cứu khá rõ. Bệnh lợn tai xanh gây ra bởi vi rút PRRS thuôc chi Arterivirus, họ Arteriviridae, bộ Nidovirales, có genom là ARN sợi đơn dƣơng [18].

Đặc điểm hình thái PRRSV là vi rút hình cầu, có vỏ bọc ngoài với đƣờng kính virion vào khoảng 45 – 55 nm, nucleocapsid có đƣờng kính từ 30 – 35 nm. Đồng thời, PRRSV là vi rút ARN, có bộ gen là một phân tử ARN sợi đơn dƣơng, mang những đặc điểm chung của chi Arterivirus [18, 60, 61]. Đặc điểm hình thái, cấu tạo của vi rút PRRS gây bêṇ h tai xanh [61]. Cấu trúc di truyền Luận văn thạc sĩ 2011 – 6 Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm Hệ gen của vi rút PRRS là ARN sợi đơn dƣơng, có kích thƣớc khoảng 15 kb và chứa 9 khung đọc mở (ORF - open reading frame): 1a, 1b, 2a, 2b và 3-7.

Trong đó ORF1a và 1b mã hóa cho các protein phi cấu trúc nhƣ replicase, polymerase tham gia vào quá trình nhân bản của vi rút. Các ORF 2-7 mã hóa cho 6 protein cấu trúc bao gồm 4 phân tử glycoprotein (GP2, GP3, GP4, E), 1 phân tử protein mạng lƣới (M) và 1 protein vỏ nhân vi rút (N) [18] (Hình 1. Mô hình cấu trúc hệ gen của vi rút PRRS [61]. Dựa vào phân tích cấu trúc gen ngƣời ta xác tính đƣợc 2 nhóm vi rút PRRS: nhóm I gồm các vi rút thuộc chủng châu Âu (tên gọi phổ thông là vi rút Lelystad) gồm 4 phân nhóm (subtype) đã đƣợc xác định.

Nhóm II gồm các vi rút thuộc chủng Bắc Mỹ (với tên gọi là VR-2332) [18, 62]. Gần đây, một biến thể của nhóm II có độc lực cao hơn đã xuất hiện gây nhiều tổn thất ở châu Á [28, 61]. Mặc dù đôi khi triệu chứng gây bệnh trên hai nhóm PRRSV có nhiều nét chung, nhƣng các nghiên cứu cho thấy giữa hai nhóm có sự khác biệt lớn về bộ gen (mức độ tƣơng đồng chỉ 55-80%), đặc tính gây đáp ứng miễn dịch cũng nhƣ độc lực vi rút [7, 42]. Điều này có nghĩa là vắcxin đƣợc làm từ một chủng PRRSV sẽ không thể bảo vệ hoàn toàn cho đàn lợn.

Luận văn thạc sĩ 2011 – 7 Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm Ngƣời ta đã chứng minh rằng có sự biến dị di truyền mạnh trong cả 2 nhóm phân lập, đƣợc khẳng định qua phân tích trình tự nucleotide và axít amin của các khung đọc mở (ORFs).Tƣơng đồng về trình tự axít amin của VR-2332 so với LV là 76% (ORF2), 72% (ORF3), 80% (ORF4 và 5), 91% (ORF6) và 74% (ORF7) [7, 54]. Phân tích trình tự cho thấy các vi rút đang tiến hoá. Giải trình tự một phần hoặc từng gen riêng biệt, hoặc toàn bộ hệ gen, đặc biệt là vùng gen chức năng và cấu trúc (mã hóa cho GP2, 3, 4, E, M, N) cho thấy tiến hoá của các chủng vi rút là do đột biến ngẫu nhiên và tái tổ hợp trong các gen. Ví dụ gen m có độ dài 522 bp ở nhóm LV và 525 bp ở nhóm VR-2332 [9, 54].

Ngoài ra, trong một nhóm PRRSV cũng có sự khác nhau giữa các phân nhóm. Ví dụ: Tổng độ dài hệ gen của chủng vi rút nhóm VR-2332 phân lập tại Mỹ (số đăng ký: AY150564) là 15451 bp, trong đó phần mã hoá cho 7 khung đọc mở là 15071 bp.