ĐẶT VẤN ĐỀ Carbohydrate là nhóm phân tử sinh học có mặt nhiều nhất trên trái đất,chiếm khoảng 80-90 % khối lƣợng khô ở thực vật và là chất dồi dào nhất trong các hợp chất hữu cơ tự nhiên, đặc biệt là cellulose, tinh bột và pectin… Hàng năm thực vật và tảo có khả năng biến - đổi hơn 100 tỷtấn CO2 và H2Othành glucose và sản phẩm hữu cơ khác nhƣ đƣờng và tinh bột là thức ăn chủ yếu của con ngƣời. Các hợp chất cacbonhydrate có ý nghĩa lớn đối với đời sống con ngƣời, tuy nhiên, với lƣợng sinh khối khổng lồ tạo ra hàng năm hiện nay trên trái đất chƣa thực sự đƣợc tận dụng một cách có hiệu quả để sản xuất ra các sản phẩm có giá trị cao hơn mà chủ yếu là quá trình phân hủy diễn ra dƣới sự tác động của hệ enzyme trong các vi sinh vật tồn tại trong tự nhiên. Vai trò của hệ enzyme phân hủy polysaccharide tự nhiên chủ yếu là góp phần vào việc khép kín chu trình cacbon trên trái đất. Hệ enzyme phân giải các hợp chất này là: cellulase, amylase, pectinase từ hệ VSV phong phú và đa dạng bao gồm cả vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm.
Trong đó, vi khuẩn có vai trò đáng chú ý nhất trong quá trình phân giảicác hợp chất các bon do hệ enzyme từ vi khuẩn thƣờng có hoạt tính mạnh và phong phú. Để tận dụng khối lƣợng lớn nguồn nguyên liệu từ sinh khối, các nhà khoa học đã nghiên cứu để sản xuất và tối ƣu hóa quá trình chuyển hóa các hợp chất polysaccharide. Một trong những hƣớng chuyển hóa các hợp chất này hiệu quả và thân thiện với môi trƣờng nhất đó là con đƣờng sinh học đƣợc thực hiện bởi hệ enzyme từ vi sinh vật. Tuy nhiên, hiện nay hệ enzyme tham gia vào quá trình phân giải các hợp chất polysaccharide hiệu quả nhƣ: cellulase, amylase, pectinase đƣợc sử dụng trong các ngành công nghiệp ở Việt Nam chủ yếu đƣợc nhập khẩu từ nƣớc ngoài với giá thành cao.
Ngoài ra, với điều kiện Việt Nam là một nƣớc nông nghiệp nên nguồn nguyên liệu dùng để sản xuất enzyme là rất phong phú, vì thế việc nghiên cứu cải thiện và nâng cao hiệu suất quá trình sản xuất ra các enzyme từ VSV phân lập từ bản địa hiện nay đang là một đòi hỏi cấp thiết. Việc tuyển chọn các VSV có khả năng sinh tổng hợp ra hệ enzyme phân giải polysaccharide, đặc biệt là cellulsae, pectinase, amylase sẽ giúp tận dụng các nguồn gen quý hiếm có sẵn từ 1 tự nhiên mà còn góp phần bảo tồn nguồn gen, cải tạo các chủng VSV công nghiệp sử dụng. Xuất phát từ thực tế đó, tôi tiến hành đề tài: “Tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp các enzyme phân giải polysaccharide” với mong muốn tìm đƣợc một số chủng vi khuẩn có năng lực sinh hệ enzyme phân giải polysaccharide cao nhằm nâng cao hiệu quả của quá trình khai thác và sử dụng nguồn nguyên liệu này. 2 CHƢƠNG I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.Tổng quan về polysacharide Cacbonhydrate là hợp chất cấu tạo nên hầu hết các vật chất hữu cơ trong tự nhiên.
Là hợp chất không những có vai trò quan trọng trong đời sống, nhƣ: cung cấp và dự trữ năng lƣợng,tạo cấu trúc, bảo vệ… mà còn đóng góp không nhỏ vào các ngành công nghiệp thực phẩm, công nghiệp đồ uống và các sản phẩm lên men…[19]. Các hợp chất cacbonhydrate rất đa dạng và phong phú, tùy vào cấu tạo đƣợc chia thành các loại: polysaccharide (chứa hơn 10 đơn phân tử, nhƣ: amylose, cellulose, pectin, agar, chitin…), oligosaccharide (chứa từ 2 đến 10 đơn phân, nhƣ: saccharose, maltose, rafinose…) và monosaccharide (là đơn phân tử, nhƣ: glucose, fructose, galactose, xylose…). Hiện nay, lƣợng cacbonhydrate trên trái đất ngày càng lớn do sinh khối thực vật và phế phụ phẩm của các ngành nông nghiệp, lâm nghiệp…trong đó chiếm phần lớn là polysaccharide [20]. Cấu trúc polysaccharide Polysaccharide đƣợc tạo thành từ các monosaccharide (> 10) liên kết với nhau bằng liên kết glucoside, còn rất ít nhóm – OH glucoside, không còn tính khử.Các monosaccharide trong polysaccharide có thể thuộc một hay nhiều loại khác nhau.
Trong một số trƣờng hợp các gốc monosaccharide có chứa các nhóm khác nhau: acid sun furic, acid photphoric, acid axetic,. Các liên kết gluxit trong phân tử polysaccharide có thể là: anpha- gluxit hay beta- gluxit [11]. Polysacchride còn gọi là glycan, tùy thành phần monose có trong polysaccharide ngƣời ta chia chúng ra làm: homopolysaccharide (chỉ chứa một loạimonosaccharide) và heteropolysaccharide (có ít nhất 2 loại monosaccharide). Tùy vào kích thƣớc và đặc điểm cấu trúc của phân tử chúng có thể tạo dung dịch keo hoặc tan hoàn toàn trong nƣớc.
Polysaccharide đóng vai trò quan trọng trong đời sống động vật, thực vật. Ở thực vật, polysaccharide chiếm 80-90% trọng lƣợng khô, tham gia vào thành phần các mô nâng đỡ, ví dụ cellulose, hay tích trữ dƣới dạng thực phẩm dự trữ với lƣợng lớn, ví dụ tinh bột. 3 Sự phân bố phổ biến và thƣờng gặp nhất của polysacchridetrong cuộc sống chủ yếu là cellulose, tinh bột, pectin. Tinh bột Là polysaccharide dự trữ của thực vật, do quang hợp tạo thành.
Trong củ và hạt có từ 40- 70% tinh bột, các thành phần khác của cây xanh có ít hơn và chiếm khoảng từ 4 đến 20%. Tinh bột không hòa tan trong nƣớc, đun nóng thì hạt tinh bột phồng lên rất nhanh tạo thành dung dịch keo gọi là hồ tinh bột. Tinh bột có cấu tạo gồm hai phần: amylose và amylosepectin, ngoài ra còn có khoảng 2% phospho dƣới dạng ester. Tỷ lệ amylosepectin/amylose ở các đối tƣợng khác nhau là không giống nhau, tỷ lệ này ở gạo nếp là lớn hơn gạo tẻ [12].
*Amylose Chiếm đến 15-20% lƣợng tinh bột, do nhiều gốc α D- glucose liên kết với nhau thông qua C1-C4 tạo thành mạch thẳng không phân nhánh. Trong không gian nó cuộn lại thành hình xoắn ốc và đƣợc giữ bền vững nhờ các liên kết hydro. Theo một số liệu trong amylase còn có chứa các α D- glucopyranose dạng thuyền [19].1: Cấu trúc amylose Amylose bắt màu xanh với iodine, màu này mấy đi khi đun nóng, hiện màu trở lại khi nguội. Một đặc trƣng hóa lý khác cần chú ý là nó bị kết tủa bởi rƣợu butylic.2: Hạt tinh bột trong lục lạp amylose *Amylopectin Cấu tạo do các phân tử α D- glucose liên kết với nhau, nhƣng có phân nhánh.
Chỗ phân nhánh là liên kết C1-C6 glucosidic [23].3: Cấu trúc amylopectin 1. Cellulose Đƣợc cấu tạo bởi những phân tử β D- glucose liên kết với nhau bằng liên kết 1-4 glucosidic. Chúng là thành phần chủ yếu của vách tế bào thực vật. Đối với ngƣời thì cellulose không có giá trị dinh dƣỡng vì cellulose không bị thủy phân trong ống tiêu hóa.
Một số nghiên cứu cho thấy nó có vai trò trong điều hòa tiêu hóa. Động vật ăn có thủy phân đƣợc cellulose nhờ enzyme cellulase [20]. Cellulose không tan trong nƣớc, tan trong dung dịch Schweitzer. Khi đun nóng với H2SO4, cellulose sẽ bị thủy phân thành các phân tử β D- glucose.
Cellulose có ở dạng hình sợi dài, nhiều sợi kết hợp song song với nhau thành chùm nhờ các liên kết hydro, mỗi chùm (micelle) chứa khoảng 60 phân tử cellulose. Giữa các chùm có những khoảng trống, khi hóa gỗ khoảng trống này chứa đầy lignin và tà xem lớp lignin này nhƣ một lớp cement. Lignin là chất trùng hợp của coniferylic alcohol [28].4: Cấu trúc cellulose Các gốc –OH của cellulose có thể tạo ester với acid ví dụ: tạo nitro cellulose với HNO3, tạo acetyl cellulose với CH3COOH. Pectin Là loại polysaccharide có nhiều trong quả, củ và thân cây, thành phần chính là galacturonic acid có nhóm –COOH bị methyl hóa.
Ngƣời ta sử dụng rộng rãi pectin trong sản xuất keo [24].5: Cấu trúc pectin 1. Ứng dụng của polysaccharide Chúng đƣợc sử dụng rộng rãi trong thực phẩm, ở các dạng tự nhiênvà biến tính nhƣ các chất tạo độ đặc hay tạo gel, chất làm bền nhũ tƣơng và các hệ phân tán. Ngoài ra chúng còn đƣợc dùng làm chất tạo màng, bảo vệ bề mặt các loại thực phẩm nhạy cảm khỏi những biến đổi không mong muốn, thành phần thêm vào trong các thực phẩm ăn kiêng. Sản phẩm của quá trình phân giải polysaccharide bằng enzyme không chỉ đƣợc ứng dụng trong y học mà còn đƣợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực công 6 nghiệp khác nhau (sản xuất cồn, sản xuất bia, chế biến thực phẩm gia súc…), trong nông nghiệp, trong hóa học… Do vậy, việc sử dụng enzyme phân giải polysaccharide có vai trò quan trọng trong đời sống hiện nay [8].
Các enzyme phân giải polysaccharide Enzyme thủy phân polysaccharide đƣợc tìm thấy ở nhiều loại vi sinh vật, bao gồm vi khuẩn và nấm. Trong tự nhiên, sinh khối polysaccharide đƣợc phân hủy hoàn toàn bởi hỗn hợp các enzyme thủy phân từ vi sinh vật trong khu hệ đặc trƣng nhƣ ở ruột mối, dạ cỏ bò và một số môi trƣờng khắc nghiệt. Những khu hệ này có thể ƣa khí hoặc kỵ khí, chỉ bao gồm vi khuẩn hoặc chỉ bao gồm nấm hoặc có cả nấm và vi khuẩn [28]. Polysaccharide gồm ba thành phần phổ biến rộng trong tự nhiên: cellulose, tinh bột, pectin tƣơng ứng với ba nhóm enzyme phân giải riêng biệt là nhóm các enzyme cellulase, amylase, pectinase.
Hiện nay, việc sản xuất chế phẩm enzyme các loại đã và đang phát triển mạnh mẽ trên quy mô công nghiệp. Thực tế đã có hàng nghìn chế phẩm enzyme bán trên thị trƣờng thế giới, các chế phẩm này đã đƣợc khai thác và tinh chế có mức độ tinh khiết theo tiêu chuẩn công nghiệp và ứng dụng. Chế phẩm enzyme không chỉ đƣợc ứng dụng trong y học mà còn đƣợc ứng dụng trong nhiều lãnh vực công nghiệp khác nhau (sản xuất cồn, sản xuất bia, chế biến thực phẩm gia súc.), trong nông nghiệp, trong hóa học… "ý nghĩa của việc sử dụng enzyme trong các lãnh vực thực tế không kém so với ý nghĩa của việc sử dụng năng lƣợng nguyên tử". Theo thời gian, enzym công nghiệp ngày càng đƣợc ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác nhau, trong đó những enzym ứng dụng nhiều nhất là protease, cellulose, ligase, amylase,…và một số enzym đặc biệt khác đã thu đƣợc rất nhiều lợi nhuận từ ngành này [20].
Cellulase Là enzyme thuộc lớp glycosyl hydrolase (GHF), thủy phân các hợp chất polysaccharide và oligosaccharide đƣợc tìm thấy trong tự nhiên ( cellulose, tinh bột, chitin, xylan,. Cellulase đƣợc chia thành ba nhóm lớn là exoglucanase hay cellobiohydrolase (EC 3.4) và β-glucosidase (EC 3. Exoglucanase di chuyển dọc theo sợi cellulose và cắt cellulose thành cellobiose. Trong khi đó, endoglucanase thủy phân ngẫu nhiên liên kết β- 1,4- glucoside bên trong sợi cllulose còn β- glucosidasecó khả năng thủy phân cellobiose thành glucose cũng nhƣ cắt glucose ra khỏi cellooligosaccharide.
7 Những enzyme này hỗ trợ nhau trong quá trình thủy phân cellulose bằng cách tạo ra những vị trí tiếp cận cho nhau, loại bỏ vật cản và hạn chế ảnh hƣởng của các chất ức chế[28].