Luận văn: Nghiên cứu chất ức chế protease HIV-1 từ lá ổi, thạch châu, ma hoàng

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu hoạt tính ức chế protease HIV-1 từ dịch chiết của lá ổi, thạch châu và ma hoàng, tìm kiếm hợp chất tiềm năng.

• Tác giả: Nguyễn Hồng Anh
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Hồng Loan
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên Cứu Chất Ức Chế Hoạt Tính Protease HIV-1 Từ Dịch Chiết Của Lá Cây Thạch Châu (Pyrenaria Jonqueriana), Ổi (Psidium Guajava) Và Ma Hoàng (Ephedra Distachya)
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Giới thiệu về HIV và Protease HIV 1

Protease HIV-1 là một enzyme quan trọng trong chu kỳ nhân lên của virus HIV, đóng vai trò thiết yếu trong quá trình tách biệt các protein tiền chất thành các protein chức năng. Hiểu rõ cơ chế hoạt động của protease HIV-1 là nền tảng để phát triển các phương pháp điều trị AIDS hiệu quả. Virus HIV (Human Immunodeficiency Virus) gây ra hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải, ảnh hưởng đến hàng triệu người trên toàn thế giới. Các chất ức chế protease là những hợp chất có khả năng ngăn chặn hoạt động của enzyme này, từ đó giúp kiểm soát sự nhân lên của virus. Nghiên cứu về các nguồn nguyên liệu tự nhiên để tìm kiếm những inhibitor protease HIV-1 hiệu quả và an toàn là một hướng đi quan trọng trong y học hiện đại.

1.1. Cấu trúc và chức năng của Protease HIV 1

Protease HIV-1 là một aspartic protease với cấu trúc homodimeric đặc biệt. Enzyme này chứa hai chuỗi peptide giống hệt nhau, mỗi chuỗi gồm 99 axit amin. Chức năng chính của protease HIV là cắt các protein tiền chất gag và gag-pol thành các protein chức năng cần thiết cho sự hình thành và hoạt động của virus. Sự ức chế protease HIV-1 sẽ dẫn đến việc tạo ra các hạt virus không hoạt động, không thể lây nhiễm các tế bào khác.

1.2. Ý nghĩa của việc tìm kiếm chất ức chế

Việc phát triển các chất ức chế protease là một phần quan trọng của liệu pháp kháng retrovirus (ART). Các inhibitor protease HIV đã được chứng minh hiệu quả trong việc giảm tải virus và cải thiện tình trạng miễn dịch của bệnh nhân AIDS. Tuy nhiên, các hóa chất tổng hợp thường gây ra các tác dụng phụ không mong muốn. Do đó, việc khám phá các chất ức chế từ các nguồn thiên nhiên như thực vật là một giải pháp lý tưởng.

II. Các cây dược liệu được nghiên cứu

Nghiên cứu khoa học đã tập trung vào ba loài thực vật truyền thống: lá ổi (Psidium guajava), lá thạch châu (Pyrenaria jonqueriana) và ma hoàng (Ephedra distachya). Các cây này đã được sử dụng trong y học cổ truyền với nhiều công dụng chữa bệnh. Lá ổi được biết đến với khả năng kháng viêm và kháng khuẩn mạnh. Thạch châu có tác dụng hỗ trợ tiêu hóa và thanh lọc cơ thể. Ma hoàng được dùng để chữa ho và cải thiện hô hấp. Dịch chiết từ các loài cây này có chứa nhiều hợp chất hoạt tính, đặc biệt là những hợp chất ức chế protease tiềm năng, mở ra các cơ hội điều trị mới cho bệnh nhân HIV/AIDS.

2.1. Ổi Psidium guajava Loài cây chủ lực

Lá ổi chứa nhiều hợp chất hữu ích như acid ursolic, tannin, và polyphenol. Acid ursolic đã được xác định là một chất ức chế protease HIV-1 đặc biệt hiệu quả. Nghiên cứu cho thấy dịch chiết từ lá ổi có khả năng ức chế hoạt tính của pepsin (một protease tương tự), từ đó gợi ý khả năng ức chế protease HIV-1. Hợp chất LO-I được tinh sạch từ cao chiết lá ổi thể hiện hoạt tính ức chế rất mạnh mẽ.

2.2. Thạch châu và Ma hoàng

Dịch chiết từ thạch châu cũng cho thấy khả năng ức chế pepsin đáng kể, cho thấy tiềm năng trong việc tìm kiếm chất ức chế protease. Ma hoàng chứa các alkaloid như ephedrine, có khả năng tác động đến các hoạt động sinh hóa của cơ thể. Các phân đoạn chiết từ ba loài cây này được so sánh để đánh giá hiệu quả ức chế protease HIV-1 của chúng.

III. Phương pháp nghiên cứu và phân tích

Để đánh giá khả năng ức chế protease HIV-1, các nhà nghiên cứu sử dụng các phương pháp khoa học hiện đại. Dịch chiết từ các loài cây được tiến hành bằng các dung môi khác nhau như ethanol, methanol. Sau đó, các hợp chất được tách biệt thông qua sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC). Cấu trúc hóa học được xác định bằng phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR) và khối phổ (MS). Hoạt tính ức chế được đánh giá bằng cách sử dụng pepsin (một protease tương tự) trên cơ chất hemoglobin, cũng như protease HIV-1 trực tiếp với cơ chất peptide đặc hiệu. Nồng độ ức chế IC50 được tính toán để xác định độ hiệu quả của từng chất ức chế.

3.1. Quy trình tách chiết và tinh sạch

Lá cây được sấy khô và xay nhỏ, sau đó ngâm trong dung môi để tạo dịch chiết. Cao chiết được thu nhận qua các bước loại dung môi. Phân đoạn chiết được phân tách dựa trên độ phân cực khác nhau. Cuối cùng, các hợp chất hoạt tính được tinh sạch đến độ tinh khiết cao để tiến hành các bài kiểm tra hoạt tính.

3.2. Đánh giá hoạt tính ức chế

Hoạt tính ức chế pepsin được xác định bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch chứa cơ chất hemoglobin. Phương pháp Anson cải tiến được áp dụng để đo lường hoạt tính với độ chính xác cao hơn. Protease HIV-1 được kiểm tra bằng cơ chất peptide đặc hiệu được gắn nhãn DABCYL/EDANS, cho phép đo lường hoạt động của enzyme một cách chính xác.

IV. Kết quả và ứng dụng tiềm năng

Kết quả nghiên cứu cho thấy lá ổi (Psidium guajava) có khả năng ức chế protease HIV-1 mạnh nhất trong ba loài cây được nghiên cứu. Hợp chất LO-I được tinh sạch từ dịch chiết lá ổi thể hiện hoạt tính ức chế rất ấn tượng với nồng độ ức chế IC50 thấp. Acid ursolic, thành phần chính của hợp chất này, đã được chứng minh là một chất ức chế protease HIV-1 hiệu quả và an toàn. Các cơ chế ức chế của acid ursolic bao gồm việc ràng buộc vào các vị trí hoạt động của protease HIV-1, từ đó ngăn chặn quá trình xúc tác. Kết quả này mở ra các cơ hội phát triển các dạng chế phẩm mới từ thực vật thiên nhiên để điều trị AIDS hiệu quả hơn, với chi phí thấp hơn so với các inhibitor protease tổng hợp hiện tại.

4.1. Hiệu quả ức chế protease HIV 1

Acid ursolic và các hợp chất liên quan từ lá ổi cho thấy hoạt tính ức chế đặc hiệu đối với protease HIV-1, với IC50 ở mức nanoMolar. Điều này chứng tỏ độ hiệu quả cao hơn so với nhiều inhibitor protease đã biết. Dạng chế phẩm phù hợp của acid ursolic cần được phát triển để tăng cường khả năng hấp thụ và sinh khả dụng trong cơ thể.

4.2. Hướng phát triển điều trị trong tương lai

Các phát hiện này tạo nền tảng cho việc phát triển chất ức chế protease từ nguồn nguyên liệu tự nhiên. Liệu pháp kháng retrovirus (ART) sẽ được cải thiện bằng các inhibitor an toàn hơn và có ít tác dụng phụ hơn. Các bệnh nhân HIV/AIDS có thể được hưởng lợi từ các thuốc mới phát triển từ thực vật dược liệu truyền thống.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS) gây ra bởi virus gây suy giảm miễn dịch ở ngƣời (HIV). Đây là virus thuộc họ Retroviridae và có hai type chính là HIV-1 và HIV-2, trong đó type 1 xuất hiện phổ biến và là nguyên nhân chính gây ra AIDS ở ngƣời. Cho đến nay, dù đã có những chƣơng trình hành động toàn cầu cùng với sự phát triển của các phƣơng pháp điều trị, AIDS vẫn là đại dịch của toàn nhân loại và cần thiết phải tăng cƣờng các biện pháp phòng ngừa, điều trị bệnh hiệu quả. Trong phòng chống nhiễm HIV-1, phát triển vaccine gặp rất nhiều khó khăn và thƣờng thất bại do thời gian ủ bệnh của HIV-1 dài, thƣờng xuyên xảy ra đột biến ở vùng gen mã hóa cho kháng nguyên.

Vì vậy, cho đến hiện nay, ngƣời nhiễm HIV-1 muốn kéo dài cuộc sống chỉ có con đƣờng duy nhất là sử dụng liệu pháp dùng thuốc kháng retrovirus (ART) [39]. Trong chu trình tái bản của HIV-1, protease là enzyme có tác dụng phân cắt các polyprotein tiền thân gag và gag-pol thành những protein cấu trúc và chức năng trong quá trình trƣởng thành của virus. Khi ức chế hoạt tính của protease hoặc gây đột biến trên gen mã hóa cho protease, các hạt virus vẫn hình thành nhƣng không đƣợc đóng gói phù hợp để tạo thành virus hoàn chỉnh nên chúng không có khả năng xâm nhiễm vào tế bào vật chủ [26]. Vì vậy, một số chất ức chế protease HIV-1 (PI) đã đƣợc phát triển thành thuốc điều trị bệnh nhân HIV/AIDS.

Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc trong thời gian dài với nồng độ cao cùng với tốc độ đột biến lớn của HIV-1 dẫn đến sự xuất hiện các chủng virus kháng thuốc là một trong những nguyên nhân chính gây thất bại điều trị với ART nói chung và PI nói riêng. Hơn nữa, việc thiết kế các chất PI mới không phải dễ dàng, không định hƣớng, phải sàng lọc trên số lƣợng khá lớn các hợp chất thiết kế tƣơng tự nhau trên cơ sở hiểu biết về cấu trúc và chức năng của protease HIV-1. Mặt khác, những chất này nhiều khi không thân thiện với con ngƣời, phải trải qua nhiều bƣớc thử nghiệm. Chính vì vậy, bên cạnh các thuốc tổng hợp hóa học, các nhà khoa học trên thế giới cũng không ngừng tìm kiếm và chọn lọc các chất tự nhiên từ dịch chiết thực vật có tác dụng ức chế protease của HIV-1 (protease HIV-1).

1 Việt Nam với nguồn thực vật phong phú và nhiều cây thuốc, vị thuốc có giá trị lớn với sức khỏe con ngƣời. Theo thống kê của Viện Dƣợc liệu, Việt Nam có hơn 12.000 loài thực vật, trong đó có gần 4.000 loài đƣợc dùng làm thuốc trong y học dân gian và y học cổ truyền. Nhƣ vậy, thực vật Việt Nam cũng s là nguồn nguyên liệu phong phú để sàng lọc và xác định các hoạt chất ức chế protease HIV-1, làm cở sở cho việc phát triển thuốc điều trị cho bệnh nhân HIV/AIDS. Tuy nhiên, cho đến nay chúng ta chƣa khai thác nguồn tài nguyên phong phú của đất nƣớc theo hƣớng này.

Xuất phát từ những thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu chất ức chế hoạt tính protease HIV-1 từ dịch chiết của lá cây Thạch châu (Pyrenaria jonqueriana), Ổi (Psidium guajava) và Ma hoàng (Ephedra distachya)” nhằm thu nhận đƣợc chất ức chế protease HIV-1 có nguồn gốc từ dƣợc liệu Việt Nam. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ HIV VÀ PROTEASE CỦA HIV-1 1. Giới thiệu chung về HIV Đại dịch HIV/AIDS đã và đang là một thách thức to lớn đối với tiến trình phát triển xã hội.

Sau 3 thập kỷ phát hiện mà đầu tiên là ở các nƣớc phát triển, HIV/AIDS đã lan rộng trên toàn thế giới, đặc biệt ở khu vực châu Phi và các nƣớc châu Á. Đến nay vẫn chƣa có vaccine phòng ngừa HIV hay thuốc chữa trị AIDS đặc hiệu. Theo chƣơng trình HIV/AIDS của Liên hiệp quốc (UNAIDS, 2015), tính đến cuối năm 2014, thế giới có khoảng 36,9 triệu ngƣời (dao động trong khoảng từ 34,3 triệu đến 41,4 triệu) đang mang căn bệnh AIDS, trong đó số đối tƣợng nhiễm mới là 2 triệu ngƣời và có khoảng 1,2 triệu bệnh nhân đã chết vì AIDS trong năm 2014. Khu vực các nƣớc Châu Phi gần Sahara (Sub-Saharan Africa) vẫn là nơi có số ngƣời nhiễm HIV cao nhất trên thế giới với hơn 2/3 dân số, tiếp đến là châu Á Thái Bình Dƣơng với 5,0 triệu ngƣời nhiễm HIV [91].

Ở Việt Nam, theo số liệu mới nhất của Cục phòng chống HIV/AIDS, Bộ Y tế (Báo cáo số 561/BC-BYT của Cục phòng chống HIV/AIDS, ngày 18/6/2015) trong 6 tháng đầu năm 2015, số ngƣời xét nghiệm phát hiện mới nhiễm HIV là 3.204 ngƣời, số ngƣời nhiễm HIV chuyển sang giai đoạn AIDS là 1.326 ngƣời, số ngƣời nhiễm HIV tử vong là 438 và số tử vong báo cáo bổ sung quý II/2015 là 1500 ngƣời. Lũy tích số ngƣời nhiễm HIV đang còn sống 227.114 ngƣời, số bệnh nhân AIDS là 71.115 và số tử vong là 74. Nhìn chung, lây truyền HIV/AIDS qua đƣờng tình dục ngày càng gia tăng liên tục từ 2007 trở lại đây; số ngƣời nhiễm HIV phát hiện mới tiếp tục có xu hƣớng giảm, nhƣng lũy tích số ngƣời nhiễm HIV còn sống tiếp tục gia tăng. Trong phòng chống nhiễm HIV/AIDS, phƣơng thức điều trị phổ biến nhất hiện nay vẫn là liệu pháp dùng thuốc chống virus (ART-antiretroviral drug therapy) bao gồm thuốc ức chế reverse transcriptase, thuốc ức chế integrase và thuốc ức chế 3 protease (PI) [39].

Trong đó, protease đƣợc mã hóa bởi gen pol của virus có chức năng cắt các chuỗi polyprotein (gag, gag-pol) tại những vị trí nhất định để tạo thành các protein cấu trúc và chức năng cần thiết cho virus hoàn chỉnh. Nếu protease bị mất hoạt tính, HIV-1 không đƣợc đóng gói phù hợp để tạo virus hoàn chỉnh [26]. Vì vậy, protease của HIV-1 (protease HIV-1) là một trong những đích quan trọng để phát triển thuốc điều trị AIDS. Cấu trúc và chức năng của protease HIV-1 Về cấu trúc, protease HIV-1 là một protease aspartyl (có chứa gốc aspartic trong trung tâm hoạt động), họ retropepsin A2.

Năm 1989, Navia và tập thể từ phòng thí nghiệm của Merck là nhóm đầu tiên công bố cấu trúc tinh thể của protease HIV-1. Sau đó, một cấu trúc chính xác hơn đã đƣợc báo cáo bởi Kent và tập thể [16]. Đến năm 2010, với sự đóng góp đáng kể của phƣơng pháp nhiễu xạ tia X, hơn 400 cấu trúc của protease HIV-1 (kiểu dại và dạng đột biến) trong phức hệ với các chất ức chế khác nhau đã đƣợc làm sáng tỏ. Những dẫn liệu này giúp các nhà nghiên cứu có đƣợc hiểu biết sâu sắc về các kiểu liên kết của enzyme với chất ức chế và cơ sở phân tử của kháng thuốc [10, 83].

Protease HIV-1 là một homodimer, mỗi monomer gồm 99 acid amin và đƣợc sắp xếp gần nhƣ theo kiểu đối xứng. Mô hình cấu trúc bậc hai đƣợc thể hiện rõ ràng ở phiến nếp gấp β và một đoạn xoắn α ngắn gần đầu C [37]. Cấu tạo của protease HIV-1 có thể chia thành ba vùng chính: vùng dimer hóa, vùng lõi và vùng mũ (Hình 1. Trong đó, vùng dimer hóa đƣợc hình thành nhờ tƣơng tác giữa 8 gốc acid amin 1 - 4 (vùng N đầu cùng) và 96 - 99 (vùng C tận cùng) từ mỗi monomer và các acid amin trong trung tâm hoạt động 24 - 29.

Các gốc acid amin này là 2 đầu C của phiến gấp nếp β đƣợc cấu tạo theo nguyên tắc các acid amin kỵ nƣớc Pro1, Ile3, Leu97 và Phe99 hƣớng vào nội phân tử enzyme còn các gốc phân cực Gln2, Thr4, Thr96 và Asn98 thì quay ra ngoài tiếp xúc với dung môi [22]. Bốn gốc ở đầu C tận cùng tham gia vào tƣơng tác giữa các chuỗi để duy trì sự ổn định của cấu trúc dimer, bao gồm 34 liên kết hydro và 4 cầu muối. Tƣơng tác 4 giữa các gốc Ile50 và Gly51’; Asp29, Arg87 và Arg88’ cũng ảnh hƣởng đến sự ổn định của cấu trúc dimer. Khi enzyme gắn thêm chất ức chế hoặc cơ chất, sự ổn định của cấu trúc dimer đƣợc tăng cƣờng.

Vùng lõi gồm 4 đầu N sợi β (các gốc acid amin 10 - 32 và 63 - 85 của mỗi monomer) có vai trò quan trọng đối với sự ổn định cấu trúc dimer và hoạt tính xúc tác của enzyme. Trung tâm hoạt động của enzyme nằm trong vùng lõi và bao gồm ba gốc acid amin từ mỗi monomer. Vùng mũ đƣợc mở rộng tạo thành một vùng gấp xuống đóng vai trò giống nhƣ một giá đỡ cho chuyển động của vùng mũ. Vùng mũ nằm ở phần rộng nhất của enzyme bao gồm các acid amin từ 33 - 43 và 44 - 63 bao quanh trung tâm hoạt động.

Đầu N của vùng này rất giàu glycine, do đó tăng cƣờng tính linh hoạt về hình dáng của các enzyme ở dạng tự do [37, 78, 85]. Cấu trúc dạng dimer (A) và cấu trúc chi tiết (B) của protease HIV-1 [43] (Vùng dimer hóa (D), vùng mũ (F), và trung tâm hoạt động (A)) Trung tâm hoạt động của protease chứa bộ ba Asp - Thr - Gly nằm tại mặt phân giới của dimer. Tại một monomer nhóm bộ ba xúc tác đƣợc đặt ở vị trí 25 - 26 - 27 và do tính đối xứng ở monomer còn lại là 25’ - 26’ - 27’. Trung tâm hoạt động đƣợc làm ổn định nhờ mạng lƣới các liên kết hydro giữa các gốc acid amin chính tại vị trí này với các gốc acid amin xung quanh.

Cấu trúc khắt khe của trung tâm hoạt động là do gốc Thr26 hình thành các liên kết hydro với nhóm amin của Thr26' và với nhóm oxygen carbonyl của Leu24 nằm ở bên cạnh gốc Asp đóng vai trò xúc tác. Mỗi gốc Asp25 cũng đƣợc liên kết với nhóm NH của Gly27'. Phân tử Asp là cần thiết cho cả cấu trúc và hoạt tính xúc tác của protease. Vai trò quan trọng của Asp25 đƣợc làm rõ khi thay thế Asp bằng các acid amin khác dẫn đến enzyme bị bất hoạt [27].

5 Để làm rõ cơ sở phân tử và đánh giá những tiềm năng của một chất ức chế chống lại sự kháng thuốc, Hou và tập thể đã tiến hành nghiên cứu vai trò của các gốc riêng biệt trên phân tử protease HIV-1 dựa trên sự kết hợp giữa enzyme với 6 loại cơ chất và 8 chất ức chế đƣợc FDA công nhận. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự đóng góp của các gốc khác nhau vào liên kết giữa enzyme với cơ chất là khác nhau. Những gốc đóng góp đáng kể vào liên kết giữa protease với cơ chất chủ yếu nằm ở ba vùng, trung tâm hoạt động (Asp25, Gly27, Ala28, Asp29, và Asp30), vùng mũ (Ile47, Gly48, Gly49, và Ile50) và vùng đầu C tận cùng (Pro81 và Ile84).